專利名稱：一種制備脫細胞基質的方法
技術領域：
本發明屬于組織工程領域，具體地說是涉及一種制備脫細胞基質的方法。
技術背景來源于脫細胞基質的各種生物支架材料，在動物實驗的臨床前研究和人種疾病的臨床應 用中，己經取得了成功。通過去除各種組織器官中異種或同種異體細胞，保留其中復雜的結 構和功能蛋白，即可得到相應組織器官的脫細胞基質。不同的脫細胞方法直接影響所得脫細 胞基質的成分和超微結構，最終影響移植后宿主對脫細胞基質的反應。現行脫細胞基質的制備方法主要包括l物理法；2化學法；3酶法。物理法指的是通過冷凍，高壓，超聲波，滲透壓改變等物理方式破壞細胞，其優點在于得到的脫細胞基質沒有其他外加成分的殘留，但這種方法的最大缺點是在破壞細胞的同時也不同程度的破壞了細 胞外基質的超微結構，同時破裂的細胞碎片一定要通過其他方式予以清除，這種清除過程會 進一步破壞細胞外基質的超微結構。化學法包括使用某些酸、堿、表面活性劑等化學方法裂 解細胞。這種方法其優點在于脫細胞過程短，速度快，但這種方法同樣會破壞細胞外基質的 超微結構，并且還會造成某些基質成分(如蛋白多糖)的丟失。酶法主要使用各種蛋白酶(如 胰蛋白酶，中性蛋白酶)核酸酶(核酸外切酶，核酸內切酶)，通過水解細胞蛋白成分和核酸 成分達到破壞細胞的目的。蛋白酶可以有效地去除細胞成分，但由于胰蛋白酶和中性蛋白酶 的作用底物比較廣泛，造成細胞外基質中的結構和功能蛋白大量降解。核酸酶選擇性的降解 核酸，不會造成細胞外基質成分的破壞，但其分子量過大，極易引起免疫反應。在組織工程中良好的支架材料應具有以下技術要求:①良好的生物相容性，自身及其降 解產物對機體無毒性,不引起排斥反應和炎性反應，不致突變、畸變;②材料攜帶具有生物誘導 性的多種細胞生長因子，誘導自體細胞生長繁殖;③支架材料的降解速率與植入脫細胞基質 的細胞形成組織器官的速率相匹配。在支架完成其功能后可被完全吸收或與新生的組織融合; ④可按各組織的特點和缺損情況進行塑形，達到完善修復;⑤具有一定的韌性和可加工性，能 形成三維立體結構，為細胞進行物質代謝提供足夠空間。現有研究表明利用脫細胞基質作為 組織工程的支架材料具有來源廣泛，可降解，有良好的生物相容性的特點，特別是材料可預先 按修復組織大小和厚薄設計，更適于各種組織病變的修復重建。因此，如何獲得具有以上5項技術要求的脫細胞基質成為組織工程亟待解決的重大課題。 發明內容本發明需要解決的技術問題是提供一種制備脫細胞基質的方法，該方法可制備到具有較 好物理學性狀和生物學功能的脫細胞基質。 解決上述技術問題的技術方案如下 一種制備脫細胞基質的方法，包括以下步驟-a. 將待用組織器官預處理；b. 將經過預處理的待用組織器官加入到包含有磷脂酶的溶液中,通過低滲或等滲液 浸泡制備脫細胞基質，其中，磷脂酶的濃度小于10000U/ml;c. 洗滌制備的脫細胞基質本發明一種利用磷脂酶制備脫細胞基質的方法的技術方案是選擇專一性更強的包含有磷 脂酶的溶液特異性水解待用組織器官中細胞的磷脂成分，達到脫去細胞而不損傷細胞外基質 的目的。同時也可以輔以化學法，使用對細胞外基質成分影響很小的一種或一種以上表面活 性劑，以加快磷脂酶的脫細胞作用。另外，根據各種組織的脫細胞要求的不同，可以再輔以 物理方法進一步加快磷脂酶的脫細胞速度。所述的待用組織器官包含有異種或同種異體或自體組織器官。可為皮膚，心瓣膜、血管、 膀胱、韌帶、軟骨、神經中的任一種，也可以為角膜、鞏膜、結膜中的任一種或其任意組合 體。 '所述的預處理指的是使用包含抗生素的生理緩沖液對待用組織器官進行常規清洗、消毒、 分離。還可以包括低滲或等滲浸泡，震蕩，調節洗滌溫度，適當頻率和強度的超聲波處理所述的磷脂酶包含有磷脂酶Ap A2， Bp B2， C， D中的任一種或一種以上。。所述的磷脂酶的濃度范圍小于10000U/ml，優選l-1000U/ml。含有磷脂酶溶液的溫度范 圍為0-56'C，含有磷脂酶溶液的pH值范圍為5-12。在利用低滲或等滲浸泡，震蕩時，可以調節反應溫度，適當頻率和強度的超聲波處理等 物理方法進一步加快磷脂酶的脫細胞速度。所述的表面活性劑指的是生物體內可以生成的具有表面活性作用的成分，或指的是人體 內可以生成的具有表面活性作用的成分。所述的表面活性劑包含有聚乙二醇，TritonX-100,膽酸鹽，脫氧膽酸鹽，鵝脫氧膽酸鹽， 甘氨膽酸鹽，甘氨鵝脫氧膽酸鹽，牛磺膽酸鹽，牛磺鵝脫氧膽酸鹽，脂多糖，脂蛋白，溶血卵磷脂等種成分或其任意組合。所述的洗滌指的是使用可以包含抗生素的生理緩沖液對所得脫細胞基質進行常規清洗。本發明選用磷脂酶對待用組織器官進行脫細胞處理，其優點在于1. 是一種高活性的、特異性的水解磷酯鍵的酶。而構成細胞膜的主要成分就是各種磷脂，因 此使用磷脂酶脫細胞特異性強，對細胞外基質中的結構和功能蛋白沒有損傷作用。2. 磷脂酶分子量小，微量殘留時能夠引起免疫反應的可能性極小。此外殘留微量的磷脂酶還 具有廣譜的抗感染，抑制炎癥作用，因此對人體無害。3. 磷脂酶對于完整細胞膜的作用大于對細胞膜碎片的作用。因此可以優先裂解完整的細胞。4. 表面活性劑可以明顯地促進磷脂酶的水解反應。各種表面活性劑本身也具有脫細胞功能， 但其在脫細胞的同時可不同程度的破壞細胞外基質中的蛋白成分，造成各種具有重要功能 的蛋白質喪失其生物學功能。但是表面活性劑在本發明中可以明顯促進磷脂酶的水解反 應，加快了水解反應速度。本發明優選的表面活性劑具有以下特征(1)能明顯促進磷脂 酶的脫細胞效果。(2)本身對細胞外基質中的結構和功能蛋白造成的損傷較小。如 TritonX—100和脫氧膽酸鈉，有一個大而且剛性的極性基因，較難進入蛋白質表面的裂縫， 使得細胞外基質蛋白四級結構受到較小影響。(3)在使用表面活性劑時，在保證提高磷脂酶 活性，促進磷脂酶水解反應的前提下，最大限度的降低表面活性劑的使用濃度，本領域的 技術人員根據現有理論可以靈活的加以實施。(4)優先選用來源于生物體或人體的表面活性 齊U，這種表面活性劑最大的優點在于其微量的殘留物不影響人體正常的生理功能。因此本 發明更優先選用膽酸鹽，脫氧膽酸鹽，鵝脫氧膽酸鹽，甘氨膽酸鹽，甘氨鵝脫氧膽酸鹽， 牛磺膽酸鹽，牛磺鵝脫氧膽酸鹽，脂多糖，脂蛋白，溶血卵磷脂中的任一種或一種以上。5. 為了進一步增強磷脂酶的脫細胞效果，可以采用物理方式對待用組織器官進行處理。本發 明主要采用物理法中低滲或等滲浸泡，震蕩，調節溫度，適當頻率和強度的超聲波等常規 方式，增加磷脂酶的脫細胞效果。6. 磷脂酶在不同pH值、溫度、濃度條件下具有不同的水解速度，因此，可以通過調節這些 參數來靈活控制磷脂酶的水解速度，以適應不同組織器官的脫細胞要求。綜上所述，本發明選用磷脂酶對待用組織器官進行脫細胞處理，根據各種組織器官的脫 細胞要求，可以采用以磷脂酶為主的方式，也可以采用磷脂酶加表面活性劑以提高磷脂酶水 解速度的方式，還可以進一步加入某些物理方式強化磷脂酶的脫細胞效果。并可隨時調整反 應體系的pH值、溫度、磷脂酶濃度，高度靈活的控制磷脂酶的脫細胞程度和速度。通過本6發明所述方法，可獲得具有良好物理學性狀和生物學功能的脫細胞基質，不但是組織工程的 重大突破，也直接為臨床疾病的治療開拓了新途徑。本發明原理可靠，工藝簡易靈活，產品 重現性好，極易實現產業化。
圖1 a為新鮮豬角膜組織蘇木素一伊紅(HE)染色照片；圖1 b為豬角膜脫細胞基質HE染色照片；圖2 a為新鮮豬角膜緣組織HE染色照片；圖2 b為豬角膜緣組織脫細胞基質HE染色照片；圖3 a為新鮮豬結膜組織HE染色照片；圖3 b為豬結膜脫細胞基質HE染色照片；圖4 a為新鮮豬鞏膜組織HE染色照片；圖4 b為豬鞏膜脫細胞基質HE染色照片；圖5 a為新鮮豬主動脈組織HE染色照片；圖5 b為豬主動脈脫細胞基質HE染色照片；圖6 a為新鮮豬皮膚組織HE染色照片；圖6 b為豬皮膚脫細胞基質HE染色照片；圖7 a為以豬角膜脫細胞基質為供體的兔眼板層角膜移植術后1天照片； 圖7b為以豬角膜脫細胞基質為供體的兔眼板層角膜移植術后80天照片。
具體實施方式
a. 待用組織器官預處理室溫下，按常規無菌操作原則，取待用組織器官，依據所取組織器 官的不同，其預處理方式可以不同。基本包括常規無菌取材，低滲或等滲液浸泡，或用 適當頻率和強度的超聲波處理。其目的是為了讓磷脂酶更好的滲透到組織內，提高磷脂酶 的脫細胞效果。b. 待用組織器官加入到包含有磷脂酶的溶液中，依據所取組織器官的不同，可選用的磷脂酶可以包含有磷脂酶Ai， A2， Bp B2， C， D中的任一種或一種以上，可選用的磷脂酶的濃 度范圍小于10000U/ml,優選l-1000U/ml，控制包含有磷脂酶的溶液的溫度范圍為0-56°C， pH值范圍為5-12。通過對磷脂酶種類，濃度，溶液溫度，反應PH值等參數的調節，可 以達到加快或減慢磷脂酶脫細胞速度的目的。依據所取組織器官的不同，和對各種脫細胞基質質量要求的不同，可以在包含有磷脂酶的 溶液中，加入一種或一種以上表面活性劑，以加快磷脂酶的脫細胞速度。控制所加入的表:面活性劑的濃度，使其可明顯提高磷脂酶的脫細胞速度，而又不損傷細胞外結構和功能蛋 白。本發明優選來源于生物體或人體的表面活性劑，這種表面活性劑最大的優點在于其微 量的殘留物不影響人體正常的生理功能，如膽酸鹽，脫氧膽酸鹽，鵝脫氧膽酸鹽，甘氨 膽酸鹽，甘氨鵝脫氧膽酸鹽，牛磺膽酸鹽，牛磺鵝脫氧膽酸鹽，脂多糖，脂蛋白，溶血 卵磷脂中的任一種或一種以上。為了進一步提高磷脂酶的脫細胞效果，可以采用物理法中的低滲或等滲浸泡，震蕩， 調節溫度，適當頻率和強度的超聲波等常規方式，來輔助磷脂酶更好的發揮脫細胞作用。C.洗滌制備的脫細胞基質，是使用可以包含有抗生素的生理緩沖液對所得脫細胞基質進行常 規清洗。因制備的脫細胞基質的不同，洗滌方式，次數，時間可以不同。但其目的都是為 了最大限度的減少脫細胞試劑的殘留量。由于本發明使用的磷脂酶和本發明優選的表面活 性劑在微量時對人體無害，因此本步驟的技術要求可以大幅度降低。實施例l本實施例的目的是用豬角膜制備豬角膜脫細胞基質。(注本實施例所用的磷脂酶溶液可以包含有磷脂酶A" A2， Bi， B2， C， D中的任一種或一種以上。所用的表面活性劑可以是生物體內或人體內可以生成的具有表面活性作用的成分，如膽酸鹽，脫氧膽酸鹽，鵝脫氧 膽酸鹽，甘氨膽酸鹽，甘氨鵝脫氧膽酸鹽，牛磺膽酸鹽，牛磺鵝脫氧膽酸鹽，脂多糖，脂蛋白，溶血卵磷脂中的任一種或一種以上，也可以是聚乙二醇，TritonX-100,其效果和以下相 同)。1. 在室溫，常規無菌操作下，用10.0mm環鉆取下新鮮豬眼角膜片。將所取的豬角膜片使 用含抗生素(100U/ml青霉素G， 100 ug/ml硫酸鏈霉素)的碳酸鹽緩沖液浸泡2-5次， 每次2-10分鐘。2. 將豬角膜片置入10ml無菌純水中，在37'C水浴中浸泡10-60分鐘。3. 將豬角膜片置入10ml無菌磷脂酶溶液I中，在37'C水浴中震蕩處理3-10小時。(無菌磷脂 酶溶液I:使用碳酸鹽緩沖液配制，pH值范圍為8-12,其中，磷脂酶Ai + A2-50 500U/ml， 表面活性劑脫氧膽酸鈉的質量百分濃度為0.01-1% )。4. 將豬角膜片取出使用碳酸鹽緩沖液洗滌l-3次。5. 將豬角膜片置入10m無菌磷脂酶溶液II中，在37。C水浴中震蕩處理l-5小時。(無菌磷脂酶溶液II:使用碳酸鹽緩沖液配制，pH值范圍為5-8，磷脂酶A^A2-50 500U/ml)6. 將豬角膜片置入50ml含抗生素(100U/ml青霉素G, 100 ii g/ml硫酸鏈霉素)的碳酸鹽 緩沖液中，在37'C水浴中震蕩沖洗3-6次，每次10-30分鐘。7. 將制成的豬角膜脫細胞基質片在4'C和無菌條件下保存。實施例2本實施例的目的是用豬角膜緣組織制備豬角膜緣脫細胞基質。(注本實施例所用的磷脂酶溶液可以包含有磷脂酶A" A2， B,， B2， C， D中的任一種或一種以上，其效果和以下相 同)。1. 在室溫，常規無菌操作下，取下新鮮豬眼角膜緣內外各2mm區域組織，將所取的豬角膜 緣組織使用含抗生素(100U/ml青霉素G， 100 lig/ml硫酸鏈霉素)的碳酸鹽緩沖液浸泡 2-5次，每次2-10分鐘。2. 將豬角膜緣組織置入10ml無菌純水中，在4X:水浴中浸泡10-60分鐘。3. 將豬角膜緣組織置入10ml無菌磷脂酶溶液中，在4'C水浴中震蕩處理6-24小時。(無菌磷 脂酶溶液使用碳酸鹽緩沖液配制，pH值范圍為8-12,磷脂酶A一A2-50 500U/ml)。4. 將豬角膜緣組織置入50ml含抗生素(100U/ml青霉素G， 100 u g/ml硫酸鏈霉素)的碳 酸鹽緩沖液中，在25。C水浴中震蕩沖洗3-6次，每次10-30分鐘。5. 將制成的豬角膜緣脫細胞基質在4'C和無菌條件下保存。實施例3本實施例的目的是用豬結膜制備豬結膜脫細胞基質。(注本實施例所用的磷脂酶溶液可 以包含有磷脂酶A!， A2， Bp B2， C， D中的任一種或一種以上。所用的表面活性劑可以是 生物體內或人體內可以生成的具有表面活性作用的成分，如膽酸鹽，脫氧膽酸鹽，鵝脫氧 膽酸鹽，甘氨膽酸鹽，甘氨鵝脫氧膽酸鹽，牛磺膽酸鹽，牛磺鵝脫氧膽酸鹽，脂多糖，脂蛋 白，溶血卵磷脂中的任一種或一種以上，也可以是聚乙二醇，TritonX-lOO，其效果和以下相 同)。1.在室溫，常規無菌操作下，取下新鮮豬眼球結膜lxlcm范圍組織，將所取的豬結膜組織 使用含抗生素(100U/ml青霉素G， 100 u g/ml硫酸鏈霉素)的碳酸鹽緩沖液浸泡2-5次，每次2-10分鐘。2. 將豬結膜組織置入10ml無菌純水中，在1(TC水浴中浸泡10-60分鐘。3. 將豬結膜組織置入10ml無菌磷脂酶溶液中，在10'C水浴中震蕩處理6-24小時。(無菌磷 脂酶溶液使用碳酸鹽緩沖液配制，pH值范圍為8-12,磷脂酶A^10 300U/m1,表面活 性劑牛磺膽酸鹽鈉的質量百分濃度為0.1-5%)。4. 將豬結膜組織置入50ml含抗生素(100U/ml青霉素G， 100 u g/ml硫酸鏈霉素)的碳酸 鹽緩沖液中，在l(TC水浴中震蕩沖洗3-6次，每次10-30分鐘。5. 將制成的豬結膜脫細胞基質在4i:和無菌條件下保存。實施例4本實施例的目的是用豬鞏膜制備豬鞏膜脫細胞基質。(注本實施例所用的磷脂酶溶液可 以包含有磷脂酶A!， A2， B!， B2， C， D中的任一種或一種以上。所用的表面活性劑可以是生物體內或人體內可以生成的具有表面活性作用的成分，如膽酸鹽，脫氧膽酸鹽，鵝脫氧膽酸鹽，甘氨膽酸鹽，甘氨鵝脫氧膽酸鹽，牛磺膽酸鹽，牛磺鵝脫氧膽酸鹽，脂多糖，脂蛋白，溶血卵磷脂中的任一種或一種以上，也可以是聚乙二醇，TritonX-lOO，其效果和以下相 同)。1. 在室溫，常規無菌操作下，取下新鮮豬眼鞏膜lxlcm區域組織，將所取的豬鞏膜組織使 用含抗生素(100U/ml青霉素G， 100 ug/ml硫酸鏈霉素)的碳酸鹽緩沖液浸泡2-5次， 每次2-10分鐘。2. 將豬鞏膜組織置入10ml無菌純水中，在37'C水浴中浸泡3-12小時。3. 將豬鞏膜組織置入10ml無菌磷脂酶溶液I中，在37"C水浴中震蕩處理6-24小時。(無菌磷 脂酶溶液I:使用碳酸鹽緩沖液配制，pH值范圍為8-12,其中，磷脂酶At + A2=50~500U/ml， 磷脂酶B一Bf50 500U/ml，表面活性劑脫氧膽酸鈉的質量百分濃度為0.01-0.5%,,牛磺膽 酸鈉的質量百分濃度為0.1-1%)。4. 將豬鞏膜組織取出使用碳酸鹽緩沖液洗滌1-3次。5. 將豬鞏膜組織置入10m無菌磷脂酶溶液n中，在37'C水浴中震蕩處理l-6小時。(無菌磷 脂酶溶液II:使用碳酸鹽緩沖液配制，pH值范圍為5-8，磷脂酶A! + A2-50 500U/ml，磷 脂酶Bi+Bf50 500U/ml)。6. 將豬鞏膜組織置入50ml含抗生素的碳酸鹽緩沖液中，在4(TC水浴中震蕩沖洗3-6次，每次10-30分鐘。7.將制成的豬鞏膜脫細胞基質在4'C和無菌條件下保存。實施例5本實施例的目的是用豬胸主動脈制備豬胸主動脈脫細胞基質。(注本實施例所用的磷脂酶溶液可以包含有磷脂酶A!, A2， Bp B2， C， D中的任一種或一種以上。所用的表面活性 劑可以是生物體內或人體內可以生成的具有表面活性作用的成分，如膽酸鹽，脫氧膽酸鹽， 鵝脫氧膽酸鹽，甘氨膽酸鹽，甘氨鵝脫氧膽酸鹽，牛磺膽酸鹽，牛磺鵝脫氧膽酸鹽，脂多糖， 脂蛋白，溶血卵磷脂中的任一種或一種以上，也可以是聚乙二醇，TritonX-100，其效果和以 下相同)。1. 在室溫，常規無菌操作下，取下新鮮豬胸主動脈5cm，剝去血管外膜，將所取的豬胸主動 脈使用含抗生素(100U/ml青霉素G， 100 Pg/ml硫酸鏈霉素)的碳酸鹽緩沖液浸泡2-5 次，每次2-10分鐘。2. 將豬胸主動脈置入50ml無菌純水中，在25'C水浴中浸泡6-24小時。3. 將豬胸主動脈置入50ml無菌磷脂酶溶液中，在25'C水浴中震蕩處理6-24小時。(無菌磷 脂酶溶液使用碳酸鹽緩沖液配制，pH值范圍為8-12，磷脂酶Ai + A^50 500U/ml，磷 脂酶Bi+Bf50 500U/ml，磷脂酶C濃度為50-500 U/ml，表面活性劑牛磺膽酸鈉質量百 分濃度為0.1-1%，溶血卵磷脂的摩爾濃度為10-100umol/L)。4. 將豬胸主動脈置入50ml含抗生素(100U/ml青霉素G， 100 P g/ml硫酸鏈霉素)的碳酸 鹽緩沖液中，在25。C水浴中震蕩沖洗3-6次，每次10-30分鐘。5. 將制成的豬胸主動脈脫細胞基質在4'C和無菌條件下保存。實施例6本實施例的目的是用豬皮膚制備豬皮膚脫細胞基質。(注本實施例所用的磷脂酶溶液可以包含有磷脂酶Ai， A2， B" B2， C， D等種中的任一種或一種以上。所用的表面活性劑可 以是生物體內或人體內可以生成的具有表面活性作用的成分，如膽酸鹽，脫氧膽酸鹽，鵝 脫氧膽酸鹽，甘氨膽酸鹽，甘氨鵝脫氧膽酸鹽，牛磺膽酸鹽，牛磺鵝脫氧膽酸鹽，脂多糖， 脂蛋白，溶血卵磷脂中的任一種或一種以上，也可以是聚乙二醇，TritonX-lOO，其效果和以下相同)。1. 在室溫，常規無菌操作下，取下新鮮豬皮膚3x3cm2，將所取的豬皮膚使用含抗生素(100U/ml青霉素G， lOOug/ml硫酸鏈霉素)的碳酸鹽緩沖液浸泡2-5次，每次2-10分鐘。2. 將豬皮膚置入50ml無菌純水中，在45'C水浴中浸泡12-24小時。3. 將豬皮膚置入50ml無菌磷脂酶溶液中，在45 。C水浴中震蕩處理6-24小時。 (無菌磷脂酶溶液使用碳酸鹽緩沖液配制，pH值范圍為8-12,磷脂酶A一A2 =50~500U/ml，磷脂酶B!+Bf50 500U/ml，磷脂酶C濃度為50-500 U/ml，磷脂酶D濃度 為50-500 U/ml，表面活性劑脫氧膽酸鈉的質量百分濃度為0.01-0.5%,,牛磺膽酸鹽鈉的質 量百分濃度為0.1-1%,溶血卵磷脂的摩爾濃度為10-100umol/L)。4. 將豬皮膚置入50ml含抗生素(100U/ml青霉素G， 100 p g/ml硫酸鏈霉素)的碳酸鹽緩 沖液中，在45"C水浴中震蕩沖洗3-6次，每次10-30分鐘。5. 將制成的豬皮膚脫細胞基質在4'C和無菌條件下保存。實施例7實施目的本發明所制備的各種脫細胞基質，以角膜脫細胞基質的技術要求最高，不但 要滿足生物相容性和機械強度要求，還要滿足活體透明性要求。因此，通過本實施例——脫 細胞角膜基質的異種移植，來證實本發明所獲脫細胞角膜基質在異種移植中不但滿足了生物 相容性和機械強度的要求，還充分滿足活體透明性的要求。以實施例1方法制備獲得的豬角膜脫細胞基質為供體材料(以下稱供體)，選健康新西 蘭兔為受體行板層角膜移植術，氯胺酮肌注全麻后，術眼常規消毒，鋪巾，開瞼器開瞼，做上下直肌固定縫線，用6.5mm環鉆在受體角膜中央鉆至約1/3角膜深度后，分離角膜前板層， 得到受體植床。供體角膜置于人工前房上，使用虹膜恢復器分離供體角膜前層(200pm)，使 用6.0環鉆鉆取供體植片，取供體植片置于受體植床上，以10-0尼龍線做8針間斷縫合。術 畢除去上下直肌固定縫線和開瞼器，復方妥布霉素眼膏涂眼。術后給予每天一次妥布霉素眼 膏涂眼。觀察角膜新生血管情況，上皮化完成狀況和角膜透明度改變等指標。移植后發現， 完全上皮化時間為9天，80天后植片完全恢復透明，未見角膜新生血管。無需進一步闡述，相信采用前面所公開的內容，本領域技術人員可最大限度地應用本發 明。因此，前面的實施方案應理解為僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發明的范圍。
權利要求
1.一種制備脫細胞基質的方法，其特征在于，包括以下步驟a.將待用組織器官預處理；b.將經過預處理的待用組織器官加入到含有磷脂酶的溶液中，通過低滲或等滲液浸泡制備脫細胞基質，其中，磷脂酶的濃度小于10000U/ml；c.洗滌制備的脫細胞基質。
2. 根據權利要求1所述的制備脫細胞基質的方法，其特征在于所述的磷脂酶為磷脂酶Ap A2, B!， B2， C， D中的任一種或一種以上。
3. 根據權利要求1所述的制備脫細胞基質的方法，其特征在于所述的磷脂酶的濃度范圍為l-1000U/ml。
4. 根據權利要求1所述的制備脫細胞基質的方法，其特征在于步驟b中含有磷脂酶的溶液中還含有表面活性劑。
5. 根據權利要求1一4任一項所述的制備脫細胞基質的方法，其特征在于步驟b中在浸泡時進行震蕩，或超聲波處理。
6. 根據權利要求1一4任一項所述的制備脫細胞基質的方法，其特征在于步驟b中溶液的溫度范圍為0-56°C， pH值范圍為5-12。
7. 根據權利要求4所述的制備脫細胞基質的方法，其特征在于所述的表面活性劑為生物體內或人體內可以生成的具有表面活性作用的成分。
8. 根據權利要求4所述的制備脫細胞基質的方法，其特征在于所述的表面活性劑為聚乙二醇，TritonX-lOO,膽酸鹽，脫氧膽酸鹽，鵝脫氧膽酸鹽， 甘氨膽酸鹽，甘氨鵝脫氧膽酸鹽，牛磺膽酸鹽，牛磺鵝脫氧膽酸鹽，脂多糖，脂蛋 白，以及溶血卵磷脂中的任一種或一種以上。
9. 根據權利要求1所述的制備脫細胞基質的方法，其特征在于所述的待用組織器官 為異種或同種異體或自體組織器官。
10. 根據權利要求9所述的制備脫細胞基質的方法，其特征在于所述的待用組織器官為皮膚，心瓣膜、血管、膀胱、韌帶、軟骨、神經中的任一種。
11. 根據權利要求9所述的制備脫細胞基質的方法，其特征在于所述的待用組織器官為角膜、鞏膜、結膜中的任一種或其任意組合體。
12. 根據權利要求1項所述的制備脫細胞基質的方法，其特征在于步驟a中所述的預處理指的是對待用組織器官進行常規清洗，消毒，分離或進行常規清洗，消毒，分離后低滲或等滲浸泡，并震蕩或超聲波處理。 13.根據權利要求1所述的制備脫細胞基質的方法，其特征在于步驟C中所述的洗滌 指的是使用可以包含有抗生素的生理緩沖液對所得脫細胞基質進行常規清洗。
全文摘要
本發明公開了一種利用磷脂酶制備脫細胞基質的方法，其特征在于待用組織器官預處理；待用組織器官加入到包含有磷脂酶的溶液中，在受控條件下制備脫細胞基質；洗滌制備的脫細胞基質。本發明可獲得具有良好物理學性狀和生物學功能的脫細胞基質，不但是組織工程的重大突破，也直接為臨床疾病的治療開拓了新途徑。本發明原理可靠，工藝簡易靈活，產品重現性好，極易實現產業化。
文檔編號A61L27/36GK101274106SQ20081002697
公開日2008年10月1日 申請日期2008年3月24日 優先權日2008年3月24日
發明者征 武, 王智崇, 冬 陳 申請人:中山大學中山眼科中心