專利名稱：遲緩愛德華氏菌疫苗抗原及其制備方法
技術領域：
本發明涉及分子免疫學領域，具體的說是遲緩愛德華氏菌疫苗抗原及 其制備方法。
背景技術：
遲緩愛德華氏菌為革蘭氏陰性桿菌，具有廣泛的宿主范圍，包括人類 及各種水、陸生動物。在水產養殖動物中，該菌能夠感染多種重要淡、海 水魚類，如鯉魚、羅非魚、牙鲆、鰻魚、鰭魚等。由于遲緩愛德華氏菌能 夠在所感染的水生動物中誘發一種嚴重的系統性疾病-愛德華氏菌病
(Edwardsiellosis ),因而對水產養殖業造成巨大的經濟損失。
目前對于愛德華氏菌病的防治主要依賴于抗生素(包括各種化學藥物) 和疫苗免疫兩條途徑。由于抗生素對動物、人類以及環境所造成的長期性 危害，其應用已逐漸在國際上受到限制。疫苗免疫雖然已證明為最為有效 的病害防治措施，但就遲緩愛德華氏菌而言，由于其免疫相關基礎研究仍 在起始階段，目前世界上應用于水產業的愛德華氏菌疫苗主要為簡單的滅 活全菌疫苗，尚未有高效的分子疫苗如重組亞單位疫苗等。滅活疫苗雖然 安全但往往由于抗原成分和結構在制備過程中被部分破壞而達不到理想的 免疫效果。相對而言分子疫苗(重組亞單位疫苗、DNA疫苗等)則具有特異 性強、免疫效應較高等特點。因而篩選和獲得具免疫保護效應的分子疫苗 抗原是愛德華氏菌病免疫防治的關鍵之一。
發明內容
本發明目的在于提供兩種遲緩愛德華氏菌疫苗抗原及其制備方法。 為實現上述目的，本發明釆用的技術方案為 遲緩愛德華氏菌疫苗抗原具有序列表SEQ ID No. 1。 制備方法
1 )質粒pET258構建將經BglII/Ndel雙酶切的質粒pET25回收的104bp 片段與經BglII/Ndel雙酶切的質粒pET28回收的5. 3kb片段用T4DNA連接 酶連接2-4小時，連接液轉化入大腸桿菌中并在含卡那霉素的LB培養基上 培養18-24小時，篩選轉化子提取質粒，即為pET258;
2 )質粒構建以菌株TX1為模板,釆用EDF1和EDR1為引物進行PCR 擴增，純化產物后與載體pBS-T載體于室溫連接2-4小時，連接混合液轉 化大腸桿菌后在含卡那霉素、Xgal、異丙基-p-D-硫代半乳糖苷的LB培養 基上培養18 - 24小時，篩選出白色轉化子為質粒pBSED;而后將質粒pBSED 用Ndel/Xho1雙酶切回收0. 58kb，同時將步驟1 )的質粒pET258用Ndel/Xho1 雙酶切回收5. 3kb片段；將質粒pBSED用Ndel/Xho1雙酶切回收0. 58kb與質粒pET258用Ndel/Xhol雙酶切回收5. 3kb片段用T4DNA連接酶于室溫連 接2 - 4小時，連接液轉化入大腸桿菌DH5 a后在含有Kn ( 50ug/ml )的LB 固體培養基上培養18-24小時，挑取2個轉化子提取質粒為質粒pETED;
其中所述菌株TX1保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心CGMCC，地址為北京巿朝陽區大屯路，保藏編號為CGMCC No. 2330， 分類命名為遲緩愛德華氏菌胸油ieiia M油;保藏曰期:2008年1月9日;
所述弓l物EDF1 5， — CATATGACGACTATCGACAGCG —3，和EDR1 (5，丄 CTCGAGGGACATGCGTACGCTGC -3，；
3)質粒的誘導表達將步驟2)的質粒pETED轉化入大腸桿菌中，在 合有Kn的LB培養基上培養18 - 24小時，篩選轉化子即為BL21/pETED;將 BLH/pETED于含有Kn的LB培養基中過夜培養；而后再將培養液加入到新 鮮的含有Kn的LB液體培養基中，于37'C搖動培養至OD固為0. 6，加入終 濃度為lmM的異丙基-D-硫代半乳糖苷，37。C繼續搖動培養4-5小時， 裂解菌體，離心收集上清，純化重組蛋白，即為具有序列表SEQ IDNol的 堿基序列的重組保護性疫苗抗原EseD; ,
其中培養液與新鮮的含有Kn的LB液體培養基體積比為1:100; BL21/pETED與含有Kn的LB培養基體積比1: 100。
遲緩愛德華氏菌疫苗抗原具有序列表No.2中的堿基序列。
制備方法
1 )質粒pET258構建將經BglII/Ndel雙酶切的質粒pET25回收的104bp 片段與經BglII/Ndel雙酶切的質粒pET28回收的5. 3kb片段用T4DNA連接 酶連接2-4小時，連接液轉化入大腸桿菌中并在含卡那霉素的LB培養基上 培養18-24小時，篩選轉化子提取質粒，即為pET258;
2 )質粒構建以菌株TX1為模板,釆用ETF1和ETR1為引物進行PCR 擴增，純化產物后與載體PBS-T載體于室溫連接2-4小時，連接混合液轉 化大腸桿菌后在含卡那霉素、Xgal、異丙基-P-D-硫代半乳糖苷的LB培養 基上培養18-24小時，篩選出白色轉化子為質粒pBSET18;而后將質粒 pBSET18用Ndel/Xho1雙酶切回收0. 58kb，同時將步驟1 )的質粒pET258用 Ndel/Xho1雙酶切回收5. 3kb片段；將質粒pBSEH8用Ndel/Xho1雙酶切回 收0. 58kb與質粒pET258用Ndel/Xho1雙酶切回收5. 3kb片段用T4DNA連 接酶于室溫連接2-4小時，連接液轉化入大腸桿菌DH5ot后在含有Kn
(50ug/ml )的LB固體培養基上培養18-24小時，挑取2個轉化子提取質粒 為質粒pET18;
其中所述菌株TX1保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心CGMCC,保藏編號為CGMCC No. 2330，分類命名為遲緩愛德華氏菌；
所述引物ETF1 5， - CATATG ACGATGCGTTTTCCCT -3，，和ETR1 5， -CTCGAGCTTCAGCAGCGAGAACGCG -3，；
5質粒的誘導表達將步驟2)的pET18轉化入大腸桿菌中，在含有Kn的LB培養基上培養18-24小時，篩選轉化子即為BL21/pET18;將 BL21/pET18于含有Kn的LB培養基中過夜培養；而后再將培養液加入到新 鮮的含有Kn的LB液體培養基中，于37i:搖動培養至OD,為0. 6，加入終 濃度為lmM的異丙基-|3-D-硫代半乳糖苷，37X:繼續搖動培養4-5小時， 裂解菌體，離心收集上清，純化重組蛋白，即為具有序列表SEQ ID No. 2 中的堿基序列的重組保護性疫苗抗原ET18;
其中培養液與新鮮的含有Kn的LB液體培養基體積比為1:100; BL21/pET18與含有Kn的LB培養基體積比1: 100。
所述步驟2)中PCR條件為94°C60s預變性模板DM,然后948C 40s， 54°C 60s，72°C 60s, 5個循環后改為94°C 40s, 57°C 60s, 72°C 60s, 25個循 環后再在72"C延伸反應10min。所述步驟2)含卡那霉素、Xgal、異丙基-(3-D-硫代半乳糖苦的LB培養基中含有50ug/ml卡那霉素、40ug/ml Xgal 和24ug/ml異丙基-P -D-硫代半乳糖苷。所述將步驟3 )離心所得抗原蛋白 純化時將離心收集的大腸桿菌總蛋白與鎳親和膠混合于4°C保溫1-2h,然 后以5000g, 4°C離心10-15min,回收沉淀將其與10-20 ml洗滌緩沖液混 合離心洗滌2-4次，回收沉淀將其與2 nil洗脫緩沖液混合于4t保溫20-30 Min,而后離心收集上清，其中鎳親和膠與大腸桿菌總蛋白按體積比1:5混 合。所述洗滌緩沖液組成成分為50mM NaH2P04, 300mM NaCl， 20mM咪唑，pH 8. 0;洗脫緩沖液組成成分為50mMNaH2PO4, 30關NaCl， 250 mM咪唑，pH 8. 0。
本發明具有如下優點
1. 免疫保護性。本發明的疫苗抗原皆能保護牙鲆抵御遲緩愛德華氏菌侵染。
2. 高效表達。本發明可使目的疫苗抗原蛋白表達量占大腸桿菌總蛋白 的90%以上。
3. 高回收率。本發明的抗原蛋白回收方法簡單，回收率高于85%。
4. 本發明所得疫苗抗原廣泛存在于病原性遲緩愛德華氏菌中，具高度 保守性;其原核高效表達系統能夠用于大量表達上述保護抗原，由此制備的 抗原蛋白保有其組成抗原的天然免疫活性，可以直接用于免疫防治。
圖1為本發明重組EseD在大腸桿菌中的表達電泳圖(其中泳道l:分 子量標準；泳道2:大腸桿菌總蛋白)。
圖2為本發明純化后的重組EseD電泳圖(其中泳道1:分子量標準； 泳道2:純化后的重組EseD)。
圖3為本發明重組Etl8在大腸桿菌中的表達電泳圖(其中泳道l:分 子量標準；泳道2:大腸桿菌總蛋白)。
圖4為本發明純化后的重組Et18電泳圖(其中泳道l:分子量標準； 泳道2:純化后的重組Et18)。
具體實施方式
下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明。實施例旨在對本發明進 行舉例描述，而非以任何形式對本發明進行限制。
在本發明實施例中所涉及到的常規性實驗方法均采用如下方法
1. 質粒提取、DNA(PCR)產物純化、DNA片段從凝膠中回收、細菌基因組 DNA提取皆使用"天根生化科技(北京)有限公司"的相應試劑盒。
2. 質粒、DNA連接液轉化進入大腸桿菌皆用Hanahan方法(Sambrook and Russell: Molecular Cloning: A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001》，
3. 所有限制性內切酶和連接酶皆購自于"紐英倫生物技術有限公司"， 北京。
實施例1
遲緩愛德華氏菌疫苗抗原具有序列表SEQ ID No. 1中的堿基序列(參 見序列表l)。
遲緩愛德華氏菌疫苗抗原的制備方法 1)質粒pET258的構建將質粒pET25 (購自于美國Novogen公司)用 BglII/Ndel雙酶切后回收104bp片段；將質粒pET28 (購自于美國Novogen 公司)用BglII/Ndel雙酶切后回收5. 3kb片段；將上述兩段DNA片段連接 用T4DNA連接酶于室溫連接2小時，連接液用Hanahan方法轉化入大腸桿 菌DH5cc后在含有卡那霉素(Kn, 50ug/ml )的LB固體培養基上培養18小 時，挑取抗卡那霉素的2個轉化子，提取質粒，測序驗證為正確重組質粒。 將該質粒命名為pET258。
2)質粒構建以遲緩愛德華氏菌TX1為模板，釆用EDF1和EDR1為引 物進行PCR擴增，PCR條件為94t60s預變性模板DNA,然后94。C40s， 54°C 60s, 72。C 60s, 5個循環后改為94°C 40s， 57°C 60s, 72。C 60s, 25個循環 后再在72flC延伸反應10min。PCR產物用天根DNA產物純化試劑盒純化后與 PCR克隆載體pBS-T (購自于"天根生化科技有限公司"，北京)于室溫連 接2小時，連接混合液轉化大腸桿菌DH5a后在含有100 ug/ml安卡青霉 素(Ap)、 40ug/ml XgaH5-溴-4-氯-3-吲哚-P-D-乳糖苷)和24 ug/ml異 丙基-(3-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LB固體培養基上培養18小時，篩選出 白色轉化子為質粒pBSED。將質粒pBSED用Ndel/Xhol雙酶切回收0. 58kb， 同時將步驟l)的質粒pET258用Ndel/XhoI雙酶切回收5. 3kb片段;將質 粒pBSED用Ndel/Xhol雙酶切回收0. 58kb與質粒pET258用Ndel/Xhol雙 酶切回收5. 3kb片段用T4DNA連接酶于室溫連接2小時，連接液轉化入大 腸桿菌DH5a后在含有Kn ( 50ug/ml )的LB固體培養基上培養18小時，挑 取2個轉化子提取質粒為質粒pETED (參見序列表1 )。
所述LB組成成分按重量百分比計1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0% 氯化鈉，97.5%蒸餾水；其中所述菌株TXl保存于中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心CGMCC,保藏編號為CGMCC No. 2330，分類命名為遲緩愛德華氏菌MirardsieHa M油。
所述引物為EDF1 5， — CATATGACGACTATCGACAGCG -3，和EDM 5，-
CTCGAGGGACATGCGTACGCTGC -3，。
序列表1
CAGCAGCGTACGCATGTCCTGA
(a) 序列特征 *長度582bp
*類型堿基序列 *鏈型單鏈 參拓撲結構線性
(b) 分子類型雙鏈DNA
(c) 假設否
(d) 反義否
(e) 最初來源遲緩愛德華氏菌TX1
(f) 特異性名稱EseD
3 )質粒pETED的誘導表達將上述步驟2 )的質粒pETED轉化大腸桿菌 BL21(DE3)(購自于"天根生化科技有限公司",北京)，在含有Kn(50ug/ml) 的LB固體培養基上培養18小時，挑取一個抗Kn的轉化子，即為BL21/pETED。 將BL21/pETED于含有Kn (50ug/ml)的LB液體培養基中過夜培養；取lml過 夜后的培養液將其加入100ml新鮮的含有Kn(50ug/ml)的LB液體培養基中， 于37°C下轉速120rpm搖動培養至OD鋼為0. 6,加入終濃度為lmM的IPTG, 37。C繼續以轉速120rpm搖動培養5hr。而后將細菌培養液以5000g， 2°C， 離心10min,收集菌液，加入5ml裂解液，在室溫于搖床上緩慢搖動1小時， 直至菌懸液變澄清為止，而后再將菌液離心以10000g， 4°C，離心30min, 回收上清，純化重組蛋白即得具有序列表SEQ ID Nol的堿基序列的重組保 護性疫苗抗原EseD。
取1 Ou 1所獲得的上清加入等體積的2x蛋白上樣緩沖液，并在沸水中加 熱5min。而后將上述處理后的上清加入到0. 1%SDS-12%聚丙烯酰胺凝膠中， 用120伏電壓進行垂直蛋白電泳1-2小時。取下凝膠，用考馬氏亮蘭染色 (參見圖1)。
根據上述蛋白條帶的亮度計算EseD在大腸桿菌中的表達量占宿主細菌 總蛋白的90%以上。
其中2x蛋白上樣緩沖液成分為100 mM Tris (pH6. 8), 4% (質量百分比)SDS, 0. 2% (質量百分比)溴酚藍，20% (體積百分比)甘油，2% (體積 百分比)P-疏基乙醇;裂解液成分50 mM NaH2P04， 300 mM NaCl， 10 mM咪 唑，pH8. 0;上述電泳緩沖液成分為0. 3% Tris, 1. 88°/。甘氨酸，0. 1% SDS。
所述重組保護性疫苗抗原EseD的純化將上述所得含有重組保護性疫 苗抗原EseD的大腸桿菌總蛋白與lml鎳親和膠(nickel-ni tr i lotr iacet ic acid)(購于美國Qiagen公司)混合，蛋白與鎳親和膠的體積比為5:1, 4°C 保溫lh,然后以5000g， 4"C離心lOniin,回收鎳親和膠將其與10ml洗滌緩 沖液混合，以5000g，4"C離心10min，而后再次用洗滌緩沖液重復清洗兩次， 最后回收鎳親和膠,將其與2 ml洗脫緩沖液混合，4。C保溫20 min，然后以 5000g, 4°C離心10min。收集上清，即為純化后的重組保護性疫苗抗原EseD。
取純化后的重組保護性疫苗抗原EseD lOul加入等體積的2x蛋白上樣 緩沖液，并在沸水中加熱5min。而后將上述處理后的上清加入到 0. P/。SDS-12y。聚丙烯酰胺凝膠中，用120伏電壓進行垂直蛋白電泳1-2小時。 取下凝膠，用考馬氏亮蘭染色(參見圖2)。
根據上述蛋白條帶的亮度計算EseD的回收率為85%以上。
其中洗滌緩沖液組成成分為50 mM NaH2P04, 300 mM NaCl, 20 mM咪 唑，pH 8. 0;洗脫緩沖液組成成分為50 mM NaH2P04， 300 mM NaCl， 250 mM 咪哇，pH 8. 0。
實施例2
遲緩愛德華氏菌疫苗抗原具有序列表SEQ ID No.2中的堿基序列(參 見序列表2)。
遲緩愛德華氏菌疫苗抗原的制備方法 l)質粒pET258的構建將質粒pET25 (購自于美國Novogen公司)用 BglII/Ndel雙酶切后回收104bp片段；將質粒pET28 (購自于美國Novogen 公司)用BglII/Ndel雙酶切后回收5. 3kb片段；將上述兩段DNA片段連接 用T4DNA連接酶于室溫連接4小時，連接液用Hanahan方法轉化入大腸桿 菌DH5oc后在含有卡那霉素(Kn， 50ug/ml )的LB固體培養基上培養24小 時，挑取抗卡那霉素的2個轉化子，提取質粒，測序驗證為正確重組質粒。 將該質粒命名為pET258。
2)質粒構建以遲緩愛德華氏菌TX1為模板，釆用ETF1和ETR1為引 物進行PCR擴增，PCR條件為94"C60s預變性模板DNA，然后94°C 40s， 54°C 60s, 72°C 60s，5個循環后改為94。C 40s, 57。C 60s， 72。C 60s，25個循環后再 在72。C延伸反應10min。 PCR產物用天根DNA產物純化試劑盒純化后與PCR 克隆載體pBS-T (購自于"天根生化科技有限公司"，北京)于室溫連接4 小時，連接混合液轉化大腸桿菌DH5cc后在含有100ug/ml安卡青霉素(Ap )、 40ug/mi Xgal(5-溴_4_氯_3-吲哚-D-乳糖苷)和24 ug/ml異丙基-P -D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LB固體培養基上培養24小時，篩選出白色轉化子 為質粒pBSET18。將質粒pBSET18用Ndel/Xhol雙酶切回收0. 58kb，同時將步驟l )的質粒pET258用Ndel/XhoI雙酶切回收5. 3kb片段；將質粒pBSET18 用Ndel/Xhol雙酶切回收0. 58kb與質粒pET258用Ndel/Xhol雙酶切回收 5. 3kb片段用T4DNA連接酶于室溫連接4小時，連接液轉化入大腸桿菌DH5 a后在含有Kn ( 50ug/ml )的LB固體培養基上培養24小時，挑取2個轉化 子提取質粒為質粒pET18 (參見序列表2)。
所述LB組成成分按重量百分比計1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0% 氯化鈉，97.5%蒸餾水；其中所述菌株TX1保存于中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心CGMCC,保藏編號為CGMCC No. 2330，分類命名為 遲緩愛德華氏菌丑dirardsieHa ta油。
所述引物為ETF1 5， - CATATG ACGATGCGTTTTCCCT —3，，和ETR1 5， 一 CTCGAGCTTCAGCAGCGAGAACGCG -3，。 序列表2:
TGTCACTACCGCGTTCTCGCTGCTGAAGTAA
U)序列特征 *長度591bp *類型堿基序列 *鏈型單鏈 參拓撲結構線性
(b) 分子類型雙鏈DM
(c) 假設否
(d) 反義否
(e) 最初來源遲緩愛德華氏菌TX1
(f) 特異性名稱Etl8
3 )質粒pET18的誘導表達將上述步驟2 )的質粒pET18轉化大腸桿菌 BL21(DE3)(購自于"天根生化科技有限公司",北京)，在含有Kn(50ug/ml) 的LB固體培養基上培養24小時，挑取一個抗Kn的轉化子，即為BL21/pET18。 將BL21/pET18于含有Kn(50ug/ml)的LB液體培養基中過夜培養；取lml過 夜后的培養液將其加入100ml新鮮的含有Kn (50ug/ml)的LB液體培養基中， 于37"C下轉速120rpm搖動培養至OD刷為0. 6，加入終濃度為lmM的IPTG， 37。C繼續以轉速120rpm搖動培養4hr。而后將細菌培養液以5000g, 4。C, 離心15min,收集菌液，加入5ml裂解液，在室溫于搖床上緩慢搖動2小時， 直至菌懸液變澄清為止，而后再將菌液離心以10000g， 4"C，離心30min， 回收上清，純化重組蛋白即得具有序列表SEQ ID No. 2中的堿基序列的重 組保護性疫苗抗原ET18。取lOul所獲得的上清加入等體積的2x蛋白上樣緩沖液，并在沸水中 加熱5min。而后將上述處理后的上清加入到0. 1%SDS-12%聚丙烯酰胺凝膠 中，用120伏電壓進行垂直蛋白電泳1-2小時。取下凝膠，用考馬氏亮蘭 染色(參見圖3)。
根據上述蛋白條帶的亮度計算ET18在大腸桿菌中的表達量約占宿主細 菌總蛋白的15%。
其中2x蛋白上樣緩沖液成分為100 mM Tris (pH6. 8) ， 4% (質量百分 比)SDS, 0.2% (質量百分比)溴酚藍，20% (體積百分比)甘油，2% (體 積百分比)(3-疏基乙醇;裂解液成分50 mM NaH2P04， 300 mM NaCl， 10 mM 咪唑，pH8. 0;上述電泳緩沖液成分為0. 3°/。Tris， 1. 88%甘氨酸，0. 1% SDS。
所述重組保護性疫苗抗原ET18的純化將上述所得重組保護性疫苗抗 原EseD或ET18的大腸桿菌總蛋白與lml Ni-NTA( nickel-nitrilotriacetic acid) beads (購于美國Qiagen公司)混合蛋白與Ni-NTA的體積比為5: 1, 4"C保溫lh,然后以5000g， 4°C離心15min，回收Ni-NTA beads將其與20ml 洗滌緩沖液混合，以5000g， 4°C離心15min，而后再次用洗滌緩沖液重復清洗 4次，最后回收Ni-NTA beads,將其與2 ml洗脫緩沖液混合，4°C保溫20 min， 然后以5000g， 4°C離心10min。收集上清，即為純化后的重組保護性疫苗 抗原ET18。
取純化后的重組保護性疫苗抗原ET18 lOul加入等體積的2x蛋白上樣 緩沖液，并在沸水中加熱5min。而后將上述處理后的上清加入到 0. 1%SDS-12%聚丙烯酰胺凝膠中，用120伏電壓進行垂直蛋白電泳1-2小時。 取下凝膠，用考馬氏亮蘭染色(參見圖4)。
根據上述蛋白條帶的亮度計算ET18回收率為90%以上。 其中洗滌緩沖液組成成分為50 mM NaH2P04， 300 mM NaCl,20 mM咪唑， pH 8. 0;洗li緩沖液組成成分為50 mM NaH2P04, 300 mM NaCl， 250 mM咪唑， pH 8. 0。 實施例3
與實施例l與2制備重組保護性疫苗抗原EseD和ET18不同之處在于 1 )質粒pET258構建將經BglII/Ndel雙酶切的質粒pET25回收的104bp 片段與經BglII/Ndel雙酶切的質粒pET28回收的5. 3kb片段用T4DNA連接 酶連接3小時，連接液轉化入大腸桿菌中并在含卡那霉素的LB培養基上培 養20小時，篩選轉化子提取質粒，即為pET258;
2)質粒構建PCR擴增后純化產物與載體pBS-T載體于室溫連接3小 時，連接混合液轉化大腸桿菌后在含卡那霉素、xgai、異丙基-p-D-硫代半 乳糖苷的LB培養基上培養20小時，篩選出白色轉化子；而后將篩選出白色 轉化子用Ndel/Xhol雙酶切回收0. 58kb，同時將步驟1)的質粒pET258用 Ndel/Xhol雙酶切回收5. 3kb片段；將篩選出白色轉化子用Ndel/Xhol雙酶 切回收0. 58kb與質粒pET258用Ndel/Xhol雙酶切回收5. 3kb片段用T4DNA連接酶于室溫連接3小時，連接液轉化入大腸桿菌DH5oc后在含有Kn (50ug/ml )的LB固體培養基上培養20小時，挑取2個轉化子提取質粒；
3)質粒的誘導表達將步驟2)的所得轉化子轉化入大腸桿菌中，在 含有Kn的LB培養基上培養20小時篩選轉化子；將轉化子于含有Kn的LB 培養基中過夜培養；而后再將培養液加入到新鮮的含有Kn的LB液體培養 基中，于37。C搖動培養至OD,為0.6，加入終濃度為lmM的異丙基-P-D-硫代半乳糖苷，37C繼續搖動培養4.5小時，裂解菌體，離心收集上清， 純化重組蛋白，即為重組保護性疫苗抗原。
所述將步驟3)離心所得抗原蛋白純化時將離心收集的大腸桿菌總蛋白 與鎳親和膠混合于4。C保溫1.5h，然后以5000g， 4t離心12min,回收沉 淀將其與15 ml洗滌緩沖液混合離心洗滌2次，回收沉淀將其與2 ml洗脫 緩沖液混合與4t保溫25 niin,而后離心收集上清。SEQUENCE LISTING < 110〉 中國科學院海洋研究所 <120>遲緩愛德華氏菌疫苗抗原及其制備方法 <130〉
<160〉 2
<170〉 Patentln version 3. 1
<210〉 1
<211〉 582
<212〉 DNA
<213>遲緩愛德華氏菌TXl <220>
<221〉 EseD
〈222〉 (1),.(582) 〈223〉
<400> 1
atgacgactatcgac3gcggcagccacggtgttaacggcattaccccaccggacggccat60
cgttacgttt,cacaggatcgcggcggcgacgccatcggccEigctgaatgagctgatggtt120
C3gCttgg3gagctgtttgggaagctgcgcgatgtgctgcgccagtatcaacagacgcag180
caaagcaacgcgttcaagatgcgtatgacacccgcgtggacgccatcgat240
aaagactttcaggccaagcaggcccaggctatcgcgcaaatcctcggcggcatcgcccag300
sccUtggcggggcgttcggcatacc3ttsgc認ggcgttaacagcatg360
acgcaggggattgtcggcgtcggctatgtcaatgacatgtcgcgtcagtcgcaggaggag420
caggcgctgtccg83tatcagcacggcctggccgagcagcagcttaagcgggcggatg朋480
acgct,ggaaaaggcgctcaagatctccggcgatctgcgcgcaccctgaat540
caggcccacgaacgtatcgccagcagcgtacgcatgtcct、582
<210> 2
<211〉 591
〈212〉 DNA
<213〉遲緩愛德華氏菌TXl <220〉<221> EU8 〈222〉 (1). . (591) <223>
〈400> 2
3tg3Cg3tgCgttttccctt8acccgatgttttcccgcgctggttgtcctcagcgccctg60
CtgCtgC33ggctgcgtcgccgccgtgatcggcagtgcgaccatggcaacCC3ggCggCC120
8gCg3tCCCCgcagcgtgggt3CCC8ggtCgacgatggtaCgCtgg3ggCccgcatctcc180
aacgccctgagcaaagacgc3C3gCtg33gaaagaggcgcgcgtcgtggtaaccgcctat240
C'3ggggC3ggtgctgctgacCggtC3ggCgccaagccaggcgctg3ttagCCgCgCC38g300
C3g3tCgCg3tgggCgttg33ggC3CC38ggcggtctataatgagatccgtttaggccag360
CCggtC3gCCtgggcactgcctcggccgatgcctggatcaccaccaaggtccgctcccag420
ctgctggccagcgacc8ggtgaaatccacc獄gtgaaggtgaccaccga480
gtcttcctgctggggctggtgacgccca犯gagggacaggccgccgcgcaaacggccagt540
aaagtcagcgtgtcactaccgcgttctcgctgctgaagtaa59權利要求
1.一種遲緩愛德華氏菌疫苗抗原，其特征在于具有序列表SEQ IDNo.1。
2. —種按權利要求l所述的遲緩愛德華氏菌疫苗抗原的制備方法，其 特征在于1)質粒pET258構建將經BglII/Ndel雙酶切的質粒pET25回收的104bp 片段與經BglII/Ndel雙酶切的質粒pET28回收的5. 3kb片段用T4DNA連接 酶連接2-4小時，連接液轉化入大腸桿菌中并在含卡那霉素的LB培養基上 培養18-24小時，篩選轉化子提取質粒，即為pET258;2)質粒構建以菌株TX1為模板，釆用EDF1和EDR1為引物進行PCR 擴增，純化產物后與載體PBS-T載體于室溫連接2 - 4小時，連接混合液轉 化大腸桿菌后在含卡那霉素、xgai、異丙基-p-D-硫代半乳糖苷的LB培養 基上培養18 - 24小時，篩選出白色轉化子為質粒pBSED;而后將質粒pBSED 用Ndel/Xhol雙酶切回收0. 58kb，同時將步驟1 )的質粒pET258用Ndel/Xhol 雙酶切回收5. 3kb片段；將質粒pBSED用Ndel/Xhol雙酶切回收0. 58kb與 質粒pET258用Ndel/Xhol雙酶切回收5. 3kb片段用T4DNA連接酶于室溫連 接2-4小時，連接液轉化入大腸桿菌DH5oc后在含有Kn (50ug/ml )的LB 固體培養基上培養18-24小時，挑取2個轉化子提取質粒為質粒pETED;其中所述菌株TX1保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心CGMCC,保藏編號為CGMCC No. 2330，分類命名為遲緩愛德華氏菌；所述引物EDF1 5， - CATATGACGACTATCGACAGCG -3，和EDR1 (5，-CTCGAGGGACATGCGTACGCTGC -3，；5質粒的誘導表達將步驟2)的質粒pETED轉化入大腸桿菌中，在 含有Kn的LB培養基上培養18-24小時，篩選轉化子即為BL21/pETED;將 BL21/pETED于含有Kn的LB培養基中過夜培養；而后再將培養液加入到新 鮮的含有Kn的LB液體培養基中，于37'C搖動培養至0D,為0. 6，加入終 濃度為lmM的異丙基-(3-D-硫代半乳糖苷，37。C繼續搖動培養4-5小時， 裂解菌體，離心收集上清，純化重組蛋白，即為具有序列表SEQ IDNol的 堿基序列的重組保護性疫苗抗原EseD;其中培養液與新鮮的含有Kn的LB液體培養基體積比為1:100; BL21/pETED與含有Kn的LB培養基體積比1: 100。
3.—種遲緩愛德華氏菌疫苗抗原，其特征在于具有序列表No.2中的 堿基序歹'j。
4.一種按權利要求3所述的遲緩愛德華氏菌疫苗抗原的制備方法，其 特征在于1)質粒pET258構建將經BglII/Ndel雙酶切的質粒pET25回收的104bp片段與經BglII/Ndel雙酶切的質粒pET28回收的5. 3kb片段用T4DNA連接 酶連接2-4小時，連接液轉化入大腸桿菌中并在含卡那霉素的LB培養基上 培養18-24小時，篩選轉化子提取質粒，即為pET258;2)質粒構建以菌株TX1為模板,釆用ETF1和ETR1為引物進行PCR 擴增，純化產物后與載體PBS-T載體于室溫連接2-4小時，連接混合液轉 化大腸桿菌后在含卡那霉素、Xgal、異丙基-D-硫代半乳糖苷的LB培養 基上培養18-24小時，篩選出白色轉化子為質粒pBSET18;而后將質粒 pBSET18用Ndel/Xho1雙酶切回收0. 58kb，同時將步驟1 )的質粒pET258用 脂/XhoI雙酶切回收5. 3kb片段；將質粒pBSET18用Ndel/Xho1雙酶切回 收0. 58kb與質粒pET258用Ndel/Xho1雙酶切回收5. 3kb片段用T4DNA連 接酶于室溫連接2-4小時，連接液轉化入大腸桿菌DH5oc后在含有Kn (50ug/ml )的LB固體培養基上培養18-24小時，挑取2個轉化子提取質粒 為質粒pET18;其中所述菌株TX1保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心CGMCC,保藏編號為CGMCC No. 2330，分類命名為遲緩愛德華氏菌；所述引物ETF1 5， - CATATG ACGATGCGTTTTCCCT -3，，和ETR1 5，-CTCGAGCTTCAGCAGCGAGAACGCG -3，；5質粒的誘導表達將步驟2)的pET18轉化入大腸桿菌中，在含有 Kn的LB培養基上培養18-24小時，篩選轉化子即為BL21/pET18;將 BL21/pET18于含有Kn的LB培養基中過夜培養；而后再將培養液加入到新 鮮的含有Kn的LB液體培養基中，于37'C搖動培養至0D,為0. 6，加入終 濃度為lmM的異丙基-(3-D-硫代半乳糖苷，37。C繼續搖動培養4-5小時， 裂解菌體，離心收集上清，純化重組蛋白，即為具有序列表SEQ ID No. 2 中的堿基序列的重組保護性疫苗抗原ET18;其中培養液與新鮮的含有Kn的LB液體培養基體積比為1:100; BL21/pET18與含有Kn的LB培養基體積比1: 100。
5. 按權利要求2或4所述的遲緩愛德華氏菌疫苗抗原的制備方法，其 特征在于所述步驟2)中PCR條件為94°C 60s預變性模板DNA，然后 94°C 40s， 54°C 60s, 72°C 60s, 5個循環后改為94。C 40s， 57°C 60s, 72°C 60s, 25個循環后再在72t延伸反應lOmin。
6. 按權利要求2或4所述的遲緩愛德華氏菌疫苗抗原的制備方法，其 特征在于所述步驟2)含卡那霉素、Xgal、異丙基-p-D-硫代半乳糖苷的 LB培養基中含有50ug/ml卡那霉素、40ug/ml Xgal和24ug/ml異丙基-|3 -D-硫代半乳糖苷。
7. 按按權利要求2或4所述的保護性疫苗抗原制備方法，其特征在于 所述將步驟3)離心所得抗原蛋白純化時將離心收集的大腸桿菌總蛋白與鎳 親和膠混合于4t保溫1-2h，然后以5000g, 4。C離心10-15min,回收沉淀 將其與10-20 ml洗滌緩沖液混合離心洗滌2-4次，回收沉淀將其與2 ml洗脫緩沖液混合與4t保溫20-30 min，而后離心收集上清，其中鎳親和膠 與大腸桿菌總蛋白按體積比1: 5混合。
8.按按權利要求7所述的保護性疫苗抗原制備方法，其特征在于所 述洗滌緩沖液組成成分為50mM NaH2P04， 300mM NaCl, 20mM咪唑，pH 8. 0; 洗脫緩沖液組成成分為50mM NaH2P04， 300mM NaCl， 250 mM咪唑，pH 8. 0。
全文摘要
本發明涉及分子免疫學領域，具體的說是遲緩愛德華氏菌疫苗抗原及其制備方法。具體為所述疫苗抗原具有序列表SEQ ID No.1或No.2中的堿基序列。構建方法以遲緩愛德華氏菌TX1為模板，用引物EDF1/EDR1或ETF1/ETR1進行PCR；PCR產物與pET258質粒連接，轉化入大腸桿菌得pETED和pET18，而后誘導表達得抗原EseD和ET18。本發明所得疫苗抗原廣泛存在于病原性遲緩愛德華氏菌中，具高度保守性；其原核高效表達系統能夠用于大量表達上述保護抗原，由此制備的抗原蛋白保有其天然免疫活性，可以直接用于免疫防治。
文檔編號A61P31/04GK101319009SQ20081001612
公開日2008年12月10日 申請日期2008年5月9日 優先權日2008年5月9日
發明者侯進慧, 黎 孫 申請人:中國科學院海洋研究所