專利名稱：：抗家畜亞洲Ⅰ型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗及其制備方法
技術領域：
：本發(fā)明屬免疫學及遺傳工程
技術領域：
，具體涉及一種抗AsiaI(亞洲I型)型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗及其制備方法。
背景技術：
：國際獸醫(yī)局將口蹄疫列為A類傳染病之首。口蹄疫是當今世界上最為嚴重的家畜傳染病，主要危害豬、牛、羊等偶蹄類動物。多年來，口蹄疫在世界范圍內大規(guī)模爆發(fā)和流行，給畜牧業(yè)造成巨大經濟損失。近幾年，Asial型口蹄疫在我國呈蔓延之勢，在全國多個省市爆發(fā)，對畜牧業(yè)和畜產品出口造成很大的經濟損失，日益引起人們的關注。因此，構建有效的亞洲I型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗對我國的畜牧業(yè)及國家經濟發(fā)展有著重大的意義。預防接種疫苗是控制該病毒的主要手段之一。在各種預防口蹄疫的疫苗中，基因工程疫苗由于安全性好，易于保存，效果穩(wěn)定等優(yōu)點具有廣闊的應用前景。與口蹄疫病毒(foot一and—mouthdiseasevirus,FMDV)免疫原性密切相關的是其外殼蛋白VP1基因，該蛋白中含有口蹄疫病毒主要抗原表位。在已有的口蹄疫基因工程多肽疫苗的研究中，主要是研究抗0型、A型的口蹄疫病毒，以VP1蛋白中的幾個不同抗原決定簇位點結合,構建重組多肽疫苗。發(fā)明人前期的實驗研究中，進行AsiaI型口蹄疫病毒抗原表位篩選，篩選到在AsiaI型口蹄疫病毒VPl結構蛋白中，存在一個誘導中和抗體的抗原表位位點，即為VP1蛋白的133-163氨基酸片段，同時篩選到在VP2結構蛋白中存在一個抗原表位位點，即VP2蛋白1-33氨基酸片段，該肽段能明顯增強動物產生中和抗體的能力。在此基礎上，構建一種有效的對抗Asial型口蹄疫病毒的基因工程多肽疫苗，組建成VP1(133-163)、VP2(l-33)抗原表位的重復串聯結構，將該口蹄疫病毒主要抗原表位重復串聯結構與一大分子載體蛋白相連，構成一融合蛋白，能有效地誘發(fā)動物產生免疫應答。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于提供一種能有效的抗家畜Asial型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗及其制備方法。本發(fā)明已篩選到AsiaI型口蹄疫病毒VP1蛋白133-163位氨基酸多肽(SEQIDNO.1,記為VP1(133-163))，VP2蛋白1-33位氨基酸多肽(SEQIDN0.2,記為VP2(1-33))，均為抗原表位，將這兩種抗原組成重復的串聯結構，實施例中為4VP1(133-163)-VP2(卜33)-VP1(133-163)重復串聯結構(SEQIDNO.3)，用化學合成的方法合成該不同抗原表位組成的重復串聯結構的DNA序列片段。并將該口蹄疫病毒主要抗原表位重復串聯結構與一大分子載體蛋白相連，構成一融合蛋白，即得本發(fā)明的抗亞洲I型口蹄疫病毒的基因工程多肽疫苗。該多肽疫苗中兩種抗原多肽的重復串聯結構可采用如下結構的任一種方式X—Y—X、X_X—Y、X-Y-Y、Y-X-Y、Y—X—X或者Y-Y-X，其中，同一個串聯結構的"X"、"Y"肽段來源于Asial型口蹄疫病毒VPl或VP2蛋白序列，并且"X"肽段代表AsiaI型口蹄疫病毒VP1蛋白133-163位氨基酸肽段(即VP1(133-163)),"Y"肽段代表VP2蛋白1-33位氨基酸肽段(即VP2(1-63))，"X"、"Y"肽段還可以分別是VP1(133-163)、VP2(1-33))前后浮動適當個數的氨基酸殘基，如VP1蛋白130-170、VP2蛋白1-40位氨基酸肽段；"X"、"Y"肽段中的氨基酸可因預防不同的口蹄疫病毒變異毒株的需要進行調整，即"X"肽段可以是VP1(133-163)中有1一6個氨基酸可被置換，"Y"肽段可以是VP2(1-33)中有1一5個氨基酸可被置換。上述VP1(133-163)、VP2(l-33)的重復串聯基因片段與載體蛋白基因相連，融合蛋白的載體蛋白可以是家畜IgG重鏈恒定區(qū)氨基酸序列的同源序列，長度可以是250-329個氨基酸；或者是P—半乳糖苷酶從第一個氨基酸開始共250-590個氨基酸肽段的同源序列。本發(fā)明分別以家畜igG重鏈恒定區(qū)蛋白或e—半乳糖苷酶蛋白為載體蛋白，將合成的VP1(133-163)、VP2(l-33)抗原多肽重復串聯結構的DNA序列片段分別插入到上述兩種載體蛋白基因的C端，構建兩種不同的重組蛋白表達質粒，分別為pTl和pT2?？笰siaI型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗的制備方法，可以是用化學合成方法分別合成編碼Asial口蹄疫病毒VP1蛋白133-163位氨基酸序列的核苷酸序列，VP2蛋白1_33位氨基酸的核苷酸序列，然后用基因工程克隆方法將這些基因以多拷貝的方式串聯，組建成AsiaI型口蹄疫病毒抗原多肽基因長片段。口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗的制備方法，包括基因制備、重組及融合蛋白的表達，其特征在于具體步驟如下(1)用化學合成方法合成編碼由VP1(133-163)、VP2(l-33)組成的重復串聯結構DNA序列，將此基因與igG重鏈恒定區(qū)基因或者e—半乳糖苷酶基因c末端相連，構成融合基因；(2)將上述融合基因插入表達質粒載體，并轉入大腸桿菌菌株；(3)將陽性菌株在3(TC到37'C之間誘導培養(yǎng)8到25小時，然后收集菌體；(4)將菌體破碎收集表達的融合蛋白乳化，配制成本發(fā)明多肽疫苗。該抗Asial型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗，也可以是融合基因插入到表達載體以后，轉入表達宿主中表達出融合蛋白，用HiTrap親和層析柱純化回收融合蛋白，再乳化配制成本發(fā)明有關的多肽疫苗。免疫佐劑可以是任何一種有效的免疫佐劑。包括礦物質佐劑和油類佐劑、微生物類佐劑或細胞因子佐劑等。將本發(fā)明制備的有效抗家畜AsiaI型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗，經免疫豚鼠后檢測到豚鼠產生較高的中和抗體，另外經過動物攻毒實驗表明該疫苗在豚鼠上的抗病毒保護效果達到100%，免疫豚鼠能全部抵抗劑量為100ID5Asial型口蹄疫病毒得攻擊。本發(fā)明的抗AsiaI型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗，同樣適用于動物如牛、羊、豬以及偶蹄類經濟動物或野生動物的免疫接種。具體實施例方式實施例1:以牛IgG重鏈恒定區(qū)肽段為載體蛋白構建口蹄疫AsiaI型口蹄疫多肽疫苗pTl。合成AsiaI口蹄疫病毒VPl基因中編碼133-163位氨基酸肽段的DNA序列，VP2基因中編碼1-33位氨基酸肽段的DNA序列，將其組建成VPl(133-163)-VP2(1-33)-VPl(133-163)結構(SEQIDNO.3),其中VPl蛋白133-163氨基酸抗原片段重復一次，中間連接VP2蛋白1-33氨基酸片段。各個抗原表位間以含有幾個氨基酸的接頭連接，氨基酸接頭分別為PG和QFELEFMVPSR。通過化學合成的方法合成得到VP1(133-163)-VP2(1-33)-VPl(133-163)串聯目的基因片段。通過限制性內切酶酶切目的基因片段，將該片段與表達載體連接，構建以牛的IgG重鏈恒定區(qū)氨基酸為載體蛋白的重組表達質粒(記為SEQIDNO.4)。在T4ligase等作用下發(fā)生連接反應。獲得的重組DNA，轉化大腸桿菌BL21菌株的感受態(tài)細胞，培養(yǎng)于氨芐青霉素平板中，37'C倒置過夜。隨意挑取轉化子，分別以酶切鑒定，DNA測序分析鑒定轉化子，從而獲得陽性克隆。序列分析證明插入的基因序列與設計相符。將此克隆命名為pTl。將pTl以含50ug/ml卡拉霉素的LB培養(yǎng)液為發(fā)酵液，37'C攪拌速度6000rpui通氣培養(yǎng)2小時，加入IPTG誘導IO小時后收集菌體。再將菌體懸浮于破壁液中，用95W功率的超聲儀破壁5分鐘，觀察超聲效果可重復超聲幾次，超聲后5000rpm離心20分鐘收集包涵體。用含8mol/L尿素的變性液處理包涵體，待包涵體完全變性后經過HiTrap親和純化柱純化包涵體，收集目的蛋白，將純化后的包涵體與ISA206油配成油乳劑，即可獲得一種新型的AsiaI型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗。實施例2:以e—半乳糖苷酶從第一個氨基酸開始共280個氨基酸肽段為載體蛋白構建AsiaI型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗pT2。實施例1中，已合成得到VP1(133-163)-VP2(1-33)-VP1(133-163)抗原表位的重復串聯結構的DNA片段，通過PCR特異性擴增反應改變該DNA片段兩末端的酶切位點，PCR反應產物回收后經限制性內切酶酶切后與e—半乳糖苷酶基因的C末端相連接。構建AsiaI型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗表達載體pT2。以實施例1中同樣的方法，用pT2制備得AsiaI型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗。用上述基因工程疫苗免疫豚鼠后中和抗體的消長分別用基因工程苗pTl和pT2免疫豚鼠，結果見表1和表2。表1中的結果是基因工程苗pTl和pT2經過2次免疫豚鼠6只后，豚鼠的中和抗體消長結果，A組為兩次免疫IgG為載體蛋白苗，B組為兩次免疫pTl苗，C組為兩次免疫e一半乳糖苷酶空白載體蛋白，D組為兩次免疫pT2苗，免疫劑量為各組分蛋白單次免疫500第一次免疫14天后進行第二次免疫，第二次免疫21天后心臟采血測定豚鼠血清中和抗體效價；CK組為陰性對照組，不免疫任何蛋白；從表l的結果中說明，用pTl和pT2這兩種苗去免疫豚鼠后，中和抗體均見明顯的增長，而以igG為載體蛋白的pTi比以e_半乳糖苷酶作為載體蛋白的pT2所引起的中和抗體水平要稍高。表2中的結果是比較基因工程苗pTl和pT2分別經過一次免疫和二次免疫豚鼠后，豚鼠的中和抗體消長結果。實驗分別設定免疫豚鼠組為1-5組及ck組，l組為兩次免疫IgG為載體蛋白苗，2組為兩次免疫pTl苗，3組為兩次免疫e—半乳糖苷酶空白載體蛋白，4組為兩次免疫pT2苗，免疫劑量為各組分蛋白單次免疫500ug，第一次免疫14天后進行第二次免疫，第二次免疫21天后心臟采血測定豚鼠血清中和抗體效價；5組為一次免疫pTl苗，免疫劑量為單次免疫lmg目的蛋白，1次免疫28天后采血測定中和抗體水平。ck組為不免疫任何疫苗空白對照組。從表2的結果中說明，基因工程苗pTl苗分別經過l次免疫和2次免疫豚鼠后，中和抗體均有明顯的增長。表1.二次免疫豚鼠中和抗體效價測定每組各只豚鼠血清中和抗體效價<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2.比較一次免疫和二次免疫豚鼠產生中和抗體水平<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表1和表2的說明血清中和抗體效價測定采用微量血清中和試驗，將滅活的血清樣品用MEM培基進行連續(xù)倍比稀釋(1/2-1/512)，每個稀釋度接4個孔，每孔50yl，并按同樣方法設立陰陽血清對照。每個孔中加入100TCID5。/50yl的口蹄疫病毒。充分混勻后，37。C中和lh。加入分散好的細胞懸液體100y1(每孔細胞數量在l(T數量級)微量板加蓋，平放于37t:，5%0)2培養(yǎng)箱內靜置培養(yǎng)3天。培養(yǎng)終止時，甩去微量培養(yǎng)板內液體，每孔加入50ul細胞染色液，染色lh,自來水沖洗。當細胞對照、病毒對照，標準陰陽性血清對照都成立時，進行結果的判讀。采用Reedmuench法計算中和抗體效價，效價采用PDs。表示，即半數細胞保護時血清稀釋度。用上述基因工程疫苗免疫豚鼠后AsiaI型口蹄疫病毒攻毒結果為了證明兩種基因工程苗對豚鼠的保護效果，分別用lmg的抗原融合蛋白免疫豚鼠。用兩種疫苗免疫豚鼠，免疫組號與表2的免疫豚鼠組號相同(具體見表2)。一定時間后以Asial口蹄疫病毒進行攻擊，攻毒劑量為100ID5。，結果顯示該兩種不同疫苗經一次免疫豚鼠后，28天后攻毒，豚鼠的抗病毒保護效果有70%，而經兩次免疫豚鼠后21天攻毒，豚鼠的抗病毒保護效果均有100%。說明這兩種疫苗在豚鼠上都有很好的抗病毒保護結果，是一種有效的抗AsiaI型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗。(見表3)表3融合蛋白對豚鼠的免疫保護效果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>序列表SEQIDNO.1KTTYGETTARRG薩ALAQRLSGRLPTSFNYSEQIDNO.2DKKTEETTLLEDRILTTRNGHTTSTTQSSVGVTSEQIDNO.3SRKTTYGETTARRG腿ALAQRLSGRLPTS麗SEQIDNO.4IgG-VPl(133-163)-VP2(1-33)-VPl(133-163)SEQIDNO.5LacZ-VPl(133-163)_VP2(1-33)-VPl(133-163)權利要求1、一種抗家畜亞洲I型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗，其特征在于以亞洲I型口蹄疫病毒VP1蛋白中133-163位氨基酸，VP2蛋白中1-33位氨基酸為抗原表位，前者記為VP1(133-163)，序列為SEQIDNO1，前者記為VP2(1-33)，序列為SEQIDNO2，將這兩個抗原表位組成重復串聯結構，化學合成該重復串聯結構的基因片段；將該重復串聯結構的基因片段與載體蛋白基因相連，該載體蛋白是家畜自體IgG或細菌的β—半乳糖苷酶，口蹄疫病毒重復串聯抗原表位基因連接在載體蛋白基因的C末端，構成一融合蛋白；其中所述抗原表位的重復串聯結構形式為X—Y—X、X—X—Y、X-Y-Y、Y-X-Y、Y—X—X或者Y-Y-X，同一個串聯結構的“X”、“Y”肽段分別來源于AsiaI型口蹄疫病毒VP1和VP2蛋白序列，并且“X”肽段代表VP1(133-163)，“Y”肽段代表VP2(1-33)；或者“X”、“Y”肽段分別是VP1(133-163)和VP2(1-33)中前后浮動適當個數的氨基酸殘基的肽段。2、根據權利要求1所述的多肽疫苗，其特征在于融合蛋白的載體蛋白是家畜IgG重鏈恒定區(qū)氨基酸序列的同源序列，長度是250-329個氨基酸；或者是e—半乳糖苷酶從第一個氨基酸開始共250-590個氨基酸肽段的同源序列。3、根據權利要求1所述的多肽疫苗，其特征在于"X"、"Y"肽段中的氨基酸進行如下調整"X"肽段中有1一6個氨基酸被置換，"Y"肽段中有1一5個氨基酸被置換。4、根據權利要求1所述的多肽疫苗，其特征在于所述抗原表位的重復串聯結構形式為VP1(133-163)-VP2(1-33)-VP1(133-163)，該重復串聯片段基因序列編碼的重復抗原多肽氨基酸序列為SEQIDNO.3,載體蛋白為動物自體IgG重鏈恒定區(qū)蛋白，其構建的串聯基因結構序列為SEQIDNO.4;載體蛋白為e—半乳糖苷酶，其構建的串聯基因結構序列為SEQIDNO.5。5、根據權利要求1中所述的多肽疫苗，其特征在于所用免疫佐劑為礦物質佐劑、油類佐劑、微生物類佐劑或細胞因子佐劑。6、如權利要求1所述的亞洲I型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗的制備方法，其特征在于是用化學合成方法或PCR體外特異性擴增方法合成編碼亞洲I口蹄疫病毒VP1蛋白133-163位氨基酸序列的核苷酸序列，VP2蛋白l-33位氨基酸的核苷酸序列，然后用基因工程克隆方法將這些基因以多拷貝的方式串聯，組建成亞洲I型口蹄疫病毒抗原多肽基因長片段。7、根據權利要求6所述的亞洲I型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗的制備方法，包括基因制備、重組及融合蛋白的表達，其特征在于具體步驟如下(1)用化學合成方法合成編碼由VP1(133-163)和VP2(1-33)組成的重復串聯結構DNA序列，將此基因與IgG重鏈恒定區(qū)基因或者e—半乳糖苷酶基因相連，構成融合基因；(2)將上述融合基因插入表達質粒載體，并轉入大腸桿菌菌株；(3)將陽性菌株在3(TC到37'C之間培養(yǎng)8到25小時，然后收集菌體；(4)將菌體破碎收集表達的融合蛋白；(5)將融合蛋白純化，并乳化配制成本發(fā)明有關的多肽疫苗。全文摘要本發(fā)明屬于免疫學與遺傳工程
技術領域：
，具體為一種抗家畜亞洲I型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗及其制備方法。本疫苗利用亞洲I型口蹄疫病毒VP1蛋白中133-163位氨基酸這一B細胞表位，以及VP2蛋白中1-33位氨基酸的T細胞表位，用化學方法合成編碼這兩種抗原表位基因組成的重復串聯基因序列，將這一串聯重復基因序列分別插入牛IgG重鏈恒定區(qū)基因的C末端，或β-半乳糖苷酶基因的C末端構建兩種表達載體，經發(fā)酵后分別表達兩種融合蛋白，超聲并純化后制備成疫苗，檢測該兩種疫苗的安全性及對動物的免疫保護作用，經動物攻毒實驗證明兩種疫苗對豚鼠有良好的保護效果，免疫豚鼠100％抵抗100ID<sub>50</sub>劑量的AsiaI型口蹄疫病毒攻擊。文檔編號A61K47/48GK101422606SQ20081003656公開日2009年5月6日申請日期2008年4月24日優(yōu)先權日2008年4月24日發(fā)明者嚴維耀,劉明秋,王加龍,鄭兆鑫,姬韓申請人:復旦大學