專利名稱：：大白栓菌的人工培養方法及用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種大白栓菌的人工培養方法，本發明還涉及大白栓菌在制備增強免疫力功能的藥物、制備抗腫瘤的藥物、制備促生長的藥物中的應用。技術背景大白栓菌rrawW^/fl^朋a(Berk.)Pat是一種多孔菌目多孔菌科栓菌屬的大型真菌，生于闊葉樹木材上。在亞洲各國廣為分布有，但國內外對大白栓菌的研究極少，特別是在人工純化、培養以及用大白栓菌或其提取物在制備增強免疫力功能的藥物、抗腫瘤的藥物、促生長的藥物中的應用未見詳細報道。
發明內容本發明的目的是提供一種大白栓菌的人工純化、培養的方法，本發明的另一個目是提供大白栓菌在制備增強免疫力功能的藥物、制備抗腫瘤的藥物、制備促生長的藥物中的應用。本發明的目的是這樣實現的1、一種大白栓菌的人工培養方法，其特征在于菌種的純化a、培養基配制先將梨木屑用水加熱提取得梨木汁，將玉米粉、石膏和白糖以按35g:2g:lg混勻，然后加入梨木汁700ral，即每700ml梨木汁中混合有玉米粉35g、石膏2g和白糖lg;再加入物料重量2%瓊脂,攪拌均勻后加熱至沸，0.1-0.15MPa蒸汽高壓滅菌30min;b、平板的制作及接種培養皿各趁熱倒入培養基，冷卻后即得平板，于無菌操作臺上進行接種，將野生大白栓菌菌絲放到75%酒精中沖洗，然后剪碎放入裝有無菌水的小三角瓶中，充分搖勻制成孢子懸浮液后涂布到平板上；C、菌體培養置28。C恒溫培養箱中培養120h，培養皿中分別長出了2—4個菌落，通過電子顯微鏡鏡檢，確定了大白栓菌；d、菌種的斜面保藏向玻璃試管中趁熱倒入培養基，包扎平放，冷卻后即成斜面；c步驟中培養皿中的各個菌落于無菌操作臺上分別接種到試管中，28。C恒溫培養72h，挑選上述生長良好的試管斜面菌種于冰箱中冷凍保藏；固體培養基培養e、固體培養基的制備以重量份計梨木屑40-70，玉米粉10-40，石膏1-3和白糖l-3混合制固體培養基，將經過純化的大白栓菌置于培養基內于28°C恒溫培養箱中培養7天。2、根據權利要求l所述的大白栓菌的人工培養方法，其特征在于固體培養基中各組分以重量份計為梨木屑70，玉米粉35，石膏2和白糖1。3、一種大白栓菌的人工培養方法，其特征在于菌種的純化a、培養基配制先將梨木屑用水加熱提取得梨木汁，將玉米粉、石膏和白糖以按35g:2g:lg混勻，然后加入梨木汁700ml，即每700ml梨木汁中混合有玉米粉35g、石膏2g和白糖lg;再加入物料重量2%瓊脂,攪拌均勻后加熱至沸，0.1-0.15MPa蒸汽高壓滅菌30min;b、平板的制作及接種培養皿各趁熱倒入培養基，冷卻后即得平板，于無菌操作臺上進行接種，將菌絲放到75%酒精中沖洗，然后剪碎放入裝有無菌水的小三角瓶中，充分搖勻制成孢子懸浮液后涂布到平板上；c、菌體培養置28'C恒溫培養箱中培養120h，培養皿中分別長出了2—4個菌落，通過電子顯微鏡鏡檢，確定了大白栓菌；d、菌種的斜面保藏向玻璃試管中趁熱倒入培養基，包扎平放，冷卻后即成斜面；c步驟中培養皿中的各個菌落于無菌操作臺上分別接種到試管中，28。C恒溫培養72h，挑選上述生長良好的試管斜面菌種于冰箱中冷凍保藏；液體培養基培養e、液體培養其的制備將梨木屑70g水煮1.5h后過得到的梨木汁；將得到的梨木汗與濾玉米粉35g，石膏2g和白糖lg和混合并加自來水稀釋至700ml，梨木汁用量為5g/100ml，用玻棒攪拌均勻加熱至沸，最后用0.1-0.15MPa蒸汽高壓滅菌30min得到液體培養基；f、三角瓶裝入適量培養基滅菌后，于無菌操作臺上接種，28'C恒溫培養10d天得到大白栓菌。大白栓菌在制備增強免疫力功能的藥物中的應用。大白栓菌在制備抗腫瘤的藥物中的應用。大白栓菌在制備伺料添加劑中的應用。本發明提供的大白栓菌的人工培養方法，通過固體培養基和液體培養基得到了大白栓菌，可實現大白栓菌大規模人工培養；以大白栓菌或其提取物為主的藥物具有較好的提高免疫力、促進生長的功效，并具有抗腫瘤作用。圖1是本發明中大白栓菌粉末特征圖。圖中l.營養菌絲2.骨架菌絲，3.纏繞菌絲，4.生殖菌絲，5.擔孢子具體實施方式通過本發明提供的制備方法得到的大白栓菌保藏于中國典型培養物保藏中心，地址湖北省武漢市武漢大學內，郵編430072,保藏日期2008年1月31日，保藏編號CCTCCNO:M208019，提供請求的培養物名稱大白栓菌rrawe^y/ac""e"。人工培養的大白栓菌的顯微特征人工培養大白栓菌，取不同生長時期的菌絲體水裝片，顯微鏡下觀察菌絲形態。子實體成熟后，取子實體粉末過80目篩，分別用水、稀甘油、水合氯醛透化裝片，顯微鏡下觀察粉末特征。營養菌絲纖細，直滑，可見橫膈膜及分枝。常交織成白色的絨絮狀菌絲體。直徑3-10ym。生殖菌絲近透明，薄壁，有或無鎖狀聯合，直徑7-13um。纏繞菌絲無色，厚壁，狹窄，多分枝，不發達，在菌肉內插入其他菌絲之間。直徑4-15um。骨架菌絲近無色或淡黃色，厚壁，細胞腔狹窄或實心，不分枝，組成一個堅硬的子實體骨架。直徑ll-34"m。擔孢子類圓形至近橢圓形，半透明，薄壁，平滑，直徑8-27iim。電子顯微鏡下可見孢子表面有眾多皺紋及凹陷。大白栓菌主要含有糖類和三萜類化合物，3-氫化松苓酸B是大白栓菌的主要成分。其結構式如下283-氫化松苳酸B本發明的制備方法一、用固體培養基培養大白栓菌菌種的純化a、培養基配制先將梨木屑用水加熱提取得梨木汁，將玉米粉、石膏和白糖以按35g:2g:lg混勻，然后加入梨木汁700ml，即每700ml梨木汁中混合有玉米粉35g、石膏2g和白糖lg;再加入物料重量2%瓊脂，攪拌均勻后加熱至沸，0.1-0.15MPa蒸汽高壓滅菌30min;b、平板的制作及接種培養皿各趁熱倒入培養基，冷卻后即得平板，于無菌操作臺上進行接種，將野生大白栓菌菌絲放到75%酒精中沖洗，然后剪碎放入裝有無菌水的小三角瓶中，充分搖勻制成孢子懸浮液后涂布到平板上；c、菌體培養置28'C恒溫培養箱中培養120h，培養皿中分別長出了2—4個菌落，通過電子顯微鏡鏡檢，確定了大白栓菌；d、菌種的斜面保藏向玻璃試管中趁熱倒入培養基，包扎平放，冷卻后即成斜面；c步驟中培養皿中的各個菌落于無菌操作臺上分別接種到試管中，28'C恒溫培養72h，挑選上述生長良好的試管斜面菌種于冰箱中冷凍保藏；固體培養基培養e、固體培養基的制備以重量份計梨木屑40-70，玉米粉10-40，石膏1-3和白糖l-3混合制固體培養基，將經過純化的大白栓菌置于培養基內于28°C恒溫培養箱中培養7天。固體培養基中各組分中優選配比為梨木屑70，玉米粉35，石膏2和白糖1。二、以液體培養基培養大白栓菌菌種的純化a、培養基配制先將梨木屑用水加熱提取得梨木汁，將玉米粉、石膏和白糖以按35g:2g:lg混勻，然后加入梨木汁700ml，即每700ml梨木汁中混合有玉米粉35g、石膏2g和白糖lg;再加入物料重量2%瓊脂，攪拌均勻后加熱至沸，0.1-0.15MPa蒸汽高壓滅菌30min;b、平板的制作及接種培養皿各趁熱倒入培養基，冷卻后即得平板，于無菌操作臺上進行接種，將菌絲放到75%酒精中沖洗，然后剪碎放入裝有無菌水的小三角瓶中，充分搖勻制成孢子懸浮液后涂布到平板上；c、菌體培養置28。C恒溫培養箱中培養120h，培養皿中分別長出了2—4個菌落，通過電子顯微鏡鏡檢，確定了大白栓菌；d、菌種的斜面保藏向玻璃試管中趁熱倒入培養基，包扎平放，冷卻后即成斜面；c步驟中培養皿中的各個菌落于無菌操作臺上分別接種到試管中，28。C恒溫培養72h，挑選上述生長良好的試管斜面菌種于冰箱中冷凍保藏；液體培養基培養e、液體培養其的制備將梨木屑70g水煮1.5h后過得到的梨木汁；將得到的梨木汗與濾玉米粉35g，石膏2g和白糖lg和混合并加自來水稀釋至700ral，梨木汁用量為5g/100ml，用玻棒攪拌均勻加熱至沸，最后用0.1-0.15MPa蒸汽高壓滅菌30min得到液體培養基；f、三角瓶裝入適量培養基滅菌后，于無菌操作臺上接種，28。C恒溫培養10d天得到大白栓菌。大白栓菌在制備增強免疫力功能的藥物中的應用1實驗材料1.1實驗動物昆明種封閉群小鼠雌雄各半，體重20i2g，SPF級。購自湖北省實驗動物中心。1.1主要藥品與試劑大白栓菌95%乙醇提取物、大白栓水提物，人參水煎液環磷酰胺(CTX)粉針劑，200mg/支，滅菌生理鹽水稀釋至一定濃度，分裝后避光常溫保存(用于造模型)；人參水煎液用作陽性對照藥。1.3主要儀器自動平衡離心機，電子天平，中藥粉碎機，超聲波清洗機2方法與結果2.1藥物制備大白栓菌95%醇提物、大白栓水提物，配制為大白栓菌醇提物高劑量1.8g/kg，大白栓菌醇提物低劑量0.9g/kg;大白栓菌水提物高劑量0.9g/kg，大白栓菌水提物低劑量0.45g/kg;人參水煎兩次濃縮致生藥1.5g/kg。4'C冰箱保存。環磷酰胺(CTX)在超凈工作臺避光條件下，無菌生理鹽水稀釋至4mg/ml后分裝于EP管并用錫紙遮蓋保存于4"C冰箱。2.2免疫力抑制模型動物于l、2、4、6天腹腔注射環磷酰胺4mg/ml造模。2.3動物分組及給藥昆明小鼠分籠飼養，自由攝食與飲水。造模后隨機分組，自造模之日起，給藥組每只小鼠按體重灌胃給藥，連續6天；同時給予模型組，空白對照組灌胃等體積生理鹽水。2.4測定結果于末次給藥半小時后，摘眼球取血，分離血清，檢測血清免疫力球蛋白。取胸腺、脾臟，用電子天平稱重。計算胸腺指數(胸腺指數=胸腺重量(mg)/小鼠體重(g))，脾臟指數(脾臟指數=脾臟重量(mg)/小鼠體重(g))。結果見表1表l大白栓菌提取物對免疫力抑制小鼠胸、脾臟指數及免疫力球蛋白的影響(X±sn=10)組別胸腺指數脾臟指數IgAIgGIgM空白2.101±0.632*4.042±0.724*0.245±0.108*1.150±0.028**0.419±0.127*模型0.578±0.1362.637±0.7840.177±0.0700.257'±0.0400.337±0.077人參0.634±0.2043.162±0.9420.176±0.1080.468±0.1550.653±0.124**醇提高劑量0.763±0.2302.760±0.7860.211±0.070*0.503±0.052*0.764±0.121**醇提低劑量0.888±0.3442.670±0.5560.166±0.0770.482±0.1500.650±0.020**水提高劑量0.739±0.2363.042±0.3220.251±0.018*0.806±0.201**0.911±0.031"水提低劑量0.763±0.4552.549±0.4790.194±00660.554±0.140*0.909±0.073**舉與模型組p〈0.05"與模型組p《0.01結果顯示大白栓菌醇提取物和水提物對環磷酰胺所致的免疫力功能低下小鼠的免疫力功能有增強作用，能顯著提高免疫力球蛋白的含量。大白栓菌在制備抗腫瘤的藥物中的應用1.1實驗材料1.l實驗動物昆明種封閉群小鼠雌雄各半，體重20士2g，SPF級。購自湖北省實驗動物中心。1.2主要藥品與試劑大白栓菌95%醇提物，大白栓菌水提物，絲裂霉素1.3主要儀器自動平衡離心機；電子天平；中藥粉碎機2方法與結果2.1藥物制備大白栓菌95%乙醇提取物高劑量1.8g/kg;大白栓菌95%乙醇提取物低劑量0.9g/kg。大白栓菌水提物高劑量0.9g/kg，大白栓菌水提物低劑量0.45g/kg。保存于4'C冰箱。絲裂霉素在超凈工作臺避光條件下，無菌生理鹽水稀釋絲裂霉素針劑至9mg/ml后分裝于EP管并用錫紙遮蓋保存于4'C冰箱。2.2動物模型的制作H22實體瘤模型小鼠肉瘤H22細胞株昆明小鼠體內連續傳代，57天傳代一次，傳代3次后，抽取接種7天左右種鼠腹水，生理鹽水洗漆離心(800rpmX5min)3次，調整細胞濃度至5.0X10'個/ml，臺盼藍拒染法檢測存活率》95%，用無菌注射器抽取腹水瘤細胞懸液注射至昆明小鼠右前腋皮下，每鼠0.2ml。全程嚴格無菌操作，30分鐘內完成。2.3動物分組及給藥昆明小鼠分籠飼養，自由攝食與飲水。造模后隨機分組，于造模后第二天起，按體重灌胃給藥，連續10天；絲裂霉素組每只小鼠按90rag/kg體重腹腔注射給藥；同時給予模型組，空白對照組灌胃等體積生理鹽水。于末次給藥后半小時，完整剝離腫瘤組織，取胸腺、脾臟，電子天平上稱重。計算抑瘤率，胸腺指數，脾臟指數。結果見表2。表2大白栓菌提取物對小鼠肉瘤fe生長的影響(x±sn=10)組別胸腺指數脾臟指數瘤重抑瘤率空白1.3298±0.631**3.336±0.497//模型0.558±0.3303.160±0.3880.916±0.296/絲裂霉素0.745±0.3272.0109±0.468*0.464±0.255**49.3醇提高劑量0.895±0.5143.612±0.6970.465±0.256**49.2醇提低劑量0.842±0.3683.3613±0.8630.639±0.157**30.2水提高劑量0.936±0.4464.41肚0.422*0.644±0.168**29.7水提低劑量0.736±0.5473.320±0.6190.737±0.228*19.5f與模型組p〈0.05"與模型組p〈0.012.4體外抗癌實驗將處于對數生長期的白血病細胞(HL6。)、宮頸癌細胞(Hela)、鼻咽癌細胞(CNE)，調整細胞濃度為1.0Xl(f個/ml。將細胞懸液接種于96孔培養板，每孔加200yl。實驗組分別加入不同濃度的大白栓醇提物，另設陰性對照組和空白調零組，陽性對照組為絲裂霉素，每組處理均設6個復孔，再培養48小時。加入5mg/mL的MTT液(15微u1/孔)，繼續培養4小時。取出96孔培養板于1000轉/分離心8分鐘，吸出孔內培養液后，在微型振蕩儀中振蕩10分鐘，使結晶物溶解，再加DMSO100ul將培養板置于微孔板振蕩器上振蕩10分鐘。用全自動酶聯免疫檢測儀于492nm處測定吸光度(0D)值，計算抑制率(％)。結果見表3、4。表3大白栓菌對肝癌細胞(H印G-2)的抑制作用結果(5土S;『6)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表4大白栓菌對宮頸癌細胞(Hela)的抑制作用結果(5土S;n=6)組別OD值抑制率<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表5大白栓菌對鼻咽癌細胞(CNE)的抑制作用結果(5土S;n二6)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>結果顯示大白栓菌醇提取物和水提物對H22實體瘤，大白栓菌醇提取物對白血病細胞(HU)、宮頸癌細胞(Hda)、鼻咽癌細胞(CNE)等生長具有抑制作用。大白栓菌在制備飼料添加劑中的應用大白栓菌作為飼料添加劑的制備取米糠以重量份計，加入l/2菌種，20%玉米芯，1%的石膏，28。C培養7-10天，攪拌均勻后再培養7-10天。長滿大白栓菌絲體后混勻8(TC干燥后作飼料添加劑用。選擇體重20kg左右的杜洛克豬，隨機分成試驗組和對照組每組10頭。預試期7天，群飼，充分詞喂(4次/天)，自由飲水。試驗期40d，試驗結束時，測定增重及飼料轉化率。對照組飼料配方為豆粕25%，麩皮15%，魚粉3%，玉米50%。沸石粉2%，食鹽0.3%o、磷酸氫鈣1.5%，賴氮酸0.2%，蛋氨酸0.05%、維生素及礦物質預混劑0.7%，試驗組1飼料配方為豆粕20%，飼料添加劑10%，麩皮10%，魚粉3%，玉米50%。沸石粉2%，食鹽0.3%o、磷酸氫鈣1.5%，賴氨酸0.2%,蛋氨酸0.05%、維生素及礦物質預混劑0.7%。試驗組2飼料配方為豆粕15%,飼料添加劑20%，麩皮5%，魚粉3%，玉米50%。沸石粉2%，食鹽0.3%o、磷酸氫鈣L5%，賴氨酸0.2%,蛋氨酸0.05%、維生素及礦物質預混劑0.7%。表6大白栓菌作為伺料添加劑對仔豬生長的影響組別始重末重試驗組20.86±1,3550,37±2.56對照組120.52±1.2357.82±3,14*對照組220.71±1.2463.79±3.53**與試驗組比*卩<0.05，**P<0.05。實驗表明大白栓菌作為詞料添加劑對仔豬生長具有明顯的促進作用。大白栓菌作為飼料添加劑對雞生長的影響選用20日齡肉雞隨機分為3組，每組20只，對照組使用六合藥業提供的全價顆粒飼料，試驗組在全價飼料中分別加入10%，20%飼料添加劑(制備方法同上述豬飼料)制備成顆粒，雞群網上平養，常規消毒，防疫。各組飼養管理條件完個相同，飼養30天稱重。表7大白栓菌作為飼料添加劑對雞生長的影響組別始重末重試驗組0.306±0.0131.46±0.037對照組10.298±0.0121,74±0.047*對照組2OJOl土O.Oll1.98±0.049**與試驗組比》P〈0.05，**P<0.05。實驗表明大白栓菌作為飼料添加劑對雞生長具有明顯的促進作用。權利要求1、一種大白栓菌的人工培養方法，其特征在于菌種的純化a、培養基配制先將梨木屑用水加熱提取得梨木汁，將玉米粉、石膏和白糖以按35g∶2g∶1g混勻，然后加入梨木汁700ml，即每700ml梨木汁中混合有玉米粉35g、石膏2g和白糖1g；再加入物料重量2％瓊脂，攪拌均勻后加熱至沸，0.1-0.15MPa蒸汽高壓滅菌30min；b、平板的制作及接種培養皿各趁熱倒入培養基，冷卻后即得平板，于無菌操作臺上進行接種，將野生大白栓菌菌絲放到75％酒精中沖洗，然后剪碎放入裝有無菌水的小三角瓶中，充分搖勻制成孢子懸浮液后涂布到平板上；c、菌體培養置28℃恒溫培養箱中培養120h，培養皿中分別長出了2-4個菌落，通過電子顯微鏡鏡檢，確定了大白栓菌；d、菌種的斜面保藏向玻璃試管中趁熱倒入培養基，包扎平放，冷卻后即成斜面；c步驟中培養皿中的各個菌落于無菌操作臺上分別接種到試管中，28℃恒溫培養72h，挑選上述生長良好的試管斜面菌種于冰箱中冷凍保藏；固體培養基培養e、固體培養基的制備以重量份計梨木屑40-70，玉米粉10-40，石膏1-3和白糖1-3混合制固體培養基，將經過純化的大白栓菌置于培養基內于28℃恒溫培養箱中培養7天。2、根據權利要求l所述的大白栓菌的人工培養方法，其特征在于固體培養基中各組分以重量份計為..梨木屑70，玉米粉35，石膏2和白糖1。3、一種大白栓菌的人工培養方法，其特征在于菌種的純化a、培養基配制先將梨木屑用水加熱提取得梨木汁，將玉米粉、石膏和白糖以按35g:2g:lg混勻，然后加入梨木汁700ml，即每700nil梨木汁中混合有玉米粉35g、石膏2g和白糖lg;再加入物料重量2%瓊脂，攪拌均勻后加熱至沸，0.1-0.15MPa蒸汽高壓滅菌30min;b、平板的制作及接種培養皿各趁熱倒入培養基，冷卻后即得平板，于無菌操作臺上進行接種，將菌絲放到75%酒精中沖洗，然后剪碎放入裝有無菌水的小三角瓶中，充分搖勻制成孢子懸浮液后涂布到平板上；C、菌體培養置28'C恒溫培養箱中培養120h，培養皿中分別長出了2—4個菌落，通過電子顯微鏡鏡檢，確定了大白栓菌；d、菌種的斜面保藏向玻璃試管中趁熱倒入培養基，包扎平放，冷卻后即成斜面；c步驟中培養皿中的各個菌落于無菌操作臺上分別接種到試管中，28'C恒溫培養72h，挑選上述生長良好的試管斜面菌種于冰箱中冷凍保藏；液體培養基培養e、液體培養其的制備將梨木屑70g水煮1.5h后過得到的梨木汁；將得到的梨木汗與濾玉米粉35g，石膏2g和白糖lg和混合并加自來水稀釋至700ml，梨木汁用量為5g/100ml，用玻棒攪拌均勻加熱至沸，最后用0.1-0.15MPa蒸汽高壓滅菌30min得到液體培養基；f、三角瓶裝入適量培養基滅菌后，于無菌操作臺上接種，28C恒溫培養10d天得到大白栓菌。4、大白栓菌在制備增強免疫力功能的藥物中的應用。5、大白栓菌在制備抗腫瘤的藥物中的應用。6、大白栓菌在制備飼料添加劑中的應用。全文摘要一種大白栓菌的人工培養方法及用途，本發明通過菌種的純化，分別以固體培養基和液體培養基對大白栓菌進行培養，得到人工培養大白栓菌。本發明可實現大白栓菌大規模人工培養；以大白栓菌或其提取物為主的藥物具有較好的提高免疫力、并具有抗的腫瘤的作用，通過本發明得到的大白栓菌也可作為一種添加劑加入飼料中畜禽生長，增強其免疫力，減少疾病。文檔編號A61P35/00GK101245318SQ200810046969公開日2008年8月20日申請日期2008年2月28日優先權日2008年2月28日發明者敏危,張亞雄,段朝鴻,汪鋆植,王星琴,凡程,高鄧,坤鄒,郭智勇,龍代凱申請人:三峽大學