專利名稱：：一種Gd-DTPA-Polylysine-McAb聯結體、制備方法及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種聯結體，尤其是涉及一種Gd-DTPA-Polylysine-McAb(抗VEGF)聯結體、制備方法及其應用。
背景技術：
：目前，臨床上常規使用的磁共振對比劑Gd-DTPA(由二乙三胺五乙酸(DTPA)與Gd"的螯合物)，屬于細胞外間隙對比劑，沒有特異性。其增強原理是含禮(Gd+3)對比劑進入動脈血管隨血流被分配至富于血供的組織結構中，并很快回流至靜脈內，最后通過腎臟排泄。釓劑能引起分布區域組織的Tl時間明顯縮短，導致在T1WI上信號強度顯著升高，即所謂強化。Gd-DTPA廣泛應用于全身多個系統的MR成像，譬如，對乳腺癌等腫瘤性病變的診斷和鑒別i貪斷。Gd-DTPA是非特異性對比劑，用于磁共振成像時，其成像有效時間窗很窄，沒有靶向性，只受組織或病灶血供程度影響，血供豐富者強化顯著，反之，則強化較輕。在疾病診斷中有一定價值，但是，采用非特異性對比劑的磁共振成像不能準確鑒別病變的良、惡性，不能針對某一基因或細胞結構成像，無靶向性，難以達到早期診斷疾病的目的。近年來，MRI因其具有很高的軟組織分辨率和良好的空間分辨率等優點，MR耙向成像已逐漸成為分子影像學的研究熱點。單克隆抗體磁共振對比劑是將單克隆抗體與MR順磁性或超順磁性粒子結合,從而使新形成的螯合劑既具有靶向功能即特異性，又具備常M^MR對比劑的作用，其不僅能與某些器官、組織及病變特異性地結合，而且能改變它們的MR信號強度，從而達到靶向"^斷的目的。分子生物學和分子病理學研究揭示，血管內皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)在乳&泉良惡性肺瘤中的表達存在顯著的差異，即乳腺癌中VEGF呈顯著的高表達，而且是乳腺癌生物學行為的重要判斷指標，如VEGF表達與否及其表達程度與乳腺癌遠處轉移率及患者預后呈顯著相關性，即VEGF高表達者，遠處轉移率高且預后差。
發明內容本發明的目的在于(1)提供一種Gd-DTPA-Polylysine-McAb(抗VEGF)聯結體；(2)提供Gd-DTPA-Polylysine-McAb(抗VEGF)聯結體制備方法；(3)提供Gd-DTPA-Polylysine-McAb(抗VEGF)聯結體應用。本發明的目的是通過以下技術方法來實現的將抗VEGF(血管內皮生長因子)單克隆抗體與二乙三胺五乙酸4L(Gd-DTPA)螯合成一種用于MR分子成像的特異性對比劑Gd-DTPA-polylysine-McAb(抗VEGF單克隆抗體)，對荷人乳腺癌棵鼠模型進行此MR對比劑的在體分子成像實驗，評價其顯像效果，獲得成功。本發明的技術方案如下一種Gd-DTPA-Polylysine-McAb(抗VEGF)聯結體，通過下列方法制得a、DTPA雙酸酐的合成將二乙三胺五酸、乙酸肝和吡咬混合；b、DTPA-Polylysine制備將多聚賴氨酸溶解于NaH2C03/Na2HC(M￡沖液中，攪拌，并加入步驟a得到的DTPA雙酸酐溶液中；c、Gd-DTPA-Polylysine制備將Gd203加入到HC1中,加熱、溶解，蒸發多余的HC1即得到GdCl3的溶液，將GdCl3溶液加入到步驟b得到的DTPA-Polylysine溶液中；d、抗VEGF單克隆抗體與Gd-DTPA-Polylysine的聯結將抗VEGF單克隆抗體溶解NaH2C03/Na2HC(M爰沖液中，然后加入碳化二亞胺和步驟c得到的Gd-DTPA-Polylysine,攪拌反應，層析，收集抗VEGF單克隆抗體與Gd-DTPA-Polylysine的聯合體。在步驟b中還包括取出多聚賴氨酸、NaH2C03/Na2HC03.DTPA雙酸酐混合溶液，用平衡透析法除去游離的DTPA,并轉換到PH=5，0.2mlNaAc/HAc緩沖液。在步驟d中選用SephdroseCL-4B層析柱層析。一種Gd-DTPA-Polylysine-McAb聯結體的制備方法包括以下步驟a、DTPA雙酸酐的合成將二乙三胺五酸、乙酸酐和吡咬混合；b、DTPA-Polylysine制備將多聚賴氨酸溶解于NaH2C03/Na2HC(Mi沖液中，攪拌，并加入步驟a得到的DTPA雙酸酐溶液中c、Gd-DTPA-Polylysine制備將Gd203加入到HC1中,加熱、溶解，蒸發多余的HC1即得到GdCh的溶液，將GdCl3溶液加入到步驟b得到的DTPA-Polylysine溶液中；d、抗VEGF單克隆抗體與Gd-DTPA-Polylysine的聯結將抗VEGF單克隆抗體溶解于NaH2C03/Na2HC03緩沖液中，然后加入碳化二亞胺和步驟c得到的Gd-DTPA-Polylysine,攪拌反應，層析，收集抗VEGF單克隆抗體與Gd-DTPA-Polylysine的聯合體。在步驟b中還包括取出多聚賴氨酸、NaH2C03/Na2HC03.DTPA雙酸酐混合溶液，用平衡透析法除去游離的DTPA,并轉換到PH=5，0.2mlNaAc/HAc緩沖液。在步驟d中選用SepharoseCL-4B層析柱層析。一種Gd-DTPA-Polylysine-McAb(抗VEGF)聯結體應用，該:眹結體作為對比劑在磁共振成像中應用。所述的磁共振成像是在體顯示腫瘤內VEGF基因表達、VEGF介導的瘤內血管生成的特異性、靶向性磁共振成像。本發明所公開一種Gd-DTPA-Polylysine-McAb(抗VEGF)聯結體、制備方法及其應用，其優點表現在(l)本發明采用單克隆抗體與釓劑的螫合制備出新型對比劑，可借助于抗體的靶向性進行特異性成像，本發明采用血管內皮生長因子(VEGF)的單抗，因此，可對VEGF及其介導的血管生成進行成像。(2)早期的研究大多將單克隆抗體與Gd-DTPA直接共扼聯結，這樣直接聯結一方面連接的Gd-DTPA量少，增強效果不理想；另一方面，由于DTPA環酐為雙環結構，容易在雙鏈或多個蛋白分子之間形成二聚體或多聚體，故隨著Gd-DTPA連接數目的增加，DTPA-抗體復合物的免疫活性下降，對比劑的靶向效果不佳。在我們的發明中，我們采用Polylysine(多聚賴氨酸)放大系統取得了良好的擴增效果。我們利用大分子多聚體能與多個Gd-DTPA聯結的技術，先制成Gd-DTPA標記的大分子多聚體，然后再把多個Gd-DTPA標記的大分子多聚體聯結到VEGF單克隆抗體上，這樣在一個抗體上可:f關結28~36個Gd-DTPA，而不降低抗體的免疫活性。用ELISA法測定Gd-DTPA-Polylysine-McAb(抗VEGF單克隆抗體)的免疫活性，結果得到與VEGF的抗體接近的結合情況。在體外的檢測中顯示Gd-DTPA-Polylysine-McAb(抗VEGF單克隆抗體)的純度高，在醋酸纖維薄膜電泳圖譜中具有單一斑點。總之，本發明借助于Polylysine(多聚賴氨酸)的擴增效應和抗體的,異性，此對比劑Gd-DTPA-Polylysine-McAb(抗VEGF單克隆抗體)具有免疫活性高、耙向性強、Gd"含量多等優點，可行在體腫瘤MR靶向成像研究，顯示VEGF表達的情況，以及VEGF介導的腫瘤血管生成情況，為富于VEGF基因的惡性肺瘤如乳腺癌等的早期診斷、良惡性腫瘤的鑒別診斷提供一條嶄新的途徑，為抗血管生成治療提高新的評價手段。圖1:Gd-DTPA-Polylysine的高壓液相(HPLC)色傳圖。圖2:Gd-DTPA-Polylysine的SDS-PAGE電泳圖語。圖3:Gd-DTPA-Polylysine-McAb(抗VEGF單克隆抗體)聯結體的醋酸纖維薄膜電泳圖語。圖4:ELISA方法測定免疫聯結體的免疫活性結果。圖5:注入對比劑前及注入對比劑Gd-DTPA-polylysine-McAb(抗VEGF單克隆抗體)后各時間掃描點MR圖像。其中圖中A:注入對比劑前。圖中B:注入對比劑后5min,腫瘤組織未見強化，肝臟組織強化，肝內血管顯示。圖中C:注入對比劑后lh，腫瘤邊緣開始強化，大血管顯示清楚。圖中D:注入對比劑后lh，肝臟組織明顯強化，肝內血管顯示清楚。圖中E，F:注入對比劑后2h,腫瘤組織、肝臟組織普遍強化。圖中G，H:注入對比劑后3h，腫瘤組織、肝臟組織強化4交2h時均勾。圖中I,J:注入對比劑后4h,肺瘤強化達高峰，肝臟強化不明顯。圖中K:腫瘤持續強化，逐漸向中心彌散。圖中L，M:注入對比劑后12h,腫瘤中心強化明顯。圖中N,0:注入對比劑后24h，腫瘤中心強化較12h時減弱。圖6:肝臟組織、腫瘤組織和M^肉組織增強率比^^。圖7:腫瘤大體及病理圖。其中圖中A:腫瘤剖面圖，腫瘤組織魚肉樣。圖中B:HE染色(40x10倍)，示腫瘤組織癌細胞大小形態不一，核分裂相多見，見壞死肺瘤細胞。圖中C:VEGF免疫組化(40x10倍)，腫瘤細胞漿見椋色顆粒示VEGF染色陽性。圖8:注入對比劑前及注入對比劑Gd-DTPA-polylysine-McAb(抗VEGF單克隆抗體)后各時間點掃描MR圖像。其中圖中A:注入對比劑前。圖中B:注入對比劑后5min，腫瘤組織未見強化。圖中C:注入對比劑后lh，肺瘤邊緣開始強化。圖中D:注入對比劑后2h，肺瘤組織普遍強化。圖中E,F，注入對比劑后3h，4h，腫瘤組織普遍強化。圖中G:注入對比劑后8h,腫瘤持續強化，逐漸向中心彌散。圖中H:注入對比劑后12h,腫瘤中心強化明顯。圖中I:注入對比劑后24h，腫瘤中心強化4交12h時減弱。圖9:注入對比劑前及注入對比劑Gd-DTPA后各時間點掃描MR圖像。其中圖中A:注入對比劑前。圖中B，C:注入對比劑后5min,腫瘤組織明顯強化。圖中D,E:注入對比劑后lh，胂瘤組織強化仍明顯，^f旦4交5min時稍弱。圖中F，G，H:注入對比劑后2h，3h,腫瘤組織強化程度隨時間延長而減弱。圖中H:注入對比劑后4h，腫瘤強化不明顯，對比劑基本退出。圖中I:注入對比劑后8h,對比劑完全退出。圖10:實驗組與對照組信號曲線圖。圖11:腫瘤大體圖片及病理圖片。其中圖中A:乳腺癌棵鼠模型(MDA-MB-231細胞)。圖中B:肺瘤剖面，腫瘤組織呈魚肉狀。圖中C:HE染色(每標尺代表25um)，腫瘤細胞大小不一，分化差。圖中D:VEGF免疫組化(40x10)，腫瘤細胞漿內見棕色顆粒示染色陽性。具體實施方式下面結合實施例對本發明作進一步描述。實施例1一種Gd-DTPA-Polylysine-McAb(抗VEGF)聯結體制備I、DTPA雙酸酐(CaDTPA)的合成10g二乙三胺五酸(DTPA)懸浮于30ml乙酸酐和15ml吡啶的混合液中，于60。C攪拌反應6h,冷卻后加適量乙醇過濾，乙醚洗滌，干燥，得白色固體DTPA雙酸酐(CaDTPA)粗品。重結晶后，測定產品熔點是178180。C(分解)，在紅外光譜圖中具有1845、1785cn^環狀酸酐的00伸縮振動雙峰。II、DTPA-Polylysine制備稱Polylysine(多聚賴氨酸)10mg，溶解于3ml的0.2mol/LNaH2C03/化2^03緩沖液(PH=9.6)中，在冰浴中不停地攪拌并加入DTPA雙酸酐(CaDTPA)溶液，室溫下再攪拌反應16小時后結束反應。取出反應混合液，用平衡透析法除去游離的DTPA，并轉換到PH=5,0.2mlNaAc/HAc緩沖液。取出透析袋中溶液，減壓濃縮后置于4。C冰箱保存，用于下步反應試驗。同時，取樣0.5ml，并用S印hadex柱(1x25cm)，0.Olmol/LPBS,PH7.4緩沖液洗脫分析，可見僅一個大分子洗脫峰出現。III、Gd-DTPA-Polylysine制備:0(1203加人到0.lmol/LHC1中，加熱至60°C，持續反應10min，完全溶解后，蒸發多余的HC1即得到GdC"的溶液。加入制備的GdCl3溶液到經過減壓濃縮的DTPA-Polylysine溶液中，然后在室溫下再攪拌反應24~30小時后，用平衡透析法除去游離的Gd,并轉該溶液的PH體系。采用高頻電感藕合等離子體發射光語法(ICP-AES)測量樣品Gd含量，計算所得到的Gd-DTPA-Polylysine每分子含30~42個Gd離子。IV、抗VEGF單克隆抗體與Gd-DTPA-Polylysine的聯結由于聚賴氨酸還有胺基存在，把抗VEGF單克隆抗體溶解在0.lmol/LNaH2C03/Na2HC03緩沖液(PH=9.6)，然后加入碳化二亞胺(ECD)和Gd-DTPA-Polylysine,在室溫下再攪拌反應24~30小時后，用S印haroseCL-4B層析柱(1x25cm)除去沒聯結上的抗體，收集抗VEGF單克隆抗體與Gd-DTPA-Polylysine的聯合體，冷凍濃縮，經0.22um除菌過濾后^L存。V、對比劑的鑒定(1)Gd含量測定采用高頻電感藕合等離子體發射光譜法(ICP-AES)測量Gd含量，Gd-DTPA-Polylysine的Gd含量是3042個(n=7)。用于動物試驗的每分子抗VEGF單克隆抗體與Gd-DTPA-Polylysine聯結體的Gd含量是28~36個Gd-DTPA。(2)、大分子的純度測定使用高效液相色譜法(HPLC)、SDS電泳法、醋酸纖維薄膜電泳和分子篩S印haroseCL-4B柱層析證明經過純化的大分子的純度。(a)HPLC:使用高壓液相色譜(HPLC)分析法測定Gd-DTPA-Polylysine的純度，柱子為TSK3000(Bio-Rad)分子篩凝膠分析柱，用0.Olmol/L,PH=7.4的PBS液洗脫，淋洗速度為lml/min，測量走紙速度為2mm/min,每次進樣2~5ul，以波長入=280nm處4全測出洗脫液。高壓液相色譜(HPLC)分析標記樣品的高壓液相色譜圖示，出現一個大峰(>95%),較小分子量峰<2%(圖1)。(b)SDS-PAGE電泳:將20ul兩倍體積的樣品緩沖^i。到等體積的樣品和標準溶液小試管中，在沸水中放置3-5min后，加到電泳樣品槽中進行SDS-PAGE電泳，恒壓100V到溴酚藍指示劑接近前沿(大約4h)，取出固定后，用考馬斯亮藍R-25染色，再用7%乙酸脫色。Gd-DTPA-Polylysine的SDS-PAGE電泳圖語示具有單一斑點(圖2)。(c)醋酸纖維薄膜電泳把樣品點在醋酸纖維薄膜上(4cm處作為原點)，然后放在盛有PH8.6巴比妥一巴比妥鈉緩沖液中進行電泳40min，恒流電流，5mA/每條，取出薄膜，用考馬斯亮藍R-25染色，再用7%乙酸脫色。Gd-DTPA-Polylysine-McAb(抗VEGF單克隆抗體)聯結體的醋酸纖維薄膜電泳圖鐠，結果表明Gd-DTPA-Polylysine-McAb(抗VEGF單克隆抗體)聯結體具有單一斑點(圖3)。(3)、免疫活性測定用ELISA法測定Gd-DTPA-Polylysine聯結抗體的免疫活性，結果得到與VEGF的抗體接近的結合情況，而(Gd-DTPA)26-VEGF抗體的免疫活性下降很多(圖4)。具體方法lug/100ulVEGF包被，包被液用0.Olmol/LPBS(PH=7.4)，4。C過夜放置，甩干。用1。/。BSA在37。C30min封閉后，200ul/孔洗滌液洗滌、甩干三次。100ng/ml為第一孔，以后5倍稀釋不同量的VEGF的抗體或相應Gd-DTPA聯結體進行免疫結合反應，37。C;改置lh。取出，200ul/孔洗滌液洗滌、甩干五次。加入70ul/孔經稀釋過的羊抗鼠IgG-HRPO(1:2000)，37。C恒溫下》文置60分鐘后，用200ul/孔洗滌液洗滌、甩干六次。加入100ul/孔ABTS顯色液，室溫下發色20min或更長時間。使用波長入=414nm情況下，測量每孔的吸收系數A值。實施例2Gd-DTPA-po1y1ysine-McAb(抗VEGF單克隆抗體)在荷人乳腺癌棵鼠才莫型活體MR分子成像中的實驗材料與方法1、動物沖莫型的制備本實驗采用細胞懸液法原位接種人乳腺癌細胞抹MDA-MB-231制作乳腺癌棵小鼠模型。棵小鼠及乳腺癌MDA-MB-231細胞抹購自中國科學院腫瘤研究所。12只棵鼠均為雌性5周齡無特定病原體級(SPF)BALB/c棵小鼠，質量為1820g。乳腺癌MDA-MB-231細胞采用Leibovitz，sL-15medimu(GIBCO公司)加入15%胎牛血清(GIBCO公司)培養，待細胞至活細胞比率〉95%時按1x1070.2ml/只接種于棵鼠右側第二對乳腺的脂肪墊內。接種后每周至少三次觀察瘤體生長情況，2周后接種部位形成肉眼可見的腫瘤，4~5周后肺瘤直徑達到1.5~2.Ocm,此時進^亍MRI成^f象研究。2、MRI掃描技術及圖像分析采用GESignaAdvantage1.5TMR儀，使用3英寸表面線圈。每只荷瘤棵鼠均先平掃后增強，平掃采用橫斷位和冠狀位SET1WI(TR/TE400/13ms)、FSET2WI(TR/TE.3000/84.3ms);增強掃描選用^黃斷位、冠狀位和矢狀位SET1WI(TR/TE400/13ms)。層厚/間距1/0.5mm(橫斷位)；2/lmm(冠狀位)，2/l腿(矢狀位)，矩陣為256x256，FOV8cmx8cm。增強時釆用特異性MRI對比劑Gd-DTPA-polylysine-McAb(抗VEGF單克隆抗體)，注射劑量均為O.2ml/只，經棵鼠尾靜脈注射。注射對比劑后掃描時間為5min、lh、2h、3h、4h、8h、12h及24h。麻醉方法為2.5%戊巴比妥鈉溶液O.05ml,腹腔注射。觀察瘤體組織、肝臟組織、瘤體鄰近前腿部肌肉組織增強表現，并測量信號強度。具體測量方法為分別于注入對比劑前后在冠狀位上測量瘤體組織、肝臟組織、瘤體鄰近前腿部肌肉組織的信號強度，并計算增強率，計算方法為(S增強-S平掃)/S平掃x100%。。測量時分別選擇5個大小一致的感興趣區(regionofinterest,R0I)，興趣面積、不小于4mm2，盡量取強化明顯且均勻的區域，取其平均值。3、病理檢查實驗結束后處死實驗棵鼠，取腫瘤組織做病理檢查，行常規組織病理檢查和免疫組化檢查。VEGF免疫組化所用I抗為鼠抗人單克隆抗體，II抗為羊抗鼠單克隆抗體。具體方法①脫水，切片，脫蠟如常。②PBS洗3次各5分鐘。滴加3訓202,室溫靜置20分鐘，蒸餾水洗3次各3分鐘。④檸檬酸緩沖液蒸煮20分鐘，冷卻后在PH7.2,0.01mlPBS中洗3次各5分鐘。⑤滴加正常山羊血清封閉液，室溫靜置20分鐘，甩去多余液體。滴力口1抗(l:40稀釋)，4。C過夜。⑦0.01PBS洗3次，每次5分鐘。⑧直接滴加II抗，37。C靜置20分鐘。0.01PBS洗3次，每次5分鐘。⑩DAB顯色5-10分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度。水洗，蘇木精復染，水洗，封片。以胞漿內含有棕黃或棕褐色顆粒為VEGF陽性。4、統計學處理注射對比劑后各時間點的信號強度值與注射前分別進行配對t檢驗，統計軟件為SPSS13.0,以戶<0.05為顯著性標準。結果1、強化表現腫瘤病灶在5min時強化不明顯，lh后腫瘤邊緣開始強化，強化程度較低，隨著時間的延長強化逐漸明顯，且由外周向中心彌散，至4h時強化達到高峰。觀察至24h肺瘤仍有輕度強化。棵鼠肝臟組織在5min時即開始強化，2h時強化達高峰，隨后隨著時間的延長對比劑逐漸退出，至4h強化不明顯。肌肉組織始終未見明顯強化。主動脈等大血管于5min時即可見明顯強化，持續約2h。(見圖5)2、腫瘤組織、肝臟組織、肌肉組織各延遲掃描時間點信號結果及增強率比較。(1)肺瘤組織各掃描時間點信號值及增強率(見表l)。將注入對比劑后各掃描點的信號值逐個與注入對比劑前的信號值進行配對t檢驗，統計結果顯示，注入對比劑后5min時瘤體組織的信號值與注入對比劑前沒有顯著差異(t=1.16,P=0.182),注入對比劑后lh至24h瘤體組織的信號強度與注入對比劑前有顯著差異(P<0.05),即腫瘤呈顯著強化表現。腫瘤強化的高峰出現在注射對比劑后4小時，最大強化率58.17%。表1:肺瘤組織各時間點信號強度及增強率信號值t值/值增強率%平掃643.88±24.64---5min664.39±27.141.610.1823.18lh825.84±37.146.950扁28.262h969.92±28.0467.65<0.00150.643h981.99±59.919.850扁52.514h1018.46±62.7716.77<0扁58.178h845.6±49.7414.41<0細31.3312h844.08±71.149.260.00131.0924h798.15±11.6111.93<0扁23.96(2)肝臟組織各掃描時間點信號強度及增強率(見表2)。將注入對比劑后各掃描點的信號值逐個與注入對比劑前的信號值進行配對t檢驗，統計結果顯示，注入對比劑后5min,lh，2h，3h瘤體組織的信號值與注入對比劑前的信號值有顯著差異(P〈0.05);注入對比劑4h后各時間點瘤體組織的信號值與注入對比劑前沒有顯著差異(P〉0.05)。胂瘤強化的高峰出現在2h,最大強化率56.33%。表2:肝臟組織各時間點信號值及增強率信號值t值/>值增強率%平掃713.53±19.09---5min1004.398±25.4318.35<0扁40.76lh1066.21±39.9834.44<0扁49.432h1115.43±25.8321.98<0扁56.333h1094.67±24.0228.47<0週53.424h762.51±42.252.680.0556.868h754.37±30.662.320.0815.7212h743.95±29.851.670.1714.2624h716.91±60.540.130.9060.47(3)肌肉組織各掃描時間點信號強度及增強率(見表3)，注入對比劑前后肌肉組織各掃描時間點信號值比較差異無統計學意義(,〉0.05)。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>(4)腫瘤組織、肝臟組織及肌肉組織各掃描時間點增強率比較(見圖6)3、病理結果常規HE染色示腫瘤細胞雜亂排列，癌細胞大小形態不一，核分裂相多見。VEGF免疫組化腫瘤細胞漿內見椋色顆粒示染色陽性。(見圖7)實施例3Gd-DTPA-polylysine-McAb(抗VEGF單克隆抗體)與Gd-DTPA在乳腺癌棵鼠模型MR分子成像中的對照實驗目前，國內外乳腺癌發病率均呈顯著上升趨勢，我國許多大城市的女性乳腺癌發病率已居婦女惡性腫瘤的首位，且發病年齡有提早的趨向。乳腺癌的診斷主要依賴影像學檢查，包括X線、B超和MRI等，其中高場強MRI動態多期增強掃描的價值最大，其特異性及敏感性均4交高，但是，采用目前應用最廣泛的Gd-DTPA時，乳Ai良、惡性胂瘤的^f茲共振表現有部分相互重疊、交叉。因此，無法做到特異性診斷，這既影響了乳腺癌與良性病變的鑒別，也影響早期乳腺癌的檢出。如何特異性的、早期診斷乳腺癌是臨床最關心的問題之一。本研究將VEGF靶向性MR對比劑Gd-DTPA-polylysine-McAb(抗VEGF單克隆抗體)和常規對比劑Gd-DTPA在乳腺癌(MDA-MB-231細胞抹)棵鼠模型中進行對照研究，評價采用Gd-DTPA-polylysine-McAb(抗VEGF單克隆抗體)進行乳腺癌MR分子成像的可能性，以及這種成像對乳腺癌的診斷作用。材料與方法1、動物模型的制備及實驗動物分組本實驗釆用細胞懸液法原位接種人乳腺癌細胞抹MDA-MB-231制作乳腺癌棵小鼠才莫型，共12只。制作方法同前。隨機將12只已接種人乳腺癌細胞抹的棵鼠分成實驗組和對照組。實驗組注射對比劑Gd-DTPA-polylysine-McAb(抗VEGF單克隆抗體)，對照組注射含相同Gd離子濃度的常規對比劑Gd-DTPA。Gd-DTPA用釓噴酸葡胺注射液(馬根維顯，含釓噴酸二葡胺469mg/ml，Schering廣州)加生理鹽水稀釋而成。對比劑注射劑量均為O.2ml/只，經棵鼠尾靜脈注射。2、MRI掃描技術及圖j象分析采用GESignaAdvantage1.5TMR儀，使用3英寸表面線圏。每只棵鼠均先平掃后增強，平掃采用橫斷位和冠狀位SET1WI(TR/TE400/13ms)、FSET2WI(TR/TE3000/84.3ms);增強掃描選用才黃斷位和冠狀位SET1WI(TR/TE400/13ms)。層厚/間距1/0.5mm(橫斷位)；2/lram(冠狀位)，矩陣為256x256，FOV8cmx8cm。注射對比劑后的掃描時間為5min、lh、2h、3h、4h、8h、12h及24h。麻醉方法為2.5%戊巴比妥鈉溶液O.05ml，腹腔注射。觀察瘤體增強表現，并測量信號強度。體測量方法為分別于注入對比劑前后測量瘤體信號強度(SIt),棵鼠模型腫瘤同側鄰近的前腿部肌肉組織信號強度(SlM),并計算其對比度噪聲比(contrasttonoiseratio,CNR)。計算方法為CNR=(SIT-SIM)/SD噪聲。毎只-寐鼠SIt及SL的測量分別選擇5個大小一致的感興趣區(ROI)，興趣面積不小于4咖2,測量時盡量取強化明顯且均勻的區域，取其平均值。3、病理;險查實驗結束后處死實驗荷瘤棵鼠，取腫瘤組織送病理檢查，分別行常規組織病理學^r查和VEGF免疫組化。具體方法同前。4、統計學處理對實驗組和對照組基線、注射對比劑后各時間測定點的信號強度值、CNR值與注射前分別進行統計分析，統計軟件為SPSS13.0，以戶<0.05為顯著性標準。結果1、強化表現實驗組注入對比劑Gd-DTPA-po1y1ysine-McAb(抗VEGF單克隆抗體)5min后掃描見小鼠血管明顯強化，腫瘤強化不明顯；lh后胂瘤邊緣開始強化，強化程度較低，隨著時間的延長強化逐漸明顯，且由外周向中心彌散，至4h時強化達到高峰。觀察至24h肺瘤仍有輕度強化(見圖8)。對照組注入對比劑Gd-DTPA5min后掃描見肺塊明顯均勻強化，隨著時間的延長強化程度逐漸減弱，于4h后對比劑基本退出(見圖9)。2、基線比較分別測定實驗組和對照組的平掃圖像上瘤體信號強度(SIt)及同側19前肢肌肉組織信號強度(SIm)值，計算CNR值，經兩樣本H企驗比較瘤體與瘤體、肌肉與肌肉之間信號的差異，顯示兩組間差異無統計學意義SIT"=0.841,尸=0.303)、SISQ=0.262，0.199)及CNR值(f=0.713,,=0.285),i兌明兩組基線無明顯差異。3、各延遲時間點掃描結果比較實驗組和對照組棵鼠分別注射不同的對比劑后在8個時間點進行掃描，在冠狀位上分別測定SIt和SIm，并計算CNR值。進行實驗組和對照組組間比較和實驗組、對照組的組內比較。分別采用方差分析(總體方差不齊，先進行秩變換，再進行方差分析)和LSD分析。結果顯示(1)實驗組和對照組組間比較實-驗組和對照組的SlT差異有統計學意義(F=31.348，P<0.001);實一驗組和對照組的SlM差異有統計學意義(F=19.094，P<0.001);實'驗組和對照組CNR差異有統計學意義(F=45.996，P<0.001),說明實—驗組和對照組之間的增強效果有差異。(見圖IO)(2)實驗組組內比較實驗組SIT值在注射對比劑前后有統計學差異(F=419.39，P<0.001),通過兩兩分析后示SIT在注射對比劑后5min時瘤體信號強度的升高與注射對比劑前比較其差異無統計學意義(P=0.301);延遲lh后至24h瘤體信號強度的升高與注射對比劑前比較，差異均有統計學意義(P<0.001)。實驗組SIM值在注射對比劑前后無統計學差異(F=1.371，P=0.209)。實一驗組CNR在注射對比劑前后有統計學差異(F=138.742,P<0.001);兩兩分析顯示在注射對比劑后5min時CNR與注射對比劑前比較其差異無統計學意義(P=0.677);延遲lh后至24hCNR值均有統計學意義(P<0.001)。(具體見表4)由此可見，注入對比劑Gd-DTPA-Po1y1ysine-McAb(抗VEGF單克隆抗體)后，瘤體在1至24h內均達到增強效果，而肌肉組織沒有明顯強化，這不僅表明了Gd-DTPA-Polylysine-McAb(抗VEGF單克隆抗體)對胂瘤的良好強化效果，亦顯示了其靶向功能。表4:實驗組注射對比劑后各時間點掃描結果SITSI固CNRXP值尸值尸值c-645息29.70-647.71±32.45--0.0552±1.01-C+5min654.95±32.400.301652.78±33.070.6450.0387±0.940.677C+lh740.15±31.490.000655.54±33.290.4761.2520±0.740.000C+2h977.60±37.230.000656.67±70.550.4153.6687±0.950細C+3h1014.41±56.010.000652.31±65.330.1594.5241±0.840扁C+4h1016.37±39.13o扁652.31±65.330.6764.9032±1.060扁C+8h843.37±30.520細643.94±26.400.7323.4152±0.710.000C+12h799.20±15.870扁634.71±33.800.2384.0365±0.860扁C+24h791.31±20.360.000638.81±30.810.4192.7024±0.670細注表示實驗組注射對比劑(C+)后各時間點測定值或計算值分別與平掃結果(C-)比較。(3)對照組組內比較對照組SIT注射對比劑前后有統計學差異(F=152.037，P〈0.001);兩兩分才斤示在注射對比劑后5min、lh、2h、3h、4h瘤體信號強度的升高與注射對比劑前比較其差異有統計學意義(P5min，lH，2H,3H,4H〈0.001);延遲8h至24h后瘤體信號強度的升高與注射對比劑前比較差異無統計學意義(P>0.05)。對照組SIM值在注射對比劑前后有統計學差異(F-26.236，P<0.001);兩兩分析示在注射對比劑5min、lh、2h和3h與注射對比劑前信號改變有統計學差異(P5min，1H，2H<0.001，P3H=0.039);延遲4h至24h后對比劑注射前后信號改變無統計學差異(P>0.05)。對照組CNR在注射對比劑前后有統計學差異(F=59.596，P<0.001);兩兩分析示在注射對比劑5min、lh、2h、3h與注射對比劑前信號改變有統計學差異(P5min，lh，2h，3h〈0.001);延遲4h至24h后對比劑注射前后信號改變無統計學差異(P>0.05)。(具體見表5)結合SIT值和CNR值的分析結果，由于CNR值在4h時無統計學差異(P-0.155)，所以我們認為SIT值在4h時的信號改變無意義。綜上所述，注入對比劑Gd口DTPA后5min、lh、2h、3h時瘤體與月幾肉組織均有強化效果，4h后對比劑退出。表5:對照組注射對比劑前后各時間點掃描結果<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>注表示對照組注射對比劑(C+)后各時間點測定值或計算值分別與平掃結果(C-)比較。3、病理結果常規HE染色示肺瘤細胞大小形態不一，核分裂相多見。VEGF免疫組化腫瘤細胞漿內見棕色顆粒示染色陽性。(見圖ll)。權利要求1、一種Gd-DTPA-Polylysine-McAb聯結體，其特征在于通過下列方法制得a、DTPA雙酸酐的合成將二乙三胺五酸、乙酸酐和吡啶混合；b、DTPA-Polylysine制備將多聚賴氨酸溶解于NaH2CO3/Na2HCO3緩沖液中，攪拌，并加入步驟a得到的DTPA雙酸酐溶液中；c、Gd-DTPA-Polylysine制備將Gd2O3加入到HCl中，加熱、溶解，蒸發多余的HCl即得到GdCl3的溶液，將GdCl3溶液加入到步驟b得到的DTPA-Polylysine溶液中；d、抗VEGF單克隆抗體與Gd-DTPA-Polylysine的聯結將抗VEGF單克隆抗體溶解NaH2CO3/Na2HCO3緩沖液中，然后加入碳化二亞胺和步驟c得到的Gd-DTPA-Polylysine，攪拌反應，層析，收集抗VEGF單克隆抗體與Gd-DTPA-Polylysine的聯合體。2、根據權利要求1所述的聯結體，其特征在于在步驟b中還包括取出多聚賴氨酸、NaH2C03/Na2HC03、DTPA雙酸酐混合溶液，用平衡透析法除去游離的DTPA,并轉換到PH-5，0.2mlNaAc/HAc緩沖液。3、根據權利要求1所述的聯結體，其特征在于在步驟d中選用SepharoseCL-4B層析柱層析。4、一種Gd-DTPA-Polylysine-McAb聯結體的制備方法包括以下步驟a、DTPA雙酸酐的合成將二乙三胺五酸、乙酸酐和吡咬混合；b、DTPA-Polylysine制備將多聚賴氨酸溶解于NaH2C03/Na2HC(M爰沖液中，攪拌，并加入步驟a得到的DTPA雙酸酐溶液中；c、Gd-DTPA-Polylysine制備將Gd203加入到HC1中，加熱、溶解，蒸發多余的HCl即得到GdCl3的溶液，將GdCl3溶液加入到步驟b得到的DTPA-Polylysine溶液中；d、抗VEGF單克隆抗體與Gd-DTPA-Polylysine的聯結將抗VEGF單克隆抗體溶解NaH2C03/Na2HC03緩沖液中，然后加入碳化二亞胺和步驟c得到的Gd-DTPA-Polylysine,攪拌反應，層析，收集抗VEGF單克隆抗體與Gd-DTPA-Polylysine的聯合體。5、根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于在步驟b中還包括取出多聚賴氨酸、NaH2C03/Na2HC03,DTPA雙酸酐混合溶液，用平衡透析法除去游離的DTPA，并轉換到PH-5，0.2mlNaAc/HAc緩沖液。6、根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于在步驟d中選用SepharoseCL-4B層析柱層析。7、根據權利要求l-3任一所述的聯結體應用，其特征在于該聯結體作為對比劑在磁共振成像中應用。8、根據權利要求7所述的應用，其特征在于所述的i茲共振成^f象是在體顯示腫瘤內VEGF基因表達、VEGF介導的瘤內血管生成的特異性、靶向性磁共振成像。全文摘要本發明涉及一種聯結體，尤其是涉及一種Gd-DTPA-Polylysine-McAb(抗VEGF)聯結體、制備方法及其應用。本發明的技術方案如下一種Gd-DTPA-Polylysine-McAb(抗VEGF)聯結體(對比劑)，通過下列方法制得a.DTPA雙酸酐的合成；b.DTPA-Polylysine制備；c.Gd-DTPA-Polylysine制備；d.抗VEGF單克隆抗體與Gd-DTPA-Polylysine的聯結。本發明借助于Polylysine(多聚賴氨酸)的擴增效應和單克隆抗體的特異性，此對比劑Gd-DTPA-Polylysine-McAb(抗VEGF單克隆抗體)具有免疫活性高、靶向性強、Gd<sup>3+</sup>含量多等優點。文檔編號A61K49/06GK101564540SQ20081003647公開日2009年10月28日申請日期2008年4月22日優先權日2008年4月22日發明者汪登斌,鐘高仁,陳克敏,英龔申請人:上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院