專利名稱：：用于預防和/或治療阿爾茨海默病的β片層阻斷肽的制作方法
技術領域：
：本發明涉及多肽及其用途，更具體而言，本發明涉及一類可用于預防和/或治療阿爾茨海默病的P片層阻斷肽，以及J斤述多肽用于預防和/或治療阿爾茨海默病的用途。
背景技術：
：阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease,AD)又稱老年癡呆癥，是一種神經退行性疾病，起病隱匿，病程呈進行性，典型的臨床特征是綜^^人知能力損害^LA^改變，表現為早期近期記憶力障礙，繼而表5W續性智能衰退、失語、判斷#^能力喪失^:動障*。這一疾病嚴重影響患者及其家^員的生活質量，*患者家庭和社^^沉重負擔。隨著人口老齡^^程的加快，老年性疾病已成為一個明顯影響人類健康的突出問題。老年性癡呆和惡性肺瘤、心腦血管意外并列為導致老年人死亡的三大疾病，被喻為21世紀人類他泉的第四大敵。世界衛生組織已將AD列入21世紀五大重點疾病之一。我國于1999年i^v^^社會。2004年底，我國60歲及以上老年人口iiJ!]1.43億，占總人口的10.97%。鄉測，這一數字在2014年將iifij2億，2026年iiJij3億，2037年超過4億，2051年iiJ)J最大值，之后一直維持在3億~4億的,。老^^人口的不斷增多，4吏阿爾茨海默病的發病率相對上升。據了解，目前，歐洲、日本和美國80歲以上的人口中有20%以上的人患有此病。4Mfr界65歲以JiA口中有5000多萬人患有不同種類的癡呆癥。阿爾茨海默病的病理學改變的主JHt征為神經細^L間形成大量由p淀粉樣肽(p-amyloidp印tide，簡寫為AP或PA)沉積形成的老年斑(senileplaque,SP)、神經細胞內過度磷酸化的Tau蛋白所致的神經元纖維纏結(neurofibrillarytangle,NT)和神纟狄大量丟失。眾多證據表明A^的神經毒f生是所有病因的共同交匯點。因此耙向AP的預防和/或治療已成為近年來AD研究的焦點之一。AP是P淀粉樣前體蛋白(p-amyloidprecursorprotein,APP)的代謝產物。正常情況下APP在cc分泌酶作用下，生成可溶性的sAPPct，sAPPa具有If^氐細胞內鉤濃度，調節突觸可塑性、M突觸的生^p保護神經元的功能，這是APP加工的主^"形式，這一途徑不產生AP;另一途徑是APP在P分泌酶作用下產生sAPPP和C99，C99進一步在Y分泌酶作用下，#^^肽。y分泌酶水解C99是不均一的，酶切丙氨酸713和蘇氨酸714之間位點產生APi-42;酶切纈氨酸711和異亮氨酸712之間的位點產生APi—40(SelkoeDJ.Alzheimer'sdisease:genes,proteins,andtherapy.PhysiolPev,2001，81(2):741-766)。APi-42占AP蛋白總量的10。/。左右，Ah—40大約占90°/。，<SAPi-42則更容易聚集，聚集的AP1-42是構成老年斑的_4^成分。APi-42肽的一級結構如下所示(SEQIDNO:4):Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser~Gly-Tyr-Glu-Va1-His—His-GIn—151015Lys-Leu-Va1-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Va1-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-16202530Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-GlyGly-Val-Val-Ile-Ala31354042A&i-42C端的10個絲^J^33~42及17~21位的絲Wl^具有高度的疏;do性，構成了ApH2疏水區；28-42位M^J^形成e折疊構象的可能性較大，而9-21位的^J^^t^也可能形成P折疊構象。P折疊構象有利于A^—42肽的聚集。實m果表明，C端的Val4。Ile"Ala42三個絲^JjftP折疊的構#^到了穩定的作用，有利于P折疊的形成。A&肽H2的N端具有親水性，才娥溶液M的不同，能夠形成oc螺i,無規螺i或e折疊的構象。研究結a明P折疊構象有利于AP肽的聚集，而Ae肽的聚集又是由于其疏水區的相互作用。Soto等人(SotoC，KindyMS,Ba咖annM，etal.,InhibitionofAlzheimer'samyloidosisbypeptidesthatpreventbeta-sheetconformation.Biochem.Biophys.Res.Commun.1996，226(3):672-680)用脯氨酸取代AP肽疏水區附近的^酸，得到的小肽不僅不會形成P折疊的構象，同時還可以與AP糾目結合，使其維持無規螺凌的構象，抑制其聚集。研究結果發現A^肽的疏水區之一A016—M五肽片段Lys-Leu-Val-Phe-Phe能與AP糾目結合，從而阻止其聚集。通過丙氨酸逐個取代，表明Lys16、Leu17、和Phe"在其中起了關鍵作用。這說明了A"—2。絲是AP肽聚集過程中與鄰近AP肽街目結合的部位。研究顯示AP的空間構象明顯影響其聚集能力，當其二^構以oc螺^7主時，聚集較慢；而以M斤疊為主時，聚集l^快。在一定條件下，富含N斤疊的結構疏水區暴露，會促使AP聚集，形成低聚物，最終成為不可溶性物質樹狄間隙^^,產生神經毒l"生并引戰內膠質細胞活性增高，產生炎性介質和4傳，共同形成淀粉樣斑塊。襯的疏水性電荷數增多是AP聚集的主要原因之一。與Ap1-40相比APH2延長的兩個JL^酸不僅增加了AP的疏水性，4吏其更易聚集，而且提高了聚集物的穩定性，早期即可選擇'lt^淀粉樣斑塊中i5C^。A^H2可能是可溶性AP形成寡聚物、纖維和斑塊的始動因素(Younkin，S.G.1995.EvidencethatAbeta42istherealculpritinAlzheimer'sdisease.Ann.Neurol.37:287-288.;MatsuokY，SaitoM，UfrancoisT,etal.Nova1therapeuticapproachforthetreatmentofAlzheimer'sdiseasebyperipheraladministrationofagentswithanaffinitytoP-amyloid[J].JNeurosci,2003，23(1):1-5)。Jarrett等提出A0H2是作為"種子"首先聚集啟動了AP的沉積；其他單^i^聚集到核的周圍，延長(elongation)肽鏈形成纖維進一步聚集并傳播,^^F形成斑塊(Jarrettn，LansburyPTJr.Seeding"one-dimensionalcrystallization"ofamyloid:apathogenicmechanisminAlzheimer'sdiseaseandscrapieCell.1993，(6):1055-1058)。從AP聚集、沉淀再到老年斑的形成及其伴隨的神經元損害被認為是阿爾茨海默病的病理^U制的中心環節。因此，若能夠抑制AP肽的聚集，加速A0肽的降解與清除，便能夠從才ML上達到預防和/或治療AD的目的。目前國際上針對AP的藥物的研究目標是減少AP的生成，增加AP清除、預防或逆轉AP聚集和抑制AP的44生等。美國華盛頓大學醫學院的研究人員發現，在清除阿爾茨海默病小鼠腦內的淀粉蛋白斑塊后，小鼠的腦細胞開始奇跡般地'1^X功能。表明針對Ap的藥物有著令A^舞的前景。在各種針對AP的藥物中，P片層阻斷劑^i^為人關注。當前國際上屬于P片層阻斷劑的藥物主要有以下兩種(1)加拿大Neurochem公司根據低相對分子質量氨基糖蛋白(gly-cosaminoglycan，GAGs)在P淀粉^^白斑塊中起穩定斑塊作用并P聘斑塊降解這一發現，設計并合成了該GAG的衍生4^物。動物體內實^^表明，該類^^目對^"質量GAG類似物可以顯著降低p淀粉#^白#漿和腦內水平，抑制Ap聚集，用于治療AD。目前小^M^物Alzhemed處于111期臨床*階段c(2)Chac6n等(Chac6nMA，BarriaMI，SotoC，etal.，Beta-sheetbreakerpeptidepreventsbeta—inducedspatialmemoryimpairmentswithpartialreductionofamyloiddeposits.Mol,Psychiatry.2004，9(10):953-61)通it^t注射纖維化AP使大I^生行為障礙，然后檢驗由5個^^iU且成的p片層阻斷肽(five-amino-acidbeta—sheetbreakerp印tide，iAbeta5p)對神經元的保護作用，結果顯示iAbeta5p不僅能l!ajLAP纖維的形成，而JJ^AP纖維具有分解能力，目前該藥處于111期臨床*階段。W域目前需要能夠與P淀粉^白單體(A&i-42)特異結合，穩定其正常空間結構，抑制其形成p片層，P^ajh可溶性p淀粉^^白寡聚體和e淀粉,白斑塊形成的新的活性藥劑。所述藥劑應能夠抑制Ap肽的聚集，加速AP肽的降解與清除，從而可用于AD的預防和/或治療。
發明內容本發明的一個目的是_41_#^種能與P淀粉#^白單體(APH2)特異結合、穩定其正常空間結構、抑制其形成P片層、fiUL可溶性e淀粉;^白寡聚體和P淀粉^^白斑塊形成、財AP纖維具有分,用的多肽，所述多肽可以,皮稱為P片層阻斷肽。本發明的發明人意夕卜就現，包脅下絲齡列的多肽能夠實現上述目的His-Xl-X2-Leu-X3-Phe-Phe-X4-Glu-Asp其中XI可以為賴氨^i^(Lys，K)或者M,殘基(Gln，Q);X2可以為賴氨^基(Lys，K)或者M,殘基(Gln，Q);X3可以為纈氨MJ^(Va1，V)或者脯氨^1>(Pro，P);X4可以為丙氨MJUAla，A)或者谷氨to^(Glu，G)。因此，在本發明的第一方面，提供了包括上述^J^^列的多肽。由于上述的多肽能與f>淀粉樣蛋白單體(APH2)特異結合、穩定其正常空間結構、抑制其形成P片層、阻止可溶性P淀粉#^"白寡聚體和P淀粉#^"白斑塊形成、且對AP纖維具有分解作用，因此可以用于阿爾茨海默病的預防和/或治療。因此，在本發明的第二方面，提供了本發明的多#制備用于預防和/或治療阿爾茨海默病的藥物中的用途。在本發明的第三方面，提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物中包括一種或多種本發明的多#可藥用的載體。在本發明的第四方面，提供了一種預防和/或治療受試者的阿爾茨海默病的方法，所述方法包括給予所述受^r有效量的本發明的多肽。圖1顯示了制備本發明多肽的一種示例性方法的步#所制備產品的檢測結果。圖1A顯示了用于合成和純化本發明多肽H101的一種示例性方法的主要步驟；圖1B顯示了H101的色譜分析結果；圖1C顯示了H101的質譜檢測結果。圖2顯示了APp42肽聚集和纖維形成的減磺l:T熒光分析結果，表明本發明多肽對AP聚集的熒光強度的影響。將給定濃度的AP肽與本發明的多肽HIOI、H102或H103或維生素E(VE)或L5在37"C賻育24小時，然后測量ThT熒光強度。n=5,承表示與APi—42纟ibf目比尸〈0.05。圖3顯示了H102和維生素E抑制AP纖維形成的劑量依賴性曲線，將濃度為10pmol/L、20nmol/L、44.30jamol/L、100pmol/L的H102和維生素E與11.07nmol/L的APp"在37"C共孵育24小時，然后測量ThT熒光強度。n=5。圖4顯示了H102和維生素E抑制APH2纖維形成的時間依賴性曲線，將濃度為44.30,1/L的H102和維生素E與11.07jimol/L的APi—42在37°C共孵育，分別在12小時，1天、3天、5天和7天時測量ThT熒光強度。n=5。圖5顯示了用濃度為44.30jimol/L的各種多肽與11.07pmol/L的Ap丄—42在37。C^賻育5天后，AP1-42多肽纖維形成的電鎮觀察結果。其中圖5A為將API—"單獨孵育5天的電鏡結果，放大倍數35000倍；圖5B為將AP!-42單獨孵育5天的電鏡結果，放大倍數50000倍；圖5C為將多肽L5與A&i-42^"^育5天的電鏡結杲，放大倍數35000倍；圖5D為將多肽H101與APh2i賻育5天的電鏡結果，放大倍數35000倍；圖5E為將多肽H102與APh2—^孵育5天的電鏡結果，放大倍數35000倍；圖5F為將多肽H103與APi-42"-^孵育5天的電鏡結果，放大倍數35000倍；圖6顯示了不同濃度(10ymol/L、20jumol/L和40ymol/L)的各種多JI^于與5ymol/L的AP1—42—起培養72小時的yUt經母細胞瘤SH-SY5Y細胞的存活率的影響。n=12,*表示與APi-42^^目比,〈0.05。圖7顯示了用APPN末端^^和AP抗/^t各組小鼠的海馬CA1區神經元切片進行免^^且化染色的結果，放大倍數為400倍。圖7A:對照組的APPN末端抗體免疫組化染色結果；圖7B:對照組的AP抗體免^l且化染色結果；圖7C:模型組的APPN末端^/^免^i且化染色結果；圖7D:模型組的A0抗體免^l且化染色結果；圖7E:多肽注射組的APPN末端抗體免疫組化染色結果；圖7F:多肽注射組的Ap抗體免疫組化染色結果。圖8顯示了用剛果tof各組動物的;^f顳葉;^和海馬進行染色的結果，放大倍數為400倍。圖8A:對照組的大腦顳葉皮層的剛果紅染色結果；圖8B:對照組的海馬的剛果紅染色結果；圖8C:^t型組的大腦顳葉^0&的剛果紅染色結果；圖8D:模型組的海馬的剛果紅染色結果；圖犯多肽注射組的:U^顳葉皮層的剛果紅染色結果；圖8F:多肽注射組的海馬的剛果紅染色結果。^M^實施方式在本文中公開了一系列多肽的#^#列，本領域技#員能夠理解的是，在以單字母或三字母的M^J^示某一序列時，該序列從左至右表示的是該多肽從N端(氨基端)至C端(羧基端)的序列。例如當使用"His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp"或"HQKLVFFAED"表示某一多肽的序列時，意為該多肽的序列為"N端-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-C端，，，即"N端-HQKLVFFAED"C端"。在本發明的第一方面，提供了包括下述M酸序列的多肽His-Xl-X2-Leu-X3-Phe-Phe-X4-Glu-Asp其中Xl可以為賴氨^^(Lys，K)或者錄ilW絲(Gln，Q);X2可以為賴氨^J^(Lys，K)或者谷氨,殘基(Gln，Q);X3可以為纈氨^J^(Val，V)或者脯氨MJ^(Pro，P);X4可以為丙氨艦基(Ala，A)或者錄艦基(Glu，G)。本發明的多肽可以包括上述M酸序列、基^^上由上述M酰亭列組成或者由上述^J^4列組成。在本發明的一個實施方案中，提供了一種具有如下序列的多肽，所述多肽在本發明中被命名為H101:H101:His-Lys-Gln-Leu-Va卜Phe-Phe-Glu-Glu-Asp(服QLVFFEED)(SEQIDNO:1)。在本發明的另一個實施方案中，提供了一種具有如下序列的多肽，所述多#本發明中被命名為H102:H102:His-Lys-Gln-Leu-Pro-Phe-Phe~Glu-Glu-Asp(HKQLPFFEED)(SEQIDNO:2)。在本發明的另一個實施方案中，提供了一種具有如下序列的多肽，所述多#本發明中,皮命名為H103:H103:His-Gln—Lys-Leu-Val-Phe-Phe—Ala~Glu-Asp(HQKLVFFAED)(SEQIDNO:3)。在本文中公開了多種多肽的tj^酸序列。顯而易見的是，可以對本發明的多肽進行各種修飾。所迷的修飾包括但不限于脯氨酸和賴氨酸的鞋基化，絲氨^或蘇氨^^的羥基基團的磷酸化，賴氨酸、精氨酸和組氨酸側鏈的o-JL^基團的甲基化,N端M的乙酰化以;s^某些情況下C端g的ife^f匕。應該理解的是，在l^本發明多肽的皿絲列i^,上述各種#^形^于本領域技^A員;L^而易見的，并且含有這些#^的包括所公開#^斷列的多肽#本發明的范圍之內。上述的本發明多肽能夠作為P片層阻斷肽，它們能夠與P淀粉樣蛋白單體(A3i-42)特異結合、穩定其正常空間結構、抑制其形成P片層、阻止可溶性P淀粉絲白寡聚體和&淀粉白斑塊形成、JJ寸AP纖維具有分幹ft用，因此可以用作預防和/或治療阿爾茨海默病的藥物。所以，在本發明的另一方面，提供了本發明的多^制名"預防和/或治療阿爾茨海默病的藥物中的用途。本文中所使用的"預防"指的是減少受試者患上疾病的風險或者延遲患者患病或癥狀出現的時間。本文中所使用的"治療"并不是指完全治愈。它是指減輕了潛在疾病的癥狀和/或減少了導致癥狀的一種或多種潛在的細胞、生理或生物化學病因或枳逸。應理解本文所使用的被減輕是相對于疾病狀況而言的，包括疾病的分子狀況，而不僅僅是疾病的生理狀況。本發明還提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物中包括一種或多種本發明的多肽和可藥用的載體。"可藥用的載體"是指在生物學上或其他方面不會具有不良作用的物質，即可以將所述物質與本發明的多肽一同給予受試者，同時不會引起^r不良的生物學影響或以有害的方式與含有它的藥物組合物的任何其他組分相互作用。顯然應當選擇可使活性成分的^^r降解降到最低并且使受試者體內的任何不良副作用減到最小的載體，這是本領域技術人員所熟知的。本發明的藥物組合物通常包括至少一種本發明的多肽和一種或多種可藥用的載體。合適的載體包括但不限于抗氧化劑、防腐劑、著色劑、調味劑和稀釋劑、乳化劑、懸浮劑、溶劑、填充劑、增量劑、緩沖劑、載體、沖淡劑、賦形劑和/或藥用佐劑。例如，合適的載體可為生理鹽水溶液、檸檬酸鹽緩沖液或人工CSF,以及可能添加常用于腸胃外給藥組合物的其他物質。中性緩沖鹽溶液或與血清清蛋白混合的鹽溶液也是示例性的載體。本領域技術人員可以容易地確定可用于本發明組合物和劑型的多種緩沖劑。典型的緩沖劑包括但不限于可藥用的弱酸、弱堿或它們的混合。優選地，緩沖組分為水溶性物質，例如磷酸、酒石酸、乳酸、琥珀酸、檸檬酸、乙酸、抗壞血酸、天冬氨酸、谷氨酸，以及它們的鹽。載體中的基本溶劑在性質上可以為水性的或非水性的。另外載體可以含有用于改善或維持制劑pH、滲透性、粘度、澄清度、顏色、無菌度、穩定性、溶出狄或氣味的其他可藥用賦形劑。本發明的藥物組合物還可以含有其他可藥用的用于改善或維持本發明多肽的釋沈逸率的載體。這類載體為配制緩釋制劑的技術人員已知的物質。當本發明的藥物組合物被配制成以后，可在無菌管中以溶液、懸液、■、乳劑、固體或者脫水或凍干粉末的形式儲存。這些制劑也可以以即用形式、以用前需要重配的凍干粉形式或以用前需要稀釋的液體形式儲存。優選地，本發明的藥物組合物以單次使用的無菌管裝形式提供，并在用前一直在2-8x:儲存。在即將給藥前，可將本發明的藥物組合物用合適的無菌的例如M上述的檸檬酸鹽緩沖液恰當地稀釋。本發明還提供了一種預防和/或治療受試者的阿爾茨海默病的方法，所述方法包旨予所述受M有效量的本發明的多肽。術語"有效量"意為所使用的化合物的量足以防止疾病的發病或癥狀的出現，或者改善疾病或病癥的一種或多種病因或癥狀。所迷改善只需減輕或改變而并不必須消除。對于本發明多肽而言，其預防和/或治療有效量應才^所針對的個體以及所用的多肽而變化。所用的多肽的預防和/或治療有效量也應根據個體的年齡、身材、體重、狀況等而變化。針對務沐受^，確定本發明多肽的預防和/或治療有效量是在^4頁域技^A員的能力范圍之內的。將本發明的多M本發明的預防和/或治療方法應用于阿爾茨海默病受試者時，具有顯著抑制受試者腦組織內AP聚集，減少淀^#斑塊的數量和面積，改善阿爾茨海默病癥狀的效杲。例如可以提高活動力和注意力并減少反應時間，可以改善發音、面部表情、體態、嗅覺、性欲、性功能和情緒狀況并使精神狀態愉快。在本發明的另一個實施方案中，可以適當地對例如阿爾茨海默病患者給予本發明的多肽作為認知增進劑，從而提高特別是被癡呆損害的學習能力或者抑制認知衰退和/或癡呆。^^發明的多肽的制備本發明的多肽可以通過本領域技^A員已知的任何制備多肽的方法來制備。可以使用化學合成法合成本發明的多肽。多肽的合成可以在溶液中進行，也可以使用固相合成法。多肽的固相合成方法包括Fmoc固相合成法和tBoc固相合成法。人工合成多肽的方法一^從C端(M端)向N端CtJ^)合成。在本發明的一個實施方案中，采用Fmoc固相合成^^成本發明的多肽，并通過HPLC進行純化。圖1以示例性的方式顯示了在這個實施方案中合成和純化本發明的一種多肽HIOI的主要步#所制備多肽的;^測結果。在這個實施方案中，使用多肽固態合成^^合成柱上合成多肽，從而大大減輕了產品提純的難度。為了防止副M的iLi，^^成柱和添加^J^酸的側^I^皮保護的。g端是游離的，并JU^gjL之前必須活化。本發明的多It^采用Fmoc法合成和采用制備高效斜目(HPLC)柱純4^，可以^J^)質譜(MS)分析來鑒定。應當理解的是，所有本發明的多肽均可用與上述實施方案類似的合成方法來制備、純化和鑒定。也可以通過重多ilj^因工程的方法生產本發明的多肽。簡而言之，可以合成編碼本發明多肽的多核苷酸，然后將其用本領域已知的方法轉化至合適的宿主細胞中并使其^^達，對表達產物進行純化或處理即可得到本發明的多肽。實施例下面結合實施例對本發明作進一步說明。以下實施例是為了使本領域M技權員能夠更好艦解本發明，這僅僅出于示例性目的，并非意在限制本發明的范圍。已經努力確M關數字(如數量、溫度等)的準確性，但應該考慮到^^存在一些誤差和偏差。除非另有說明，份數為重量份數，溫度以"C為W或者為環境溫度，壓力接近或等于大氣壓。實施例l:本發明的多肽的制備在本實施例中，首先^^1Fmoc/tBu固相多肽合成法合成了本發明的一種多肽HIOI，所述多肽的序列為His-Lys-Gln-Leu-Val-Phe-Phe-Glu-Glu-Asp(SEQIDN0:1)。本實施例的多肽合成方法中所用原料為Fmoc-Asp(OtBu)-WangResin(0.37咖ol/g)、Fmoc-Va卜0H、Fmoc~Glu(0tBu)-0H、Fmoc-His(trt)-0H、Fmoc-Gln(trt)-OH、Fmoc-Leu-0H、Fmoc-Lys(Boc)-0H和Fmoc-Phe-OH。本實施例中應用的多肽合^純化方法的主要步驟如圖1A所示。圖1A所示的實驗方案中所用的TFA試劑的配方為[TFA:H20:乙_=^|:錄，以僻^p、比為92.5:2.5:2.5:2.5混/H。，'j備得到的肽粗產品通過HPLC純化，佳J^獲得的肽的純度大于95%，HPLC的結果示于圖1B。將通itii^法制備和純化的多肽H101^^]質譜(MS)分析鑒定并測序，質^^析的結果示于圖1C。鑒定和測序的結果顯示，用上述方法制備的多肽序列和分子量與預期相符。用與本實施例中類似的方法，it^還制備了以下;ut本發明的多肽HI02:His_Lys-Gln-Leu-Pro-Phe-Phe-Glu-Glu-Asp(SEQIDNO:2);H103:His-Gin-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp(SEQIDNO:3)。對以上;ut合成多肽的測序和鑒定結a明，本實施例所述的合成和純化方法適用于本發明的各種多肽。用所述方法制備的各種多肽的序列和分子量均與預辦目符。并且用上述it化方法可以得到純度大于95°/4的多肽產物。實施例2:本發明多JIWP淀粉皿白的影響材料與方法1.藥品與試劑A0i—42(純度>98°/。)、維生素E、硫磺素T(ThioflavinT，ThT)、噢哇藍(MTT)，二甲肚砜(DMSO),均購自美國Sig咖7〉司；MEM培養基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(trypsin)均購自美國Gibco-BRL公司；本發明的珊多肽HIOI、H102和H103采用實施例1所迷的方法制備；同時還用與實施例l所述方法類似的方法^^成了一種五肽Leu-Pro-Phe-Phe-Asp，該五肽與Soto-Jara等人發明的P片層阻斷肽iAbeta5的序列相同，并J^本發明中被命名為L5，在本實施例和其后的實施例中#^用L5肽作為對照。以上幾種多肽均由上海吉爾生物>{^司合成，并通過高效液相色鐠法(HighperformanceLiquidChromatography,HPLC)純化，贈妝(MS)分析鑒定敝均〉95%。2.確磺素T(ThioflavinT，ThT)熒光分析和電子顯微^^見察ThT熒光強度可以反映ap的聚集程度，所以用ThT熒^^分沖/m蛋白的聚集程度。據mii，維生素E(VE)可以有效抑制AP聚集和纖維形成，因此本實驗采用維生素E作為陽i樹照。將A&I—"凍干粉用50咖ol/LPBS(pH7.4)配制成22.15|imol/L溶液，將上述四種多肽(HIOI、H102、H103和L5)用同樣的PBS分別配制成濃^788.61umol/L的溶液，維生素E用含0.2%Tween80的PBS配制成88.61jamol/L的乳化液。實驗時將Apw2溶液與樹多峻液等^、^^，使它們的終濃度分別為11.07pmol/L和44.30|amol/L。將Api-"和維生素E乳化液等^V:^作為陽']i^照，將只含有而不含有^r上述多M維生素E的溶液作為陰性對照。將上述各組溶液在37X:共同賻育24h后，每組取10ji1加入990n1的3.0pmol/LThT磷離緩沖液中，在狄波長453nm，發射波長478~486nm處測定ThT熒光強度。3.本發明多肽與APi-42的量效和時效關系選取多肽H102,用上述PBS配制成系列濃度，與11.07umol/LA0i-42溶';^37。C共同孵育24小時后,進行ThT熒^r測，以確定本發明多肽與APi-42的量效關系。將濃^44.30,1/L的證和維生素E與11.07jumol/L的APH2在37匸共孵育，分別在粹育開始后12小時(12h)、1天(ld)、3天(3d)、5天(5d)和7天(7d),進^f亍ThT熒i^r測，以確定XPLS^種多肽與APi-42的時效關系，同時，單獨孵育A0l-42肽作為陰'^t照。4.電#^膝為了進一步*纖維的形成，用濃^44.30jumol/L的各種多肽與11.07y邊ol/L的AP1-42在37。C^孵育5天后，取每組樣本各5ji1,滴于含碳支持膜的300目去離子銅網上，室溫靜置15min。2y。醋酸xsl^4W光負染2min，干燥后用透射電m察。同時將APi-42肽單獨孵育5天作為陰'l!^t照。5.細^^勝實驗選擇4^域常用的人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞系作為細胞條t生實驗的對象，該細胞系購于首都醫科大學宣武醫院，在MEM培養基內按常財法培養，其中添加10。"v/v)的胎牛血清，于371c、5%0)2培養箱中培養，每5天傳代一次。將細胞生長狀態穩定并處于對l^t長期的SH-SY5Y細胞以密度為1.0x107ml接種于96孑Ul(Costar產品)，每孔培養液體積200n1，24小時后更換為iLA清培養基，并加入5jimol/LApi-42溶液，^^且。將前述四種多肽分別以10p邁ol/L、20jiniol/L和40pmol/L濃妙入各組細胞的培養液中。將只加^t血清培養基紗入APh2和多肽的細J!^i且作為陽性對照，將培養基中只加入APi—"而^MpAJi述多肽的細J5Si且作為陰'樹照。在加入多^72小時，向每孔中加入3-(4,5-二曱基-2-#^)-2，5-二苯絲化四唑(MTT)(5mg/ml)20p1，37t:孵育4小時，棄去原培養液，每孑L^入DMS0200nl，靜置10min，震搖lmin,使曱臜顆粒完全溶解，用全自動酶標儀測定492nm處的光密度值(0pticaldensity,0D)。6.統計學處理對于兩組之間的數據比較，采用t檢驗方法；對于兩組以上的lt據比較，采用尸檢驗方法。結果1.所測試的各種多肽對AP1-42聚集和纖維形成的抑制作用用ThT焚光法分析所測試的各種多肽和VE對APi—42聚集和纖維形成的影響，AP1-42在PBS溶液中能形成非常高的熒光強度，表明AP1-42能自我聚集和形成AP纖維。將只含有APp42而不>|^[可測試多賦維生素E的陰'f樹照的熒光強度計為100%。計算所測試的各種多肽對A&H2聚集和纖維形成的抑制率(％)。結果示于下表l(注表l中4^t據均已扣除儀器系統本身產生的本底焚光)。表l:各種多^tAP聚集的抑制作用(0/。)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>由Ji^l的結果可以看出，H1O2對A01—42聚集的抑制率最高，向下遞減依次為L5、維生素E、H101和H103。將Ji^的實M^i會制成直方圖，示于圖2。如圖2所示，H102能明顯抑制Ap聚集和纖維形成；維生素E與AP共同孵育，也有明顯抑制A^-42聚集和纖維形成的作用，^效果比H102弱。2.本發明多肽與APi-42的量效關系圖3示出了不同濃度的多肽H102和維生素E與11.07limol/LA01-42溶液在37匸共同孵育24小時后，進行ThT熒i^測的結果。由圖3可以看出，H102和維生素E對AP纖維形成的抑制具有濃度效應，H102在#^濃度泉的抑制率均大于維生素E。H102和維生素E的最高抑制M均在20Mmol/L附近。3.本發明多肽與APi-"的時效關系圖4示出了本發明多肽H102和維生素E與11.07pmol/LA^—42溶液在37t:共同孵育不同時間后，進行ThT熒光檢測的結果。由圖4可以看出，11.07pmol/LApi-42單獨賻育前24h的熒光強度較低，第3天急劇增強，隨后形成一平臺式增長，H102組和VE組的各時間點的熒光強度均明顯減弱，并且以H102處SI旦的^最為顯著。以曲線的半高峰出現的時間Tm代表曲線的變化特征，AP組的Tm在第3天。與AP^a4目比，H102和維生素E組將1/2延遲至第4天。4.電^^L^結果圖5顯示了用濃JL^牧30jLimol/L的各種多肽與11.07M血ol/L的Ap在37X^"^孵育5天后，A^-42多肽纖維形成的電鎮觀察結果。從各圖中可以看出，APi-42單獨孵育5d，出現大量AP纖維，直徑約8~10nm，長約0.5~5p邁，呈芒刺式晶狀聚集，有分枝，甚至交織成網狀，其間夾雜著少量呈聚集狀態的無定形結構(圖5A和5B，對照組)；L5與A0孵育5d,形成的AP纖維明顯較細，并聚絲直徑約48nm,長O.3~5pm,交織成網狀，其間夾雜著極少量呈聚集狀態的無定形結構(圖5C);H101與AP共同孵育5d，有A0纖維形成，直徑較細，約5-8nm，長O.5~5jLxm，有分枝交織成網狀，其間可見極少量呈聚集狀態的無定形結構(圖5D);H102與AP共同孵育5d,AP纖維形成明顯減少且直徑變細，約36nm，長O.3~3jum，交織成網狀，其間夾雜著極少量呈聚集狀態的無定形結構(圖5E);H103與AP共同孵育5d，A^纖維形成，并聚iy^直徑約58nm，長0.55jim,呈芒刺式晶狀聚集，交織成網狀，其間夾雜著少量呈聚集狀態的無定形結構(圖5F)。5.本發明多肽對SH-SY5Y細胞存活率的影響圖6顯示了不同濃度(10p邁ol/L、20nmol/L和40uniol/L)的各種多^t于與5mmol/L的A&1-42—起培養72小時的yUt經母細胞瘤SH-SY5Y細胞的存活率的影響。n-12，承表示與APH2組相比戶〈0.05。由圖6中可以看出，APi—42作用于SH-SY5Y細胞72h后，細J^活率下降，而用不同濃度的4種多肽(10jLimol/L、20p邁ol/L、40jimol/L)分別與APi—42共同孵育細胞，細胞存活率有所改善，并呈現一定的劑量依賴關系。以上結果表明，H102對細胞存活率的提高最有效，并且以20nmol/L為最適濃度。實施例3:Hl02對APP轉基因小鼠腦內淀粉#^白(A&)和淀粉##白前體蛋白(APP)表達的影響材料與方法實M物9月齡APP695轉基因小鼠30只，同遺傳背景同月齡C57BL/6J小鼠10只，料不限，均購自中國醫學科學院中國協和醫科大學^^物研究中心。藥品與試劑Api—42跳購自美國Chemicon公司；APP抗體、即用型SABC免疫組化染色試劑盒、DBA顯色試劑盒、剛果紅購自武漢博士^/〉司；^L試劑均為國產分析純。H102多絲用如實施例l所述的方法制備、純化和鑒定，在實驗時用生理鹽水稀釋配制成40jimol/L溶液。動物分組和;^型制備30只APP695轉基因小鼠隨機分為模型組15只，多肽注射組15只；C57BL/6J10只設為正常對照組。多肽注射組每次向動物側腦室注射40nmol/L的H102生理鹽水溶液3pl，對照組和模型組每次向動物側腦室注射等體積生理鹽水，每日注射一次，連續注射10天。所有動物均以相同M飼養于天津醫科大學實驗動物中心SPF級清潔鼠房。將動物用10%水合氯醛按400mg/Kg體重的劑量進4亍^^后，固定于腦立體定向M,剪去頭部4JL用氨爾碘消毒后，沿正中線切開^pi^長約lcm，剝離骨膜，顯露骨性標志。調整小鼠頭部平面，4吏Bregma和Lambda處于同一高度。參照George，s小鼠腦立體定位圖譜，在顱骨上于側腦室(P。..58，&，H—L》位置打一直徑為l咖小孔為進針點。手術后第二天，開始注射。借助小動物腦立體定位^it過微量注射器緩慢、勻it^向側腦室注入3pl多g液或生理鹽水，注射結A^留置針lmin,緩慢退針。局部壓iiih血，連續注射10天。小鼠海馬石i^t刀片的制備對各組動物連續進行側腦室注射10A^，采用0.1kg/L水合氯趁按4mL/kg體重的劑量進行皿注射麻醉，經左心室iSi4插管，同時剪開右心房，快速灌注生理鹽水；待肝臟變白后，改灌注40g/L多聚甲醛，ii^'^慢，至小鼠四肢僵硬為滿意；取小鼠腦，快it^tA含30%蔗糖的多聚甲醛溶液中固定2~4天。待腦組織下沉后，即可4tit塊包埋。行小鼠腦矢狀面切片，待海馬CA1區出g,進行連續切片，每隔10^L1張，每只小鼠每種^W3張，厚度5ym。免疫組織化學染色按照免疫組化試劑盒說明書的步驟，分別進4亍AP、APP的免疫組化染色，第一^#釋;^別為1:100和1:200，第二求M釋度均為1:100。在400倍方文大倍數下，JiS并拍照。小鼠腦組織切片的剛果紅染色上述石蠟包埋切片至水，^10%甲醛液15min后，直接^^剛果紅染色液15min,水洗4min，浸入蘇木^素液2min,水^將切片浸入0.5%鹽酸乙醇分化，充分水洗泛藍后用乙醇脫水，用二甲^it明化，用中性樹膠封固。在400倍》文大倍數下，條并拍照。結果1.APPN末端抗體免J^且化染色和A&抗體免疫組化染色。圖7顯示了用APPN末端l^和A0抗體對各組動物的海馬CA1區神經元切片進行免^^且化染色的結果。從圖7中可以看出(l)對照組中APPN末端抗體和Ap^^免^i且化染色的結果(分別為圖7A和圖7B)顯示對照組海馬CA1區神經元胞漿著色呈陰性或弱陽性；(2)模型組中APPN末端抗體和AP抗體免疫組化染色的結果(分別為圖7C和圖7D)顯示模型組與對照la^目比陽性細胞增多，表達增強，胞漿著色明脅深；(3)多肽注射組中APPN末端抗體和AP抗/^免疫組化染色的結果(分別為圖7E和圖7F)顯示:多肽注射組APP同模型^4目比陽性細胞減少，胞M色變淡，表達減弱。2.剛果紅染色。用剛果紅對小鼠腦組織病理切片進行染色后，對小鼠;U^顳葉皮層和海馬淀粉樣斑^4達情;X^行，J^，染色結果示于圖8。從圖8中可以看出(1)對照組小鼠的:^顳葉皮層(圖8A)和海馬(圖8B)中未見陽性淀粉樣斑塊；(2)模型組小鼠的雄顳葉皮層(圖8C)和海馬(圖8D)出現大小不一，淡紅色著色團塊狀淀粉#^白斑塊物質，多為圓形或類圓形，ltfe分布，分布密度不均，周圍可見多少不等的神經元細胞；(3)多肽注射組小鼠的她顳葉J^(圖8E)和海馬(圖8F)也出現一些團塊狀淀粉^W白斑塊物質，但是多肽注射組中的淀粉樣斑塊數》b^型組明顯減少。結論免疫組化染色結果顯示^M^型組小鼠雄CA1區，AP1-42陽性的細胞明顯高于正常對照組。而H102多肽注射組陽性的細胞較模型組明顯減少。由此推測在體內可以抑制AP的聚集，降低Ap的務性。jtW卜，剛果紅染色發現，轉基因組小鼠腦內明顯出現淀粉樣斑塊，正常對照組小鼠腦中未見斑塊，H102多肽注射組小鼠腦內的淀粉樣斑塊的數目和面積較轉基因組有明顯的減少。這^iit了H102可以抑制AP的聚集，減少其生成的結論。在本申請中，引用了多種出版物。所M的出版物通過引用的方式全文納A^^說明書中，以使，詳盡的敘ii^發明所^t術領域的情況。對于本領域技術人員顯而易見的是，只要不背離本發明的范圍和橋沖，可對本發明進行各種修改和變動。通過考慮本發明在此所公開的說明書和實例，本發明的M實施方案對;W域技^^員來^A顯而易見的。本說明書和實施例應僅看作示例性用途，本發明真正的范圍和精神在所附的權利要求書中說明。序列表<110>天津醫科大學王威<120>用于預防和/或治療阿爾茨海默病的P片層阻斷肽<130>CP1080054/CB<160>4<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>1HisLysGinLeuValPhePheGluGluAsp1510<210>2<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>2HisLysGinLeuProPhePheGluGluAsp1510<210>3<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>3HisGinLysLeuValPhePheAlaGluAsp1510<210>4<211>42<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>4AspAlaGluPheArgHisAspSerGlyTyrGluValHisHisGinLys151015LeuValPhePheAlaGluAspValGlySerAsnLysGlyAlalielie202530GlyLeuMetValGlyGlyValVallieAla3540權利要求1.一種包括如下氨基酸序列的多肽His-X1-X2-Leu-X3-Phe-Phe-X4-Glu-Asp其中X1可以為賴氨酸殘基(Lys，K)或者谷氨酰胺殘基(Gln，Q)；X2可以為賴氨酸殘基(Lys，K)或者谷氨酰胺殘基(Gln，Q)；X3可以為纈氨酸殘基(Val，V)或者脯氨酸殘基(Pro，P)；X4可以為丙氨酸殘基(Ala，A)或者谷氨酸殘基(Glu，G)。2.根據權利要求l的多肽，所述多肽具有如下M酸序列-.His-Xl-X2-Leu-X3-Phe-Phe-X4-Glu-Asp其中Xl可以為賴氨^^(Lys，K)或者;^tM^g(Gln，Q);X2可以為賴氨Wi^(Lys，K)或者谷氨,^J^(Gln，Q);X3可以為纈氨^基(Val，V)或者脯氨酸殘基(Pro，P);X4可以為丙氨^J^(Ala，A)或者谷氨酸戎基(Glu,G)。3.根據權利要求2的多肽，所述多肽具有選自下述的M酸序列His-Lys-Gln-Leu-Val-Phe-Phe-Glu"Glu-Asp(SEQIDNO:1);His-Lys-Gln-Leu-Pro-Phe-Phe-GlU"Glu-Asp(SEQIDNO:2);His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp(SEQIDNO:3)。4.根據權利要求1-34P項的多IL^制備用于預防和/或治療阿爾茨海默病的藥物中的用途。5.—種藥物組^吻，所述藥物組合物中包括一種或多種,權利要求1-3任一項的多#可藥用的載體。6.—種預防和/或治療受試者的阿爾茨海默病的方法，所述方法包:^給予所述受^T有效量的才N^權利要求1-34—項的多肽。全文摘要本發明涉及一類可用于預防和/或治療阿爾茨海默病的β片層阻斷肽，以及所述多肽用于預防和/或治療阿爾茨海默病的用途。文檔編號A61P25/28GK101531703SQ200810006598公開日2009年9月16日申請日期2008年3月13日優先權日2008年3月13日發明者周根發,徐淑梅,威王申請人:天津醫科大學;王威