專利名稱：可注射人發角蛋白軟組織填充材料的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種醫學整形美容用材料，尤其涉及一種來源于自體的 適合于注射的可注射人發角蛋白軟組織填充材料的制備方法。
背景技術：
軟組織填充材料在整形外科領域有著廣泛而重要的應用。在組織缺 損修復、改善面部及身體輪廓的治療中，通過軟組織填充材料可以達到 理想的效果；與手術方法相比，注射軟組織填充材料的方法簡單實用、 易于掌握、形態容易控制。
但是這種方法對填充材料的要求很高，理想的充填材料應當具有以 下的特點1)最好是自體的材料，不存在免疫排斥問題；2)能比較長 期地存留，但不一定是永久性的；3)無痛苦且放置容易，質地接近正常 組織；4)最好能通過注射法置入；5)價格不昂貴，副作用少，不出現 皮膚青腫、刺激性、炎癥、遷移等。理想的自體注射材料能夠提供長期 的矯正效果，不需要犧牲額外組織，僅需可以忽略的手術操作獲得原始 組織，通過適當的處理加工獲得無限的產量。
1899年，Gersuny為一位睪丸切除后的年輕男性行陰囊內石蠟注射 陰囊充填開始，誕生了注射充填的技術和科學。自從1977年膠原注射材 料的出現，許多來源于人體、動物甚至是細菌的天然填充材料應用于臨 床，如填充眼睛和唇周圍的表淺皺紋和前額、眉間或鼻唇區可見的深 層皺紋，矯正凹陷性疤痕或水痘凹窩，醫源性或創傷性疤痕和真皮萎縮 等。每一種材料都有它們本身的優缺點，如透明質酸凝膠有較強的異
3源性且易被吸收；提純精制的牛膠原，包括ZydermI (含膠原35 mg/mL)、 ZydermII (含膠原65mg/mL)和Zyplast (含戊二醛交聯的膠原35mg/mL)在 組織內存留期僅有6 9月，且會導致1% 3%的健康病人注射區域發生 局部過敏反應，表現為暫時性的紅斑、搔癢癥狀、硬結和腫脹等；聚甲 基丙烯酸甲酯(PMMA)微粒易導致如過敏反應、毛細血管擴張、肉芽腫 形成并發癥，且PMMA是惰性材料不能降解，置入后很難取出。注射硅膠 的并發癥則多見周邊組織肉芽腫形成、硬化、皮膚變薄、潰瘍形成等； 聚丙烯酰胺水凝膠則易導致出血、血腫、感染、局部水腫、硬結和不對 稱等；膨體聚四氟乙烯(ePTFE)雖性質穩定，組織相容較好，但極易吸附 雜質或吸入雜質貯留于其內部微孔之中，使其喪失了良好的組織相容性， 且對手術操作要求較高，價格較昂貴；自體脂肪顆粒、自體成纖維細胞 溶漿等作為軟組織填充材料的遠期療效并不確切。其他異源性材料如 Artecoll、透明質酸帝J劑、纟屯石圭酉同、Fibrel、 Alloderm、 Dermalogen等 也面臨類似情況，有的已經被美國FDA嚴令禁止使用。因此尋找一種長 期、安全、有效的材料，依然是一個亟待解決的問題。
人發是真皮的演化物，主要成分多硫角質蛋白的肽鏈間存在著廣泛 的交聯，呈現高度的穩定性，使其對物理、化學因素有高度的抵抗力、 性質穩定、耐酸堿、不易被組織吸收降解。人發經戊二醛合劑處理后， 角蛋白處于半解聚狀態，在體內的降解產物為多種氨基酸，可為遷入的 真皮細胞利用，為細胞的生長代謝提供營養。此外，網狀的人發還提供 了粗支架，利于細胞的遷入。將經特殊處理的人發與細胞共培養，發現 人發與成纖維細胞相容性好，且對細胞有吸附性。將人發編織成網狀摻 入膠原中，在體外可抑制成纖維細胞收縮，同時機械張力還能促進彈性 蛋白的表達。已有將人發植入人體填補面部軟組織缺損以及應用人發角 蛋白作為人工腱修復肌腱及韌帶的缺損的臨床應用成功的報導。人發高度的穩定性，無免疫原性及良好的組織相容性，使其作為填 充材料具有良好的前景；同時人發具有獲取方便、可以反復取材和便于 加工等優點，有望利用自體毛發制成填充材料應用于人體自身從而獲得 滿意的填充效果。
發明內容
本發明提供一種可注射人發角蛋白軟組織填充材料的制備方法，該
填充材料可反復取材，安全無毒，組織相容性好，易于人體耐受，且能
夠刺激膠原增生。
本發明采用如下技術方案 一種可注射人發角蛋白軟組織填充材料的制備方法，步驟如下
(1) 清洗除雜質室溫下，取人發樣品中段，蒸餾水反復清洗，晾
干；
(2) 脫脂室溫下，將清洗干凈的人發浸入乙醇脫脂液，1.5 2h，
蒸餾水清洗，干燥；
(3) 氯化NaC10和稀H2S04，水浴比1:30，室溫反應20分鐘，流
水沖洗；
(4) 漂白采用室溫漂白法，清洗干凈的人發毛發20 30質量份， 質量體積濃度為&02 30質量份，焦磷酸鈉質量8份，氨水質量60份， 過硫酸鉀3質量份，室溫反應4小時；
(5) 清洗烘干待人發原料色澤變白后，蒸餾水反復清洗，去除殘 留物，過濾，烘干；
(6) 人發角蛋白顆粒的制備漂白烘干后的人發，按質量體積比為 12 15: IOO的比例，將人發與生理鹽水混合，經碾磨加工8 12h，形 成粒徑約60 80um的人發角蛋白顆粒勻漿，鈷60輻照滅菌。
與現有技術相比，本發明具有如下優點
人發對物理、化學因素有高度的抵抗力,性質穩定，耐酸堿，不易被組織吸收降解，獲取方便，可以反復取材和便于加工等優點，克服現有 的軟組織填充材料的異源性且易被吸收、易過敏、易導致出血、血腫、 感染、局部水腫、硬結和不對稱等；且對手術操作要求較高，價格較昂 貴或遠期療效并不確切等不足之處。本發明來源于自體，便于獲得，安 全無毒，組織相容性好，易于人體耐受，且能夠刺激膠原增生的適合于 注射的人發角蛋白軟組織填充材料。從而實現皮膚及軟組織的長期修復， 滿足整形美容領域的軟組織填充材料的需要。
具體實施例方式
一種可注射人發角蛋白軟組織填充材料的制備方法，步驟如下
(1) 清洗除雜質室溫下，取人發樣品中段，蒸餾水反復清洗，晾
干；
(2) 脫脂室溫下，將清洗干凈的人發浸入乙醇脫脂液，1.5 2h，
蒸餾水清洗，干燥；
(3) 氯化NaC10和稀H2S0"水浴比1:30，室溫反應20分鐘，流
水沖洗；
(4) 漂白采用室溫漂白法，清洗干凈的人發毛發20 30質量份， 質量體積濃度為^02 30質量份，焦磷酸鈉質量8份，氨水質量60份， 過硫酸鉀3質量份，室溫反應4小時；
(5) 清洗烘干待人發原料色澤變白后，蒸餾水反復清洗，去除殘 留物，過濾，烘干；
(6) 人發角蛋白顆粒的制備漂白烘干后的人發，按質量體積比為 12 15:100的比例，將人發與生理鹽水混合，經碾磨加工8 12h，形成 粒徑約60 80um的人發角蛋白顆粒勻漿，鈷60輻照滅菌。
取20g中段人發經脫脂洗滌烘干后，氯化(0. 32%NaC10、 0. 5%H2S04， 水浴比1:30， 20°C ， 20分鐘)，流水沖洗，雙蒸水浸泡3次后，漂白 (30%H202，焦磷酸鈉8g/1，過硫酸鉀3g/1，氨水14g/1，浴比1:100， 40。C水浴，3.5h。)在本實施例中，可以在將勻漿進行鈷60輻照滅菌之前，將勻漿移至液氮罐中，凍干，鈷60輻照后4'C保存。實施例一
1.1實驗材料，試劑和儀器C02細胞培養箱(Heal Force BB16UV HongKong)，相差顯微鏡(NikonEclipse TS100日本)，96孔板，DMEM培養基(Gibco公司美國)，胎牛血清(杭州四季清)，PBS緩沖液，MTT(溴化-3-(4-5-二甲基噻唑基-2)2， 5二苯基四唑，Sigma公司美國)濃度為5mg/ml(0.5%)，過濾除菌，DMSO(Sigma公司，美國)，生理鹽水，高壓滅菌，30%過氧化氫，濃氨
水，過硫酸鉀。1.2人發處理
取20g中段人發經脫脂洗滌烘干后，氯化(0.32。/。NaClO，0.5。/。H2SO4，水浴比l: 30， 20°C， 20分鐘)，流水沖洗,雙蒸水浸泡3次后，漂白(30%H2O2，焦磷酸鈉8g/l，過硫酸鉀3g/1，氨水14g/l，水浴比1:100，4(TC水浴3.5h)， 3(TC烘干，稱重并取lg試樣用作制備粉體材料浸提液，其余分為兩等份。取其中一半試樣，按14%的濃度與生理鹽水混合并分為3等份，分別加工8、 6、 4h，得到粗、中、細三種形態粉體勻漿。另
一半試樣制備人發角蛋白凝膠。1.3試樣浸提液制備
人發角蛋白凝膠經液氮冷凍固化后粉碎，取lg加入10ml生理鹽水中,振蕩混勻后在細胞培養孵箱中37。C放置7d，離心后吸出上清液，制備凝膠浸提液原液(初始100%濃度材料浸液400mg/ml);人發漂白試樣取lg加入10ml生理鹽水中，同法制備粉體浸提液原液，過濾除菌備用。
1.4體外急性全身毒性試驗
選用健康小白鼠24只，體重在20g左右，雌雄各半，隨機分為3組，每組8只，記錄初始體重.試驗組小鼠腹腔分別注射凝膠和粉體的浸提液原液(100%)，上下午各1次，每次0.5ml/10g，連續7天;對照組小鼠取浸提介質生理鹽水腹腔注射，方法同上。于每次注射后即刻，4h，24h， 48h和72h觀察小鼠一般狀態及毒性表現和死亡數。并分別于實驗開始之后第3天，第5天，第7天觀察并記錄各組小鼠體重變化。1.5小鼠骨髓嗜多染紅細胞(PCE)微核試驗選體重在20g左右的健康小鼠20只，雌雄各半，隨即分為4組，每組5只.分別為凝膠浸液組，粉體浸液組，陽性對照組和陰性對照組。兩實驗組按0.5ml/20g量分別腹腔注射凝膠組和粉體組浸提液原液;陰性對照組給予生理鹽水(0.5ml/20g腹腔注射)；陽性對照組給予環磷酰胺(40mg/kg，腹腔注射)。各組均間隔24小時給樣，第二次給樣后6小時處死小鼠，胸骨骨髓涂片，吉姆薩染色，鏡檢。每只動物計數1000個骨髓的嗜多染紅細胞(PCE)，記錄含有微核的PCE細胞數，計算微核率。(微核率指含有微核的嗜多染紅細胞數，以千分率(％ )表示)1.6 MTT比色法測細胞毒性實驗
受試液的制備:將浸提液原液(100%)和DMEM培養基1 : 1混合稀釋，為50%濃度;將浸提液原液和DMEM培養基1 : 3混合稀釋，為25%濃度;對照組加入浸提介質生理鹽水。收集對數期L-929細胞，以5X104個/ml密度接種于96孔板，每孔100ul，分為4組(3個濃度組+對照組)，每組重復8孔。置37"， 5。/。C02培養箱培養24小時，棄去原液，每孔換入100ul新培養液，實驗組每組各孔再加入100ul 100%、 50%、25%的相應受試液，對照組加同量的生理鹽水。置37'C， 5。/。C02培養箱培養，于培養的第3天，第5天和第7天分別取出一塊96孔板，棄去每孔上清110ul，加入10ulMTT(0.5%MTT)，置箱中培養4小時，取板，小心吸去孔內上清，每孔加入DMSO 150ul，再放入37。C， 5%C02培養箱中孵育15分鐘，盡快測定光度值(OD值)，測定波長為4卯nm，參考波長為540腿。
2結果
2.1人發材料的大體觀察
經漂白，不同球磨時間的人發粗、中、細三種粉體勻漿和液態人發角蛋白凝膠都具有較好的流動性和粘滯性，適合注射，且原發中的黑色素含量都已淺化，可以用來填充于面部等較為表淺的層次。
通過x20倍顯微觀察，除細態粉體材料中有部分人發斷片細小，不易觀察到之外，粗、中材料中的人發斷片都保持人發原有穩定的束狀結構，這將有利于延緩注入組織后的降解從而延長填充的持續時間。將人發材料通過不同方法制成粗細各異的粉體和角蛋白凝膠兩種不同形式的材料，可在以后的動物皮下填充實驗中互作對照，以尋求符合注射要求而又有最好填充效果的人發材料的形態。
2.2小鼠急性全身毒性試驗
小鼠一般情況較好，7天觀察期內無死亡，72h觀察期內各組動物
未見中毒癥狀或不良反應，無死亡，體重增長正常，方差分析表明兩試驗組與生理鹽水組之間小鼠體重變化不存在明顯差異，這表明人發凝膠和粉體兩種形式材料浸提液均無急性毒性作用。
2.3小鼠骨髓嗜多染紅細胞(PCE)微核試驗
粉體組和凝膠組的微核發生率與陰性對照組無顯著差異(PX).05)，而與陽性對照組比較差異顯著(PO.01)，則兩組受試物小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核實驗呈陰性，說明人發凝膠組和粉體組無致染色體畸變毒性作用。結果:見表1
表1骨髓嗜多染紅細胞(PCE)微核試驗結果
動物 數目 (只)檢查 PCE計數 (個)微核發生率 f。/ AP value
凝 膠組510002. 4±1. 140P〉0. 50
粉 體組510001. 8±0. 837P>0. 50
陰 性組510002. 2±0. 837P〉0. 50
陽 性組5100024. 2±5. 80 5P<0. 10
2.5 MTT比色法測細胞毒性實驗
按公式:RGR-材料各濃度組吸光度/陰性對照組吸光度X 100%計算細胞相對增殖度(RGR)，并依據細胞相對增殖率與細胞毒性分級的關系轉換成細胞毒性分級。結果表明，人發凝膠和粉體兩種形式材料的不同濃度浸提液在三個時間點測得的細胞相對增殖率均達80%以上，細胞毒性分級為一級，說明具有良好的細胞相容性，無細胞毒性。見表2
表2-1凝膠MTT結果統計分析
3d 5d 7d表2-2粉體MTT結果統計分析
3d 5d 7d
100%濃度組
50%濃度組
25%濃度組
8
3. 2
9%
9
0. 2
9%
9
7. 4
7%
一級
4. 9
0%
9
3. 3
4%
9
7. 5
2%
鄰
一級
8
1. 9
8%
9
1. 2
3%
9
8. 0
2%
.級
實施例二
1動物模型制備
在每只兔背部取毛區沿中軸線左右兩側標記5個注射部位，備皮后用8號針頭在其皮下分別注射制備的A、 B、 C、 D四種自體兔毛角蛋白粉體勻漿材料約2.5ml，使之形成直徑約2cm的皮下隆起，另外一個部位注射生理鹽水做對照。采用Marler等人設計的軟組織填充材料注射動物模型對材料的體內吸收性進行考察。使用游標卡尺測量注射后第i月
10
R
1,
100
%濃度組50%濃度組2
25%濃度組6.
胞分
細性級
主母
G
9
8
2
9
6
3
八 5
9
o
7
CO
性及
毒f
.3.1 /7
G
R
9
5
3
2
<3/
9
9
9
2-
<3/
9
2
7
c3/
胞分
細性級
主母
R
G
9 1 9 9 9 5
3 淪 2 6 4
胞分
細性級
主母
G
R
分
細性級
毒
R
G
胞分
細性
主，母
R皮丘參數皮丘長度a卜皮丘寬度bi、皮丘高度Ci，計算皮丘體積Vi(式1)，及皮丘體積保持率Si (式2) 。
5越高，表明材料的吸收率越低。
計算A、 B、 C、 D四種S值，并記錄其動態變化。<formula>formula see original document page 11</formula>
2 —般情況觀察 ]
動物活動及進食皆正常，背部材料注射區皮膚無紅腫無滲液等炎癥反應，皮丘觸之皆軟于正常皮膚組織；隨觀察時間的增長，A、 B、 C、D四種材料的皮丘質地也逐漸變韌，第12周時，觸之已似正常皮膚組織；至注射后第28周后，材料A注射部位逐漸形成一個皮下硬結，而B， C、D三種皮丘質地較前變化并不明顯。
3材料吸收性觀察除生理鹽水皮下注射后約3小時可完全吸收外，從總體趨勢看，相比A、 B、 C三種材料，D材料吸收降解較快，注射14周后已基本被吸收。A、 B、 C三種材料則吸收相對緩慢。注射后12周時的數據表明D材料平均S值(21%)遠低于A、 B、 C三種(3均值分別為77%， 80%和73%)，統計分析表明，該差別具有顯著性意義(PO.OOl)，而各時段的A、 B、 C三種之間S均值無顯著差異(PX).05)。
4組織學觀察
l周，A、 B、 C、 D四種材料周圍有少量炎性細胞浸潤，以中性粒細胞為主，材料內部亦有少量成纖維細胞長入。
4周(l個月)，A、 B、 C、 D四種材料周圍組織內炎性細胞較前已明顯減少，其周圍有菲薄的纖維包膜形成，尤其以材料A為明顯。
12周(3個月)，A、 B、 C、 D四材料周圍纖維增生，纖維包膜較前有所增厚，依然以材料A明顯，且這四種材料內部纖維成份亦有所增多，周圍未見炎性細胞浸潤。
24周(6個月)，材料A周圍有纖維包膜形成，B、 C材料周圍纖維包膜增厚不明顯；材料D此時已基本被吸收。以自體毛發為原料制備的四種填充材料，除顆粒A在后期之地較硬外，B、 C、 D三種粒徑的毛發角蛋白顆粒填充局部的質地均接近正常軟
組織，有較好的填充效果。既保持了毛發原有的較穩定的結構，又能滿
足于注射填充的使用要求，局部組織反應輕，生物相容性好，其中B、 C顆粒注射后有效的填充維持時間能達到大約為12個月，在12個月的觀察周期后在動物皮下仍存留40%,并且吸收情況呈現平臺期。
上述結果顯示在此部分我們已探索出一套毛發角蛋白顆粒勻漿的
制備方法，并通過不同粒徑毛發角蛋白顆粒的吸收情況的比較，尋找到了較為理想的作為填充材料和作為載體的毛發顆粒粒徑范圍，可以根據患者的要求并且根據具體情況，分別選取不同粒徑的毛發角蛋白顆粒進行填充。
權利要求
1、一種可注射人發角蛋白軟組織填充材料的制備方法，其特征在于，步驟如下(1)清洗除雜質室溫下，取人發樣品中段，蒸餾水反復清洗，晾干；(2)脫脂室溫下，將清洗干凈的人發浸入乙醇脫脂液中1.5～2h，用蒸餾水清洗后干燥；(3)氯化NaClO和稀H2SO4，水浴比1∶30，室溫反應20分鐘，流水沖洗；(4)漂白采用室溫漂白法，清洗干凈的人發毛發20～30質量份，質量體積濃度為H2O230質量份，焦磷酸鈉質量8份，氨水質量60份，過硫酸鉀3質量份，室溫反應4小時；(5)清洗烘干待人發原料色澤變白后，蒸餾水反復清洗，去除殘留物，過濾，烘干；(6)人發角蛋白顆粒的制備漂白烘干后的人發，按質量體積比為12～15∶100的比例，將人發與生理鹽水混合，經碾磨加工8～12h，形成粒徑約60～80um的人發角蛋白顆粒勻漿，鈷60輻照滅菌。
2、根據權利要求1所述的可注射人發角蛋白軟組織填充材料的制備 方法，其特征在于在將勻漿進行鈷60輻照滅菌之前，將勻漿移至液氮罐 中，凍干，鈷60輻照后4。C保存。
全文摘要
本發明涉及醫學整形美容技術領域，根據人發對物理、化學因素有高度的抵抗力，性質穩定，耐酸堿，不易被組織吸收降解，獲取方便，可以反復取材和便于加工等優點，克服現有的軟組織填充材料的不足之處。利用固態的自體人發中段作為原材料，經過清洗、漂白、碾磨加工、凍干、包裝、鈷60輻照處理，將漂白人發制成不同粗細的粉體勻漿及液態人發角蛋白顆粒，提供一種來源于自體，便于獲得，安全無毒，組織相容性好，易于人體耐受，且能夠刺激膠原增生的適合于注射的人發角蛋白軟組織填充材料。實現皮膚及軟組織的長期修復，滿足整形美容領域的軟組織填充材料的需要。
文檔編號A61L31/04GK101530636SQ20081000748
公開日2009年9月16日 申請日期2008年3月12日 優先權日2008年3月12日
發明者章慶國 申請人:章慶國