抗-cd20單克隆抗體的制作方法

專利名稱：抗-cd20單克隆抗體的制作方法
技術領域：
本發明涉及抗-⑶20單克隆抗體。
背景技術：
⑶20是一種不含有糖鏈的蛋白，其在人-B淋巴細胞的細胞表面上得到表達。除了 外周血、脾臟、扁桃體和骨髓中的正常B-細胞以外，⑶20在許多惡性腫瘤B-細胞上得到表 達。單克隆抗體指引CD20與其結合的表位非常不同并且已經報道了多種生物應答。此外， 存在許多關于識別CD20的單克隆抗體的報道。其中，利妥西單抗(rituximab)是一種嵌合 的小鼠/人單克隆抗體(C2B8)，其源自通過SB細胞株的免疫獲得的小鼠抗體2B8，SB細胞 株是一種人B-細胞(參見專利文獻1和2)。利妥西單抗實際上已經以名稱Rituxan 用 作治療低惡性的非霍奇金淋巴瘤(NHL)的治療劑。從此以后，進一步報道了 Rituxan能有 效對抗許多與B-細胞相關的免疫疾病，例如，惡性腫瘤，如慢性淋巴細胞性白血病(CCL)， 涉及致病性自體抗體的自體免疫疾病，如自體免疫溶血性貧血和原發性血小板減少性紫癜 (ITP)，以及炎性疾病，如類風濕性關節炎(RA)和多發性硬化(參見非專利文獻1至4)。已經報道了利妥西單抗結合人補體，導致淋巴細胞世系的B-細胞受到補體依賴 性細胞毒性(CDC)的裂解(參見非專利文獻5)，并且利妥西單抗在用于抗體依賴性細胞介 導的細胞毒性(ADCC)的測試中呈現出活性，在氚化胸腺嘧啶結合測試中呈現出生長抑制 活性和細胞凋亡誘導(參見非專利文獻6)。具有來自不同動物物種的分子的嵌合分子是抗原性的，并因此通常作為治療劑是 不理想的，盡管認為是抗-CD20抗體，包括利妥西單抗，不是抗原性的，因為它們靶向并消 除所有類型的B-細胞，包括正常細胞。然而，已經報道了在治療過程中存在利妥西單抗誘 導中和抗體的情況，盡管只有幾個百分比，并且根據其劑量和持續時間，誘導中和抗體的可 能性可以進一步提高。此外，在將待治療的目標從B-細胞淋巴瘤延伸至RA、IT和MS的過 程中，對抗原性相關的問題存在著提高的關注。出于這些原因，近來對人抗體或含有與人序 列更相似的序列的人源化抗體存在著需求。嵌合抗體產生了它們在血液中具有相對短的半衰期的問題。嵌合小鼠/人抗體 (包括利妥西單抗)的0半衰期(0 1/2)不超過3至4天。已經報道了利妥西單抗在臨 床試驗中對抗低惡性NHL的功效低于50% (參見非專利文件7)。此外，存在著在NHL治療 中待給藥的利妥西單抗的含量增加的問題，因為利妥西單抗對于CD20抗原的解離常數(Kd 值)為5. 2nM并且結合親和性不是非常高(參見非專利文件8)。[專利文獻1]國際公開No. W094/11026小冊子[專利文獻2]美國專利No.5，736，137說明書和權利要求書[非專利文獻 1] :Coiffier B 等，Blood 1998 ；92 1297-32[非專利文獻 2] Edward JC 等，Rheumatology (Oxford) 2001 ；40 :205_11[非專利文獻 3] :Zaja F 等，Heamatologica 2002 ；87 189-95[非專利文獻 4] :Perrotta S 等，Br J Haematol 2002 ；116 465-7
[非專利文獻 5] :Reff 等，Blood 1994 ；83 :435_445[非專利文獻 6] :Maloney 等，Blood 1996 ；88 :637a[非專利文獻7] :IDEC Pharmaceuticals Corporation News Release ;1998年 12 月8號[非專利文獻 8] :Mitchell ER 等，Blood 1994 ；82 :435_445發明公開本發明待解決的問題鑒于上述問題，本發明的主要目的是提供呈現出更適于藥物用途的生物活性的 抗-CD20單克隆抗體。解決問題的手段為了實現以上目的，本發明人已經進行了認真的研究來制備對天然狀態的人CD20 分子呈現出高結合親和性的單克隆抗體，由此獲得具有卓越特征的抗-CD20單克隆抗體。因 此，本發明人已經發現了可以通過使用SB或Raji細胞作為免疫原來獲得呈現出卓越生物活 性的高親和性單克隆抗體，其中認為SB或Raji細胞是含有高密度CD20抗原的B-細胞株，結 合使用遺傳重組修飾以在細胞膜上表達大量CD20的非人動物細胞，由此實現本發明。換句話說，本發明提供了下列各項(1)人源化抗-⑶20單克隆抗體，其含有SEQ ID No 27至30任一中所示L_鏈和 SEQ ID No 31至34任一中所示H-鏈的組合；(2)根據以上所述(1)的人源化抗-⑶20單克隆抗體，其含有SEQID No 30中所 示L-鏈和SEQ ID No 34中所示H-鏈的組合；(3)根據以上所述(1)的人源化抗-⑶20單克隆抗體，其含有SEQID No 30中所 示L-鏈和SEQ ID No 31中所示H-鏈的組合；(4)根據以上所述(1)的人源化抗-⑶20單克隆抗體，其含有SEQID No 29中所 示L-鏈和SEQ ID No 33中所示H-鏈的組合；(5)根據以上所述(1)的人源化抗-CD20單克隆抗體，其是通過選自使用日本產 業技術綜合研究所的國際專利生物保藏，依據保藏號FERM ABP-10907、FERM ABP-10906和 FERM ABP-10905進行保藏的細胞產生的；(6)生產人源化抗-⑶20單克隆抗體的方法，其包括培養選自使用日本產業技術 綜合研究所的國際專利生物保藏，依據保藏號FERMABP-10907、FERM ABP-10906和FERM ABP-10905進行保藏的細胞；(7)用于治療B-細胞介導的疾病的治療劑，其含有根據上述⑴至(6)任一項的 人源化抗-CD20單克隆抗體作為活性成分。發明效果本發明提供了單克隆抗體，特別地，人源化單克隆抗體，及其生產方法，其對CD20 抗原的胞外表位呈現出高結合親和性并具有生物活性，如細胞生長的抑制活性，并且其適 于作為藥物使用。本發明還提供了用于治療涉及B-細胞的疾病的治療劑，其含有該單克隆 抗體。附圖簡述

圖1是顯示用于表達重組抗體的載體pN0W-Ab結構的限制圖譜(restrictionmap) 0圖2是顯示用于表達蛋白的載體pNOW結構的限制圖譜。圖3a是顯示細胞凋亡測試結果的圖。圖3b是顯示細胞凋亡測試結果的圖。圖3c是顯示細胞凋亡測試結果的圖。圖3d是顯示細胞凋亡測試結果的圖。圖4a是顯示抗體濃度和ADCC之間的關系的圖(使用RAJI細胞)。圖4b是顯示抗體濃度和ADCC之間的關系的圖(使用WIL2細胞)。圖4c是顯示抗體濃度和ADCC之間的關系的圖(使用SU-DHL4細胞)。圖4d是顯示抗體濃度和ADCC之間的關系的圖(使用RC-K8細胞)。圖5a是顯示E T比例和ADCC之間的關系的圖(使用RAJI細胞)。圖5b是顯示E T比例和ADCC之間的關系的圖(使用WIL2細胞)。圖5c是顯示E T比例和ADCC之間的關系的圖(使用SU-DHL4細胞)。圖5d是顯示E T比例和ADCC之間的關系的圖(使用RC-K8細胞)。圖6a是顯示⑶C測試結果的圖(使用RAJI細胞)。圖6b是顯示⑶C測試結果的圖(使用WIL2細胞)。圖6c是顯示⑶C測試結果的圖(使用SU-DHL4細胞)。圖6d是顯示⑶C測試結果的圖(使用RC-K8細胞)。圖7a是顯示使用小鼠抗體的細胞凋亡實驗的結果的圖。圖右側的數字表示抗體 的濃度(Pg/ml)，并且+和-各自表示存在和不存在與山羊抗體的交聯(這些表示適用于 圖7a至圖7d)。所用的細胞是RAJI細胞。圖7b是顯示使用小鼠抗體的細胞凋亡實驗的結果的圖。所用的細胞是WIL2細胞。圖7c是顯示使用小鼠抗體的細胞凋亡實驗的結果的圖。所用的細胞是SU-DHL4 細胞。圖7b是顯示使用小鼠抗體的細胞凋亡實驗的結果的圖。所用的細胞是RC-K8細 胞。圖8a是顯示使用人源化抗體的細胞凋亡實驗的結果的圖。圖右側的數字表示抗 體的濃度(Pg/ml)，并且+和-各自表示存在和不存在與山羊抗體的交聯(這些表示適用 于圖8a至圖8d)。所用的細胞是RAJI細胞。圖8b是顯示使用人源化抗體的細胞凋亡實驗的結果的圖。所用的細胞是WIL2細 胞。圖8c是顯示使用人源化抗體的細胞凋亡實驗的結果的圖。所用的細胞是SU-DHL4 細胞。圖8d是顯示使用人源化抗體的細胞凋亡實驗的結果的圖。所用的細胞是RC-K8 細胞。圖9a是顯示使用人源化抗體的早期細胞凋亡比例的圖。將未加入抗體情況中的 值設定為1。圖右側的數字表示抗體的濃度(Pg/ml)，并且+和-各自表示存在和不存在 與山羊抗體的交聯(這些表示適用于圖9a至圖9d)。所用的細胞是RAJI細胞。圖9b是顯示使用人源化抗體的早期細胞凋亡比例的圖。所用的細胞是WIL2細胞。
圖9c是顯示使用人源化抗體的早期細胞凋亡比例的圖。所用的細胞是SU-DHL4 細胞。圖9d是顯示使用人源化抗體的早期細胞凋亡比例的圖。所用的細胞是RC-K8細 胞。
圖IOa是顯示人源化抗體和嵌合抗體的⑶C活性的圖。所用的細胞是Raji細胞。圖IOb是顯示人源化抗體和嵌合抗體的⑶C活性的圖。所用的細胞是SU-DHL4細 胞。圖IOc是顯示人源化抗體和嵌合抗體的⑶C活性的圖。所用的細胞是WiL2細胞。圖IOd是顯示人源化抗體和嵌合抗體的⑶C活性的圖。所用的細胞是RC-K8細胞。圖Ila是顯示人源化抗體濃度和ADCC之間的關系的圖。所用的細胞是RAJI細胞。圖lib是顯示人源化抗體濃度和ADCC之間的關系的圖。所用的細胞是SU-DHL4 細胞。圖Ilc是顯示人源化抗體濃度和ADCC之間的關系的圖。所用的細胞是WiL2細胞。圖Ild是顯示人源化抗體濃度和ADCC之間的關系的圖。所用的細胞是RC-K8細 胞。圖12a是顯示使用人源化抗體的細胞凋亡實驗的結果的圖。(XL)表示存在與二抗 (山羊抗人抗體)的交聯。所用的細胞是RC-K8細胞。圖12b是顯示使用人源化抗體的細胞凋亡實驗的結果的圖。(XL)表示存在與二抗 (山羊抗人抗體)的交聯。所用的細胞是SU-DHL4細胞。圖12c是顯示使用人源化抗體的細胞凋亡實驗的結果的圖。(XL)表示與存在二抗 (山羊抗人抗體)的交聯。所用的細胞是RAJI細胞。圖12d是顯示使用人源化抗體的細胞凋亡實驗的結果的圖。(XL)表示與存在二抗 (山羊抗人抗體)的交聯。所用的細胞是WIL2NS細胞。圖13a是顯示使用人源化抗體的細胞凋亡實驗的結果的圖。(XL)表示與存在二抗 (山羊抗人抗體)的交聯。所用的細胞是RC-K8細胞。將未加入抗體誘導的細胞凋亡活性 設定為1。圖13b是顯示使用人源化抗體的細胞凋亡實驗的結果的圖。(XL)表示與存在二抗 (山羊抗人抗體)的交聯。所用的細胞是SU-DHL4細胞。將未加入抗體誘導的細胞凋亡活 性設定為1。圖13c是顯示使用人源化抗體的細胞凋亡實驗的結果的圖。(XL)表示與存在二 抗(山羊抗人抗體)的交聯。所用的細胞是RAJI細胞。將未加入抗體誘導的細胞凋亡活 性設定為1。圖13d是顯示使用人源化抗體的細胞凋亡實驗的結果的圖。(XL)表示與存在二 抗(山羊抗人抗體)的交聯。所用的細胞是WIL2NS細胞。將未加入抗體誘導的細胞凋亡 活性設定為1。圖14a是顯示人源化抗體的⑶C活性的圖。所用的細胞是RC_K8細胞。圖14b是顯示人源化抗體的⑶C活性的圖。所用的細胞是SU-DHL4細胞。圖15a是顯示人源化抗體的ADCC活性的圖。所用的細胞是RC-K8細胞。圖15b是顯示人源化抗體的ADCC活性的圖。所用的細胞是SU-DHL4細胞。
縮寫說明Pcmv 巨細胞病毒啟動子PAbgh 牛生長激素基因的poly A添加信號Psvd 增強子缺失型猿猴病毒40啟動子DHFR 小鼠二氫葉酸還原酶的cDNAPAsv 來自猿猴病毒40的poly A添加信號PBR322ori 大腸桿菌復制起點Ampr 大腸桿菌選擇標記(氨芐青霉素抗性)Neor 哺乳動物細胞選擇標記(G418抗性)INrbg 兔β球蛋白內含子SPl 抗體輕鏈信號肽VL 抗體輕鏈可變區的cDNACk 抗體κ輕鏈恒定區的cDNASPh 抗體輕鏈信號肽Vh 抗體輕鏈可變區的cDNAC γ 1 抗體γ 1重鏈恒定區的cDNA實施本發明的最佳方式在本說明書和權利要求書中，“抗體”不僅包括完整的抗體，而且還包括對其抗原表現出與完整抗體相當的結合親和性的片段，如含有原始完整抗體可變區的片段(例如， Fab、F(ab，)2等)。根據本發明的單克隆抗體是對人CD20抗原表現出高親和性并具有優良生物活性 的單克隆抗體，包括小鼠源單克隆抗體，及其嵌合變體和人源化變體。根據本發明的第一個優選實施方案，提供了具有對抗表達人CD20抗原的細胞的 生長抑制活性和對人CD20抗原高親和性的單克隆抗體，對Raji細胞(漂浮細胞)的解離常 數(Kd值)不超過產生利妥西單抗的小鼠抗體2B8的Kd值的一半，優選具有1.7至3. 39nM 的Kd值。對于測量解離常數(Kd值)的方法沒有特別限制，只要這些方法可以測量關于漂 浮細胞的Kd值即可。然而，在本說明書和權利要求書中，通過下文實施例中所述方法來獲 得解離常數。優選本發明的抗體對抗表達人⑶20抗原的細胞的生長抑制活性高于2B8的。生 長抑制活性優選為在缺乏外周血單核細胞時，對于表達人CD20抗原的細胞的體外培養物 的生長抑制活性，更優選，生長抑制活性是由于細胞凋亡誘導引起的。例如，可以使用在Miyamoto Τ, Min W, Lillehoj HS. Avian Dis. 2002 年 1 月-3 月；46(1) :10-6中所述的方法來進行上述的生長抑制活性的測量。根據本發明第一個實施方案的單克隆抗體的特定實例包括小鼠源單克隆抗體，其 中L鏈可變區的氨基酸序列和H鏈可變區的氨基酸序列分別列于SEQ ID No:l和9、SEQ ID No 2和10、或SEQ ID No 3和11中，并包括該抗體的嵌合變體或人源化變體。例如，根據Ishida T, Imai K, Nippon Rinsho Vo. 160，No. 3，2002-3 :439_444 中 所述的已知方法，通過將來自小鼠源單克隆抗體可變區的氨基酸序列與來自人免疫球蛋白恒定區的氨基酸序列融合來進行嵌合。
例如，可以根據Ishida T, Imai K, Nippon Rinsho V0I6O, No3，2002-3 :439_444 ； Eduardo A. Padlan, Molecular Immunology, Vol.28-4/5, pp. 489-498,1991 ；Eduardo A.Padlan 等，The FASEB Journal, vol. 9, pl33_139 ；禾口 Tai te Wu, Elvin A. Kabat, Molecular Immunology, Vol. 29-9, ppll41_146，1992中所述的已知方法，通過使用小鼠源 單克隆抗體可變區的CDR氨基酸序列和人免疫球蛋白的氨基酸序列來進行人源化。當進行嵌合或人源化時，可以將來自復數種小鼠單克隆抗體的L鏈可變區的氨基 酸序列以任意組合與來自H鏈可變區的氨基酸序列組合。實例包括，例如，結合了具有來自 SEQ ID No :1至3中任一中所示的小鼠源單克隆抗體可變區氨基酸序列的嵌合氨基酸序列 的L鏈和具有來自SEQ ID No :9至11所示的小鼠源單克隆抗體可變區氨基酸序列的嵌合 氨基酸序列的H鏈的嵌合抗⑶20單克隆抗體；和結合了具有來自SEQ ID No :1至3任一中 所示的小鼠源單克隆抗體可變區氨基酸序列的人源化氨基酸序列的L鏈和具有來自SEQ ID No 9至11所示的小鼠源單克隆抗體可變區氨基酸序列的人源化氨基酸序列的H鏈的人源 化抗⑶20單克隆抗體。根據本發明第二個優選實施方案的抗體是對Raji細胞(其是漂浮細胞)的解離 常數(Kd值)不超過2B8 Kd值的1/8的小鼠源嵌合或人源化單克隆抗體。眾所周知，當對人CD20抗原具有高親和性并且特別是含有人IgGl或IgG3序列或 從其修飾的人Fc序列(包括小鼠源單克隆抗體的嵌合或人源化形式)的抗體結合細胞表 面上的⑶20時，它們通過NK細胞上的Fc γ RIII (⑶16)誘導了效應細胞的激活，導致抗體 依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)。眾所周知，對人源化CD20抗原具有高親和性并且特別 是含有人IgG或IgGM序列或人Fc序列的修飾形式(包括小鼠源單克隆抗體的嵌合或人源 化形式)的抗體結合細胞表面上的CD20時，它們誘導了補體的激活，導致補體依賴性細胞 毒性(CDC)。因此，可以預期根據本發明第二個實施方案的抗體具有低或不可檢測的生長抑制 活性并呈現出ADCC或CDC。根據本發明第二個實施方案的抗體的特定實例為其中L鏈可變區的氨基酸序列 和H鏈可變區的氨基酸序列分別列于SEQ ID No 4和12、SEQ ID No 5和13、SEQ ID No 6 和 14、SEQ ID No :7 和 15、或 SEQ ID No :8 和 16 中的抗體。可以通過與根據第一個實施方案的抗體中相似的方法來進行嵌合或人源化。可 以將來自復數種小鼠單克隆抗體的L鏈可變區的氨基酸序列以任意組合與來自H鏈可變 區的氨基酸序列組合。實例包括，例如，結合了來自SEQ ID No :4至8任一中所示的小鼠 源單克隆抗體可變區氨基酸序列的嵌合氨基酸序列的L鏈和具有來自SEQ ID No:12至 16所示的小鼠源單克隆抗體可變區氨基酸序列的嵌合氨基酸序列的H鏈的嵌合抗CD20 單克隆抗體；和結合了具有來自SEQ ID No :4至8任一中所示的小鼠源單克隆抗體可變 區氨基酸序列的CDR氨基酸序列的L鏈和具有來自SEQ ID No 12至16任一中所示的小 鼠源單克隆抗體CDR氨基酸序列的人源化氨基酸序列的H鏈的人源化抗CD20單克隆抗 體。根據本發明優選的第三個實施方案的抗體屬于一組人源化單克隆抗體，其不受 2B8的特定解離常數(Kd值)的限制，包括能有效對抗利妥西單抗對其無效的細胞的人源化單克隆抗體。 這樣抗體的實例包括如下組合L-鏈和H-鏈的人源化抗⑶20單克隆抗體SEQ ID No 18中所示的L鏈和SEQ ID No 24中所示的H鏈；SEQ ID No 18中所示的L鏈和SEQ ID No 22中所示的H鏈；SEQ ID No 19中所示的L鏈和SEQ ID No 22中所示的H鏈；禾口 SEQ ID No 19中所示的L鏈和SEQ ID No 23中所示的H鏈。例如，通過使用以下所述方法的篩選獲得雜交瘤克隆，通過從該雜交瘤克隆中選 擇能產生具有所需特性的單克隆抗體的克隆，可以制備根據本發明的小鼠源單克隆抗體或 可以用于制備根據本發明的抗體的小鼠源單克隆抗體。例如，作為致敏原(免疫原)，使用了是CD20表達細胞的SB細胞或Raji細胞，和 已經通過重組技術使用例如可購得的CD20 DNA (或其具有相同作用的片段)轉化的CHO細 胞(CH0/CD20)，使得在細胞表面上表達CD20。給藥了首次免疫、加強免疫和最后免疫，使得 使用遞呈致敏原并來源于與待免疫動物屬于不同目的動物的細胞株進行至少一次首次免 疫和加強免疫，或使用通過遺傳重組在細胞膜表面上遞呈致敏原并來源于與待免疫動物屬 于相同目的動物的細胞株進行至少一次首次免疫和加強免疫，并且使用其他細胞株進行最 后免疫。其它條件可以與用于制備產生常規單克隆抗體的雜交瘤的方法中的條件相似。根 據已知的方法通過(1)免疫待免疫的動物；(2)從已免疫的動物制備淋巴細胞；(3)制備親 本細胞；(4)淋巴細胞和親本細胞的細胞融合；和(5)篩選并克隆來制備生產單克隆抗體的 雜交瘤(參見，例如，Monokuronaru kotai, Seikagaku Jikkenho [Monoclonal Antibody, Biochemical Experiment Method], Ailsa Μ. Campbell 'ΦΜ, ToshiakiOSAffA Hif Tokyo Kagaku Dojin (1989))。使用克隆的雜交瘤制備單克隆抗體的方法可以與用于制備單克隆抗體的常規方 法相似，除了使用用根據本發明產生雜交瘤的方法制備的雜交瘤外。例如，可以使用通過細 胞培養或作為小鼠腹水產生抗體的方法來實現大規模生產。通過制備編碼嵌合或人源化抗 體的基因，將該基因插入表達載體并在合適的細胞中表達該表達載體來進行嵌合或人源化 抗體的生產。例如，可以使用用于人免疫球蛋白L鏈恒定區和H鏈(κ )恒定區的基因并插入用 于CHO細胞的高表達載體中來嵌合L鏈可變區和H鏈可變區的基因。盡管可以使用可購得 的用于生產重組抗體的載體系統，但也可以使用在pNOW-ab中構建的載體，其是二聚體高 表達載體，含有用于L鏈和H鏈的多克隆位點(MCS)，其是基于pNOW，是用于哺乳動物細胞 的高表達載體(日本專利3，582，965號公報)。顯示這些載體結構的限制圖譜示于圖1和 圖2中。用含有嵌合抗體基因的表達載體來轉染CHO細胞，然后選擇高生產性的克隆。使 用常規方法從這些克隆中生產抗體。根據本發明第一個實施方案的抗體表現出與利妥西單抗相比相對高的結合親和 性和優選由于細胞凋亡誘導引起的高生長抑制活性，并因此這些抗體的嵌合或人源化抗體 可以用作用于B-細胞的惡性腫瘤和涉及B細胞的疾病的治療劑的活性成分。此外，認為根 據本發明的第二個和第三個實施方案的抗體呈現出對抗表達人CD20抗原的細胞的補體依 賴性細胞毒性(CDC)或抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)，并因此可以用作用于B-細 胞的惡性腫瘤和涉及B-細胞的免疫疾病的治療劑的活性成分。因此，本發明還提供了用于涉及B細胞的疾病的治療劑，該治療劑含有作為活性成分的本發明嵌合或人源化抗體。 此外，在根據本發明的抗體中，是不需要在細胞凋亡的誘導中需要與二抗交聯的 抗體的抗體，并且這些抗體適于藥物使用，因為抗體自身能夠誘導細胞凋亡，而不需要任何二抗。此外，在本發明中，可以結合兩種或更多種類型的根據本發明的抗體。涉及B-細胞的疾病包括，但不限于，例如，非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血 病、急性淋巴細胞白血病、類風濕性關節炎、自體免疫溶血性貧血、原發性血小板減少性紫 癜、全身性紅斑狼瘡、抗磷脂抗體綜合征、干皮性骨化癥、克羅恩病、真皮炎和多發性硬化寸。可以通過已知的用于藥物制備的技術來生產治療劑。對其他配制成分沒有特別限 制。劑量等可以參考關于已知的Rituxan來確定。在進一步的實施方案中，本發明提供了結合了 SEQ ID NO :27至30任一中所示的 L-鏈和SEQ ID NO 31至34任一中所示的H-鏈的人源化抗-⑶20單克隆抗體(在此稱為 抗體1782，系列1782的抗體等)。在這些抗體中，作為優選抗體舉例說明的是其中結合了 SEQ ID NO :30中所示的L-鏈和SEQ ID NO :34中所示的H-鏈的人源化抗-CD20單克隆抗 體(克隆ff)；結合了 SEQ ID NO 30中所示的L-鏈和SEQ ID NO 31中所示的H-鏈的人 源化抗-⑶20單克隆抗體(克隆fv)；和SEQ ID NO 29中所示的L-鏈和SEQ ID NO :33中 所示的H-鏈的人源化抗-CD20單克隆抗體(克隆ss)。這些人源化抗體，其也源自小鼠，可 以如上所述人源化。系列1782的人源化抗體對于自身誘導的細胞凋亡具有弱的活性，但是在交聯條 件下，呈現出等于或高于Rituxan (C2B8)的細胞凋亡誘導活性。人源化抗體1782呈現出不 僅對抗RAJI、WIL2NS和SU-DHL4細胞而且還對抗RC-K8細胞(其是Rituxan-抗性株)的 ⑶C活性。特別地，如實施例中詳述的，系列1782的克隆ff和fv具有高⑶C活性并呈現出 明顯高于Rituxan的抗SU-DHL4細胞的⑶C活性。將Kd值和CDC活性的結果放在一起，系 列1782的克隆ff是優選的，因為其具有最高的親和性，相對高的CDC活性以及對抗RC-K8 株(Rituxan抗性株)的⑶C活性。系列1782的克隆fv也是優選的，因為其具有最高的⑶C 活性，此外，對RC-K8株(Rituxan抗性株)也是有效的。特別地，因為系列1782的克隆 具有非常高的親和性，可以將其RI標記，以將其用于涉及B-細胞疾病的靶向治療。此外， 系列1782的克隆fv是優選的，因為其具有對抗SU-DHL4細胞的高CDC活性，克隆ss是優 選的，因為其具有對抗RC-K8的高ADCC活性。根據本發明的人源化抗-⑶20單克隆抗體的1782系列還可以用作用于治療B-細 胞的惡性腫瘤和涉及B-細胞的免疫疾病的治療劑的活性成分。因此，在進一步的實施方案 中，本發明提供了用于治療B-細胞的惡性腫瘤和涉及B-細胞的免疫疾病的治療劑，其中治 療劑含有系列1782的抗體作為活性成分。治療劑給藥的方法和含量可以由本領域技術人 員容易地確定。上述疾病舉例說明了作為涉及B-細胞的疾病。下文中將參照實施例更詳細地描述本發明。然而，本發明并不限于這些實施例。實施例1(1)制備用于敏化小小鼠的免疫劑體外培養SB細胞和Raji細胞，其是表達⑶20的B-細胞株。
分別使用特特異的弓丨物 hCD20-S-GK-Not :aatgcggccgccaccatgacaacacccaga aattc(SEQ ID No 25)禾口 hCD20_E_Xba :gctctagattaaggagagctgtcattttc(SEQ ID No: 26)克隆編碼完整 CD20 分子的 DNA(Multiple Choice cDNA human spleen, Origene Technologies, Inc. ,6 Taft Court, SuitelOO, Rockville,MD20850) 將該 DNA 插入用于哺 乳動物細胞的高表達載體PNOW中(圖1)，并將構建的載體用于轉化CHO細胞。使用FACS 分析鑒定在細胞表面上表現出高水平⑶20表達的重組CHO細胞(⑶20/CH0細胞)。使用 FITC-標記的抗-CD20單克隆抗體進行染色，并且當細胞獲得SB細胞5倍或更高倍數的熒 光強度時，將該細胞選擇作為高表達細胞。(2)制備免疫原 用補充10% FCS的RPMI 1640培養基培養SB或Raji細胞。用補充800 μ g/ml G418的CHO-S-SFM II培養基(Gibco,目錄號12052-098)培養CD20/CH0細胞。將這些培 養過的培養基在1，IOOrpm下離心5分鐘，將細胞懸浮于Dulbecco’ s PBS (-)中并再次離 心。將該洗滌步驟再重復一次，并將生理鹽水溶液加入細胞中，以制得用于免疫的懸浮液 (細胞數1-3χ107 個/ml)。(3)免疫將這些免疫原制劑通過腹膜內給藥7至11周齡的雌性Balb/c小小鼠。以不同的 天數間隔重復給藥2-3次SB或⑶20/CH0細胞后，使用不同類型的細胞(⑶20/CH0或Raji 細胞)進行最后免疫。對于每一次這些免疫，所給藥的細胞數目為1-3χ107個細胞/小小 鼠°所使用的免疫原組合顯示于表1中。(4)細胞融合在最終免疫后3天，從2只小小鼠制備脾細胞，并根據0i，V. Τ.和 L. A. Herzenberg, 1980,見Selected Methods in Cellular Immunology, B. Mishell 禾口 S. Μ. Shiigi 編輯(Freeman and Co. San Francisco, CA)，p. 351 中所述的方法在 PEG-1500 存在下與小鼠骨髓瘤細胞(NS-I)融合。(5)初篩和二篩用其上附有⑶20/CH0或CHO細胞(親本株)的96孔平板進行細胞ELISA，以選擇 其中產生了抗體與CD20特異性反應的孔。用其上附有相同的CD20/CH0細胞的96孔平板 接受使用利妥西單抗(C2B8)的競爭反應，以選擇與C2B8的相似表位反應的抗體(孔)。這些篩選的結果顯示于表1中。(6)細胞 ELISA將附于聚-L-賴氨酸覆蓋的96孔平板(AsahiTechoglass Corporation,目錄號 1-023-018)上的⑶20/CH0或CHO細胞(親本株)用于細胞ELISA。將150 μ 1封閉緩沖液 (含有0. 2%明膠、0. 5% BSA的PBS溶液)導入各孔中，并使板在37°C下靜置1小時。使 用150nM NaCl,0. 05%吐溫20的水溶液將平板洗滌5次，然后將100 μ 1樣品(培養物上清 液的稀釋液)導入各孔中。在37°C下進行1小時的初次反應。洗滌后將100μ1標記抗體 (HRP標記的抗小鼠IgG (H+L)兔抗體(Jackson Lab.，編號315-035-003)或HRP標記的抗小 鼠IgG(Fcy)兔抗體(Jackson Lab，編號315-035-008))的稀溶液導入各孔中，并在37°C 下進行1小時的二次反應。在制備用于初次反應和二次反應的反應溶液中使用同樣的封閉溶液。洗滌后將100 μ 1顯色液(OPD)導入各孔中，并在30分鐘后加入50 μ 1 4Ν H2SO4以 終止反應。測量492nm處的吸光率。(7)細胞ELISA中的競爭反應制備樣品(培養物上清液的稀釋液)和嵌合抗體(10-40ng/ml)的混合溶液。在如上所述在細胞ELISA中進行封閉反應后，將100 μ 1每種混合溶液導入各 孔中，并在37°C進行1小時的初次反應。洗滌后，將100 μ 1標記抗體(HRP標記的抗人 IgG (H+L)兔抗體(Jackson Lab.，編號309-035-082))的稀釋液導入各孔中，并在37°C下進 行1小時的二次反應。洗滌后，將ΙΟΟμΙ顯色液(OPD)導入各孔中，并在30分鐘后，加入 50 μ 1 4Ν H2SO4以終止反應。測量492nm處的吸光率。由于標記的抗體只與嵌合抗體反應，因此初次反應中加入樣品中的抗體與嵌合抗 體之間的任何競爭導致了測量值的降低。(8)克隆使用了有限稀釋法。將培養細胞接種于96孔板后，對含有單個克隆的孔的培養物 上清液進行細胞ELISA，由此選擇產生特異性抗體的克隆。(9)制備純化的抗體在補充10% FCS的RPMI 1640培養基中培養產生特異性抗體的克隆。當細胞密度達到大約5xl05個細胞/ml時，用無血清培養基ASF-104N(Ajinomoto)替換該培養基。2至 4天后，將培養過的培養基離心，以收集培養物上清液。將蛋白G柱用于純化抗體。用150mM NaCl透析單克隆抗體洗脫液。通過0. 2 μ m濾器將透析的溶液過濾除菌，以獲得待測試的抗 體樣品(抗-人CD20小鼠單克隆抗體)。表1 選定孔的數目-A 其中產生抗體與CD20/CH0細胞反應但不與CHO細胞反應的孔選定孔的數目-B 在A中選定的孔中，其中產生抗體經歷與參照抗體(C2B8)的競 爭反應的孔由8個代表性克隆產生的單克隆抗體的L-鏈V-區的氨基酸序列(SEQ ID No 1-8)和H-鏈V-區的氨基酸序列(SEQ ID No 9-16)如下所示。1K0924 的 H-鏈 V-區的序列(SEQ ID No 11) QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTF TSYNIHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTSDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARMSTMITGF DYffGQGTTLTVSS1K1228 的 H-鏈 V-區的序列(SEQ ID No 16) QVQLQQPGAELVKPGASVKVSCKASGFTF TSYNLHWVKQTPGQGLVWIGAIYPGNGDTSYNQKFRGKATLTADISSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYYGYDAM DYffGQGTSVTVSS1K1422 的 H-鏈 V-區的序列(SEQ ID No 9) QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCRASGYTFT NYNMHWIKQTPGQGLEWIGAIYPGSGDTSYNRKFKGKATLTADTSSSTAYMQFSSLTSADSAVYYCARFTYYYGGTY GAMDYffGQGTSVTVSL1K1791 的 H-鏈 V-區的序列(SEQ ID No 10) QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTF TNFGVNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPSYADDFKGRFAFSLEASANTAYLQINNLKNDDMSTYFCTRRTNYYGTS YYYAMDYffGQGTSVTVSS1K1712 的 H-鏈 V-區的序列(SEQ ID No 12) QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGFTF TSYNLHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGSGDTSYNQQFKGKATLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYCCARSAMISTGN WYFDYffGQGTTLTVSS1K1402 的 H-鏈 V-區的序列(SEQ ID No 13) QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGFTFTSY匪HWVKQTPGQGLEWIGGIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARFYYYGSMG AMDYffGQGTSVTVSS1K1736 的 H-鏈 V-區的序列(SEQ ID No 14) QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTF TTYNLHWVKQTPGQGLEWIGGIYPGNGDTSYNQKFKVKATLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARffIYYGNYE GTLDYffGQGTSVTVSS1K1782 的 H-鏈 V-區的序列(SEQ ID No 15) QVQLQQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTF TSYWMHWVKQRPGQGLEWIGYITPSTGYTDYNKKFKDKATLTADRSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYYCARSGPYFDVW GAGTTVTVSS1K0924 的 H-鏈 V-區的序列(SEQ ID No 3) :QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVS YMHWYQQRPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYYFTISRVEAEDAATYYCQQWNSNPPTHGGGTKLEIK1K1228 的 H-鏈 V-區的序列(SEQ ID No 8) :EIILTQSPTTMAASPGEKITITCSASSSISSYY LRWYQQKPGFSPKVLIYRTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTIGTMEAEDVATYYCQQGNTVPLTFGSGTKLEIK1K1422 的 L-鏈 V-區的序列(SEQ ID No 1) QIVLTQSPPIMSASLGEEITLTCSASSRVS YMLWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWTSNPCTFGGGTKLEIK1K1791 的 L-鏈 V-區的序列(SEQ ID No 2) :STVMTQTPKFLLVSA⑶RVTITCKASQSVS NDVAWYQQKPGQSPKVLIYFASNRYTGVPDRFTGSGYGTDFTFTINTVQAEDLAVYFCQQDYSSPLTFGAGTKLELK1K1712 的 L-鏈 V-區的序列(SEQ ID No 4) :QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVS YMDWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDTATYYCQQWTFNPPTFGSGTKLEIK1K1402 的 L-鏈 V-區的序列(SEQ ID No 5) :QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVS YMHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTITRVEAEDAATYYCQQWTFNPPTFGAGTKLELK1K1736 的 L-鏈 V-區的序列(SEQ ID No 6) :QIVLSQSPAILSSSPGEKVTMTCRASSSVS YMLWYQQKPGSSPEPWIYATSNLASGVPARFSGGGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTFNPPTFGGGTKLEIK1K1782 的 L-鏈 V-區的序列(SEQ ID No 7) DILLTQSPAILFVSPGERVSLSCRASQNIG TSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESFSGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNSWPFTFGSGTKLEIK實施例2對于一些所得到的克隆，測定了它們的單克隆抗體基因可變區的堿基序列。此外， 如下所述，測量了抗體結合親和性并對由它們產生的單克隆進行了生物特性測試。(1)結合親和性的測量使用了源自在細胞表面表達目標抗原的人B細胞的漂浮Raji細胞和源自不表 達⑶20抗原的人T細胞的漂浮Jurkat細胞。將兩種類型的細胞在CO2培養箱(SANYO MC0-175M)中于37°C和5% CO2濃度下，使用補充10%胎牛血清(FCS) (BIOLOGICAL IND,目 錄號04-001-1A，批號815242 ；為了使補體組分失活在56°C預熱30分鐘)的RPM11640培 養基(NACALAI TESQUE Inc.，目錄號30264-85，批號L4K2844)中培養。通過每周2次亞培 養來維持細胞。用Burker-Turk血球計(Erma Inc.，目錄號03-303-1)來進行細胞數目的測量。將亞培養后3至4天的匯合細胞的培養過的培養基在室溫下用多用途冷凍離心 機LX-120(T0MY Co.，Ltd.)在3000rpm下離心3分鐘。除去上清液并收集細胞。選擇在該 步驟中所用的轉速和時間，使得重復離心分離并除去上清液后的細胞數目保持不變。為了 除去培養基和殘留在細胞表面上的FCS (洗滌)，將收集的細胞懸浮于Dulbecco’ s磷酸緩沖鹽水中(-)(無 Ca 和 Mg，PBS (-)，(NaCl =Wako,目錄號 191-01665 ；Na2HPO4 =Wako,目錄號 197-02865，批號 ASF2635 ；KCl =Wako,目錄號 163-0334T，批號 CEQ7122 ；KH2PO4 =Wako,目錄 號169-0425，批號ELG7616))，并在3000rpm下離心3分鐘2次以除去上清液。洗滌后將細 胞懸浮于PBS中的BSA溶液中(Wako目錄號013-07492，批號PKH3483)，并調節至5xl06 個細胞/ml的細胞密度。將作為一抗的待測試抗體或陽性對照抗體(2B8)的分別以15、30、50、75、100、 125、150、200ng(l. 5-5 μ 1)的量注入 1. 5ml 試管中(BMEquipment Co.，Ltd.，BM-環鎖管， 目錄號BM-15)。同時，準備四支未加抗體的試管。對每一種待測試的抗體制備三份樣品。 向每份樣品中加入100 μ 1 (5x10s個細胞)1 % BSA的PBS溶液(Wako,目錄號013-07492，批 號ΡΚΗ3483)，并混合，并在室溫下振蕩反應1小時。
反應后，將反應液在室溫下使用高速冷凍離心機ΜΧ-100 (TOMY)在3，OOOrpm下離 心3分鐘。收集細胞后，將細胞懸浮于200 μ 1 PBS中并在3，OOOrpm下離心三分鐘以除去 上清液。將這些程序重復兩次以除去殘留在細胞表面上的未反應的一抗。加入相對于結合細胞的一抗而言過量(500ng)的FITC-標記的抗小鼠IgG(H&L) 二抗[綴合熒光素的山羊抗小鼠IgG(H&L)，親和性純化的二抗，Chemicon,目錄號AP124F， 批號24021014]，接著加入100 μ 11% BSA-PBS溶液(500ng/100 μ 1)。將該混合物在室溫下 振蕩1小時，同時避光，并檢測結合細胞的一抗。反應后，將混合物在3，OOOrpm下離心3分 鐘以收集細胞。為了除去殘留在細胞表面上的任何未反應的FITC-標記的抗小鼠IgG(H&L) 抗體，將細胞懸浮于200 μ 1 PBS中并在3，OOOrpm下離心3分鐘以除去上清液。將這些程 序重復兩次。將由此收集的細胞懸浮于100 μ 1 PBS中，并轉移至平底96孔平板中(Sumitomo Bakelite Co.，Ltd.，ELISA PLATE,目錄號 8496F)。使用 Typhoon 9210 圖像分析儀 (Amersham Bioscience)在以下檢測條件下測量二抗的熒光強度熒光模式600V，526SP/ 綠色(532nm)；焦距底面上 +3mm。使用 100 μ 1 加入了 0,12. 5、25、50、75、100、125、 150ngFITC-標記二抗的PBS來制備用于構建標準曲線的對照。檢測后，使用圖像分析軟件Image Quant (AmershamBioscience)將圖像數字化，并 使用ExceKMicrosoft)分析。通過測量只在細胞和FITC-標記的二抗之間的反應來測定 平板、PBS溶液和非特異性結合細胞的FITC-標記二抗的背景值，并從每個樣品的熒光強度 值中減去四個點的平均值。通過這種方式，獲得了來自結合細胞的FITC-標記二抗的熒光 量。通過測量各種濃度的用作對照的FITC-標記二抗的熒光量來構建標準曲線，并計算結 合細胞的二抗量(摩爾數或重量)。假定每種一抗和FITC-標記的二抗以1 2的比率反 應，計算結合細胞的一抗量。通過從加入量中減去結合量來確定懸浮液中游離一抗的量。將 抗體濃度轉化成摩爾濃度時，單克隆抗體的分子量為150，000。觀察到隨著加入的一抗量增加，結合反應變得飽和，并且熒光強度達到了恒定值。 使用斯卡查德分析來計算細胞表面上的抗原數目和解離常數(Kd值)(請參閱Scatchard， G. ；Ann. N. Y. Acad.Sci.,51 660-672,1949, New Cultured Cell Experimental Methods inMolecular Biology Research (分子生物學研究中新培養細胞實驗方法)，Yodosha Co., Ltd. , Jikken Igaku separate volume, Bio Manual UP Series 修訂的第二版，p212 至 217)。數值為各樣品三個值的平均。
8個代表性克隆產生的單克隆抗體和陽性對照抗體(2B8)的測量結果顯示于以下 的表3中。(2)生物學特性測試(a)細胞凋亡誘導測試 使用流式細胞術(Armexin V/PI染色)測量測試抗體誘導細胞凋亡的能力。使用 了陽性對照(2B8)和陰性對照(抗CD3單克隆抗體(BDPharMingen))。使用MEBCYT0細胞 凋亡試劑盒(MBL，目錄號4700，批號20)進行測試。將Raji細胞離心，并懸浮于補充10% (滅活)FBS(ICN，目錄號2916754，批號 8005C)的新鮮RPMI 1640培養基中(Sigma,目錄號R8758，批號44K2416)，并將Iml體積的 密度為5xl05個細胞/ml的溶液導入12孔平板的每個孔中。將12孔/抗體用于測試，并 將抗體接入代表性的孔中，以使得終濃度為2yg/ml或4yg/ml(3孔X2種濃度X2個時 間點，共12孔)。在培養開始后的第一天和第二天，收集含有約2xl05個細胞的培養過的培 養基，離心后用PBS洗滌細胞一次。然后，將細胞懸浮于85 μ 1結合緩沖液中。在與10 μ 1 Annexin V-FITC和5 μ 1 PI充分混合后，將混合物在室溫下反應15分鐘，同時避光。使 用流式細胞術進行測量(FACS Calibur, Becton Dickinson)，并使用CellQuest進行分析 (Becton Dickinson)。6個代表性克隆產生的單克隆抗體、陽性對照抗體(2B8)和陰性對照抗體(抗 CD3)的測量結果顯示于以下的圖3a至圖3d中。盡管通常認為28B具有高的誘導細胞凋亡 的能力，但通過1K17系列(用⑶20/CH0和Raji細胞免疫)的細胞融合獲得的克隆lkl791 產生的單克隆抗體和通過1K14系列(用SB細胞和⑶20/CH0細胞免疫)細胞融合獲得的 克隆lkl422產生的單克隆抗體與2B8比較時表現出高的誘導細胞凋亡的能力。(b)細胞生長抑制測試在補充10% FCS的RPMI 1640中制備細胞濃度為5xl04個細胞/ml的Raji細 胞懸浮液，以100 μ 1/孔的體積加入96孔平板中并培養。24小時后，向每孔中加入體積 為50 μ 1/孔的抗體溶液，使抗體濃度為1 μ 1/ml，并繼續培養。在加入抗體后72小時時， 以 10 μ 1/孔加入顯色劑 Cell Counting Kit-8 (Donin Kagaku，目錄號 343-07623，批號 SG076)，再繼續培養4小時，然后在492nm處測量吸光率。來自如上所述的6個克隆的單克隆抗體、陽性對照抗體(2B8)和陰性對照的吸光 率測量結果顯示于以下的表2中，其特性顯示于表3中。細胞生長抑制測試表2 單克隆抗體的特性表3 (c)抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)在該系列的實驗中，測量了通過抗-⑶20嵌合抗體的Fc區是否激活了效應細胞，
并由此裂解淋巴瘤細胞系的細胞。在補充10%滅活FCS的RPMI1640培養基中(培養基)，于37°C和5% CO2濃度下
培養和維持源自人B細胞的四種細胞Raji、WiL2-NS、SU-DHL4和RC-K8。
在這些實驗中，用含有10% FCS的RPMI1640洗滌每種類型的細胞，并在37°C下與 鈣黃綠素反應15分鐘，由此使鈣黃綠素結合活的細胞，然后將細胞數目調節至4xl05個細 胞/ml。因為鈣黃綠素只保留在具有正常細胞膜的細胞中，因此可以將其用于只染色活細 胞。使用含有10% FCS的RPMI1640將作為抗⑶20嵌合抗體的利妥西單抗(C2B8)和6種 類型嵌合抗體(Ik0924、lkl402、lkl422、lkl712、lkl736 和 lkl791)調節至 20 μ g/ml、4 μ g/ ml和0. 8 μ g/ml。通過從健康對象采取血液并立即將血液鋪在Ficoll上，接著離心來收集 淋巴細胞級分，從而獲得效應細胞后，將效應細胞調節至5xl06個細胞/ml、IxlO6個細胞/ ml 和 0. 2xl06 個細胞/ml。在總的100 μ 1中，將25 μ 1調整了濃度的細胞懸浮液、25 μ 1各種抗⑶20嵌合抗 體溶液(各自的終濃度分別為5、1和0.2yg/ml)和50 μ 1用于各種抗體濃度的效應細胞 (各自的E T比率為25 1、5 1和1 1)在96孔平板中充分混合，并于37°C和5% CO2濃度下在培養箱中反應4小時。如下制備了三種樣品其中用含有10% FCS的RPMI1640 取代抗體溶液和效應細胞的第一種樣品，以計算細胞的自發溶解；其中用含有10% FCS的 RPMI1640取代抗體溶液的第二種樣品，將其用于計算只有效應細胞的抗體依賴性活性；和 其中用20%曲通(Triton)X-IOO取代抗體溶液的第三種樣品，將其用于計算最大溶解。在反應后，如果細胞已經被裂解了，那么細胞膜已經破裂并且鈣黃綠素已經從細胞中釋放出來。基于此，使用Quencher來淬滅釋放至反應溶液中的鈣黃綠素的熒光，然后 使用熒光分析儀來測量熒光量。檢測后，使用圖像分析軟件(Amersham Bioscience)將圖像數字化，并使用以下的 等式來計算每種樣品的裂解率。等式1裂解率(％)=((自發裂解)_(樣品))/((自發裂解)_(最大裂解))xl00圖4a至圖4d顯示了效應細胞如NK細胞的數量和目標細胞的數量的比例(E T 比例)為25 1時，對于每種細胞類型的抗體濃度和細胞毒性活性之間的關系。圖5a至 圖5d顯示了抗體濃度為5 μ g/ml時，對于每種細胞類型的E T比例和細胞毒性活性之間 的關系。如圖4a至圖4d所示，在E T比例為25 1的條件下，所有類型的細胞在加入 抗體時表現出細胞毒性活性。換言之，抗體參與細胞毒性。此外，除WiL2-NS以外的細胞株 在0. 2 μ g/ml的抗體濃度下(在0. 2 μ g/ml時出現飽和)表現出相當于1 μ g/ml和5 μ g/ ml的活性，并且活性達到最大值后就保持不變，表明在抗體量小于補體依賴性細胞毒性活 性所需的抗體量時提供了這些作用。如圖5a至圖5d中所示，認識到從抗體濃度為5 μ g/ml時E T比例對細胞毒性 活性的作用看，細胞毒性活性取決于E T比例濃度而增加。從這看，可以推斷出細胞毒性 是由效應細胞的作用而引起的。(d)補體依賴性細胞毒性(⑶C)在該系列實驗中，測量了在含補體血清的存在下，抗CD20嵌合抗體是否能夠裂解 淋巴瘤細胞系的細胞。在補充10%滅活FCS的RPMI1640中(培養基)于37°C和5% CO2濃度下在培養 箱中培養和維持四種源自人B細胞的細胞Raji、WiL2-NS、SU-DHL4和RC-K8。
在這些實驗中，在含有10% FCS的RPMI1640中洗滌每種類型的細胞，將細胞數目 調節至2-3xl06個細胞/ml。使用含有10% FCS的RPMI1640，將作為抗⑶20嵌合抗體的 C2B8(利妥西單抗))和6種類型的嵌合抗體(Ik0924、lkl402、lkl422、lkl712、lkl736和 lkl791)調節至 20、4 和 0. 8 μ g/ml 在總的100 μ 1中，使用漩渦混合器將55 μ 1具有調節濃度的細胞懸浮液、25 μ 1各 種抗CD20嵌合抗體溶液(終濃度分別為5yg/ml、lyg/ml、0.2yg/ml)和20 μ 1采自五個 健康對象的混合血清或其滅活血清充分混合，并于37°C和5% CO2濃度下在培養箱中反應2 小時。制備其中25 μ 1抗體溶液由補充10% FCS的RPMI1640替代的樣品，作為用于背景計
算的樣品。反應后，使用PI (碘化丙啶)將死細胞染色，并通過FACS (Becton Dickinson)進 行分析。作為數值，直接使用死細胞獲得的群，從其中減去背景值和加入滅活血清的樣品的值。圖6a至圖6d顯示了每種細胞類型的抗體濃度和的細胞毒性活性之間的關系。如圖6a至圖6d中所示，所有6種類型的抗體都在Raji、WiL2_NS和SU-DHL4中 顯示出活性。此外，可以證實濃度依賴性，并且在5 μ g/ml濃度下比較時，相對于其它抗體， lkl791顯示出特別高的活性，接著為Ikl736、lkl422和lkl712顯示出高活性。在該濃度 下，在Raji和Wil2-NS細胞中可以認識到lkl791誘導了接近由其他抗體誘導水平的約兩 倍水平的細胞毒性，其它抗體也表現出等于或高于利妥西單抗的活性。另一方面，發現認為利妥西單抗對其沒有效果的RC-K8細胞在各種抗體之間顯示 出明顯的差別。利妥西單抗、lkl402和lkl712顯示出幾乎沒有或沒有對抗RN-K8的活性。 相反，lkl791顯示出非常高的活性，并在5 μ g/ml濃度時顯示出大約為50%的細胞毒性。 lkl791之后，lk0924顯示出大約為25%的細胞毒性，lkl422和lkl736顯示出大約為10% 的細胞毒性。從以上可以看出，證實了用作這些測試對象的6種嵌合抗體表現出等于或強于利妥西單抗的CDC活性。實施例3(1)結合親和性的測量在CO2培養箱中在37°C和5% CO2濃度下用補充10%滅活FCS的RPMI1640培養 基培養源自人B細胞的Raji細胞。通過每周亞培養兩次來維持這些細胞。將亞培養后三至四天的細胞(含有大約IxlO6個細胞/ml)在室溫下1，OOOrpm離 心5分鐘。將細胞懸浮于PBS(-)中并再以1，OOOrpm離心5分鐘，以除去上清液。將這些 程序重復兩次用于洗滌細胞。通過使各自的抗⑶20抗體(作為陽性對照抗體的小鼠抗體2B8、嵌合抗體和人 源化抗體C2B8)與Raji細胞充分混合，并將混合物在室溫下接受反應一小時，來進行與一 抗的反應。在反應中，各自的抗CD20抗體具有1. 33,2. 67,4. 00,5. 33,6. 67,8. 00,9. 33、 10. 67、12. 00、13. 33、14. 67、16. OOnM的12個終濃度，細胞數目為5xl06個細胞，并且反應溶 液使用了 BSA/PBS溶液，將其注入1. 5ml管中至100 μ 1的終體積。每一種待測試的抗 體制備三個樣品，還準備了 4支不加抗體的試管，作為用于背景計算的樣品。反應后，在室溫下將混合物以3，OOOrpm離心3分鐘以除去未反應的一抗，并收集細胞。
將100 μ 1體積的在1 % BSA/PBS溶液中以5 μ g/ml的濃度制得的FITC-標記的二 抗加入試管中，使得FITC標記的二抗相對于結合細胞的一抗是過量的，并且在懸浮后，將 混合物在室溫下反應一小時，同時避光。所用的FITC-標記二抗對于小鼠抗體為山羊抗小鼠IgG(H&L)_FITC，對于嵌合抗 體或人源化抗體為山羊F(ab，)2片段[sic]抗人IgG(FcY)-FITC。反應后，將混合物在室溫下以3，OOOrpm離心3分鐘。除掉未反應的FITC-標記的 二抗，并收集細胞。通過將細胞懸浮于200 μ 1 PBS中并再次離心來洗滌細胞。將細胞懸浮于100 μ 1 PBS中，并轉移至平底96孔平板中。用Typhoon9210圖像 分析儀(Amersham Bioscience)測量二抗的熒光強度。檢測后，用圖像分析軟件Image Quant (AmershamBioscience)將圖像數字化，并使 用Excel (Microsoft)分析。計算相同的測試抗體的平均值，并且從每種測試抗體的值中減 去從用于背景計算的樣品(其中僅有細胞和FITC-標記的二抗反應)獲得的平均值，由此 估算從平板、PBS溶液和與細胞非特異性結合的FITC-標記的二抗得到的背景值。此外，通 過測量僅含有0,12. 5、25、50、75、100、125和150ng/100y 1量的FITC-標記二抗的溶液產 生的熒光量來制備標準曲線。將該標準曲線用于測定結合細胞的二抗的摩爾數。假定每種 一抗和FITC-標記的二抗以1 5比率反應，計算了結合細胞的一抗的量。通過從加入量 中減去結合量來計算游離一抗的量。將這些值用于斯卡查德分析，由此計算解離常數Kd。結果顯示于以下的表4中。(2)細胞凋亡誘導測試用Armexin V-FITC細胞凋亡試劑盒在以下兩種反應條件下檢測最初的細胞凋亡 第一種條件是其中測量了抗CD20抗體單獨誘導對抗源自人B細胞株的細胞的細胞凋亡 (無交聯的條件)，第二種條件是其中測量了通過加入識別抗CD20抗體Fc區的二抗誘導的 細胞凋亡(交聯)。通過在補充10%滅活FCS的RPMI1640(培養基)中，在37°C和5% CO2濃度下培 養源自人B細胞的四種細胞Raj ji、WiL2-NS、SU-DHL4和RC-K8細胞。通過每周亞培養兩 次來維持這些細胞。亞培養后三至四天，將細胞培養物(大約IxlO6個細胞/ml)在室溫下以1，OOOrpm 離心5分鐘，以收集細胞。將各自的抗CD20抗體(作為陽性對照抗體的小鼠抗體2B8，嵌合抗體和人源化抗 體C2B8 ；作為陰性對照的抗CD2單克隆抗體)與懸浮于新鮮培養基中的細胞充分混合，并 且將混合物在37°C和5% CO2濃度的培養箱中反應1. 5小時。在反應中，各自的抗⑶20抗 體具有0. 2、1和5 μ g/ml三種終濃度，細胞密度為IxlO6個細胞/ml，并且反應溶液使用了 培養基，并將其以250 μ 1的體積置于1. 5-ml試管中，并接受反應。對于每種待測試的抗體， 制備三種樣品。反應后在室溫下以1，200rpm將混合物離心3分鐘，以除去未反應的抗體并收集細 胞。在無交聯的條件下，將250μ1的新鮮培養基加入細胞中。在交聯的條件下，將 250 μ 1識別抗-⑶20抗體Fc區的二抗(其含量是⑶20抗體含量的5倍)加入細胞中。混合后，將混合物在37°C和5% CO2濃度的培養箱中再反應三小時。所用的二抗對于小鼠抗體 為山羊抗小鼠IgG Fcy片段，對于嵌合和人源化抗體為特異性的山羊抗人IgG Fcy片段。
反應后，將混合物在室溫下以3，OOOrpm離心3分鐘以除去未反應的二抗并收集細 胞。通過將細胞懸浮在250 μ 1 PBS中并再次離心來洗滌細胞。用于檢測的試劑使用了 MEBCYT0細胞凋亡試劑盒-AnnexinV_FITC，PI-(MBL,目錄 號4700，批號21)。將細胞懸浮于85μ 1結合緩沖液后，加入5μ 1 Annexin V-FITC和5μ1 碘化丙啶(PI)(終濃度為0. 5mg/ml)并充分混合，將混合物在室溫下避光反應15分鐘。使用流式細胞術(EPICS ALTRA :BECKMAN COULTER)測量總數為20，000的細胞并 進行分析(Expo32 :BECKMAN COULTER)。結果顯示于圖7a至圖9d中。(3)制備生產人源化抗體的細胞株(a) DNA 合成基于SEQ ID No 17-24中所示的氨基酸序列，以常規程序設計并合成對CHO細胞 密碼子優化的DNA。(b)制備構建體使用作為表達載體的pNOW構建了 16種用于人源化1K1791的表達構建體。制得 了用于人源化 1K1791 的表達構建體。pN0ff-aa 1791 kgUpN0ff-af 1791 kgUpNOff-as 1791 kgU pN0ff-avl791kgU pN0ff-fal791kgU pNOff-ff 1791kgU pNOff-fs 179 IkgU pN0ff-fvl791kgU pN0ff-sal791kgU pNOff-sf 1791kgU pN0W_ssl791kgl、pN0ff-svl791kgU pN0ff-val791kgU pN0W-vfl791kgl、pN0W-vsl791kgl、pN0W-vvl791kgl。(c)使用化學試劑的轉染和選擇使用轉染試劑將用于人源化1K1791的表達構建體各自引入CHO DG44cdB中。將 其中引入各種基因的IxlO6個CHO DG44cdB細胞懸浮于100ml選擇培養基中，接種于5塊 96孔平板中(200 μ 1/孔)，在37°C和5%二氧化碳氣氛下培養3至4周。轉染試劑Qiagen，Effectene轉染試劑，目錄號301427。選擇培養基:ISCHO-CD w/ 水解產物 /4mM GlutaMAX/0. 8mg/ml G418。(d)高表達細胞株的選擇1)從存在克隆的孔中回收上清液，使用斑點印跡測定法測量所產生的抗體量。2)將表現出高抗體產量的克隆轉移至24孔平板種，在培養大約5天后，回收上清 液，并使用夾心ELISA來測量所產生的抗體量。3)選擇兩個表現出高表達水平的克隆并轉移到T75培養瓶中。(e)小規模培養將所選擇的用于16種構建體的兩個克隆在含有30ml選擇培養基的T75培養瓶中培養。(4)人源化抗體生產株的培養和純化在含有IS CHO-CD的水解產物/補充了 4nM GlutaMax (Invitrogen,目錄號 35050-061)和 200yg/ml G418 (Sigma,目錄號 A1720-5G)的水解產物培養基(Irvine Scientific,目錄號91119)中，在37°C和5% CO2濃度的CO2培養箱中培養生產抗體的細胞 株(遺傳重組的CH0-DG44細胞)。通過每周亞培養兩次來維持這些細胞。
在開始亞培養后大約2周的細胞培養物在室溫以3，500rpm離心5分鐘以收集上 清液，隨后使用0. 45 μ m注射器濾器過濾，并用50mM Tris-HCl, pH7. 0平衡。
將上清液裝載至Hi Trap蛋白質A HP柱(GE Healthcare,目錄號17-0402-01)中， 然后使用50mM Tris-HCl，pH7. 0洗滌。使用0. IM檸檬酸pH4. 0獲得洗脫液。收集400 μ 1 的級分并用40μ 1(對應于級分體積的10/l[sic])的IM Tris-HCl, pH 9.0中和。使用 Slyde-A Lyzer IOK透析盒(PIERCE，目錄號66453)對100倍體積的PBS進行透析2次，每 次2. 5小時，然后再進行一次15-18小時的透析。使用0. 22-μ m注射器濾器將純化的樣品 過濾，接著使用 VIVA SPIN 50，000 MWCO PES(VICASCIENCE,目錄號 VS0231)進行濃縮。使 用BECKMANCOULTER DU530從A280值計算抗體濃度。所用的產生抗體的細胞株為CHO細胞hzl791-fvl0、hzl791-ff34、hzl791_sf43和 hzl791-SS32，這些細胞株依據布達佩斯條約的規定，分別于平成18年(2006)3月1日以保 藏號FERM BP-10543、FERMBP-10544、FERM BP-10545和FERM BP-10546保藏于國際專利生物 保藏單位日本產業技術綜合研究所，Tsukuba Central6, l-l-lHigashi，Tsukuba, Ibaraki，日本。下文描述了從這些細胞株獲得的人源化抗⑶20單克隆抗體H鏈V區和L鏈V區 的氨基酸序列(SEQ ID No:17-24)(下劃線的氨基酸不同于相應的小鼠抗體的那些)。人源化Ikl791序列L-鏈 V-區的序歹Ij (SEQ ID No 20)Ven 1791:STVMTQSPDSLAVSLGERVTINC KASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKVLIY FASNRYTGVPDRFSGSGYGTDFTFTISSVQAEDVAVYFC QQDYSSPLTFGAGTKLELKH-鏈 V-區的序歹Ij (SEQ ID No 24)Ven 1791 :QIQLVQSGPELKKPGASVKISCKASGYTFT NFGVNffVKQAPGKGLKffMG WINTYTGEPSYADDFKG RFAFSLDASVSTAYLQISSLKAEDTSTYFCTR RTNYYGTSYYYAMDY WGQGTTVTVSSL-鏈 V-區的序歹Ij (SEQ ID No 17)abb 1791 :STVMTQSPDSLAVSLGERATINC KS SQSVSNDVAWYQQKPGQSPKVLIY FASNRYSGVPDRFSGSGYGTDFTLTISSLQAEDVAVYFC QQDYSSPLTFGAGTKLEIKH-鏈 V-區的序歹Ij (SEQ ID No 21)abb 1791 :QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFT NFGVNffVRQAPGKGLEffMG WINTYTGEP SYAQGF1G RFVFSLDASVSTAYLQISSLKAEDTATYFCTR RTNYYGTSYYYAMDY WGQGTTVTVSSL-鏈 V-區的序歹Ij (SEQ ID No 19)sdr 1791:STVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSNSNDVAWYQQKPGQSPKVLIY FASNRYSGVPDRFSGSGYGTDFTLTISSLQAEDVAVYFC QQDYSSPLTFGAGTKLEIKH-鏈 V-區的序歹Ij (SEQ ID No 23)sdr 1791 :QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFT NFGVNffVRQAPGKGLKffMG WINTYTGEPSYAQGFTG RFAFSLDASVSTAYLQISSLKAEDTATYFCTR RTNYYGTSYYYAMDY WGQGTTVTVSS
L-鏈 V-區的序歹Ij (SEQ ID No 18)fra 1791STVMTQSPSFLSASVGDRVTITC KASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKVLIY FASNRYTGVPDRFSGSGYGTDFTLTISSLQAEDVAVYFC QQDYSSPLT
FGAGTKLEIKH-鏈 V-區的序歹Ij (SEQ ID No 22)fra 1791 :QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFT NFGVNffVKQAPGKGLKffMG WINTYTGEPSYADDFKG RFAFSLDASASTAYLQISSLKAEDMTYFCTR RTNYYGTSYYYAMDY WGQGTTVTVSS在該系列實驗中，關于獲自結合四種AbbL、FraL, SdrL, VenL和四種AbbH、FraH, SdrHJenH產生的全部16個序列組合中各兩個克隆進行了實驗。從以上結果看，可以基于 它們的Kd值，將這些克隆分類成4組，如表5中所示。從每組選擇一個克隆并用于進一步 的實驗中。在本說明書和權利要求書中，例如，提及人源化抗體1791的克隆fv時，意味著其 中結合了 ￡ral791 的 L-鏈(SEQ ID NO 18 中所示的 L-鏈)禾Π Ven 1791 的 H-鏈(SEQ ID NO :24中所示的H-鏈)的抗體克隆(進行下劃線標注用于解釋)。這同樣適用于其他克隆。對照c2B8I 組Kd=>20nMII 組Kd = 10-20nMIII 組Kd = 8-10nMIV 組Kd=<8nM 表4人源化抗體結合解離常數
表5人源化抗體的結合解離常數
這些使用8種小鼠抗體的細胞凋亡實驗的結果顯示于圖7a至圖7d中。發明人能 夠將8種小鼠抗體以及已知的CD20抗體2B8和2H7相對于四種類型的細胞分成2類(不 包括一些例外)。A 組m0924、ml422、ml791、m2B8B 組ml228、ml402ml712、ml782、m2H7(然而，對于SU-DHL4細胞，m0924包括在B組內)。換言之，A組包括表現出通過自身足以誘導細胞凋亡的能力并且即使在與二抗交 聯的情況下也具有大約相同的細胞凋亡誘導能力水平的抗CD20抗體，而B組包括表現出通 過自身不足以誘導細胞凋亡的能力并且在交聯條件下具有很大程度提高的誘導細胞凋亡 能力的抗-⑶20抗體。此外，屬于A組的抗體呈現出與2B8抗體相當的親和性，而屬于B組的抗體則表現出高于2B8的親和性。因此，可以推斷A組的抗體更適于用作藥物，因為它們 不需要二抗的存在來誘導細胞凋亡并且能夠通過自身來誘導細胞凋亡。現在轉向細胞類型，結果表明RAJI、WIL2-NS、RCK8在30至40%的范圍中具有最 高的細胞凋亡比例，而SU-DHL4細胞在一些情況中表現出不低于80%的最大比例。四種人源化抗體的結果顯示于圖8a至圖9d中。與小鼠抗體相似，將人源化1791抗體的四個克隆相對于所有四種類型的細胞分
成兩組。A 組fvl0、ff34B 組sf43、ss32、C2B8呈現出與C2B8相當親和性的A組抗體fvlO和ff34在沒有交聯的條件下具有與 C2B8幾乎相同的細胞凋亡活性，并在交聯情況下具有明顯提高的活性。盡管B組的sf和ss 抗體比A組的抗體表現出更大的解離常數和更弱的親和性，但這些抗體獨立表現出比C2B8 略強的細胞凋亡活性。關于抗⑶20抗體誘導對抗B細胞的細胞凋亡的能力，當它們呈現出充分的通過自 身誘導細胞凋亡的能力時，在交聯條件下的細胞凋亡比例基本上是相同。然而，當它們由于 抗體類型、不飽和的條件等而未呈現出足夠的通過自身誘導細胞凋亡的能力時，可能在交 聯條件下細胞凋亡活性將提高。圖9a至圖9d是顯示早期細胞凋亡(％ )的圖，其中將實驗當天“無Ab”(未加入 抗體)條件下的早期細胞凋亡比例設定為1。人源化抗體1791的四個克隆(克隆fv、ff、sf和ss)對抗Raji、SU-DHL4、WiL_2 和RCK8細胞的細胞凋亡活性概括于表6中。表6人源化抗體-1791克隆的細胞凋亡活性 使用Raji細胞、SU-DHL4細胞、WiL_2細胞和RCK8細胞，對人源化抗體1791的克 隆fv、ff、Sf和SS測量了⑶C活性。各自的結果顯示于表7中。包括利妥西單抗(C2B8)和克隆1791(cl791)作為對照。表7根據本發明的人源化抗體的⑶C活性 表7中的結果顯示克隆ff和fv表現出等于或強于利妥西單抗的⑶C活性。此外， sf對WiL2和RCK8細胞顯出示極強的⑶C活性。還進行了實驗來研究抗體濃度和CDC活性之間的關系。將所用的抗體純化至比按 照實施例2所述制備的抗體更高的純度。按照以下所述的程序來進行純化。在含有補充了4mM GlutaMax (Invitrogen,目錄號 35050-061)和 200 μ g/ml G418 (Sigma，目錄號 A1720-5G)的水解產物的 IS CHO-CD/w 培養基(Irvine Scientific, 目錄號91119)中，在37°C和5% CO2濃度下，在CO2培養箱中培養生產抗體的細胞株(遺 傳重組的CH0-DG44細胞)。通過每周亞培養兩次來維持該細胞。將亞培養后大約2周的 細胞培養物在室溫下以3，500rpm離心5分鐘以收集上清液，隨后使用0. 45 μ m注射器濾 器過濾并用50nM Tris-HCl, ρΗ7.0平衡。將上清液裝載至Hi Trap蛋白質A HP柱上(GE Healthcare,目錄號 17-0402-01)，然后使用 50mM Tris-HCl, ρΗ7· 0 洗滌。使用 0. IM 檸檬 酸，ΡΗ4. 0，獲得洗脫液。收集400 μ 1的級分并用40 μ 1 (對應于級分體積的10/1 [sic]) IM Tris-HCl, pH9. 0 中和。使用 Slyde-A-LyzerlOK 透析盒(PIERCE 目錄號 66453)對 100 倍 體積的PBS進行透析2次，每次2. 5小時，然后再進行一次15-18小時的透析。使用VIVASPIN50, 000MWC0 PES(VIVASCIENCE,目錄號 VS0231)濃縮透析過的樣 品。將樣品裝載于用PBS平衡的HiLoadl6/60superdex 200制備級柱上(GE Healthcare, 目錄號17-1069-01)。使用0. 22 μ m注射器濾器過濾純化的樣品，并用VIVASPIN50，000MWC0 PES (VIVASCIENCE,目錄號 VS0231)濃縮。使用 BECKMAN C0ULTERDU530 從 A280 值計算抗體 濃度。圖IOa至圖IOd顯示了人源化抗體fv、ff、sf和ss以及嵌合抗體clkl79對Raji、 SU-DHL4、WiL-2和RCK8細胞的濃度和⑶C活性之間的關系。在所有實驗系統中，5 μ g/ml 或更高濃度下的人源化抗體fV、fT、sf和ss的CDC活性等于或高于利妥西單抗(C2B8)的。 特別地，盡管利妥西單抗呈現出對抗RC-K8細胞的低CDC活性，但根據本發明的人源化抗體 1791的四個克隆呈現出利妥西單抗至少約4倍高的對抗RC-K8細胞的⑶C活性。還檢測了fv、ff、sf 和 ss 對抗 Raji、SU-DHL4、WiL-2 和 RCK8 細胞的 ADCC 活性。抗體濃度和ADCC之間的關系顯示于圖Ila至圖Ild中(E T比例為25)。根據本發明的 人源化抗體1791的四個克隆fv、ff、sf和ss的ADCC活性等于或高于Rituxan (C2B8)的。 這些ADCC活性結果還證明了根據本發明的人源化抗體系列1791的功效。實施例4 獲得另一種類型的人源化抗-CD20單克隆抗體(人源化抗體1782)從沒有通過自身誘導細胞凋亡并具有高親和性的抗體組中選擇系列1782作為具 有最高親和性的抗體，并接受人源化。獲得人源化抗體1782的克隆并根據之前實施例中所 述的程序檢測其特性。還根據之前實施例中所述的程序檢測了所得到的人源化抗體的特性。基于SEQ ID NO ,21至34中的氨基酸序列，涉及了對CHO細胞密碼子優化的DNA， 并以常規程序合成。使用PNOW作為表達載體構建了 16種用于人源化1K1782的表達構建 體。這些構建體如下pN0W-aal782kgl、pN0ff-af 1782kgl, pN0ff-as 1782kgU pN0W_avl782kgl、 pN0ff-fal782kgU pNOff-ff 1782kgU pNOff-fs 1782kgU pNOff-fv 182IkgU pN0W_sal782kgl、 pNOff-sf 182IkgU pN0W_ssl782kgl、pN0ff-svl782kgU pNOff-va 1782kgU pNOff-vf 1782kgU pN0ff-vsl782kgl 和 pN0W_vvl782kgl。此外，根據實施例3中所述的程序進行了使用化學劑的轉染和選擇，用于選擇高 表達細胞株，小規模培養和培養產生人源化抗體的細胞株并純化人源化抗體。所用的生產抗體的細胞株是CHO 細胞 hzl782_ss21、hzl782_fv02、hzl782-ffl4 和 hzl782-sf23，其中細胞株 hzl782_ss21、hzl782-fv02 和 hzl782_ffl4 依據布達佩斯條 約的規定，分別于平成19年(2007)8月31日以保藏號FERM ABP-10907、FERM ABP-10906 和FERMABP-10905保藏于國際專利生物保藏單位日本產業技術綜合研究所，Tsukuba Central6,1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, El*。以下描述了獲自這些細胞株的人源化抗-⑶20單克隆抗體的H-鏈V-區和L-鏈 V-區的氨基酸序列(SEQ ID NO 17至24)。人源化lkl782的序列L-鏈 V-區的序歹Ij (SEQ ID No 27)Ven 1782 DILLTQSPATLSLSPGERATLSC RASQNIGTSIHWYQQKPGQSPRLLIK YASESFSGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFADYYC QQSNSffPFTFGSGTKLEIKH-鏈 V 區的序列(SEQ ID No :31)Ven 1782 QVQLVQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFT SYffMHffVKQAPGQGLEffIG YITPSTGYTDYNKKFKDKATLTADRSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR SGPYFDVWGAGTTVTVSSL-鏈 V-區的序歹Ij (SEQ ID No 28)abb 1782 DIVLTQSPATLSLSPGERATLSC RASQNIGTSIHWYQQKPGQSPRLLIK YASESFTGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFADYYC QQSNSffPFTFGSGTKLEIK
H-鏈 V-區的序歹Ij (SEQ ID No 32)Abb 1782 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SYffMHffVRQAPGQGLEffMG YITPSTGYTDYNQKFQGRVTLTADRSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR SGPYFDVWGAGTTVTVS S
L-鏈 V 區的序列(SEQ ID No 29)sdr 1782 DILLTQSPATLSLSPGERATLSC RASQNVGTSLHWYQQKPGQSPRLLIK YASERFTGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFADYYC QQSNSffPFTFGSGTKLEIKH 鏈 V-區的序列(SEQ ID No 33)sdr 1782 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SYffMHffVKQAPGQGLEffIG YITPSTGYTDYNQKFQGKATLTADRSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR SGPYFDVWGAGTTVTVSSL-鏈 V 區的序列(SEQ ID No 30)fra 1782 DILLTQSPATLSVSPGERATLSC RASQNIGTSIHWYQQRPGQSPRLLIK YASESFSGIPSRFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDIADYYC QQSNSffPFTFGSGTKLEIKH-鏈 V-區的序歹Ij (SEQ ID No 34)fra 1782 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SYffMHffVKQAPGQGLEffIG YITPSTGYTDYNKKFKDKATLTADRSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR SGPYFDVWGAGTTVTVSS在說明書和權利要求書中，提及人源化抗體1782的克隆fv時，意思是其中結合了 fral782 的 L-鏈(SEQ ID NO 30 中所示的 L-鏈)和 Venl782 中所示的 H-鏈(SEQ ID NO 31中所示的H-鏈)的抗體。這同樣適用于其他克隆。(a)人源化抗體1782的親和性測量參照實施例3中的結果，發明人假定了人源化抗體1782的克隆也分成四組，并且 選擇了屬于各組的ss、sf、ff和fv。測量了這些抗體、Rituxan (C2B8)和人源化抗體2f2對 抗⑶20的Kd值。結果顯示于表8中。在說明書和權利要求書中，例如，提及人源化抗體1782的克隆sf時，意思是其中 結合了 sdrl782的L-鏈(SEQ ID NO 29中所示的L-鏈)和fral782中所示的H-鏈(SEQ ID NO :34中所示的H-鏈)的抗體(進行下劃線標注用于解釋)。這同樣適用于其他克隆。表8人源化抗體1782克隆的結合解離常數(Kd) 根據之前的實施例檢測了這些人源化抗體的Kd值。所用的細胞是Raji細胞。一 抗的檢測使用了 FITC-標記的蛋白A，并且對一抗和蛋白A的結合比例為1 3的假定進行 了分析。
人源化抗體1782的克隆ff呈現出最低的Kd值，這低于Rituxan和人源化抗體 2f2的那些。即，發現了人源化抗體1782的克隆ff對⑶20具有最高的親和性。
(b)人源化抗體1782的細胞生長抑制活性測定了人源化抗體1782的四個克隆fv、ff、sf和ss的細胞凋亡誘導活性、⑶C活 性(％ )和ADCC活性。根據之前實施例中所述的程序測量這些活性。(bl)人源化抗體1782的細胞凋亡誘導活性使用RC-K8、SU-DHL4、RAJI和WIL2NS細胞測量了人源化抗體1782的細胞凋亡誘 導活性。結果顯示于圖12a至圖12d中(在圖中)，右側的數字表示抗體濃度，而XL表示存 在與二抗(山羊抗人抗體)的交聯。圖13a至圖13d顯示了將無加入抗體條件下誘導細胞凋亡的能力設定為1時，人 源化抗體-1782克隆的細胞凋亡誘導活性。人源化抗體的系列1782呈現出弱的通過自身誘導細胞凋亡的能力，但在交聯條 件下細胞凋亡誘導活性等于或高于Rituxan(C2B8)的。結果概括于表9中。人源化抗體-1782克隆的細胞凋亡誘導活性(在表中，XL表示與二抗(山羊抗人 抗體)交聯的存在)。表 9 (b2)人源化抗體1782的CDC活性首先使用RC-K8和SU-DHL4細胞測量了人源化抗體1782的克隆fv和ff的CDC活性。結果顯示于圖14a和圖14b中。發現了在0.1和lyg/ml抗體濃度下的活性之間沒 有太大差別。人源化抗體1782的克隆fv和ff呈現出對抗這些細胞類型中任一種的高⑶C 活性。在抗Rituxan的RC-K8細胞的情況中，fv具有最高的CDC活性。在SU-DHL4細胞的 情況中，人源化抗體1782的克隆fv和ff呈現出高⑶C活性，這高于Rituxan的。使用RAJI、WIL2NS、SU-DHL4和RC-K8細胞測量了人源化抗體1782的四個克隆fv、 ff> Sf和SS的⑶C活性。結果概括于表10中。表10人源化抗體-1782克隆的⑶C活性 這些人源化抗體-1782克隆呈現出對抗RC-K8細胞的⑶C活性，RC-K8細胞是抗 Rituxan的，以及對抗RAJI、WIL2ND和SU-DHL4細胞的CDC活性。特別地，克隆ff和fv具 有高⑶C活性并呈現出明顯高于Rituxan的對抗SU-DHL4細胞的⑶C活性。將Kd值和CDC活性的結果放在一起看，優選克隆ff，因為其具有最高的親和性，相 對高的⑶C活性以及對抗Rituxan抗性株RC-K8的⑶C活性，以及克隆fv也是優選的，因 為其具有最高的⑶C活性，并且此外，其對抗Rituxan抗性株RC-K8也是有效的。特別地， 因為克隆ff具有非常高的親和性，可以將其RI標記，以用于涉及B-細胞疾病的靶向治療。(b3)人源化抗體1782的ADCC活性首先使用RC-K8和SU-DHL4細胞測量了人源化抗體1782的克隆fv和ff的ADCC 活性。結果顯示于圖15a和圖15b中。發現了在0.1和lyg/ml抗體濃度下的活性之間沒 有太大差別。在RC-K8細胞的情況中，克隆ff具有高于克隆fv和Rituxan的ADCC活性。 在SU-DHL4細胞中，克隆fv呈現出與Rituxan相當的ADCC活性，而克隆ff具有相對低的 ADCC活性。使用RAJI、WIL2NS、SU-DHL4和RC-K8細胞測量了人源化抗體1782的四個克隆fv、 ff> Sf和SS的ADCC活性。結果概括于表11中。表11人源化抗體-1782克隆的ADCC活性
克隆fv是優選的，因為其具有對抗SU-DHL4細胞的高ADCC活性，以及克隆ss也 是優選的，因為其具有對抗RC-K8細胞的高ADCC活性。工業應用性根據本發明，提供了抗CD20單克隆抗體，特別是人源化抗體，及其生產方法，和含 有這些抗體的用于治療涉及B-細胞疾病的治療劑，抗體在其天然狀態對人CD20分子具有 高結合親和性并表現出適合作為藥物用途的生物學活性。因此，本發明適用于制造用于治 療癌癥的藥物、癌癥研究等領域。序列表的自由文本SEQ ID NO 17 人源化抗體abb 1791的L鏈V區序列SEQ ID NO 18 人源化抗體fra 1791的L鏈V區序列SEQ ID NO 19 人源化抗體sdr 1791的L鏈V區序列SEQ ID NO 20 人源化抗體Ven 1791的L鏈V區序列SEQ ID NO 21 人源化抗體abb 1791的H鏈V區序列SEQ ID NO 22 人源化抗體fra 1791的H鏈V區序列SEQ ID NO 23 人源化抗體sdr 1791的H鏈V區序列SEQ ID NO 24 人源化抗體Ven 1791的H鏈V區序列SEQ ID NO :25 引物SEQ ID NO :26 引物SEQ ID NO 27 人源化抗體 Ven 1782 的 L-鏈 V 區SEQ ID NO 28 人源化抗體 abb 1782 的 L-鏈 V 區SEQ ID NO 29 人源化抗體 sdr 1782 的 L-鏈 V 區SEQ ID NO 30 人源化抗體 fra 1782 的 L-鏈 V 區SEQ ID NO 31 人源化抗體 Ven 1782 的 H-鏈 V 區SEQ ID NO 32 人源化抗體 abb 1782 的 H-鏈 V 區SEQ ID NO 33 人源化抗體 sdr 1782 的 H-鏈 V 區SEQ ID NO 34 人源化抗體 fra 1782 的 H-鏈 V 區[序列表]
權利要求
人源化抗-CD20單克隆抗體，其含有SEQ ID NO27至30任一中所示的L-鏈和SEQ ID NO31至34任一中所示的H-鏈的組合。
2.根據權利要求1的人源化抗-⑶20單克隆抗體，其含有SEQIDN0:30中所示的L-鏈 和SEQ ID NO 34中所示的H-鏈的組合。
3.根據權利要求1的人源化抗-⑶20單克隆抗體，其含有SEQIDN0:30中所示的L-鏈 和SEQ ID NO 31中所示的H-鏈的組合。
4.根據權利要求1的人源化抗-⑶20單克隆抗體，其含有SEQIDN0:29中所示的L-鏈 和SEQ ID NO 33中所示的H-鏈的組合。
5.根據權利要求1的人源化抗-CD20單克隆抗體，其是通過選自使用日本產業技術 綜合研究所的國際專利生物保藏，依據保藏號FERMABP-10907、FERM ABP-10906和FERM ABP-10905進行保藏的細胞產生的。
6.生產人源化抗-CD20單克隆抗體的方法，其包括培養選自使用日本產業技術綜合研 究所的國際專利生物保藏，依據保藏號FERMABP-10907、FERM ABP-10906和FERM ABP-10905 進行保藏的細胞。
7.用于治療B-細胞介導疾病的治療劑，其含有根據權利要求1至6任一項的人源化 抗-CD20單克隆抗體作為活性成分。
全文摘要
打算提供具有對抗具有人CD20抗原的細胞的生長抑制活性的單克隆抗體，其通過使用表達人C20抗原的人B細胞系作為免疫原和源自非人動物的細胞系來生產抗體，該非人動物不同于待免疫的動物并且已經用人CD20DNA轉化，并提供通過上述單克隆抗體的嵌合或人源化獲得的單克隆抗體。這些單克隆抗體顯示出適于用作藥物的生物活性。
文檔編號A61K39/395GK101848999SQ20078010142
公開日2010年9月29日 申請日期2007年9月6日 優先權日2007年9月6日
發明者內山進, 福井希一 申請人:國立大學法人大阪大學