一種體內誘導出針對TNF-α分子的自身抗體的蛋白疫苗的構建方法

專利名稱：一種體內誘導出針對TNF-α分子的自身抗體的蛋白疫苗的構建方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術領域，具體涉及基因克隆、基因重組、外源基因在原核細 胞中的表達、目的蛋白的純化、動物免疫實驗、誘導抗血清的體外活性檢測以及惡病質 治療、急性肺損傷治療、類風濕性關節(jié)炎治療實驗等技術領域，進一步涉及一種在體內 能夠誘導出針對TNF- a分子的自身抗體的蛋白疫苗的構建方法。
背景技術：
1. TNF- a分子及抗TNF- a治療的相關研究 1. 1 TNF-a分子1975年Carsw11等發(fā)現，卡介苗和細菌內毒素感染的小鼠血清中有一種高活性的腫 瘤細胞毒因子，該物質可使腫瘤發(fā)生出血性壞死，但對正常組織細胞無殺傷活性，將其 命名為腫瘤壞死因子。經研究表明TNF - a是一種由單核/巨噬細胞分泌產生的多功能細 胞因子。人TNF-a基因位于第6號染色體，基因長4kb，由4個外顯子和3個內含子組 成，與MHC基因密切連鎖，其前體由232個氨基酸組成，含有76個氨基酸的信號肽。小 鼠TNF基因位于17號染色體，也由4個外顯子和3個內含子組成，其前體由235個氨基 酸組成。人和小鼠TNF前體有79呢的同源性，切除信號肽后形成的成熟型人TNF-a由157 個氨基酸組成，分子量約為17KD，較小鼠成熟型TNF在73位多一個組氨酸殘基。人和 小鼠的成熟型TNF分子中相同位置上有兩個半胱氨酸(人69、 101位；鼠69、 IOO位)， 可以形成分子內二硫鍵。從產生人TNF- a的細胞株培養(yǎng)上清中分離純化的TNF- a在非還 原的條件下分子量大小不等，在還原條件下分子量為17KD，與根據成熟型TNF氨基酸順 序推算的分子量理論值一致。這可能是因為TNF - a以不同程度的聚合體形式存在的原 因。目前己證實TNF活性形式是由3個17KD的亞基組成的三聚體。TNF-a是一種多功能的細胞因子。它除了能在體內、外殺傷腫瘤細胞外，還具有誘 導炎癥反應、抗病毒感染、調節(jié)機體免疫、促進細胞增殖和活化等多種功能。TNF-a對 腫瘤具有直接抑制和細胞溶解作用，但不同腫瘤株對TNF-a的敏感性不同。TNF-a抗 腫瘤的機制不完全清楚，目前的研究結果表明TNF-a抗腫瘤的機制主要有(1)通過與腫瘤細胞TNF的表面受體結合而發(fā)揮細胞毒作用。目前已知的TNF受 體有兩種，TNFR I和TNFRII ，均為跨膜糖蛋白。TNFR I通過其胞漿區(qū)的約80個氨基酸殘基的死亡區(qū)(DD)介導腫瘤細胞的凋亡。(2) 通過對血管內皮細胞的作用，誘導凝血因子的表達，增加纖溶酶原抑制劑的 分泌，從而促進血管內凝血及血栓的形成，造成腫瘤組織的局部流血阻斷而發(fā)生壞死。(3) 通過介導殺瘤效應細胞的作用和誘導腫瘤局部的炎癥反應，促進殺瘤效應細 胞的作用。在抗病毒方面，TNF- a可以選擇性的殺傷病毒感染的細胞，并對不同的病 毒感染具有不同的作用。如對VSV、 HSV等病毒具有抑制作用，但是對HIV具有促進作 用。另外，TNF- a是重要的炎癥因子， 一方面它可以刺激內皮細胞表達MHCI類抗原和 多種黏附分子的表達，促進IL-1、 IL-6的表達，刺激內皮細胞和白細胞釋放一系列炎 癥介質。另一方面TNF- a可促進中性粒細胞、淋巴細胞及單核細胞黏附在內皮細胞上， 從而參與炎癥反應。TNF- a還能夠促進T細胞和B細胞增值，促進B細胞產生抗體； 活化單核細胞和巨噬細胞，提高其殺傷活性；上調巨噬細胞MHCII類分子，提高其抗原 呈遞能力；提高巨噬細胞的吞噬能力增強ADCC作用。TNF - a還可以促進細胞增殖和分化，可以誘導骨髓樣白血病細胞向巨噬細胞分化， 促進T細胞、B細胞的增殖，并對某些腫瘤細胞具有生長因子樣的作用，并協同EGF、 TOGF和胰島素的促增殖作用，促進EGF受體的表達。 1. 2抗TNF-a治療雖然TNF-a自體內具有多種生物學活性，但是研究發(fā)現，TNF-a在體內持續(xù)、高水 平的表達時在多種疾病中發(fā)揮重要的作用，如惡液質、胰島素抵抗、感染性休克、炎 癥反應、自身免疫性疾病、移植抗宿主病等。TNF-a的這些負面作用也使其成為藥物研 究的重要靶點，研制TNF-a拮抗藥物為治療TNF-a水平增高相關疾病提供了一條好的途 徑。傳統的用于治療體內TNF-ci的過量表達相關疾病的藥物主要有非甾類抗炎藥 (NSAIDS)，緩解疾病的抗風濕藥物(DMARD)，皮質甾類、免疫抑制劑和止痛劑。但 是這些藥物有的具有長期毒性，并且一些患者對此類藥物的治療不敏感。近年來， 一些 治療此類疾病的新藥相繼問世。主要有氨甲喋呤、來氟米特和一些生物制劑。氨甲喋 呤是一種葉酸類似物，其作用與免疫抑制和抗炎活性有關，但具有肝毒性。來氟米特是 Aventis公司開發(fā)的一種治療類風濕關節(jié)炎的藥物，是一種免疫抑制劑，但在近年的臨床 用藥中發(fā)現，該藥也具有肝毒性，并且與出生缺陷有關。生物制劑主要是TNF-ci拮抗 藥物，經臨床治療研究發(fā)現TNF-a拮抗藥物對此類疾病有較好的療效，并且具有較小 的副作用。目前，TNF- a拮抗藥物有infliximab、etanerc印t、adalimumab、CDP571和CDP870。其中■ infliximab、 etanerc印t禾口 adalimumab藥物已通過FDA批準。Enbrel，屬名 Etanerc印t，是美國I腿nex和Wyeth-Ayerst Laboratories公司研制的基因重組 sT隨5與人IgGFc段的融合蛋白，可同時抑制TNF - a和TNF - P ， 1998年11月被FDA 批準用于治療青少年類風濕關節(jié)炎和腰肌炎，是第一個用于臨床上的基因工程可溶性受 體和抗TNF- a藥物。Remicade，屬名Infliximab,是Johnson & Johnson公司研制的 一種對人TNF- a具有中和活性的人鼠嵌和抗體，該抗體可變區(qū)為小鼠蛋白，而恒定區(qū) 則為人的蛋白序列，因此，其抗原性較小。Remicade可特異性結合可溶性及膜結合型TNF-a，從而抑制TNF-a引起的免疫及炎癥反應，1999年11月該抗體被FDA批準用來治療 類風濕關節(jié)炎，后又被FDA批準用來治療Crohn病，是第二個用于臨床上的基因工程抗 TNF - a藥物。Adalimumab是Abbott公司研制的一種具有TNF - a特異中和活性的重組 的完全的人IgGl單克隆抗體，比Remicade具有更小的抗原性，2002年12月被FDA批 準用來治療類風濕關節(jié)炎，很快又被FDA批準用來治療Crohn病，成為第三個用于臨床 上的基因工程抗TNF- d藥物。近年來，臨床研究表明抗TNF-ci在臨床治療類風濕關節(jié) 炎取得了較好的療效。2002年美國風濕病學會發(fā)布的類風濕性關節(jié)炎治療最新指南指 出，早期RA患者和使用DMARDS治療無效的患者對etanerc印t有效。使用足量氨甲喋呤 不能控制的進行性活動性的RA患者，etanerc印t和infliximab聯合使用有效，目前推 薦單獨使用infliximab或與氨甲喋呤聯合治療。Bang等]進行了對照實驗，研究了 Adalimumab對類風濕性關節(jié)炎的治療效果，結果發(fā)現，Adaliraumab和氨甲喋呤聯合用藥 或單獨使用Adalimumab比安慰劑和氨甲喋呤聯合用藥或采用標準的治療類風濕性關節(jié) 炎的方法有更高的ACR20、 ACR50和ACR70，使用Adalimumab可以明顯延緩關節(jié)損傷的 進程，并且具有起效快、藥效持續(xù)時間長、耐受性好的優(yōu)點。TNF-a拮抗藥物治療除了可用于類風濕性關節(jié)炎的治療外，也可應用于其他TNF-a水平增高相關疾病的治療，如，惡病質、克隆病、強直性脊柱炎、銀屑病關節(jié)炎、自 身免疫性皮膚病、移植抗宿主病、非感染性色素層炎和鞏膜炎等炎癥和自身免疫性疾病。雖然，在臨床上TNF- a單克隆抗體和可溶性受體具有較好的療效，但是，這些藥 物存在有用藥量大、需長期反復使用、易引起超敏反應的缺陷。除此之外，昂貴的藥費 也是阻礙此類藥物廣泛應用的原因。據統計，臨床上每位接受Enbel治療的病人平均年 花費為1. 5萬美元，接受Humiral或Remicade治療的病人平均年花費為9萬美元，如 此昂貴的藥費即使在發(fā)達國家也是難以負擔的。 2.治療性疫苗 2. 1研究進展近年來，針對人類自身蛋白的單克隆抗體在治療急、慢性疾病的過程中顯示出了良 好的效果。但是，造價的昂貴和使用上的不便限制了單克隆抗體的廣泛應用，因此，由 被動地接受這種抗體蛋白轉向尋求針對人類自身蛋白的主動免疫疫苗，既用主動免疫的 治療方式替代被動免疫，成為蛋白藥物的發(fā)展方向。目前，治療性疫苗的研究已成為一 個熱點，涉及很多疾病，如慢性病毒感染、過敏、腫瘤、阿爾海默茨病、糖尿病、高 血壓、肥胖癥以及風濕性關節(jié)炎等。治療性疫苗使人的免疫系統發(fā)生有利于患者的反應。大部分的疫苗可以分為兩大 類 一類是誘導機體發(fā)生體液免疫反應，產生抗體；另一類是誘導機體發(fā)生細胞免疫反 應，產生細胞毒性T細胞(CTLs)。后一類治療性疫苗主要用于腫瘤和病毒感染性疾病 的治療。絕大多數的預防性疫苗都是通過誘導抗體的產生來保護機體的，這就證明通過誘導 抗體來治療感染性疾病是一種有效的治療方法。與預防性疫苗相比，治療性疫苗的發(fā)展 就要緩慢的多，直到近幾年治療性疫苗才看到成功的希望。同時，單克隆抗體在治療疾 病方面所取得的巨大成功預示著能夠在體內誘導抗體產生的治療性疫苗有著廣闊的發(fā) 展前景。實際上，已經有動物試驗表明誘導出一定水平的內源性特異性抗體來治療疾病 是可能的，如阻斷TNF-a以治療炎癥性疾病。人源化的抗TNF-a單克隆抗體已經被證明在治療類風濕性關節(jié)炎和Crohn' s病 (節(jié)斷性回腸炎)方面十分有效。目前已經有幾種TNF-a的阻斷劑上市，包括兩種單 克隆抗體(infliximab, adalimumab)和一種受體阻斷劑(etanerc印t)，它們正在幫 助成千上萬的病人減輕痛苦，而且年收入達到20億美元。所以阻斷過量表達的TNF-a 能夠達到治療疾病的效果。在動物試驗中已經證實通過主動免疫可以特異性誘導出 TNF-a的中和性抗體，而且誘導的抗體滴度足以治療動物關節(jié)炎模型。其他的動物試驗表明，可以通過誘導體內產生高滴度抗體來治療以下疾病針對血 管緊張素的疫苗可以治療高血壓；針對IL-9的疫苗可以治療病原體引起的嗜酸性細胞增 多癥；針對IL-5的疫苗可以治療哮喘；針對N-methyl-D-aspartate rec印tor-1 (NMDAR1) 的疫苗可以治療中風。另外，針對一些性激素如人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotro- pin HCG)的免疫可以降低婦女體內的激素水平而達到避孕效果；針對促性 腺素釋放激素(GnRH)的疫苗可以用于治療晚期前列腺癌；在晚期胰腺癌病人中，利用 治療性疫苗誘導出針對胃泌素(gastrin)的抗體可以延長病人的生命。那么，治療性疫苗的研究中存在哪些問題呢？最近在針對阿爾海默茨病的治療性疫 苗的研制過程所發(fā)生的情況似乎對這個問題做了回答。阿爾海默茨病是一種看起來非常適合用治療性疫苗進行治療的疾病，這種病的發(fā)病過程長達數年甚至數十年。如果能用 治療性疫苗誘導出持續(xù)時間較長的抗體的話，那么無疑是一種理想的治療方法，尤其是 這種病人經常忘記吃藥。阿爾海默茨病的特征是大腦中斑塊的沉積，這種斑塊中含有Ae-肽，這種AP-肽 是從淀粉樣蛋白的前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)衍生來的。在編碼APP 的基因發(fā)生突變導致A 0 -肽的生成增加的人群中，阿爾海默茨病在早年就開始發(fā)生了 。 表達這種突變的APP的轉基因小鼠大腦內有大量的斑塊沉積，這種斑塊與阿爾海默茨病 病人腦中發(fā)現的斑塊相似。用AP-肽加上強免疫佐劑來免疫這種轉基因小鼠會使小鼠腦 中的斑塊減少，小鼠的精神表現明顯好轉。隨后， 一種針對阿爾海默茨病的治療性疫 苗開始了臨床試驗，在臨床I期試驗證明其有良好的耐受性后，包括300多名病人的臨 床II期緊跟著開始了，但是沒有想到的是6%的試驗對象由于產生無菌性腦炎而被迫停 止試驗。隨后研究證實，這種副作用與抗體的滴度沒有關系，實際上， 一名沒有產生抗 體反應的受試病人也得了無菌性腦炎。另外，在一名病人的大腦中發(fā)現有大量的淋巴細 胞浸潤。這些研究結果與一種假說相一致，那就是在病人中發(fā)現的副作用是由于AP-肽特異性的T淋巴細胞引起的，而不是由于抗體引起的。這就要求能夠研制出不引起T 淋巴細胞介導的自身免疫的第二代疫苗。那么，這種針對阿爾海默茨病的治療性疫苗的 效果如何呢？在前面提到的臨床II期試驗中，在誘導出抗A P -肽抗體的病人中有一部分 認知力的減弱確實推遲了，有一些病人甚至在接受治療的這一年中意識狀態(tài)有了好轉。 如果在疫苗設計時能夠解決其安全性問題，那么在不久的將來，針對阿爾海默茨病的治 療性疫苗就會出現。另一類稍有不同的疫苗對安全性的要求更低一些，那就是針對上癮藥物的疫苗。在 動物試驗中針對可卡因和尼古丁的疫苗降低了這些藥物在大腦中的水平，消除了它們的 成癮癥狀，試驗動物在接受了免疫后對藥物不再依賴。在臨床I期試驗中，可卡因疫苗 被證明有良好的耐受性，并且可以誘導出良好的抗體反應，現在，人們正在翹首以待它 的有效性結果。2. 2誘導自身抗體的理論研究針對自身蛋白的治療性疫苗是如何誘導自身免疫系統產生針對自身蛋白的抗體 呢？要產生足夠高的滴度的特異性抗體以治療相關疾病，治療性疫苗必須克服三個障 礙T細胞耐受、B細胞耐受、在沒有佐劑和抗原長效制劑的情況下誘導出抗體。眾所 周知，人體免疫系統主要是對外來入侵者發(fā)動攻擊的，而對機體本身是不攻擊的，這可 能是由于機體具有能夠識別"非我"與"自我"的能力。免疫系統的這種特性通常被稱為耐受或無反應性。耐受發(fā)生在B細胞和T細胞水平。 一般來說，T細胞耐受更嚴格一 些。對許多抗原來說，在發(fā)生T細胞耐受的同時，正常的B細胞株卻在體內存在。實際 上，有三種機制導致了免疫耐受細胞株剔除，即特異性的淋巴細胞從淋巴細胞群中被 徹底剔除；免疫無能，即特異性的淋巴細胞存在，但其功能不能被激活；免疫忽略，即 具有免疫功能的淋巴細胞存在，但是由于沒有遇到以抗原形式存在的自身抗原，所以不 能被激活。對T細胞來說，誘導耐受和無能的主要器官是胸腺(中心耐受)，但誘導耐 受也可以在外周進行。B細胞耐受主要在骨髓中誘導，但也可在外周誘導。通常，對于 普遍表達的豐富抗原的免疫耐受更容易闡明。在針對外來抗原的免疫反應中，T細胞和B細胞互相配合才能有效地產生抗體當 受到外來抗原免疫時，特異性的B細胞結合抗原，產生起始的激活信號。另外，B細胞 內吞抗原，在其表面呈現抗原肽和MHCII類分子的復合物。通常，B細胞不能激活TH細 胞。要激活TH細胞，樹突狀細胞是必不可少的，樹突狀細胞攝取抗原，并在其細胞表 面呈遞抗原肽和MHCII類分子的復合物，激活TH細胞。激活后的TH細胞識別B細胞表 面呈現的抗原肽和MHCn類分子的復合物，引起B(yǎng)細胞增殖、抗體的產生以及抗體類別 的轉換。如果因為免疫耐受而缺乏TH細胞的協同作用，那么就不會產生抗體。在針對 自身蛋白的疫苗的設計過程中，如果將自身抗原與外源蛋白或多肽載體融合或偶聯在一 起，就有可能繞過TH細胞耐受自身抗原特異性的B細胞就能夠攝取該自身抗原以及 與其相連的載體蛋白，并在其表面呈現載體肽與MHCII類分子的復合物，由于TH細胞對 載體蛋白沒有免疫耐受，所以能夠被激活，從而協同自抗原特異性的B細胞產生針對自 身抗原的特異性抗體。與T細胞耐受相比，B細胞耐受要寬松得多。實際上，在許多情況下，自身特異性B 細胞在體內以正常的頻率出現，如果受到抗原和TH細胞的共同作用就會被激活。所以對 許多可溶性自身蛋白來講，體內存在其特異性B細胞株，尤其當這種蛋白不是非常富余 表達的時候更是這樣。對于這類蛋白或多肽，將其與載體蛋白相連，繞過T細胞耐受， 就有可能產生有效的疫苗。實際上，利用這種策略，針對多種自身激素的抗體反應已經 被誘導出來了。3、 TNF-a自體疫苗的研究進展目前，TNF-ci疫苗研究主要集中在篩選TNF-ci抗原表位、融合蛋白疫苗和DNA疫苗 幾個方面。Sioud等用人TNF純化類風濕關節(jié)炎病人的抗血清，得到具有TNF-a中和活 性的TNF-a自身抗體，用此抗體篩選噬菌體隨機九肽庫，用篩選得到的噬菌體顆粒免疫 小鼠，誘發(fā)了鼠抗人TNF-a抗體，研究表明重組噬菌體可作為疫苗研究的有效工具。Dalum等用T輔助細胞表位和TNF- a融合表達的蛋白免疫二型膠原誘導的關節(jié)炎小鼠模 型，結果小鼠的癥狀得到了緩解，為類風濕關節(jié)炎和慢性感染疾病的治療開辟了一條新 途徑。Blank等用編碼TNF- a的DNA免疫抗磷脂綜合癥的小鼠，在小鼠體內誘發(fā)了抗TNF-a抗體，這些抗體可以阻滯TNF-a引起的內皮細胞活性，抑制了單核細胞對活化的內皮 細胞的黏附，與對照組相比可以明顯的改善抗磷脂綜合癥小鼠的癥狀。Waterston等比 較了TNF-a單克隆抗體和TNF-a自體疫苗在治療腫瘤轉移的效果，結果表明兩者在小鼠 體內都可成功的減少肺腫瘤的轉移。近來Waterston等通過一期臨床試驗評估了 TNF-a 自體疫苗的免疫原性和安全性，不幸的是盡管疫苗誘發(fā)的血清抗體可以識別變性的人 TNF-a分子，但是卻不能中和天然狀態(tài)的人TNF-a分子，分析原因可能是因為抗原的純化過程中是抗原變性的原因。以上研究表明，雖然TNF- a自體疫苗也是一種治療TNF- a表達過高相關疾病的好方 法，但是，篩選有效的T細胞輔助表位，適合的表位插入位置以及適合純化方法都成為 TNF-a自體疫苗研究的關鍵性問題。發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于，提供一種篩選出一種人TNF-a自體疫苗分子，使之在體內誘 導出針對人TNF- a分子的特異性抗體的治療性疫苗，為TNF- a表達過高的相關疾病提供 一種新的治療藥物。為了實現上述目的，本發(fā)明所采用的技術方案是首先對小鼠TNF-a基因系列截短，將其克隆入pGEX-4T-l原核表達載體，轉化大 腸桿菌。在大腸桿菌中獲得高效表達，菌體蛋白走SDS-PAGE后，切膠免疫小鼠，通過對 誘導的抗體滴度的分析結合計算機輔助設計確定T輔助表位的插入位置為小鼠TNF126 位至140位氨基酸序列，相應人TNF127位至141位氨基酸。利用人工合成的方法用編碼TT830-844 ( QYIKANSKFIGITEL ) 、 HEL46-61 (NTDGSTDYGILQINSR)和PADRE (AKFVAAWTLKA)氨基酸的基因序列替換編碼小鼠TNF-a 126位至140位氨基酸序列的核酸，從而獲得mTNF-TT, mTNF-HEL， mTNF-PADRE基因 片段，將其插入pBV220原核表達載體，轉化大腸桿菌。在大腸桿菌中獲得高效表達，經 純化后得到mTNF-TT, mTNF-HEL, mTNF-PADRE蛋白。本發(fā)明構建出的三種TNF-a融合蛋白疫苗，用該蛋白進行免疫后，在小鼠體內可產 生高滴度的抗mTNF-ci自身抗體，并且該抗體的血清能夠在體外中和mTNF-a對L929細 胞的殺傷作用。比較這三種分子誘導針對mTNF-a自身抗體的滴度，篩選出mTNF-PADRE 具有最好的免疫效果。用mTNF-PADRE重組蛋白免疫小鼠可以減輕mTNF- a誘導的惡病質小鼠，LPS誘導的急性肺損傷小鼠的以及二型膠原誘導的類風濕性關節(jié)炎的癥狀。將構建好的pBV220-mTNF-TT， pBV220-mTNF-HEL， pBV220-mTNF-PADRE質粒轉化大腸 桿菌，在大腸桿菌中獲得高效表達。表達產物經裂菌、溶解包涵體、凝膠柱純化，蛋白純度可達95%以上。純化后的 mTNF-TT， mTNF-HEL， mTNF-PADRE蛋白在體外能夠與小鼠TNF-a多克隆抗體結合，并且 失去了小鼠TNF-a的生物活性。用純化的mTNF-TT， mTNF-服L， mTNF-PADRE蛋白免疫小 鼠，比較抗血清，mTNF-PADRE具有最好的免疫效果。在小鼠體內經mTNF-PADRE蛋白免 疫后，能夠減輕mTNF-ci誘導的惡病質小鼠，LPS誘導的急性肺損傷小鼠的以及二型膠原 誘導的類風濕性關節(jié)炎的癥狀。本發(fā)明中的mTNF-TT， mTNF-HEL ， mTNF-PADRE蛋白的制備方是人工合成 mTNF-TT830-844， mTNF-HEL46_61 ， mTNF-PADRE基因片段，將該片段插入pBV220載體中 構建mTNF-TT830-844 , mTNF-HEL46-61 , mTNF-PADRE蛋白基因；含有目的基因 mTNF-TT830-844， mTNF-HEL46_61, mTNF-PADRE的原核表達載體的構建及重組蛋白表達； 表達產物的鑒定；重組蛋白的純化；mTNF-TT830-844， mTNF-HEL46_61， mTNF-PADRE蛋 白免疫小鼠后產生的抗血清與小鼠TNF-a的結合作用；該抗血清在體外可以中和小鼠 TNF-a對L929細胞的殺傷；比較這三種分子誘導針對mTNF-a自身抗體的滴度，篩選出 mTNF-PADRE具有最好的免疫效果。本發(fā)明篩選的重組小鼠mTNF-PADRE蛋白，通過免疫小鼠可以突破小鼠的免疫限制， 產生高滴度抗小鼠TNF-a自身抗體，其對應的重組人TNF-PADRE融合蛋白從而有可能在 人體內產生抗人TNF-a自身抗體，為TNF-a表達過高的相關疾病的免疫治療提供一種新 的蛋白質藥物。該自體疫苗的應用目的在于以TNF-a為靶點篩選獲得一種能夠促使體內產生針對 TNF-a分子的中和抗體的自體疫苗，從而研究應用主動免疫的方法進行TNF-a表達過高 的相關疾病的免疫治療。進而減少單抗副作用，減輕病患負擔。


圖l是GST融合小鼠TNFa系列截短體表達質粒酶切鑒定結果，圖中的標號為1、 DL2000, 2、 <formula>formula see original document page 11</formula>酶切鑒定結果，3、 <formula>formula see original document page 11</formula>酶切鑒定結果，4、 <formula>formula see original document page 11</formula>酶切鑒定結果，5、 <formula>formula see original document page 11</formula>酶切鑒定結果，6、 <formula>formula see original document page 11</formula>酶切鑒定結果，7、 <formula>formula see original document page 11</formula>酶切結果。圖2是GST融合小鼠TNFa系列截短體IPTG誘導表達結果圖中的標號為1、蛋白分子量標準，2、pGEX-4T-l-mTNFa/ DH5alPTG誘導，3、pGEX-4T-l-mTNFal-149/ DH5alPTG 誘導，4、 pGEX-4T-l-mTNFal-122/DH5alPTG誘導，5、 pGEX-4T-l-mTNFal-67/DH5alPTG 誘導，6、 pGEX陽4T-l-mTNFal-39/DH5alPTG誘導，7、 pGEX-4T-l-mTNFa/DH5a未誘導。 圖3是GST融合小鼠TNFa系列截短體的Western Blot鑒定結果；圖中的標號為1、 蛋白分子量標準，2、 pGEX-4T-l-mTNFa/ DH5alPTG誘導，3、 pGEX-4T-l-mTNFal-149/ DH5alPTG誘導，4、 pGEX-4T-l-mTNFal-122/DH5alPTG誘導，5、 pGEX隱4T-l-mTNFal-67/ DH5alPTG誘導，6、 pGEX-4T-l-mTNFal-39/ DH5alPTG誘導，7、 pGEX-4T-l-mTNFa/ DH5a 未誘導。圖4是mTNFa及GST融合小鼠TNFa系列截短體的切膠定量，圖中的標號為，1、 蛋白分子量標準，2、 GST-mTNFa， 3、 GST-mTNFal-149， 4、 GST-mTNFal-122， 5、 GST-mTNFal-67， 6、 GST-mTNFal-39， 7、 mTNFcu圖5是mTNFa及GST融合小鼠TNFtt系列截短體免疫抗血清的鑒定。圖6是小鼠和人TNF- a抗原表位預測結果。其中(A)是小鼠TNF- a抗原表位預測結果， (B)是人TNF-a抗原表位預測結果；圖7是pBV220-mTNF-TT、 pBV220-mTNF-HEL、 PBV220-mTNF-PADRE表達載體質粒酶切圖。 A pBV220-TNF-TT酶切鑒定結果1、 DL2000, 2、 pBV220iTNF-TT ￡bof I和尸W I酶切結果， 3、 pBV220I和尸W I酶切結果；B pBV220_mTNF-HEL和pBV220-mTNF-PADRE酶切鑒定 結果1、 DL2000, 2、 pBV220-mTNF-HEL fcoWI和5kH酶切鑒定結果，3、 pBV220-mTNF-PADRE I和I酶切鑒定結果，4、 pBV220 fcoy I和I酶切結果。圖8是pBV220-mTNF-TT/ DH5 a ， pBV220-mTNF-HEL/ DH5 a和pBV220-mTNF-PADRE/ DH5 a 誘導表達結果。圖中的的標號為l、蛋白分子量標準，2、 pBV220-mTNF-TT/DH5 a未誘導， 3、pBV220-mTNF-TT/ DH5 a誘導，4、pBV220-mTNF_HEL/DH5 a誘導，5、pBV220-mTNF-PADRE/ DH5a誘導。圖9是mTNF-TT、 mTNF-HEL、 mTNF-PADRE的純化結果，圖中的標號為Al mTNF-TT過凝膠柱層析圖。Bl mTNF-TT過凝膠柱SDS-PAGE結果1、蛋白分子量標準，2、 上柱前，3、峰l， 4、峰2 (目的蛋白峰)，5、 mTNF-TT復性后；A2 mTNF-HEL過凝 膠柱層析圖。B2 mTNF-HEL過凝膠柱SDS-PAGE結果1、蛋白分子量標準，2、上柱前，3、 峰l， 4、峰2， 5、峰3 (目的蛋白峰)，6、 mTNF-HEL復性后；A3 mTNF-PADRE過凝 膠柱層析圖。B3 mTNF-PADRE過凝膠柱SDS-PAGE結果1、蛋白分子量標準，2、上柱前， 3、峰l, 4、峰2 (目的蛋白峰)，5、 mTNF-PADRE復性后。*為目的蛋白峰。圖10是mTNF-TT、 mTNF-HEL、 mTNF-PADRE、 mTNF純化蛋白的Western-blot鑒定，其中，l、蛋白分子量標準，2、 pBV220-mTNF-TT/ DH5a未誘導，3、 mTNF-TT純化蛋白，4、 mTNF-HEL純化蛋白，5、 mTNF-PADRE純化蛋白，6、 mTNF純化蛋白。 圖ll是mTNF-TT、 mTNF-HEL、 mTNF-PADRE的生物活性鑒定； 圖12是mTNF-TT、 mTNF-HEL和mTNF-PADRE誘導的抗血清比較，A結合活性比較在1000倍和10， 000倍稀釋時，mTNF-PADRE組P<0.05 vs. mTNF-TT組，PO.01vs. mTNF-HEL組；B中和活性比較在2倍和4倍稀釋時，mTNF-PADRE組p<0.05 vs.mTNF-TT組，p<0.01 vs. mTNF-HEL組。圖13是mTNF-PADRE自體疫苗分子對惡病質小鼠疾病模型的治療，其中，A、體重比較*P<0.05， **P<0.02， ***P<0.01; B、生存率比較mTNF-PADRE組P<0.05 vs生理鹽水組。圖14是mTNF-PADRE自體疫苗分子對內毒素休克小鼠疾病模型的生存期的影響，其中， 生存率比較mTNF-PADRE組P<0.05 vs生理鹽水組，mTNF-PADRE plus with adjuvant組 P>0.05 vs生理鹽水組。圖15是mTNF-PADRE自體疫苗分子對二型膠原誘導的類風濕性關節(jié)炎小鼠發(fā)病率和小 鼠發(fā)病肢數影響，其中，A 。 二型膠原誘導的類風濕性關節(jié)炎小鼠發(fā)病率，B、 二型膠原誘 導的類風濕性關節(jié)炎小鼠小鼠發(fā)病肢數；圖16是mTNF-PADRE對CIA小鼠關節(jié)炎后足足厚的影響(*P<0.05)。圖17是mTNF-PADRE自體疫苗分子對二型膠原誘導的類風濕性關節(jié)炎小鼠關節(jié)評分的 影響。圖18是小鼠膝關節(jié)和踝關節(jié)病理檢測。 以下結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述。
具體實施方式
依照本發(fā)明的技術方案制備的人TNF治療性自體疫苗，首先篩選TNF分子的外源T 輔助表位插入位置，利用小鼠TNF- a系列截短體構建與GST融合表達的系列融合蛋白， 切膠免疫小鼠，通過對誘導的抗體滴度的分析結合計算機輔助設計確定T輔助表位的插 入位置為小鼠TNF126位至140位氨基酸，相應人TNF的127-141位氨基酸；然后篩選適 合的外源T輔助表位，用編碼TT830-844 ( QYIKANSKFIGITEL ) ， HEL46-61 (NTDGSTDYGILQINSR)和PADRE (AKFVAAWTLKA)氨基酸的核酸序列替換小鼠TNF-a 126 位至140位氨基酸的核酸序列，從而獲得mTNF-TT、 mTNF-HEL、 mTNF-PADRE融合蛋白， 純化后免疫小鼠，比較這三種分子誘導針對mTNF-a自身抗體的滴度和體外中和mTNF-a活性的能力，篩選出mTNF-PADRE具有最好的免疫效果。用mTNF-PADRE重組蛋白免疫小鼠不僅可以減少mTNF- a誘導的惡病質小鼠體重的減輕，同時還可以延長mTNF- a誘導 的惡病質小鼠的生存期；延長LPS誘導的急性肺損傷小鼠的生存期；減輕二型膠原誘導 的類風濕性關節(jié)炎的癥狀。其對應的重組人TNF-PADRE融合蛋白從而有可能在人體內產 生抗人TNF- a自身抗體，為TNF- a表達過高的相關疾病的免疫治療提供一種新的蛋白質 藥物。實現本發(fā)明疫苗的篩選，疫苗構建和純化，免疫動物，抗體檢定以及動物實驗工作， 按以下步驟完成 1.疫苗的制備和篩選 1. 1疫苗表位插入位置的篩選 1.1.1 GST-mTNF系列截短體表達載體的構建依照小鼠TNF-a的氨基酸序列和大腸桿菌偏愛密碼子設計小鼠TNF-a的基因序列，交上海生工生物技術有限公司全基因合成，合成的基因克隆入pUC57中構建含有小鼠 TNF- a的克隆載體pUC57-mTNF- a 。設計引物對克隆載體pUC57-mTNF- a進行PCR獲得上 游含有EcoRl酶切位點，下游含有Sall酶切位點和終止密碼子的小鼠TNF-a的全長基 因和系列小鼠TNF-ci截短體基因，截短從小鼠TNF-ci的C端開始，截短位置為149位， 122位，67位和39位氨基酸，克隆入載體pGEX-4T-1中。構建pGEX-4T-1-mTNF-a ， pGEX-4T-卜mTNF- a 149 , pGEX-4T-1-mTNF- a 122 ， pGEX-4T-l_mTNF- a 67 和 pGEX-4T-1-mTNF- a 39融合蛋白表達載體。構建的質粒載體分別轉化感受態(tài)細胞DH5 a ， 挑取單克隆培養(yǎng)過夜，提取質粒，經酶切鑒定獲得預期大小的插入片段(圖l),進行測 序。工程菌命名為pGEX-4T-1-mTNF- a /DH5a ， pGEX-4T-1-mTNF- a 149/DH5a ， pGEX-4T-l-mTNF- a 122/DH5 a ， pGEX_4T-1-mTNF- a 67/DH5 a和pGEX-4T-1-mTNF- a 39/DH5 a 。全長小鼠TNF-a的基因序列為CTCCGTTCATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCACGTCGTAGCAAACCACCAAGTGGAGGAGAGAAGGGTGACCAACTCAGCGCTGAGGTCAATCTGCCGAAGTACTTAGACTTTGCGGAGTCCGGTCAGGTCTACTTTGGCGTTATTGCTCTG1.1.2重組蛋白表達挑取工程菌單菌落接種于5mLLB培養(yǎng)液(含AmplOOmg/L)中，37'C搖床培養(yǎng)過夜， 次日以l: IOO的比例轉接到含A卿的LB培養(yǎng)液中，在37'C搖床培養(yǎng)3h至對數生長中 期(ODe。。為0.4 0.6)，加入終濃度為lmmol/L的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)4h。離心收集菌體。 1.1.3表達產物的鑒定 1.1.3.1SDS-PAGE鑒定取少許菌體蛋白加入30 u L水和30u L 2X載樣緩沖液，混勻。沸水中煮5min， 12000 rpm離心5 min,取10 y L上清加樣于15%分離膠6%濃縮膠，電壓160 V約lh，用0. 5% 考馬斯亮蘭R-250振蕩染色2 -3 h，脫色直至背景清晰后制備千膠保存(圖2)。 1.1.3.2免疫印跡反應SDS-PAGE結束后，按Bio-Rad產品說明，凝膠靠近陰極一側，硝酸纖維膜(NC膜) 靠近陽極一側，置轉移緩沖液中(25 mmol/L Tris、 192 mmol/L Glycine、 20%甲醇)， 100V恒壓lh,將蛋白從凝膠電轉移至NC膜上，電轉移結束后，取出NC膜，用洗滌液 TBST (含0. 02 mol/L pH7. 4 TBS、 0. 4% Tween20)室溫洗3次，浸入封閉液(含2% BSA 的TBST)中37'C， lh，洗漆液(TBST)室溫洗3次，加入羊抗小鼠TNF-a多克隆抗體， 37'C孵育lh， TBST室溫洗膜3次，加入兔抗羊IgG-AP 二抗，37'C孵育1 h， TBST室溫 洗膜3次，再用TBS洗3次，NC膜浸入顯色液中，室溫避光顯色5min，蒸餾水沖洗終 止反應(圖3)。 1.1.4融合蛋白抗原的制備用己知量的人血清白蛋白作為對照，走SDS-PAGE對以上系列融合蛋白進行定量分 析(圖4)，對目的蛋白條帶進行切膠，充分研磨后，稀釋至相同濃度免疫BALB/C小鼠。 1.1. 5動物免疫1. L 5.1 BALB/C小鼠分組與免疫方案分組將35只雄性BALB/C小鼠分成7組，分別為GST切膠對照組，天然mTNF組， GST-mTNF組，GST- mTNF149組，GST-mTNF122組，GST-mTNF67組，GST-mTNF39組。在 第4次免疫后10天摘眼球采血，測定血清中抗mTNF抗體效價。免疫方案背部皮下多點注射；融合蛋白30yg/只；溶液總體積為200 P L/只，分 別隔周注射。1.1. 5. 2抗血清ELISA鑒定在第4次免疫后10天采血，收集抗血清，通過間接ELISA測定血清抗mTNF抗體效 價。ELISA實驗方法如下-所需溶液的配制a. 包被緩沖液: 碳酸鹽緩沖液取Na2CO3: 0.32g(終濃度0.015mol/L), NaHCO3: 0.59g(終濃度 0.035mol/L), 純水定容至200mL(pH 9.6), 有效期: 兩周.
b. 洗滌液: 含0.5%Tween-20的PRS (pH 7.4).
c. 封閉液: 含1%BSA的洗滌液.
d. 稀釋液: 含0.5%BSA的洗滌液.
e. 底物緩沖液: Na2PHO4.12H2O: 1.84g, 檸檬酸: 0.51g純水定容至100mL(pH 5.0).
f. 底物顯色液: OPD: 8mg, 3% H2O2: 30 uL.
h. 終止液: H2SO4:１mol/L.
操作方法
包被取96孔ELISA板, 小鼠TNF-a蛋白溶解于包被緩釋液中(0.5ug/mL), 按100uL/孔加入孔板中. 4.C包被過夜.
然后倒掉包被緩釋液加入封閉液, 室溫封閉2h;
棄去封閉液, 用洗滌液洗6次, 每次2min;
分別加入倍比稀釋的小鼠人抗B7-H1單抗(500ug/mL)和抗血清, 100uL/孔, 室溫孵育1h;
棄去單抗和抗血清, 用洗滌液洗滌6次, 每次3min;
加入底物顯色液, 100uL/孔, 室溫, 顯色10min-20min;
加入終止液, 50uL/孔, 終止反應;
酶標儀讀數, 測定每孔在490nm的吸光值.
實驗結果如圖5所示, 隨小鼠TNF-a從C端的逐步截短, 誘發(fā)的抗血清對小鼠TNG-a的抗體滴度逐步增加, 截短至67位截短體時抗體滴度為最高, 繼續(xù)截短抗體滴度下降, 說明TNF-a的N端有誘導自身抗體的重要表位.
1.1.6 計算機輔助設計預測TNG-a抗原表位
用Kolaskar和Tongaonkar方法對小鼠和人TNG-a的抗原表位進行預測, 結果如圖6所示, 人和小鼠的TNG-a在10-21, 32-38, 111-125, 146-153氨基酸序列處具有共同的抗原表位.
1.1.7 疫苗表位插入位置的選擇
結合以上實驗結果, 為了插入的外源T輔助表位不破壞TNG-a本身的抗原表位, 我們選擇小鼠TNG-a126-144位氨基酸為外源表位插入位置, 經同源比對對應人TNG-a的外源T輔助表位插入位置為人TNG-a127-144位氨基酸.1.2插入的抗原表位的篩選1.2.1小鼠TNF-TT， TNF-HEL和TNF-PADRE的構建用編碼TT，服L， PADRE氨基酸的基因分別替換編碼小鼠TNF-a 126-140位氨基酸的 基因，從EcoR I和Sal酶切位點克隆入pBV220表達載體，構建了 pBV220-mTNF-TT， pBV220-mTNF-HEL和pBV220-mTNF-PADRE表達載體，序列中EcoR I至Bgl II酶切位點為 小鼠TNF 1-125位氨基酸的基因序列，Bgl II至Nde I酶切位點為TT， HEL或PADRE氨 基酸的基因序列，Nde I至Sal I酶切位點為小鼠TNF-a 140-156氨基酸的基因序列， Bgl II和Nde I酶切位點用于克隆時表位的置換。構建的質粒載體分別轉化感受態(tài)細胞 DH5a，挑取單克隆培養(yǎng)過夜，提取質粒，經酶切鑒定獲得預期大小的插入片段(圖7)， 進行測序。工程菌命名為pBV220-mTNF-TT/DH5 a ， pBV220-mTNF-HEL/DH5 a 和 pBV220-mTNF-PADRE/DH5 a 。全長小鼠TNF-TT的基因序列(劃線部分為TT表位的核酸序列，加粗部分分別為Bgl II和Nde I酶切位點)GTCTACTTTGGCGTTATTGCTCTG全長小鼠TNF-HEL的基因序列為(劃線部分為HEL表位的核酸序列，加粗部分分別 為Bgl II和Nde I酶切位點)AGGACACCCCTGAGGGTGCTGAGCTCAAACCGTGGTATGAGCCGATCTACCTGGGCGGTGTCTTCCAGCTGAGATCCAGGTCTACTTTGGCGTTATTGCTCTG全長小鼠TNF-PADRE的基因序列為(劃線部分為PADRE表位的核酸序列，加粗部分 分別為Bgl II和Nde I酶切位點)TTTGGCGTTATTGCTCTG1.2.2重組蛋白表達挑取工程菌單菌落接種于5mLLB培養(yǎng)液(含AmplOOmg/L)中，30'C搖床培養(yǎng)過夜， 次日以l: lOO的比例轉接到含Amp的LB培養(yǎng)液中，在30'C搖床培養(yǎng)3h至對數生長中 期(0De。。為0.4 0.6)， 42。C升溫誘導培養(yǎng)4h。離心收集菌體。SDS-PAGE檢測表達結果 (圖8)，在預期位置由新生條帶產生。 1.2.3重組蛋白的純化10克菌體蛋白懸浮于100ml裂菌緩沖液中(50mM Tris - HC1， pH 8. 0， 150mMNaCl)。 在冰浴中超聲15min (工作5sec，間隔10sec，功率300w)， 12, 000 rpm離心30min收集沉 淀。收集的裂菌沉淀用100ml飽含體洗滌液(4M Urea， l%Triton X-100， 5mM EDTA， 5mMP-mercaptoethanol， 50mMTris-HC1 pH8. 5)洗滌兩次，每次洗滌30min， 12， 000 rpm離心30min收集沉淀。洗滌后的沉淀用包涵體溶解液(20mM P iercaptoethanol ， 7M guanidine hydrochloride)溶解過夜，12， 000 rpm離心30 min收集上清。lml的TNF-TT包涵體溶解 上清以0.3ml/min的流速過S印hacry1-IOO層析柱(2.4 X70cm)， TNF-PADRE和TNF-HEL 包涵體溶解上清以O. 5 ml/min的流速過S印hacry1-300層析柱(2. 4 X 100cm)，流動相均 為50mM Tris-HCl， pH8.5， 8M urea， 100mM NaCl。收集目的峰，對復性液(10mM Tris-HCl， pH8. 5， 1/1000 (v/v) 3-mercaptoethanol， 1/105 (v/v) 0. 5MCuS04) 透析8hor復性，之后對雙蒸水透析過夜。Lowry法測定蛋白濃度。純化結果如圖9所示。 1.2.4重組蛋白的鑒定 1.2.4.1免疫原性及純度的鑒定純化的蛋白樣品經15% SDS-PAGE，然后從凝膠電轉移至硝酸纖維膜，BSA封閉后， 用一抗(山羊抗小鼠TNF多克隆抗體)結合lhor， 二抗(兔抗山羊IgG-AP)結合30min， 最后用AP底物室溫避光顯色5min,蒸餾水沖洗終止反應。結果顯示mTNF-TT, mTNF-HEL， raTNF-PADRE可以特異的和山羊抗小鼠TNF多克隆抗體結合(圖10)。純化得到的TNF-TT、 TNF-HEL、 TNF-PADRE進行純度鑒定。色譜柱為排阻色譜柱 (7. 5mmX 300mm G2000SW column (T0S0H))，流動相液為PBS，流速為O. 5ml/min，檢測 波長為280nm。結果如圖所示，純度均大于95%。 1.2.4.2細胞毒性試驗將生長狀態(tài)良好的小鼠L929細胞調至106/ral的細胞懸液，恥孔培 養(yǎng)板中每孔加入100iil細胞懸液，50ml/l C02、 37'C培養(yǎng)過夜，棄上清，每孔加入系列 稀釋的復性后的TNF-TT， 5%C02、 37。C培養(yǎng)16h，棄上清，每孔加入30 p L的濃度為500 Pg/mL結晶紫染色3-5分鐘，用流水小心沖去結晶紫，摔干殘余水分，每孔加入脫色液IOO PL，酶標儀570nm處測定吸光值。小鼠的TNF作為陽性對照，純化的GST蛋白作為陰性對 照。結果顯示TNF-TT、 TNF-服L、 TNF-PADRE均無TNF的細胞毒性(圖ll)。 1.2.4動物免疫1. 2. 4. 1 BALB/C小鼠分組與免疫方案分組將25只雄性BALB/C小鼠分成5組，分別為佐劑組，小鼠TNF組，小鼠TNF-TT 組，小鼠TNF-HEL組和小鼠TNF-PADRE組。在第4次免疫后10天摘眼球采血，測定血清 中mTNF抗體效價。免疫方案背部皮下多點注射；30ug抗原/只；第l次使用完全佐 劑，第2、 3次和第4次使用不完全佐劑，佐劑溶液總體積為200uL/只，分別隔周注射。 1. 2. 4. 2抗血清ELISA鑒定在第4次免疫后IO天采血，收集抗血清，通過間接ELISA測定血清抗mTNF抗體效 價。ELISA實驗方法如1. 1.5. 2所示。實驗結果如圖12所示，小鼠TNF-PADRE可以誘發(fā)最高的抗小鼠TNF抗體。與對照組， 小鼠TNF組，小鼠TNF-TT組，小鼠TNF-HEL組比較p<0. 01 。 1. 2. 4. 3抗血清中和活性鑒定在第4次免疫后10天釆血獲得的抗血清，通過對天然小鼠TNF對L929細胞殺傷的 阻斷實驗測定比較抗血清的中和活性。所需溶液的配制a.完全培養(yǎng)基l: 10% FCS-DMEM培養(yǎng)液。b.完全培養(yǎng)基2: 3% FCS-DMEM培養(yǎng)液。c. 0.05%的結晶紫溶液50mg結晶紫用20ml無水乙醇溶解后，加 水定容至100ml，室溫保存。d.脫色液50ml水加入50ml無水乙醇和0. lml乙酸混勻 即可。 操作方法1. 用完全培養(yǎng)基1將小鼠L929細胞調至1X105 /ml， 100 u 1/孔加入96孔細胞培 養(yǎng)板，5% C20、 37。C培養(yǎng)過夜。2. 用完全培養(yǎng)基2系列稀釋抗血清，1: 1與20U/ml的小鼠TNF混合，5% C20、 37。C孵育2h。3. 棄去96孔板中細胞培養(yǎng)上清，100 y 1/孔加入孵育后的抗血清和小鼠TNF混合液， 5% C20、 37。C繼續(xù)孵育16h。4. 棄去96孔板細胞培養(yǎng)上清，30"1/孔加入0.05%結晶紫染色3-5分鐘，流水小 心沖去結晶紫，甩干培養(yǎng)孔殘余水份，100ul/孔加入脫色液，酶標儀570nm測定光密度 值。實驗結果如圖12所示，小鼠TNF-PADRE誘發(fā)最高的抗小鼠TNF中和抗體，與對照組、 小鼠TNF組，小鼠TNF-TT組和小鼠TNF-HEL組比較p<0. 01 ?？寡彖b定表明PADRE具有最好的輔助TNF誘導自身抗體的能力。篩選出TNF-PADRE為 TNF自體疫苗的候選分子。2、 TNF-PADRE對小鼠TNF誘導的惡病質模型的治療 2.1分組并免疫小鼠BALB/c小鼠，雄性，共30只，體重18-20克，按體重隨機分兩組，每10只一組， 組間體重統計學無差異。A組TNF-PADRE組，抗原溶解于生理鹽水中，50yg/只，200。 B組生理鹽水組。免疫方案前三次背部皮下多點免疫，第4次腹腔免疫，免疫溶液 體積為200ul/只，分別隔周注射。 2.2模型的誘導免疫的小鼠按體重每組各取5只，體重27-28克，組間體重無統計學差異，每天腹 腔注射小鼠TNF 1X 105111/只，每天稱量小鼠體重。免疫的小鼠按體重每組各取IO只，體重27-30克，組間體重無統計學差異，每天 腹腔注射小鼠TNF 2X105IUAR,統計小鼠的生存期。實驗結果如圖13所不，與對照相比TNF-PADRE可以減乾TNF誘導的惡病質小鼠模I 的癥狀。3、 TNF-PADRE對LPS誘導的急性肺損傷小鼠模型的治療 3. l分組并免疫小鼠BALB/c小鼠，雄性，共20只，體重18-20克，按體重隨機分兩組，每10只一組， 組間體重統計學無差異。A組TNF-PADRE組，抗原溶解于生理鹽水中，50lig/只，200。 B組生理鹽水組。免疫方案前三次背部皮下多點免疫，第4次腹腔免疫，免疫溶液 體積為200nl/只，分別隔周注射。 3.2模型的誘導Pg /只，統計小鼠的生存期。實驗結果如圖14所示，與對照相比TNF-PADRE可以延長LPS誘導的惡病質小鼠模 型的癥狀。4 TNF-PADRE對二型膠原誘導的類風濕性關節(jié)炎小鼠模型的治療 4. 1誘導劑的制備-將II型膠原溶于0.1M醋酸制成4mg/mL的溶液，與等體積的完全弗氏佐劑(弗氏 不完全佐劑加入終濃度2mg/mL的卡介苗)混合后以注射器反復推吸乳化，配制成II型 膠原終濃度為2mg/mL的乳劑。 4.2動物的免疫從上海斯萊克動物中心購買5周齡的DBA-1近交系小鼠21只，隨機分為三組，第 一組4只，免疫方法為皮下多點免疫，免疫劑量為10(^L生理鹽水/只，隔周免疫一次， 共免疫四次。第二組8只，免疫方法與第一組相同。第三組9只免疫方法為皮下多點免 疫mTNF-PADRE，免疫劑量為50ug/只，隔周免疫一次，共免疫四次。 4.3模型的誘導和治療免疫后10天，第一組小鼠每只尾根部皮內注射100pL生理鹽水；第二組和第三組 小鼠每只尾根部皮內注射100nL誘導劑。誘導21天后第一組小鼠每只尾根部皮內再次 注射50nL生理鹽水;第二組和第三組小鼠每只尾根部皮內再次注射50pL相同的誘導劑。小鼠發(fā)病率和發(fā)病肢數統計第二次誘導后次日即開始統計II型膠原誘導的小鼠類 風濕關節(jié)炎的發(fā)病率和平均每只小鼠的發(fā)病肢體數。結果如圖15所示，與對照相比 TNF-PADRE可以降低II型膠原誘導的小鼠類風濕關節(jié)炎的發(fā)病率和平均每只小鼠的發(fā)病 肢體數。小鼠后足足厚的測量第—次誘導后次日即開始測量后足的足厚，測量丄具為螺旋 測微器。雙尾T檢驗檢驗組間差異。結果如圖16所示，與對照相比TNF-PADRE可以降 低II型膠原誘導的小鼠類風濕關節(jié)炎的小鼠后足足厚。小鼠關節(jié)炎病變評分標準第二次誘導后次日即開始開始觀察前后足腫脹程度并評 分，以每只鼠前后關節(jié)病變評分為急性關節(jié)炎分數。關節(jié)炎指數(arthritis index, AI) 評分標準如下0分一無紅腫；l分一關節(jié)稍腫；2分一關節(jié)輕度紅、腫、熱；3分一關 節(jié)中度紅、腫、熱，輕度功能障礙；4分一關節(jié)重度紅、腫、熱，嚴重功能障礙，無法 負重，晚期畸形。累積4個踝關節(jié)的得分即為每只小鼠的關節(jié)評分。雙尾T檢驗檢驗組 間差異。結果如圖17所示，與對照相比TNF-PADRE可以降低II型膠原誘導的小鼠類風濕 關節(jié)炎的小鼠關節(jié)炎病變評分。小鼠膝關節(jié)和踝關節(jié)病理檢測小鼠膝關節(jié)和踝關節(jié)以10%福爾馬林溶液固定72h， 脫鈣液(8%甲酸溶液和8%鹽酸溶液等量混勻)脫鈣10天，每日換液，待骨軟化后以流 水沖洗36h，再經蒸餾水沖洗，石蠟包埋后切成5um厚的切片，蘇木精-伊紅(HE)染 色。加拿大樹膠封片。光鏡下觀察關節(jié)腔的病理改變，每組樣品選兩張典型的切片與顯 微鏡下觀察并照相。其他切片密封后4'C保存。結果如圖18所示，與對照相比TNF-PADRE 可以降低II型膠原誘導的小鼠類風濕關節(jié)炎關節(jié)的病變程度。 5.本發(fā)明的效果經實驗證實本發(fā)明的效果如下(1) 篩選并構建了TNF-PADRE融合蛋白疫苗。(2) 該疫苗保持了 TNF的免疫原性，去除了TNF的生物活性。(3) 通過動物實驗證實該融合蛋白能夠在小鼠體內誘導出高滴度中和抗體。(4) 初步證明了該蛋白作為腫瘤疫苗可在一定程度上可以減輕TNF誘導的惡病質小 鼠模型的癥狀，延長LPS誘導的急性肺損傷小鼠的生存期，減輕二型膠原誘導的類風濕 性關節(jié)炎小鼠的癥狀。pBV220-mTNF-TT/DH5 a ， pBV220-mTNF-HEL/DH5 a和pBV220-mTNF-PADRE/DH5 a基因序列全長小鼠TNF-TT的基因序列其中劃線部分為TT表位的核酸序列，加粗部分分別 為Bgl II和Nde I酶切位點GTCTACTTTGGCGTTATTGCTCTG全長小鼠TNF-HEL的基因序列其中劃線部分為HEL表位的核酸序列，加粗部分分 別為Bgl II和Nde I酶切位點TGGAGTGGCTGAGCCAGCGCGCCAACGCCCTCCTGGCCMCGGCATGGATCTCMAGACAACCAACTGGTGGTGCCCAGGTCTACTTTGGCGTTATTGCTCTG全長小鼠TNF-PADRE的基因序列其中，劃線部分為PADRE表位的核酸序列，加粗 部分分別為Bgl II和Nde I酶切位點TGCTAAATTCGTTGCTGCATGGACTCTGAAAGCTGCAGCTCATATGTTAGACTTTGCGGAGTCCGGTCAGGTCTAC TTTGGCGTTATTGCTCTG
權利要求
1.一種體內誘導出針對TNF-α分子的自身抗體的蛋白疫苗的構建方法，其特征在于，該方法采用人工合成mTNF-TT830-844，mTNF-HEL46-61，mTNF-PADRE基因片段，將該片段插入pBV220載體中構建mTNF-TT830-844，mTNF-HEL46-61，mTNF-PADRE蛋白基因；含有目的基因mTNF-TT830-844，mTNF-HEL46-61，mTNF-PADRE的原核表達載體的構建及重組蛋白表達，經表達產物的鑒定、重組蛋白的純化，將mTNF-TT830-844、mTNF-HEL46-61、mTNF-PADRE蛋白免疫小鼠后產生的抗血清與小鼠TNF-α的結合作用，該抗血清在體外可以中和小鼠TNF-α對L929細胞的殺傷；比較這三種分子誘導針對mTNF-α自身抗體的滴度，篩選出mTNF-PADRE蛋白；將篩選的mTNF-PADRE蛋白，通過免疫小鼠可突破小鼠的免疫限制，產生高滴度抗小鼠TNF-α自身抗體，其對應的重組人TNF-PADRE融合蛋白能在人體內產生抗人TNF-α自身抗體，即可得到TNF-α分子的自身抗體的蛋白疫苗。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，按以下步驟完成 (1) TNF-PADRE基因的克隆及原核表達載體的構建根據大腸桿菌偏愛密碼子、人和小鼠TNF氨基酸序列以及PADRE氨基酸序列，設 計TNF-PADRE基因序列，其中小鼠TNF-PADRE的基因序列用PADRE的編碼序列取代 小鼠TNF126-140位氨基酸的編碼序列，對應人TNF-PADRE的基因序列用PADRE的 編碼序列取代人TNF127-141位氨基酸的編碼序列；設計小鼠TNF-PADRE的基因序列， 上游引入Ecoll酶切位點，下游引入SalI酶切位點，并克隆入載體pBV220中；將上述載體轉化大腸桿菌DH5 a ，測序正確的質粒命名為pBV220-mTNF-PADRE， 工程菌命名為pBV220-mTNF-PADRE /DH5a;其基因序列為CTCCGTTCATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCACGTCGTAGCAAACCACCAAGTGGAGG虹AGCAGGACACCCCTGAGGGTGCTGAGCTCAAACCGTGGTATGAGCCGATCTACCTGGGCGGTGTCTTCCAGCTGAGATC TGCTAAATTCGTTGCTGCATGGACTCTGAAAGCTGCAGCTCATATGTTAGACTTTGCGGAGTCCGGTCAGGTCTACTTTGGCGTTATTGCTCTG; (2)重組蛋白表達挑取工程菌單菌落接種于5mL LB培養(yǎng)液中，所述的LB培養(yǎng)液含AmplOOmg/L， 3(TC搖床培養(yǎng)過夜，次日以1: IOO的比例再次轉接到LB培養(yǎng)液中，在3(TC搖床培養(yǎng) 3h，至對數生長中期OD6oo為0.4 0.6， 42'C升溫誘導，繼續(xù)培養(yǎng)4h,離心收集菌體；(3)表達產物的鑒定 (D SDS-PAGE取30yL裂菌上清，加入30uL 2X載樣緩沖液，混勻；另取其他樣品加入30uL 水，混懸后再加入30uL2X載樣緩沖液混勻，沸水中煮5min, 12000 rpm離心5 min， 取10ixL上清加樣于18%分離膠6%濃縮膠，上樣后電壓為60 V, 20min，樣品進入分 離膠后電壓升至100V， 4h 5h，用0.5%考馬斯亮蘭R-250振蕩染色2 h 3h，脫色直 至背景清晰后制備干膠保存；② 免疫印跡反應SDS-PAGE結束后，按Bio-Rad產品說明，凝膠靠近陰極一側，硝酸纖維膜靠近陽 極一側，置轉移緩沖液中，緩沖液的配方為25mmol/LTris、 192 mmol/L Glycine、 20% 甲醇，100V恒壓lh，將蛋白從凝膠電轉移至NC膜上，電轉移結束后，取出硝酸纖維 膜，用洗滌液TBST室溫洗3次，洗滌液TBST含有0.02 mol/L pH7.4 TBS、0.4% Tween20， 室溫洗3次，浸入封閉液中，該封閉液含2。/。BSA的TBST， 37°C， 1 h,以TBST洗滌 液室溫洗3次，加羊抗小鼠TNF- a多克隆抗體，37'C孵育1 h， TBST室溫洗膜3次，加 入兔抗羊IgG-AP 二抗，37'C孵育1 h， TBST室溫洗膜3次，再用TBS洗3次，NC膜 浸入顯色液中，室溫避光顯色5min，蒸餾水沖洗終止反應；③ 融合蛋白的純化和復性取含pBV220-mTNF-PADRE重組質粒的菌株大量誘導菌液，5000 rpm離心10min，收 菌，超聲裂菌；4'C， 12000rpm，離心20min,分別收集上清液和沉淀；將溶解的沉淀和上清分別取樣進行SDS-PAGE電泳，對目的蛋白的表達形式進行分 析，在證實目的蛋白以包涵體的形式表達后，用層析純化所溶解的沉淀；按lg菌體加10 mL裂菌緩沖液的比例將菌體重懸，冰浴條件下進行超聲裂菌；12000rpm，離心15min， 收集的裂菌沉淀用100ml飽含體洗滌液洗滌兩次，該洗滌液為4MUrea， l%TritonX-100， 5mMEDTA, 5mMp-mercaptoethano1， 50mMTris-HC1， pH8.5;洗滌后的沉淀用包涵體 溶解液溶解過夜，包涵體溶解液為20mM卩-mercaptoethano1， 7M guanidine hydrochloride; 12， 000 rpm離心30min收集上清；lml的TNF-PADRE的包涵體溶解上清，以0.5 ml/min 的流速過2.4xl00cm的Sephacryl-300層析柱，流動相均為50mM Tris—HC1， pH8.5、 8M urea, lOOmMNaCl;收集目的峰，以復性液透析復性8h，復性液為10mM Tris-HC1， pH8.5，以體積比1/1000的p-mercaptoethanol，體積比1/105的0.5MCuS04，之后以雙蒸 水透析過夜，用Bradford法測定蛋白濃度，即可篩選出mTNF-PADRE融合蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種體內誘導出針對TNF-α分子的自身抗體的蛋白疫苗的構建方法，方法采用人工合成mTNF-TT830-844，mTNF-HEL46-61，mTNF-PADRE基因片段，將該片段插入pBV220載體中構建mTNF-TT830-844，mTNF-HEL46-61，mTNF-PADRE蛋白基因；含有目的基因mTNF-TT830-844，mTNF-HEL46-61，mTNF-PADRE的原核表達載體的構建及重組蛋白表達，經表達產物的鑒定、重組蛋白的純化，將mTNF-TT830-844、mTNF-HEL46-61、mTNF-PADRE蛋白免疫小鼠后產生的抗血清與小鼠TNF-α的結合作用，該抗血清在體外可以中和小鼠TNF-α對L929細胞的殺傷；比較這三種分子誘導針對mTNF-α自身抗體的滴度，篩選出mTNF-PADRE蛋白；將篩選的mTNF-PADRE蛋白，通過免疫小鼠可突破小鼠的免疫限制，產生高滴度抗小鼠TNF-α自身抗體，其對應的重組人TNF-PADRE融合蛋白能在人體內產生抗人TNF-α自身抗體，即可得到TNF-α分子的自身抗體的蛋白疫苗。
文檔編號A61K38/19GK101214372SQ20081001723
公開日2008年7月9日 申請日期2008年1月4日 優(yōu)先權日2008年1月4日
發(fā)明者一 萬, 包春杰, 張英起, 萌 李, 鑫 秦, 薛曉暢, 葦 韓 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學