凝血酶-殼聚糖自組裝納米微粒的制備方法及用途的制作方法

專利名稱：凝血酶-殼聚糖自組裝納米微粒的制備方法及用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物醫藥領域，涉及一種凝血酶-殼聚糖自組裝納米微粒制備方法及用途； 具體的說是涉及一種能快速使用，具有迅速止血、粘合和封閉創面作用的藥物復合物，是一 種生物止血材料。
背景技術：
過度失血是事故和戰傷致死的主要原因，也是外科手術治療過程中致死的主要原因之 一，控制失血是手術、急救和野外創傷護理的關鍵環節。不幸的是，來自各種原因的出血(流 血)是非常見的，日常生活和工作中的意外受傷出血(流血)、外科手術中的創傷出血(流血)、 來自戰爭的受傷出血(流血)等，如不能控制及時控制，則將有可能造成巨大損失甚至死亡。 因此，止血日益成為醫學界研究熱點。常規的止血方法有人工擠壓、燒灼術和傷口縫合但這 些方法有時并不能有效止血，而延長了止血時間。目前臨床上，在皮膚刨傷和脾、腎等軟組 織器官損傷及手術的出血治療中，大都采用天然衍生可降解止血材料，主要有明膠海綿、氧 化纖維素、微纖維膠原粉末、纖維蛋白膠，膠原海綿等。而這些止血產品，在止血效果、止 血時間、創面愈合、生物相容性等方面都存在一定的不足。如明膠和膠原的組織黏附力較差， 兩者的止血功能均依賴于足量的血小板和凝血因子，故應用受到限制。在第二次世界大戰的 最后一年血纖蛋白原和凝血酶被廣泛使用。不過后來受到了禁止，因為它會傳播肝炎。自美 國紅十字會以及其他機構開發出了血漿蛋白純化方法，而且這些方法能消除肝炎的危險以 后，單一供體血纖蛋白密封劑被廣泛地在臨床上使用，不僅用于出血控制，而且用于各種手
術場合的手術室輔助物。在九十年代，廣州倍繡科技公司率先以動物血作為原料，生產纖維 蛋白膠產品在國內獲得大規模的應用。其原料是哺乳動物血液，具有來源廣泛、價格低廉、 避免人類傳染病等優點。但亦存在以下問題①環境穩定性差，需要低溫貯存；②使用不便， 需要10-15分鐘的準備時間；③功能單一，不能用作藥物載體，如在腫瘤切除術中不能用作
局部化療的載體等；④來自動物的血纖維蛋白膠其生物相容性差；⑤而且血纖維蛋白膠源自 血液，不能排除導致病毒感染的可能。因此，如何使用新技術、新材料，優化制備工藝，研 制一種具有生物安全性、生物相容性，且有較強的止血功能的新型止血材料，實現止血材料 的多功能性，便成為當前亟待研究和探索的重要課題。
4當前，天然多糖引起了國內外研究人員的極大重視，在止血領域，殼聚糖因為其優良的 止血、組織黏附、抗感染、促進傷口愈合等功能和良好的生物相容性和生物降解性，成為一 個研究熱點。
殼聚糖[e — (1—4)—2—氨基—2—脫氧—D—葡萄糖]是一種獨特的堿性多糖，其結構 見圖l，是由甲殼素脫乙酰化而制備。甲殼素[e—(l一4)一2 —乙酰氨基一2—脫氧一D—葡萄 糖]廣泛存在于甲殼綱動物蝦、蟹的甲殼、昆蟲的甲殼、真菌和植物的細胞壁中，其結構中， 基于酰胺基團的三維空間氫鍵使得甲殼素具有較高的結晶度。由于殼聚糖源自生物體，具有 無毒、無抗原性和生物相容性，可在體內降解、吸收等特性，在醫藥方面的用途越來越引起 人們的重視。殼聚糖本身具有凝血特性，殼聚糖的凝血效果與它的物理性狀和化學性質有關。 當異質材料和血液接觸時，血漿蛋白迅速吸附在材料表面，主要包括白蛋白、y—球蛋白、 血纖維蛋白原和凝血原酶等，被吸附的血漿蛋白介導了血小板在材料表面的黏附。接著，血 小板發生形變并被激活，同時引起血小板內容物的釋放(包括e —血小板球蛋白、5—羥色胺、 腺苷核苷酸和促凝血激活物等)。其中，腺苷核苷酸能促使更多的血小板在材料表面的黏附， 最終形成的血小板聚集體和不溶性血纖維蛋白以及被截留的血細胞共同形成了血栓。許多生 物大分子，如黏多糖、磷脂及細胞外基質蛋白都顯負電性；在pH《6.8的環境中，殼聚糖即 質子化而顯正電性。大量文獻表明，殼聚糖的血栓形成能力部分歸結于它和生物大分子之間 的靜電相互作用。殼聚糖止血相關化學性質還包括分子量、脫乙酰度、質子化程度和結晶度。 高度有序的分子鏈三維結構賦予了殼聚糖優良的止血能力。殼聚糖本身的止血作用主要是通 過以下幾個途徑①殼聚糖和血小板相互作用；②殼聚糖和紅細胞相互作用；③殼聚糖和補 體系統作用；④殼聚糖和血液其他成分作用。
殼聚糖除本身具有優良的止血作用外，殼聚糖還具有較好的成膜性，成膜后具有良好的
生物通透性和相容性；殼聚糖還可以作為藥物載體，殼聚糖納米級聚合物粒子作為藥物傳遞 和控釋的載體，由于其超微小的體積，合理的體內分布和高效的藥物利用率，能夠通過組織 上皮，從而更有效地對藥物進行靶向輸送和控制釋放，因而成為包埋多肽、蛋白質、核酸、 疫苗等生物活性大分子藥物的理想載體。從結構來看，殼聚糖具有水溶性和帶正電荷的特性， 這具有非常重要的意義。這些特點使其在液態介質中可與帶負電荷的聚合物、大分子甚至一
些聚陰離子相互作用，由此發生的溶膠一凝膠轉變過程則可方便地用于納米微粒的制備。從 生物藥劑的觀點看，殼聚糖還能黏附于黏膜表面，這又提供了它作為一個黏膜給藥體系的可 能。殼聚糖的還有一個特性是它能打開上皮細胞的緊密結合處，因此能很好地將大分子穿過 緊密的上皮層，隨著新型藥物給藥系統的發展，作為無毒、來源豐富、具有良好生物相容性 及生物可降解性的天然物質，殼聚糖成為了應用廣泛的新型輔料，利用殼聚糖所制成的納米粒具有靶向、緩釋、增加藥物吸收、提高藥物穩定等作用，成為新劑型研究的熱點。
通過添加其它成分來對殼聚糖進行改性，在一定條件下，改性后的殼聚糖會在溶液中形 成自簇集組裝結構從而來制備出殼聚糖納米粒。由于這種制備納米粒的方法不僅制備條件溫 和而且納米微粒表面存在大量親水性或離子基團， 一類親水性較強的大分子藥物，便容易通 過氫鍵或靜電相互作用結合在該微粒表面。因而蛋白、多肽等適合用該方法制備的納米顆粒 來釋放。而且制得的該納米顆粒的載藥量可高達50%，可達到給藥劑量。
凝血酶是一種專一性很強的絲氨酸蛋白水解酶，它能水解血纖維蛋白原的4個Arg—Gly 肽鍵，產生不溶性的血纖維蛋白，使血液變成凝膠而發生凝固.在臨床上，凝血酶是廣泛使 用的局部止血藥，可用于手術中不易結扎的小血管止血、消化道出血以及外傷出血等。為局 部止血藥，凝血酶與大多數酶類藥物一樣，穩定性較差，其水溶液在室溫保存24d便完全失 活。

發明內容
為解決上述問題，本發明的目的在于克服凝血酶作為局部止血藥穩定性較差的不足，發 揮殼聚糖的止血、成膜、藥物載體、生物相容性及生物可降解性的多重功能，從而提供一種 具有迅速止血、粘合、封閉組織、使用快捷方便的凝血酶-殼聚糖自組裝納米微粒的制備方 法。
本發明的技術方案是
一種凝血酶-殼聚糖自組裝納米微粒的制備方法，其特特征在于包括以下順序步驟
(1) 將殼聚糖加入到乙酸水溶液中，攪拌至完全溶解，形成殼聚糖乙酸水溶液；
(2) 將凝血酶加入至p朋.0-8.0緩沖液中，攪拌溶解，形成凝血酶溶液；
(3) 將凝血酶緩沖溶液加入到殼聚糖乙酸水溶液中，加入交聯劑至濃度為0.01%-0.10%, 升溫至30°C-50°C ，以100轉/分鐘-800轉/分鐘的速度攪拌20分鐘-60分鐘，將其傾倒入 至液體石蠟中，攪拌，再加入分散劑至濃度為1%_10%，以300轉/分鐘-1500轉/分鐘的速 度高速攪拌2小時-8小時進行乳化；
(4) 取上述乳化液再加入交聯劑至濃度為0. 5%-5. 0%，攪拌20分鐘-60分鐘，使其分散均 勻，置于3(TC-50'C水浴中進行交聯，8小時-12小時，將產物冷卻至室溫，取出，進行過濾；
(5) 產物用丙酮洗滌2-5次，使得丙酮表面無漂浮油斑，即得凝膠狀半透明納米微粒； 以乙醇洗滌脫水，即得固態納米微球；
(6) 將制備產品置于真空干燥器中1(TC-4(TC溫度下真空干燥，得凝血酶一殼聚糖類白色 或白色自組裝納米微粒。所述的凝血酶-殼聚糖自組裝納米微粒的制備方法，其步驟(1)中乙酸水溶液的濃度為 0. 5%_2. 5%。
所述的凝血酶殼聚糖自組裝納米微粒的制備方法，其步驟(l)中殼聚糖乙酸水溶液的殼 聚糖濃度為0. 5°/。-8%。
所述的凝血酶-殼聚糖自組裝納米微粒的制備方法，其步驟(3)中凝血酶緩沖溶液與殼聚 糖乙酸水溶液混合，其中殼聚糖與凝血酶的投料比為4: 0.5-2.0。
所述的凝血酶-殼聚糖自組裝納米微粒的制備方法，其步驟(2)中凝血酶可以是人凝血 酶、豬凝血酶、牛凝血酶或羊凝血酶。
所述的凝血酶-殼聚糖自組裝納米微粒的制備方法，其步驟(3)中將凝血酶緩沖溶液加入 到殼聚糖乙酸水溶液中時，對溶液緩慢攪拌。
所述的凝血酶-殼聚糖自組裝納米微粒的制備方法，其步驟(3)、 (4)中的交聯劑可以是 聚乙二醇、海澡酸鈉或戊二醛。
所述的凝血酶殼聚糖自組裝納米微粒的制備方法，其步驟(4)中的分散劑可以是司盤80、 吐溫80或泊洛沙姆。 _
根據上述方法制得的凝血酶-殼賽糖自組裝納米微粒，應用時可通過具有噴射功能的裝 置將其噴涂到創傷面上，用于普通外科、.骨科、心胸外科、神經外科、腦外科、婦產科的組 織止血、組織封口和組織粘合。
為了制備成高活性、高穩定性、高機械強度的固定化酶，從而擴大酶類藥物的應用范圍， 本發明以殼聚糖(chitosan，即脫乙酰殼多糖)作載體.通過添加聚乙二醇、海澡酸鈉、戊二 醛等成分來對殼聚糖進行改性，在一定條件下，殼聚糖在溶液中形成自簇集組裝結構從而來 制備出殼聚糖納米粒；由于這種制備納米粒的方法不僅制備條件溫和而且納米微粒表面存在 大量親水性或離子基團，將親水性較強的大分子藥物凝血酶很容易地通過氫鍵或靜電相互作 用結合在該微粒表面，因而制備出固定化酶的凝血酶-殼聚糖自組裝納米微粒。該納米止血 材料，既發揮了殼聚糖本身的止血功效，又將凝血酶固定化，使凝血酶的止血效果更佳。同 時又提高了凝血酶的穩定性，使凝血酶以固體形式可常溫保存。而且納米微粒具有較好的流 動性，易在創面形成薄層，發揮殼聚糖的成膜功能，對出血創面組織起粘合和封閉作用。
本發明的優點和效果在于選擇了適當的凝血酶與殼聚糖的投料比例、合適的反應條件首 次制備得到了能夠在乙酸水溶液中自組裝成納米微粒的凝血酶-殼聚糖，此納米微粒的凝血 酶非常穩定。本發明具有如下特點
l.本發明通過多糖乙酸水溶液自組裝形成核殼結構的原理制備成高活性、高穩定性、高 機械強度的固定化酶新型納米止血材料；2. 本發明這種制備納米粒的方法不僅制備條件溫和而且納米微粒表面存在大量親水性 或離子基團，將親水性較強的大分子藥物凝血酶通過氫鍵和靜電相互作用結合在該微粒表 面，既提高了凝血酶的穩定性，又保存了凝血酶的活性；
3. 本發明制得產品既具有高分子微球類止血材料的特點(分子篩及提供凝血表面)，又 充分融合了生物類止血材料的優勢(補充凝血因子，加速生理止血)，從而顯著提高止血效 果；
4. 本發明制得產品中的殼聚糖既是形成納米微粒的載體材料，又是本身具有止血功效 藥物成分，同時還具有成膜功能，可對出血創面組織起粘合和封閉作用；
5. 本發明制得產品具有簡單方便、止血快速、完全人體降解吸收和價格低等顯著特點。
6. 本發明制得產品可廣泛應用于臨床手術、院前急救、戰備前線以及人民日常生活等 各種急救需用領域，對提高我國臨床手術和創傷急救水平有重要意義，其社會和經濟意義都 十分可觀。


圖l是殼聚糖結構圖2是本發明所制得凝血酶-殼聚糖納米微粒的形態圖。
具體實施例方式
本發明將殼聚糖加入乙酸水溶液形成殼聚糖溶液；將凝血酶加入到緩沖液形成凝血酶溶 液；將凝血酶溶液與殼聚糖溶液混合均勻，加入交聯劑攪拌后，將其倒入液體石蠟中攪拌， 再加入分散劑，乳化；再加入交聯劑通過水浴進行交聯反應后，過濾，用丙酮洗滌后，再用 乙醇洗滌脫水，最后真空干燥，獲得凝血酶-殼聚糖自組裝納米微粒。
以下通過具體的實施例對本發明做進一步的闡述，但本發明并不限于此特定例子。 實施例l
取殼聚糖粉20g,置三頸燒瓶中，加入2X的乙酸水溶液1000ml，攪拌使其完全溶解，
形成濃度為2. 0%的殼聚糖乙酸水溶液；另稱取凝血酶5g(相當于30000ii)，加磷酸鹽緩沖液
(pH7.4)100ml，攪拌溶解，形成凝血酶的緩沖溶液；在室溫下緩慢攪拌，將凝血酶的緩沖溶
液滴加到上述殼聚糖乙酸水溶液中，滴加時間為30min,升溫至4(TC，滴加0.1%戊二醛溶液
30ml，以200轉/分鐘的速度連續攪拌30min，停止攪拌，將其傾倒入至1500液體石蠟中，
攪拌25min，加入150ml的吐溫80，以500轉/分鐘的速度高速攪拌4小時進行乳化；取乳
化液再加入25X的戊二醛溶液180ml，攪拌30min使其分散均勻，置于4(TC水浴鍋中進行交聯自組裝8h，將產物冷卻至室溫，取出，進行過濾，得產物用丙酮洗滌3次，每次300ml，， 即得凝膠狀半透明納米微粒；后再依次以70%、 80%、 90X及無水酒精各200ml洗滌脫水， 即得固態納米微球；將制得固態納米微球置于真空干燥器中3(TC真空干燥，得凝血酶一殼聚 糖類白色自組裝納米微粒24. 3g。 實施例2
取殼聚糖粉40g，置三頸燒瓶中，加入2.5^的乙酸水溶液1500ml，攪拌使其完全溶解， 形成濃度為2. 6%的殼聚糖乙酸水溶液；另稱取凝血酶12g(相當于72000u)，加磷酸鹽緩沖液 (pH7.2)200ml，攪拌溶解，形成凝血酶的緩沖溶液；在室溫下緩慢攪拌，將凝血酶的緩沖溶 液滴加到上述殼聚糖乙酸水溶液中，滴加時間為50min，升溫至45。C,滴加0.5X聚乙二醇溶 液100ml，以150轉/分鐘的速度連續攪拌40min，停止攪拌，將其傾倒入至2500液體石蠟 中，攪拌35min，加入200ml的司盤80，以800轉/分鐘的速度高速攪拌3小時進行乳化； 取乳化液再加入15X的聚乙二醇溶液300ml，攪拌40min使其分散均勻，置于45'C水浴鍋中 進行交聯自組裝10h,將產物冷卻至室溫，取出，進行過濾，得產物用丙酮洗滌3次，每次 500ml，即得凝膠狀半透明納米微粒；后再依次以70%、 80%、 90%及無水酒精各400ml洗 滌脫水，即得固態納米微球；將制得固態納米微球置于真空干燥器中35'C真空干燥，得凝血 酶一 殼聚糖類白色自組裝納米微粒52. 1 g 。 實施例3
取殼聚糖粉30g，置三頸燒瓶中，加入l^的乙酸水溶液1500ml，攪拌使其完全溶解， 形成濃度為2. 0%的殼聚糖乙酸水溶液；另.稱取凝血酶6g(相當于36000u),加草酸鹽緩沖液 (pH7.5)150ml，攪拌溶解，形成凝血酶的緩沖溶液；在室溫下緩慢攪拌，將凝血酶的緩沖溶 液滴加到上述殼聚糖乙酸水溶液中，滴加時間為40min，升溫至50'C，滴加0.5X海澡酸鈉溶 液30ml，以250轉/分鐘的速度連續攪拌20min，停止攪拌，將其傾倒入至2500液體石蠟中， 攪拌25min，加入150g的泊洛沙姆，以800轉/分鐘的速度高速攪拌3小時進行乳化；取乳 化液再加入15%的海澡酸鈉溶液250ml，攪拌50min使其分散均勻，置于5CTC水浴鍋中進行 交聯自組裝12h，將產物冷卻至室溫，—取出，進行過濾，得產物用丙酮洗滌3次，每次400ral， 即得凝膠狀半透明納米微粒；后再依次以70%、 80%、 90X及無水酒精各250ml洗滌脫水， 即得固態納米微球；將制得固態納米微球置于真空干燥器中4(TC真空干燥，得凝血酶一殼聚 糖類白色自組裝納米微粒36. 3g。 實施例4
取殼聚糖粉25g，置三頸燒瓶中，加入1.5X的乙酸水溶液1200ml，攪拌使其完全溶解，
形成濃度為2.1%的殼聚糖乙酸水溶液；另稱取凝血酶6g(相當于31000u)，加磷酸鹽緩沖液
9(pH7.4)120ml，攪拌溶解，形成凝血酶的緩沖溶液；在室溫下緩慢攪拌，將凝血酶的緩沖溶 液滴加到上述殼聚糖乙酸水溶液中，滴加時間為35min，升溫至40°C，滴加0. 1%戊二醛溶液 35ml，以180轉/分鐘的速度連續攪拌40min,停止攪拌，將其傾倒入至1600液體石蠟中， 攪拌30min，加入130ml的司盤80，'以500轉/分鐘的速度高速攪拌4小時進行乳化；取乳 化液再加入25%的戊二醛溶液180ml，攪拌30min使其分散均勻，置于4CTC水浴鍋中進行交 聯自組裝10h，將產物冷卻至室溫，取出，進行過濾，得產物用丙酮洗滌3次，每次350m1，， 即得凝膠狀半透明納米微粒；后再依次以70%、 80%、 90X及無水酒精各220ml脫水，即得 固態納米微球；將制得固態納米微球置于真空干燥器中35'C真空干燥，得凝血酶一殼聚糖類 白色自組裝納米微粒30.7g。
對本發明所制得產品的分析試驗及結果如下
(一)本發明所制得的自組裝凝血酶-殼聚糖納米微粒，在室溫條件下，用透射電鏡研 究凝血酶-殼聚糖自組裝納米微粒的形態與粒徑。結果見圖2，制備得到的納米粒呈球形或類 球形，且具有比較光潔的表面以及很好的規整度，大多形態比較均勻完整，制備得到的粒徑 分布為20-300nm。
(二 )凝血酶活性測定與凝血酶-殼聚糖自組裝納米微粒中固定化凝血酶的穩定性考察
a. 纖維蛋白原溶液的制備精密稱取纖維蛋白原標準品適量，加0.9XNaCl溶液溶解， 制成含0.2%凝固物的溶液.加0.05mol/LNa2HP(V溶液適量，調pH為7.0—7.4。再加0. 9 %NaCl溶液稀釋成含0. 1%凝固物的纖維蛋白原溶液，備用；
b. 標準曲線的制備精密稱取凝血酶標準品適量，加0. 9%NaCl溶液溶解并制成為每lml 含凝血酶為5. 0、 6. 4、 8. 0、 10. 0 u的標準溶液，搖勻。另取內徑lcm，長10cm的試管4支.各 精密加入0. 1%纖維蛋白原溶液0. 9ml.置(37±0. 5) 。C水浴中恒溫5min，分別精密加入標準 溶液各0. lml，立即記時，搖勻，，置(37±0. 5) 。C恒溫水洛中，分別觀察各個試管中纖維蛋白 原的初凝時間，平行測定5次，得標準曲線方程Y^6.52-0.21t(其中y為凝血酶活性單位濃 度，t為初凝時間)，r=0.9982.
c. 凝血酶-殼聚糖固定化凝血酶活性測定精密稱取凝血酶-殼聚糖固定化凝血酶適量 (約相當于凝血酶10u)，精密加入磷酸鹽緩沖液(pH7.4)溶解，按凝血酶活性測定項下方法
測定初凝時間，代入標準曲線方程計算，即得。測得本制備方法所得固定化凝血酶活性回收 率為89. 96% 。 RSD為0. 32% (n=5)。
d. X射線衍射實驗
分別對凝血酶、殼聚糖、凝血酶-殼聚糖固定化凝血酶進行x射線衍射實驗。結果顯示，固定化凝血酶X衍射圖譜中，殼聚糖載體19.76。的特征衍射峰消失，45.45° 、 31.87°出 現了凝血酶特征衍射峰，表明凝血酶沒有被破壞，與殼聚糖發生了交聯，凝血酶被固定于載 體上。
e.凝血酶-殼聚糖固定化凝血酶的穩定性考察
(l)光照試驗取凝血酶-殼聚糖固定化凝血酶置注射劑澄明度測定儀下，于3000-50001x 光照度放置10d按固定化凝血酶活性測定項下的方法，于0、 1、 3、 5、 10d分別取樣測定， 結果見表l。
表1光照試驗結果
時間(d)性狀活性(u)活性回收率(％)
0類白色粉末7. 69100
1類白色粉末7.4897
3類白色粉末7. 5798
5類白色粉末7. 6299
10類白色粉末7. 1393
(2)低溫試驗
取凝血酶-殼聚糖固定化凝血酶置密閉容器中在0。C放置10d，按固定化凝血項下方法，于o、1、 3、 5、 10 d分別取樣測定，結果見表2。
表2低溫試驗結果
時間(d)性狀活性(u)活性回收率(％)
0類白色粉末7.69100
1類白色粉末6. 7898
3類白色粉末6.8198
5類白色粉末6. 6295
10類白色粉末6. 4693
(3)高溫試驗
取凝血酶-殼聚糖固定化凝血酶置密閉容器中，分別在40。C、 6(TC、 8CTC放置10 d，按
固定化凝血酶活性測定項下方法，于0、 1、 3、 5、 10 d分別取樣測定，結果見表3。
表3高溫試驗結果
溫度rc)時間(d)性狀.活性(u)活性回收率(％)
0類白色粉末7. 69100
1類白色粉末7.4296
403類白色粉末7.6199
5類白色粉末7.5898
10類白色粉末7.5397
0類白色粉末7.65100
1類白色粉末7.31%
603類白色粉末4.8163
5淡黃色粉末-0. 65-8.5
10淡黃色粉末-1.43-19
110類白色粉末7.67100
1淡黃色粉末-0.37_4.8
803淡黃色粉末-2. 74-36
5淡黃色粉末-3. 12-41
10淡黃色粉末-3. 46-45
(4)室溫留樣觀察
取凝血酶-殼聚糖固定化凝血酶在室溫自然條件下放置，按固定化凝血酶活性測定項下 方法于0、 0.5、 1、 2、 3月分別取樣測定，結果見表4. (5)對酸堿的穩定性
精密稱取凝血酶-殼聚糖固定化凝血酶適量，分別加pH值為5.5、 5.9、 6.0、 6.8、 7.4、 8.0、 8.5、 9.0、 9.1的緩沖溶液溶解，在室溫放置72h，按固定化凝血酶活性測定項下方法 測定其活性。結果表明，在72h內，在pH5.9 — 9.1范圍內均有恬性。72h后，僅pH值6. 8-9.0 之間比較穩定，在pH值為7. 4時活性無下降，而在pH值為5. 9、 6. 0和9. 1時，活性基本 喪失。
表4室溫留樣觀察結果
時間(月)__活性(u) 活性回收率(％)
5 類白色粉末 ^
0.5 類白色粉末 7.62 99
1 類白色粉末 7.51 98
2 類白色粉末 7.65 99
3 類白色粉末 7.17 93
實驗結果顯示，凝血酶-殼聚糖固定化凝血酶在光照、低溫、高溫、室溫留樣觀察及酸 堿等不同條件下，均具有較好穩定性僅在60。C、 80'C高溫條件下該固定化酶的初凝時間延長 了，雖然用文中固定化凝血酶活性測定方法不能測出其活性(按標準曲線方程計算為負值)， 但實際凝血教果依然較好。
(三)凝血酶-殼聚糖納米微粒止血效果試驗 本實驗考察了本發明所制得的凝血酶-殼聚糖納米微粒對家兔體內出血模型的止血時 間，以驗證凝血酶-殼聚糖納米微粒的止血作用。 1材料和方法 1. 1材料
凝血酶-殼聚糖納米微粒按實施例4制備所得，批號070609;樣品用具有細小噴孔的 軟塑料瓶分裝。健康家兔，雌雄均用，體重2.5 3.0kg，(由南方醫科大學實驗動物中心提 供)；戊巴比妥鈉(南方醫科大學動物實驗中心)；云南白藥(云南白藥集團股份有限公司)； 普通紗布、可溶性止血紗布和膠原蛋白海綿，均由市場購得。
1. 2試驗方法
121.2. 1止血實驗
戊巴比妥鈉按30mg/kg體重于兔耳靜脈緩慢注入，麻醉動物。腹部剪毛，消毒鋪巾后， 沿右側肋緣下6cm切口，深度先至皮膚全層，再切開腹肌至腹膜層，提起腹膜，剪開進入腹 腔。從肋緣下找到肝臟，并暴露肝臟。在其平坦面，用15號手術刀片沿肝臟長軸先后劃出 長lcm，深lmm的兩條對稱性傷口，創面出血活躍。10S后兩側傷口按隨機化原則分別敷云 南白藥或凝血酶-殼聚糖納米微粒100mg，觀察創面出血情況，每隔3 5s觀察一次，傷口停 止出血的時間為止血時間；若2min內未再出血，即認為止血成功，記錄止血時間，并觀察 止血制劑與創面的粘合情況。
1. 2. 2統計學方法
采用SPSS10.0統計軟件包進行統計學分析。數據以均數土標準差表示，組間比較行配 對t檢驗P值〈0. 05為有統計學意義。 1.3出血時間(bleeding tirae， BT)
凝血酶-殼聚糖納米微粒組BT為0. 83±0. llmin，云南白藥對照組BT為3. 33±0. 37min。 經統計學分析，兩組比較差異有統計學意義(P〈0.01)。同時，凝血酶-殼聚糖納米微粒與創 面黏附良好，能有效地密封出血創面在止血操作中，先用紗布吸干出血后，再用凝血酶-殼 聚糖納米微粒覆蓋滲血創面可以起到良好的止血作用。
2結果和討論
凝血酶-殼聚糖納米微粒具有明顯的止血作用，主要作用表現在以下幾個方面首先凝 血酶-殼聚糖納米微粒對組織表面有較強的粘附性，特別是粘附在出血周圍的組織，吸收血 液后體積縮小，對創面形成壓迫作用，阻止進一步出血；吸收血液中的水份后使血液粘稠， 減少血液的流動性促進止血；凝血酶-殼聚糖納米微粒吸水后形成水凝膠，水凝膠分子中的 羥基能和纖維蛋白原分子形成氫鍵，促進纖維蛋白的交鏈，加速止血，這也是凝血酶-殼聚 糖納米微粒加速血液凝固減少出血量和縮短出血時間的主要作用機制。云南白藥吸收血液后 使血液變粘稠，但對創面的粘合性不強。^南白藥的止血作用不如凝血酶-殼聚糖納米微粒 理想。結論凝血酶-殼聚糖納米微粒是一種新型的可降解生物材料，具有肯定的止血作用。 在分子水平上凝血酶-殼聚糖納米微粒能增強纖維蛋白原的凝固性，縮短凝血酶時間；在大 體水平上凝血酶-殼聚糖納米微粒對組織表面具有較強的粘附性，壓迫創面止血，吸收血液 中的水份使血液粘稠，促進凝血，達到縮短止血時間和減少出血量的作用。
權利要求
1. 一種凝血酶-殼聚糖自組裝納米微粒的制備方法，其特征在于包括以下順序步驟(1)將殼聚糖加入到乙酸水溶液中，攪拌至完全溶解，形成殼聚糖乙酸水溶液；(2)將凝血酶加入至pH6.0-8.0緩沖液中，攪拌溶解，形成凝血酶溶液；(3)將凝血酶緩沖溶液加入到殼聚糖乙酸水溶液中，再加入交聯劑至濃度為0.01％-0.10％，升溫至30℃-50℃，以100轉/分鐘-800轉/分鐘的速度攪拌20分鐘-60分鐘，將其傾倒入至液體石蠟中，攪拌，再加入分散劑至濃度為1％-10％，以300轉/分鐘-1500轉/分鐘的速度高速攪拌2小時-8小時進行乳化；(4)取上述乳化液再加入交聯劑至濃度為0.5％-5.0％，攪拌20分鐘-60分鐘，使其分散均勻，置于30℃-50℃水浴中進行交聯，8小時-12小時，將產物冷卻至室溫，取出，進行過濾；(5)產物用丙酮洗滌2-5次，使得丙酮表面無漂浮油斑，即得凝膠狀半透明納米微粒；再以乙醇洗滌脫水，即得固態納米微球；(6)將制備產品置于真空干燥器中10℃-40℃溫度下真空干燥，得凝血酶—殼聚糖類白色或白色自組裝納米微粒。
2. 根據權利要求l所述的凝血酶-殼聚糖自組裝納米微粒的制備方法，其特征在于所述步驟(l)中乙酸水溶液的濃度為0. 5%-2. 5%。
3. 根據權利要求1所述的凝血酶殼聚糖自組裝納米微粒的制備方法，其特征在于所述步驟(l)中殼聚糖乙酸水溶液的殼聚糖濃度為0. 5%-8%。
4. 根據權利要求1所述的凝血酶-殼聚糖自組裝納米微粒的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中，凝血酶緩沖溶液與殼聚糖乙酸水溶液混合，其中殼聚糖與凝血酶的投料比為4: 0.5-2.0。
5. 根據權利要求l所述的凝血酶-殼聚糖自組裝納米微粒的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中凝血酶是人凝血酶、豬凝血酶、牛凝血酶或羊凝血酶。
6. 根據權利要求l所述的凝血酶-殼聚糖自組裝納米微粒的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中將凝血酶緩沖溶液加入到殼聚糖乙酸水溶液中時，對溶液緩慢攪拌。
7. 根據權利要求l所述的凝血酶-殼聚糖自組裝納米微粒的制備方法，其特征在于所述步驟(3)、 (4)中的交聯劑是聚乙二醇、海澡酸鈉或戊二醛。
8. 根據權利要求1所述的凝血酶殼聚糖自組裝納米微粒的制備方法，其特征在于所述 步驟(4)中的分散劑是司盤80、吐溫80或泊洛沙姆。
9. 根據權利要求l所述的凝血酶殼聚糖自組裝納米微粒的制備方法，其特征在于所述步驟(5)中的以乙醇洗滌脫水，是以70%、 80%、 90%及無水酒精依次脫水，得到固態 納米微球。
10.根據權利要求1制得的凝血酶-殼聚糖自組裝納米微粒，應用時可通過具有噴射功能 的裝置將其噴涂到創傷面上，用于普通外科、骨科、心胸外科、神經外科、腦外科、婦產科 的組織止血、組織封口和組織粘合。
全文摘要
本發明涉及凝血酶-殼聚糖自組裝納米微粒制備方法及用途。本發明將殼聚糖加入乙酸水溶液形成殼聚糖溶液；將凝血酶加入到緩沖液形成凝血酶溶液；將凝血酶溶液與殼聚糖溶液混合均勻，加入交聯劑攪拌后，將其倒入液體石蠟中攪拌，再加入分散劑，乳化；再加入交聯劑通過水浴進行交聯反應后，過濾，用丙酮洗滌后，再用乙醇洗滌脫水，最后真空干燥，獲得凝血酶-殼聚糖自組裝納米微粒。本發明將凝血酶與殼聚糖按比例投料首次制備得到自組裝成納米微粒的凝血酶-殼聚糖，保持其凝血酶的穩定性和更好地發揮其殼聚糖與凝血酶的綜合止血效果。本發明可廣泛應用于外科領域如普外科、骨科、心胸外科、神經外科、婦產科等的組織止血、組織封口和組織粘合。
文檔編號A61L15/38GK101485899SQ200810025839
公開日2009年7月22日 申請日期2008年1月16日 優先權日2008年1月16日
發明者李吉來, 江彩霞, 潘小寧, 肖尚志, 陳彥文, 星 黃 申請人:廣州倍繡生物技術有限公司