專利名稱：：化合物兒茶素在抗耐藥菌株方面的應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種天然化合物兒茶素在抗耐藥菌株方面的應用，尤其涉及其在體內外的協同抗耐藥菌方面的應用。
背景技術：
：金黃色葡萄球菌是醫院感染的主要病原菌之一，金黃色葡萄球菌可以引起小到皮膚感染，大到可以致命的嚴重肺炎、腦膜炎以及骨關節感染、心內膜炎和菌血癥。通常接受血液透析治療的晚期腎臟疾病患者特別容易感染金黃色葡萄球菌，金黃色葡萄球菌感染是引起住院病人感染和死亡的主要原因。隨著新型抗生素的不斷問世，金黃色葡萄球菌的耐藥性逐漸增強，成為臨床治療的棘手問題，而目前，對于新抗菌藥物的研究開發，主要是合成，半合成以及尋找新的、產生抗生素的高產優質微生物菌種，其研發過程相當復雜，且抗菌藥物價格昂貴。從植物中，尤其是藥用植物中尋找具有抗耐藥菌株活性成分的研究，將會是一個全新的
技術領域：
。兒茶素類化合物種類繁多，其中以兒茶素、表兒茶素、沒食子兒茶素等黃垸類化合物為代表，在植物中分布廣泛，其中以豆科(如兒茶、鴨皂樹)、茜草科(如兒茶鉤藤)、薔薇科(如委陵菜、山櫻桃、鵝絨委陵菜、單子山楂)、蓼科(如大黃、拳參、篇蓄)、山茶科(如山茶)、七葉樹科(如紅七葉樹、加洲七葉樹)為多。兒茶素類化合物具有明顯的清除體內自由基、抗癌、抗菌抗炎、抗突變、抗衰老及改善肝功能等生物活性。目前，有關兒茶素的研究主要集中在茶葉兒茶素的人體保健(如抗氧化抗衰老)、肉類保鮮等方面。而國內外關于兒茶素抗菌方面的研究，也大部分是針對植物中特別是茶葉中總多酚或總兒茶素類進行抗菌篩選，很少有進行深入的單體體內外抗菌活性的研究；至于兒茶素對抗耐藥菌株活性的研究，至今尚未有報道。
發明內容本發明的目的在于提供一種對天然化合物兒茶素進行抗菌特別是體內協同抗耐藥菌株的活性應用。為了實現上述目的，本發明的技術方案在于采用了一種化合物兒茶素在抗耐藥菌株方面的應用。所述的化合物兒茶素與青霉素聯合使用時在抗耐藥金黃色葡萄球菌方面的應用。所述的化合物兒茶素在協同抑制耐藥金黃色葡萄球菌方面的應用。所述的兒茶素與青霉素的重量比為(13):1。兒茶素與青霉素的重量比優選為2:1。本發明所涉及的化合物兒茶素對金黃色葡萄球菌耐藥菌株具有抑制活性，與青霉素混合進行協同作用試驗中，證明本發明的化合物兒茶素具有協同抑制耐藥金黃色葡萄球菌菌株活性，且其穩定性優于y5-內酰胺酶抑制劑克拉維酸鉀。體內試驗也表明兒茶素與青霉素在協同作用下對耐藥金黃色葡萄球菌菌株具有抑制活性。另外，本發明所涉及的化合物兒茶素在自然界分布廣泛，有豐富的原料來源，將其應用在治療金黃色葡萄球菌感染方面具有很好的效果，且成本低。本發明的兒茶素從茜草科帽蕊木屬植物中提取，篩選出具有抗耐藥菌成分的藥物，進一步豐富了中草藥資源方面的研究內容。本發明針對目前金黃色葡萄球菌耐藥性嚴重的問題，對兒茶素進行了體外和體內抗菌試驗。體外試驗發現其對金黃色葡萄球菌敏感菌株無活性，而對其耐藥菌株有活性，在此基礎上，體外協同試驗發現其與青霉素在最佳配比作用下對耐藥金黃色葡萄球菌有較好的抗菌活性，并且體內試驗也表明本發明化合物兒茶素在協同作用下也有較好的活性。菌株敏感程度檢測目前臨床學耐藥細菌的檢測，主要是根據美國臨床實驗室標準化委員會采用紙片擴散法用普通方法可獲得濃度的常規抗菌藥物不能被抑制，或(和)在特殊耐藥機制與有效臨床不能治療時，MIC接近或大于常規水平，這種菌株被定義為耐藥菌株。參照NCCLS實驗，對金黃色葡萄球菌敏感菌株及耐藥菌株，以營養瓊脂為培養基，采用青霉素G和德國Serva公司生產的青霉素(Serva31749)進行菌株敏感程度測定，按照中國藥品生物制品檢定所、衛生部抗菌藥物細菌耐藥性檢測中心制定的藥敏試驗判斷標準。本次試驗中所使用的金黃色葡萄球菌耐藥菌株，當應用青霉素G測定敏感度時，1000U/disc所產生的抑菌圈直徑為13毫米；而標準中青霉素G10U/disc，抑菌圈直徑小于20毫米時，即判斷為耐藥菌株。據此可以判斷該耐藥菌株為耐藥性金黃色葡萄球菌，并用Serva31749尋找出該菌株對青霉素的MIC為7.5|ig/disc。見表1表1菌株敏感程度測定金黃色葡萄球菌敏感菌株與耐藥菌株對青霉素敏感性試驗測試表<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注該實驗平行重復3次，取平均值圖1為兒茶素在液體培養條件下與青霉素的協同作用；圖2為兒茶素與青霉素協同作用下的抑菌率。具體實施例方式實施例1抗金黃色葡萄球菌活性研究試藥兒茶素，青霉素G(哈爾濱制藥六廠)，PenicillinServa31749(Germanyservacom丄td)菌種金黃色葡萄球菌(26112-5)青霉素敏感菌株；金黃色葡萄球菌(CMCC26003對青霉素G，苯唑青霉素，頭孢唑啉，氟哌酸耐藥)培養基營養瓊脂培養基(中國科學院上海昆蟲科技開發公司康樂培養基廠生產)紙片擴散法對植物帽蕊木的分離產物兒茶素進行抗菌活性篩選。初篩后發現，本發明化合物兒茶素對金黃色葡萄球菌敏感菌株沒有活性，但對其耐藥菌株有活性。在此基礎上，本發明又進行了復篩，結果見表2。表2化合物對金黃色葡萄球菌耐藥菌株的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注該實驗平行重復3次，取平均值D為抑菌圈直徑由表2可知，該發明化合物對耐藥菌株有抑制活性，且MIC為300pg/disc(MIC以培養基上完全無菌生長的試藥最高稀釋度作為該藥的最低抑菌濃度)。實施例2本實施例為兒茶素在協同抑制耐藥金黃色葡萄球菌方面的應用協同作用試驗抗生素的聯合使用以及增效劑在臨床上的廣泛使用，使協同作用理論日益完善。根據抗生素合并后的抗菌活性，有顯著的差異決定于合并用藥中每個抗生素的組分，對聯合使用后的抗生素效果進行評判當合并用藥后的抗菌活性高于其組分抗菌活性總和時，則產生協同作用。將兒茶素與青霉素(Serva31749)按重量比例為1:1;2:1;3:1的比例混合，尋找最優配比。結果見表3。表3化合物與青霉素協同作用最優配比的篩選NoRatioCon1/51/101/201/401/80l細1/3201/6401/1280M21(|ig)1:1612122.461.3530.6815.347.673.831.920.96-D(mm;)2118181614121199M21(ng)2:1362.772.5436.2718.149.074.532.271.130.57-D(mm)25151515151513138M2l(ng)3:1483.696.2748.3624.1812.096.053.02---D(mm)1818141412119注3次試驗均值；D:抑菌圈直徑；Con:原始濃度，即未稀釋前的濃度，單位Ug/disc;-:無菌生長；Ratio:化合物與青霉素配比；M21:化合物兒茶素由表3可以看出，Ma與青霉素有協同作用，且其最優配比是2:1。實施例3本實施例為兒茶素與青霉素聯合使用時在抗耐藥金黃色葡萄球菌方面的應用。協同作用下對菌株的抑制率將兒茶素與青霉素以2:l的最佳比例混合，用甲醇配成4pg/ml的溶液，按濃度梯度加入接種菌株CMCC26003的10ml培養基試管中，置于搖床上，28°C150次/min的條件下分別培養0，2，4，6，……24小時取出，分別置于冰箱內統一測定。同時做不加試藥的空白對照和不加試藥與接種菌株的空白對照，分別培養12小時和24小時，將待測定的培養試管，取600pl于EP管中，離心機10000r/min處理，取上清液200^1，作為空白對照，各取200pl分別加入菌體培養液于96孔板，MolecularDevicesSpectralMax190比色儀器上，測定OD600(光密度)。利用細菌懸液與渾濁度成正比的關系，用以表示該菌株在本實驗條件下的相對生長量。并可根據公式計算百分抑制率1%，公式見下P/o-100。/。(V腿—Vmaxb)/V匪,(注1%為百分抑制率；V腿為樣品OD600，V腿b為樣品空白OD600,Vmaxl為陰性對照組OD600。)以OD600為縱坐標，以實驗藥物的濃度微克/毫升為橫坐標，對每次試驗的結果在坐標上找出相應的點，聯結這些點得到兩條曲線，此為附圖l。在根據上述公式計算出百分抑制率，以1%為縱坐標，以實驗藥物濃度微克/毫升為橫坐標，作出柱狀圖，此為附圖2。由附圖l可以看出，在培養12小時后(A曲線)，96)ig/ml濃度下的試藥對菌株抑制作用相當明顯；24小時后(B曲線)，抑制效果明顯降低；由附圖2可以看出，12小時與24小時所產生的抑制率相似，在濃度96pg/ml下，抑制率分別為84.42%和84%。實施例4本實施例為兒茶素的體內試驗(1)材料儀器試藥本發明化合物M21(兒茶素)，青霉素G(哈爾濱制藥六廠)動物昆明小鼠，空腹體重1822g，雌雄各半(由河南省醫學動物實驗中心提供)菌株金黃色葡萄球菌(26112-5)青霉素敏感菌株；金黃色葡萄球菌(CMCC26003對青霉素G，苯唑青霉素，頭孢唑啉，氟哌酸耐藥)儀器LRH-150恒溫培養箱(上海一恒科技有限公司)，電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)(2)兒茶素對金黃色葡萄球菌感染小鼠死亡的保護作用將兒茶素與青霉素以最佳配比2:1混合，作為試藥。金黃色葡萄球菌(CMCC26003)原菌液，離心，沉淀以5%酵母液稀釋至所需濃度(最小致死量MLD)，制備成感染菌液供小鼠腹腔注射用。8取昆明小鼠75只，空腹稱重，隨機分為5組，每組15只，即生理鹽水組(A組)、青霉素陽性對照組(B組)、化合物與青霉素配比物的低、中、高劑量組(Q、C2、C3組)。實驗日晨每只鼠均腹腔注入100%MLD感染菌液0.5ml，感染后即刻和6h分別對每只小鼠腹腔注射受試藥物，觀察各組小鼠死亡情況。結果見表4。表4化合物與青霉素G2:1協同作用下對感染CMCC26003小鼠的影響(n=15)組別動物數(只)劑量(mg/kg)死亡數存活數死亡保護率/%PA組一132一_B組1501061.5PO.01Cl組15100833.3P>0.05C2組151506950P<0.05C3組1520041166.7PO.01對感染動物的保護率(％)=(空白死亡率-給藥組死亡率)/空白組死亡率由表4可見，化合物與青霉素協同作用下對感染金黃色葡萄球菌耐藥菌株的小鼠具保護作用，150和200mg/kg劑量組對感染小鼠的死亡保護率分別為50%、66.7%，與生理鹽水組比較具有顯著性差異。最后所應說明的是以上實施例僅用以說明，而非限制本發明的技術方案，盡管參照上述實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解依然可以對本發明進行修改或者等同替換，而不脫離本發明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應涵蓋在本發明的權利要求范圍當中。權利要求1、化合物兒茶素在抗耐藥菌株方面的應用。2、根據權利要求l所述的化合物兒茶素在抗耐藥菌株方面的應用，其特征在于所述的化合物兒茶素與青霉素聯合使用時在抗耐藥金黃色葡萄球菌方面的應用。3、根據權利要求l所述的化合物兒茶素在抗耐藥菌株方面的應用，其特征在于所述的化合物兒茶素在協同抑制耐藥金黃色葡萄球菌方面的應用。4、根據權利要求2或3所述的化合物兒茶素在抗耐藥菌株方面的應用，其特征在于所述的兒茶素與青霉素的重量比為(l一3):1。5、根據權利要求4所述的化合物兒茶素在抗耐藥菌株方面的應用，其特征在于兒茶素與青霉素的重量比優選為2:1。全文摘要本發明公開了一種化合物兒茶素在抗耐藥菌株方面的應用以及該化合物兒茶素在協同抑制耐藥金黃色葡萄球菌方面的應用，同時還涉及了該化合物兒茶素與青霉素聯合使用時在抗耐藥金黃色葡萄球菌方面的應用。本發明所涉及的化合物兒茶素對金黃色葡萄球菌耐藥菌株具有抑制活性，與青霉素混合進行協同作用試驗中，證明本發明的化合物兒茶素具有協同抑制耐藥金黃色葡萄球菌菌株活性，且其穩定性優于β-內酰胺酶抑制劑克拉維酸鉀。體內試驗也表明兒茶素與青霉素在協同作用下對耐藥金黃色葡萄球菌菌株具有抑制活性。文檔編號A61K31/353GK101590034SQ200810049870公開日2009年12月2日申請日期2008年5月26日優先權日2008年5月26日發明者姬志強,宋艷麗,康文藝,王金梅申請人:河南大學