專利名稱：免疫受體調節劑偶聯體前體和偶聯體及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種免疫受體調節劑偶聯體前體和偶聯體，及其制備方法，和在免疫調節中的應用。
背景技術：
免疫激動劑和免疫抗原(如疫苗，免疫多肽，免疫蛋白，免疫多糖，免疫多聚核苷及酸，滅活的細胞和滅活的微生物等)的聯合應用或者偶聯，往往產生提高的免疫效應(World Chin J Digestol 2005 September 15；13(17)2078-2081 & Vaccine，Volume 23，Issue45，1 November 2005，Pages 5263-5270).本發明合成了一系列免疫受體調節劑偶聯體前體，以及它們和免疫抗原的偶聯體。
發明內容
本發明的目的在于提供一系列免疫受體調節劑偶聯體前體和偶聯體，以提高它們的免疫效應。
本發明的另一目的在于提供上述免疫受體調節劑偶聯體前體和偶聯體在藥物上的應用。
本發明是有關一系列免疫受體調節劑偶聯體前體及其偶聯體，其化學結構通式為[I]
通式[I]中 X1代表O，S，Se或NRR R代表氫，各種直鏈的或支鏈的烷基，鹵代烷基，烷氧基烷基.環烷基，雜環烷基，酰氧基烷基，芳基或雜芳基. R1代表氫，各種直鏈的或支鏈的，取代的和未取代的烷基，烷氧基烷基，各種取代的羰基(包括醛基，酯基，酰胺基等)，硝基，腈基，鹵素； 當R2代表各種生物配體(包括疫苗，免疫多肽，免疫蛋白，免疫多糖，免疫多聚核苷及酸，滅活的細胞和滅活的微生物等)的情況下， X2代表如下所示的化學基團
其中n＝1---12 當R2代表H原子時，X2代表如下所示的化學基團
其中n＝1---12 以OVA為例的蛋白的偶聯體25，26，27，28的結構式代表如下
在通式[I]中，當X2代表單鍵時，R2代表氫原子.或者當X2代表次甲基(-CH2-)時，R2代表如下化學基團
其中n＝0----10；R3代表鹵素或者磺酰氧基和各種酰氧基；代表性化合物19，20，21，23的結構式如下所示
以偶聯前體化合物5，8，11為例的合成路線(Scheme 1)如下所示
以偶聯前體化合物13和17為例的合成路線(Scheme 2)如下所示
以化合19，20，21，23，24為例的合成路線(Scheme 3)如下所示
本發明的有益效果為通過免疫受體調節劑偶聯體前體及其偶聯體，使其用于抗病毒，抗流感和禽流感以及各種急慢性病毒性疾病和其它疾病如抗微生物和抗腫瘤等的免疫調節，具有較好的效果。
本發明的制備方法，具有工藝簡單，成品收率高的優點。
圖1偶聯物25和非偶聯物6的的IFN-γ誘導對比 圖2偶聯物25和非偶聯物6的IL-12誘導對比
具體實施例方式 化合物3的合成 將化合物1(403mg，1mmol)和300mL TEA的10mL DMF溶液中，加入110mg的氯甲酸乙酯.混合物攪拌反應3小時，真空蒸餾除去DMF，殘余物中加入100mL乙酸乙酯，用水洗一次，鹽水洗一次.有機層分離出，無水硫酸鈉干燥.減壓蒸餾除去乙酸乙酯，得化合物2，可直接用于化合物3的合成.將得到的化合物2溶于100mL的無水乙醇，加入1毫升的活性鎳(R-Ni)，通入氫氣至40psi(約2.8大氣壓)，密封氫化12小時.過濾除去催化劑，濾液減壓濃縮，硅膠柱層析分離純化(洗脫液二氯甲烷-甲醇10∶1)，得化合物3(311mg，65％).ESIMSm/z 480.3(MH+). 化合物5的合成 將化合物3(100mg，0.21mmol)和TEA100μL溶解于10mL的DMF中，加入化合物4(59mg，0.22mmol).室溫攪拌12小時.真空蒸餾除去DMF，殘余物中加入100mL乙酸乙酯，用水洗一次，鹽水洗一次.有機層分離出，無水硫酸鈉干燥.減壓蒸餾除去乙酸乙酯，殘余物硅膠柱層析分離純化(洗脫液二氯甲烷-甲醇20∶1)，得化合物5(101mg，76％).ESIMSm/z 631.5(MH+). 化合物8的合成 將化合物6(100mg，0.24mmol)溶解于10mL的DMF中，加入丁二酸酐(25mg，0.24mmol)，于室溫攪拌3小時.再加入N-羥基丁二酰亞胺(28mg，0.24mmol).另將DCC(54mg，0.25mmol)溶解于2mL的無水四氫呋喃中，于0℃滴加到上述DMF溶液中.混合物攪拌過夜，過濾，濾液減壓蒸餾除去溶劑，殘余和20毫升乙酸乙酯混合攪拌1小時，再過濾，濾液濃縮至較小體積，用硅膠柱層析分離純化(洗脫液二氯甲烷)，得化合物8(96mg，65％).ESIMSm/z 614.4(MH+). 化合物11的合成 將化合物9(120mg，0.25mmol)和化合物10(56mg.0.25mmo1)混合于20mL的乙二醇二甲醚中，加入0.2mL的冰醋酸，混合物室溫反應24小時.析出固體，過濾，干燥得產物11(146mg，85％).ESIMSm/z 686.6(MH+). 化合物13的合成 將化合物9(120mg，0.25mmol)和化合物12(101mg.0.25mmol)混合于20mL的無水乙二醇二甲醚中，減壓蒸餾至干(小于60℃)得固體，用乙酸乙酯重結晶得化合物13(98.8mg，48％).ESIMSm/z 824.6(MH+). 化合物15的合成 將化合物3(100mg，0.21mmol)和14(23mg，0.11mmol)混合溶解于20毫升的干燥DMF中，于0℃下慢慢加入DCC(45.5mg，0.22mmol)的1mL THF溶液，加完后，于室溫反應24小時，減壓蒸干溶劑，殘余溶于50毫升乙酸乙酯并攪拌2小時，過濾，濾液濃縮，殘余物用硅膠柱層析分離純化(洗脫液二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)，得化合物15(84mg，67％).ESIMSm/z 1134.2(MH+). 化合物16的合成 將化合物15(113.3mg，0.1mmol)溶解于無水乙醇20mL中，加入NaBH4(23mg，0.6mmol)，混合物室溫攪拌12小時，減壓下于小于30℃濃縮至較小體積，混合物于0℃下加入50mL的1N HCl溶液中，用乙酸乙酯提取(2×50mL)，水洗，鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾干，殘余用硅膠柱層析分離純化(洗脫液二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)，得化合物16(92mg，81％).ESIMSm/z 568.5(MH+). 化合物17的合成 將化合物16(113.5mg，0.2mmol)溶解于10mL的二氯甲烷中，另將2，2′-二吡啶過硫化物(176.2mg，0.8mmol)溶解于15mL的二氯甲烷溶液緩慢滴加到16的二氯甲烷溶液中，混合物于室溫攪拌18小時，減壓濃縮，殘余物用硅膠柱層析分離純化(洗脫液二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)，得化合物17(88mg，65％).ESIMSm/z 677.6(MH+). 化合物23的合成 將化合物6(100mg，0.24mmol)溶解于10毫升的無水吡啶中，再加入DMAP(30mg，0，24mmol)，冷卻到0℃，慢慢滴加化合物22(63mg，0.24mmol)的無水四氫呋喃溶液.加完后繼續于10℃攪拌2小時.將反應混合物傾倒于50毫升冰水中，用二氯甲烷提取(3×50mL)，合并提取液，鹽水洗滌一次，無水硫酸鈉干燥.過濾，濾液減壓濃縮，殘余物用硅膠柱層析分離純化(洗脫液二氯甲烷)，得化合物23(126mg，82％).ESIMSm/z 641.5(MH+). 用合成化合物23的同樣方法得19，20，21. 化合物24的合成 將化合物23與濃鹽酸混合，與室溫攪拌12小時，減壓(小于40℃)濃縮至干，得化合物24(100％).ESIMSm/z 568.5(MH+) 化合物8和OVA protein的偶聯物25合成 將100mg的OVA(ovalbumin，雞卵白蛋白，平均分子量45000)溶解于2mL的蒸餾水，與50mg化合物8的20mL的DMSO溶液混合.于室溫攪拌過夜.混合物液中加入碳酸氫鈉飽和溶液2毫升，均勻攪拌30分鐘，用PD-10脫鹽柱分離(Amershamdisposable PD-1 desalting column)，將含產品OVA結合物的流出液(用280nM吸收波檢測)合并，冷凍干燥.用質譜確定平均分子量為47492.確定產品25包含了5個化合物8的對應單體.用同樣的方法合成了26，27，28. 生物活性測試方法 方法ELISA 試劑和條件 人體外周血單核細胞用重力沉降法離心分離得到。離心機為Ficoll-Hypaque.將分離出的細胞懸浮在RPMI1640媒介中，添加10％的FBS，L-谷氨酸，青霉素/鏈霉素(RP1O，Invitrogen)，植于96井的試板。用本發明中的化合物25---28，在濃度0.1--10μM激發細胞，于37℃，5％的CO2環境下，培養24小時。用Luminex儀(Austin，TX)測量α-干擾素和白介素的水平。圖1和圖2中的所示的結果為平均值。
圖1和圖2為偶聯物25和非偶聯物6的免疫激動效應對比圖1化合物25和6的IFN-γ誘導對比；圖2化合物25和6的IL-12誘導對比。由圖中可以看出，偶聯物的免疫效果有較大的提高。
權利要求
1.一種免疫受體調節劑偶聯體前體和偶聯體，其化學結構通式為[I]
X1代表O、S、Se或NRR；
R代表氫、烷基、鹵代烷基、烷氧基烷基、環烷基、雜環烷基、酰氧基烷基、芳基和雜芳基的任一種；
R1代表氫、烷基、烷氧基烷基、羰基、硝基、腈基和鹵素的任一種；
(1)當R2代表各種生物配體(包括疫苗，免疫多肽，免疫蛋白，免疫多糖，免疫多聚核苷及酸，滅活的細胞或滅活的微生物)的情況下，X2代表如下所示的化學基團的任一種
其中n＝1---12
(2)當R2代表H原子時，X2代表如下所示的化學基團的任一種
其中n＝1---12
(3)當X2代表單鍵時，R2代表氫原子；
(4)當X2代表次甲基(-CH2-)時，R2代表如下化學基團的任一種
其中n＝0--10；R3代表鹵素、磺酰氧基和各種酰氧基的任一種。
2.根據權利要求1所述的免疫受體調節劑偶聯體前體及其偶聯體，為如下結構式的任一種
3.一種權利要求1所述的免疫受體調節劑偶聯體前體及其偶聯體，用于制備抗病毒，抗流感，禽流感，抗腫瘤的免疫調節藥物上的應用。
4.根據權利要求3所述的免疫受體調節劑偶聯體前體及其偶聯體，其特征在于所述的藥物為固體制劑、注射劑、外用制劑、噴劑、或復方制劑。
全文摘要
本發明涉及一種免疫受體調節劑偶聯體前體和偶聯體，及其制備方法，和在免疫調節中的應用。其化學結構通式為[I]，本發明的有益效果為通過免疫受體調節劑偶聯體前體及其偶聯體，使其用于抗病毒，抗流感和禽流感以及各種急慢性病毒性疾病和其它疾病如抗微生物和抗腫瘤等的免疫調節，具有較好的效果。
文檔編號A61P37/02GK101239980SQ20081001424
公開日2008年8月13日 申請日期2008年2月18日 優先權日2008年2月18日
發明者靳廣毅 申請人:靳廣毅