多價肺炎球菌多糖-蛋白質綴合物組合物的制作方法

專利名稱：多價肺炎球菌多糖-蛋白質綴合物組合物的制作方法
專利說明多價肺炎球菌多糖-蛋白質綴合物組合物 發明領域 本發明總體上涉及醫藥領域，并具體地涉及微生物學、免疫學、疫苗和通過免疫預防細菌病原體感染。

背景技術：
肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)是世界上嬰兒和幼兒中腦膜炎、肺炎和嚴重侵入性疾病的主要病因。多年前就批準了多價肺炎球菌多糖疫苗并且已經證明其在老年人和高危病人中預防肺炎球菌疾病是有價值的。然而，嬰兒和幼兒對多數肺炎球菌多糖應答很弱。7價肺炎球菌綴合物疫苗(7vPnC，

)是第一種表明對嬰兒和幼兒中侵入性疾病和中耳炎具有高度免疫原性和有效的疫苗。該疫苗現在在世界上許多國家被批準。Prevnar含有來自血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的莢膜多糖，每種多糖綴合到稱作CRM197的載體蛋白。Prevnar在美國、歐洲和世界的其他地區分別覆蓋約80-90％、60-80％和40-80％侵入性肺炎球菌疾病(IPD)[1，2]。Prevnar的引入后數年中收集的監視數據已經清楚地表明如所預期的，在美國嬰兒中侵入性肺炎球菌疾病減少(

圖1)[3，4]。
在Prevnar引入前美國嬰兒中進行的IPD監視表明由于血清群6和19的疾病的大部分是由于6A(約1/3)和19A(約1/4)血清型[5，6]導致的。在Prevnar批準后，在美國進行的肺炎球菌侵入性疾病監視表明大部分的疾病仍然歸因于血清型6A和19A(圖1)[3]。此外，這兩種血清型造成比血清型1、3、5和7F總和還要多的侵入性疾病病例(100,000個2歲以下兒童中8.2對3.3例)。此外，血清型6A和19A與高比率的抗生素抗性有關(圖2)[7，8，9]。盡管隨著更多兒童被免疫，可能血清組交叉保護將導致血清型6A和19A疾病的下降，但是有證據表明該下降將很有限，并且由于這些血清型引起的疾病的很大負擔將保持(見下文)。
考慮到由于血清型1、3、5、6A、7F和19A的侵入性肺炎球菌疾病的相對負擔和重要性，向Prevnar制劑中加入這些血清型將在美國和歐洲增加侵入性疾病的覆蓋率到＞90％，在亞洲和拉丁美洲高達70％-80％。該疫苗將顯著擴大Prevnar的覆蓋度，并且提供對6A和19A的覆蓋，其不依賴于血清組交叉保護的限制。
發明概述 因此，本發明總體上提供了包含13種不同的多糖-蛋白質綴合物的多價免疫原性組合物，其中每種綴合物含有綴合到載體蛋白的來自不同血清型的肺炎鏈球菌的莢膜多糖，以及生理學上可接受的載體。任選地，在該制劑中包含佐劑，如基于鋁的佐劑。更具體地，本發明提供了13價肺炎球菌綴合物(13vPnC)組合物，其包含7vPnC疫苗中的7種血清型(4、6B、9V、14、18C、19F和23F)加上6種附加的血清型(1、3、5、6A、7F和19A)。
本發明還提供了多價免疫原性組合物，其中莢膜多糖來自肺炎鏈球菌的血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F并且載體蛋白是CRM197。
本發明還提供了多價免疫原性組合物，其中莢膜多糖來自肺炎鏈球菌的血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F，載體蛋白是CRM197，并且佐劑是基于鋁的佐劑，諸如磷酸鋁、硫酸鋁和氫氧化鋁。在本發明的一個具體實施方案中，佐劑是磷酸鋁。
本發明還提供了多價免疫原性組合物，其包含多糖-蛋白質綴合物以及生理學上可接受的載體，其中每種綴合物包含綴合到載體蛋白的來自肺炎鏈球菌的不同血清型的莢膜多糖，并且所述莢膜多糖制備自血清型3和至少一種額外的血清型。
在該多價免疫原性組合物的一個實施方案中，額外的血清型選自血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F。在另一實施方案中，載體蛋白是CRM197。在再一個實施方案中，組合物包含佐劑，諸如選自磷酸鋁、硫酸鋁和氫氧化鋁的基于鋁的佐劑。在一個具體實施方案中，佐劑是磷酸鋁。
本發明還提供了多價免疫原性組合物，其包含多糖-蛋白質綴合物和生理學上可接受的載體，其中每種綴合物包含綴合到載體蛋白的來自肺炎鏈球菌的不同血清型的莢膜多糖，并且該莢膜多糖制備自血清型4、6B、9V、14、18C、19F、23F和至少一種額外的血清型。
在該多價免疫原性組合物的一個實施方案中，額外的血清型選自血清型1、3、5、6A、7F和19A。在另一實施方案中，載體蛋白是CRM197。在再一個實施方案中，組合物包含佐劑，諸如選自磷酸鋁、硫酸鋁和氫氧化鋁的基于鋁的佐劑。在一個具體實施方案中，佐劑是磷酸鋁。
本發明還提供了誘導對肺炎鏈球菌莢膜多糖綴合物的免疫應答的方法，其包括對人施用免疫有效量的前述任一種免疫原性組合物。
本發明還提供了施用的任一種免疫原性組合物是單個的0.5mL劑量，其經配制成含有除了4μg6B外，2μg每種糖；約29μg CRM197載體蛋白；0.125mg元素鋁(0.5mg磷酸鋁)佐劑；和作為賦形劑的氯化鈉和琥珀酸鈉緩沖劑。
還提供了制備包含與載體蛋白共價連接的肺炎鏈球菌血清型3(Pn 3)多糖的免疫原性綴合物的方法。在一個實施方案中，該方法包括(i)使純化的Pn 3多糖與溫和的酸反應，得到水解的Pn 3多糖；(ii)在二價陽離子的存在下使水解的Pn 3多糖與氧化劑反應，得到活化的Pn 3多糖；(iii)使活化的Pn 3多糖與載體蛋白混合；(iv)使混合且活化的Pn 3多糖和載體蛋白與還原劑反應，得到Pn 3多糖載體蛋白綴合物；和(v)封閉Pn 3多糖載體蛋白綴合物中未反應的醛，得到包含與載體蛋白共價連接的肺炎鏈球菌Pn 3多糖的免疫原性綴合物。
在一個其它實施方案中，該方法包括(i)使純化的Pn 3多糖與乙酸反應，得到水解的Pn 3多糖；(ii)在MgCl2的存在下使水解的Pn 3多糖與高碘酸反應，得到活化的Pn 3多糖；(iii)純化活化的Pn 3多糖；(iv)使活化的Pn3多糖與載體蛋白混合；(v)共同凍干混合且活化的Pn 3多糖和載體蛋白；(vi)使共同凍干且活化的Pn 3多糖和載體蛋白與氰基硼氫化鈉反應，得到Pn3多糖載體蛋白綴合物；和(vii)用硼氫化鈉封閉Pn 3多糖載體蛋白綴合物中未反應的醛，得到包含與載體蛋白共價連接的肺炎鏈球菌Pn3多糖的免疫原性綴合物。
還提供了制備活化的肺炎鏈球菌Pn3多糖的方法。該方法包括(i)使純化的Pn 3多糖與溫和的酸反應，得到水解的Pn 3多糖；和(iii)在二價陽離子的存在下使水解的Pn 3多糖與氧化劑反應，得到活化的Pn 3多糖。
附圖簡述 圖1描繪了在美國年齡＜2歲的兒童從基線(1998/1999)到2001年按照血清型的IPD比率的改變。
圖2描繪了在＜5歲的兒童中具有青霉素(PCN)抗性的肺炎球菌分離株的分布(1998)。
圖3描繪了來自D118-P16 Prevnar試驗的第三次劑量后OPA的倒數累積分布曲線(reverse cumulative distribution；RCDC)。
發明詳述 Prevnar血清型4、6B、9V、14、18C、19F、23F的包括 來自1995-1998年間IPD監視的數據估計Prevnar中的7種血清型造成＜2歲年齡的兒童中約82％的IPD[5]。在加利福尼亞北部功效試驗地點，Prevnar血清型占嬰兒和幼兒中所有IPD病例的90％[10]。自從在2000年引入Prevnar疫苗，由于該疫苗血清型引起的疾病的下降，總的IPD率顯著降低[3，4]。因此，在此時沒有理由從下一代肺炎球菌綴合物疫苗除去任一種Prevnar血清型，而是加入血清型以得到更寬的覆蓋范圍。
血清型1、3、5和7F的包括 在美國，5歲以下兒童中血清型1引起的IPD率＜2％，對于血清型3和7F的每一種大概相同[1，6]。血清型1和5占具有侵入性肺炎球菌疾病的高危美國人口中IPD的較高發病率。具體地，血清型1引起阿拉斯加＜2歲的本地兒童中3.5％的IPD，和2-4歲兒童中18％的IPD[11]。血清型1和血清型5在世界的其他地方和發達國家的土著人口中顯著致病[12，13，14]。
與其他肺炎球菌血清型相比，血清型1也與更嚴重的疾病有關[15]。該觀察是基于美國和歐洲之間病例鑒定率的差異，和醫療實踐中相關的差異。總體上，IPD的發病率在歐洲低于美國。然而，在歐洲由血清型1引起的IPD的百分比不成比例地高于美國(分別為6-7％對1-2％)。在歐洲，血液培養物主要從住院兒童得到。在美國，在門診病人從發熱≥39℃并且具有升高的白細胞數的兒童得到血液培養物是常規的醫療實踐。考慮到醫療實踐的差異，推測在美國血清型1引起的疾病的較低百分比可能被引起較輕的疾病的其他血清型的較高比率稀釋，而歐洲的較高百分比反映了更嚴重的疾病。此外，具有并發肺炎的兒童的血清流行病學研究表明血清型1被不成比例地表示[16，17，18]。這提示血清型1的包括可以降低嚴重肺炎球菌疾病的量，以及促進侵入性肺炎球菌疾病的總的減少。
加入血清型3和7F將在世界上的多數地區對IPD的覆蓋率增加約3％-7％，在亞洲增加約9％。從而，11價疫苗將覆蓋亞洲中的約50％和所有其他地區中IPD的約80％[1，2]。這些血清型對于中耳炎覆蓋率也是重要的[19]。在引起中耳炎的肺炎球菌血清型的多國家研究中，Hausdorff等人發現血清型3是第8位最普遍的總體中耳液分離物[20]。血清型3占與中耳炎相關的肺炎球菌血清型的高達8.7％。因而，在中耳炎以及IPD中血清型3和7F的重要性保證它們包括在肺炎球菌綴合物疫苗中。
然而，產生顯示出就血清型3多糖而言的顯著免疫原性的多價肺炎球菌綴合物疫苗的嘗試沒有成功。例如，在11價肺炎球菌蛋白D綴合物疫苗(11-Pn-PD)的免疫原性和安全性研究中，在接受三劑該疫苗接著接受相同疫苗或者肺炎球菌多糖疫苗的加強劑量的嬰兒中沒有觀察到血清型3的引發效果(Nurkka等人(2004)Ped.Inf.Dis.J.，231008-1014)。在另一研究中，來自已經接受11-Pn-PD劑量的嬰兒的調理吞噬測定(OPA)沒有顯示出在與其他測試的血清型相當的水平上對血清型3的抗體應答(Gatchalian等人，17th Annual Meeting of the Eur.Soc.Paed.Inf.Dis.(ESPID)，Poster No.4，P1A Poster Session 1，Istanbul Turkey，2001年3月27日)。在再一個研究中，評估了11-Pn-PD在預防急性中耳炎中的功效，疫苗沒有提供對血清型3引起的發作的保護(Prymula等人(2006)Lancet，367740-748)。因此，包含來自血清型3的莢膜多糖和能夠引起對血清型3多糖的免疫原性應答的肺炎球菌綴合物疫苗提供了在本領域現狀上的顯著進步。
血清型6A和19A的包括 a.血清型6A和19A的流行病學 文獻中的監視數據提示血清型6A和19A與血清型1、3、5、和7F組合相比，造成美國＜2歲的兒童中更多的侵入性肺炎球菌疾病(圖1)[1，5]。此外，這些血清型通常與抗生素抗性有關(圖2)并且在中耳炎中起重要作用[6，19，20]。當前的Prevnar疫苗保護6A和19A引起的疾病的能力還不清楚。下面討論在13vPnC疫苗中包括6A和19A組分的原理。
b.6B和19F多糖誘導的對6A和19A的應答 所批準的未綴合的肺炎球菌多糖疫苗(用于至少2歲的人中)已經含有6A或6B莢膜多糖，但是不含有兩者[21]。在配制23價肺炎球菌多糖疫苗時產生的免疫原性數據表明6B單價疫苗誘導針對6A和6B莢膜的抗體。使用游離多糖和使用肺炎球菌綴合物疫苗在多種群體中評估IgG和調理吞噬測定(OPA)應答的幾個試驗的數據表明針對6A的IgG應答通過6B抗原誘導，但是該應答通常較低，并且使用6A生物的OPA活性與使用6B生物的不同[22，23，24，25]。此外，以高6B抗體應答的受試者可以對6A有很小活性或無活性。
與6A和6B莢膜多糖的化學組成(其中存在高度相似性)相反，19A和19F莢膜由于在19A多糖中存在兩條額外側鏈而相當不同。不令人驚奇的是，在用19F多糖疫苗免疫的人類志愿者中測量的免疫應答表明在80％的受試者中誘導了對19F的應答，但是僅20％的受試者具有對19A的應答[26]。用19F多糖免疫后對血清型19A的低水平的交叉反應性IgG和OPA應答也已經在使用綴合物疫苗的試驗中記載[24，26]。
已經從在美國嬰兒中進行的7vPnC橋接試驗(D118-P16)產生了關于對6A和19A的交叉反應性OPA應答的內部數據(圖3)。這些研究與其他人的發現一致，并且表明用6B多糖免疫后誘導對6A多糖的交叉反應性功能抗體，盡管在較低水平，和用19F免疫后對19A的極低的功能抗體。
動物模型中6B和19F免疫對6A和19A的影響 已經用動物模型評估用多糖免疫的交叉保護的潛力。在Giebink等人開發的中耳炎模型中，用四價多糖外膜蛋白(OMP)綴合物疫苗(含有6B、14、19F、23F糖)或安慰劑免疫灰鼠[27]。在該試驗中，顯示對6A有一定的交叉保護；然而，這沒有達到統計學顯著性并且保護水平低于用6B對中耳炎的保護水平。在該相同模型中，存在對19F中耳炎的100％保護，但是對19A中耳炎僅有17％的保護。
Saeland等人在肺感染模型中，在用6A生物進行鼻內攻擊之前，使用來自用8價肺炎球菌破傷風綴合物疫苗(含有6B和19F)免疫的嬰兒血清被動免疫小鼠[28]。在59個血清樣品中，53％的樣品保護小鼠抵抗具有6B的菌血癥，37％的樣品保護抵抗6A。在相同模型中用來自4劑11價肺炎球菌綴合物疫苗(含有綴合到破傷風類毒素的19F)免疫的嬰兒的血清被動免疫的小鼠被給予19A生物的鼻內攻擊[29]。在100只被動免疫然后攻擊的小鼠中，60只小鼠在肺組織中沒有檢測到19A生物，而在給予鹽水安慰劑的所有小鼠中鑒定到生物。然而，在該模型中，被動免疫不能保護用19F生物的攻擊；因此，該模型對于血清群19的相關性是可疑的。通常，這些模型提供證據證明6B免疫對6A生物的一定的生物學影響，盡管對異源血清型的影響沒有用同源血清型觀察到的大。從這些模型還沒有很好地了解19F免疫對19A生物的影響。
在功效/有效性試驗中6B和19F多糖綴合物免疫對6A和19A疾病的影響 表1中指出了在7vPnC和9vPnC(7vPnC加血清型1和5)功效試驗中由于6B、6A、19F和19A血清型導致的疾病病例數[30，10，31]。侵入性疾病病例的數目太小而不能對血清型6A和19A得出任何結論。然而，Finnish中耳炎試驗產生了大量肺炎球菌分離菌[32]。在根據方案分析(per protocolanalysis)中，7vPnC對由于血清型6B引起的中耳炎為84％(95％Cl 62％，93％)有效，對由于血清型6A引起的中耳炎為57％(95％Cl 24％，76％)有效(表1)。相反，對由于19F或者19A引起的中耳炎沒有顯示使用7vPnC的血清型特異的功效。
表1.在使用7vPnC和9vPnC疫苗的功效試驗中，由于血清型6B、6A、19F和19A引起的肺炎球菌疾病的病例
＊顯示的統計學顯著功效 來自參考文獻30、10和33，和個人交流 Contr＝對照 ITT＝打算治療分析 PP＝根據方案分析 還可以從疾病控制中心(Centers for Disease Control)進行的病例-對照試驗得到上市后IPD監視數據以評估Prevnar的有效性[33]。在監視實驗室中鑒定了3到23個月大的兒童中發生肺炎球菌侵入性疾病的病例并通過年齡和郵政編碼與三個對照病例匹配。得到知情同意后，從病例和對照的父母和醫學提供者得到醫療和免疫史(如果受試者接受了至少一劑Prevnar，那么認為他們是被免疫的)。初步結果在2003年ICAAC會議上給出并且在表2中給出對6B、19F、19A和6A疾病的發現總結。這些數據表明Prevnar能夠預防由于6A引起的疾病，盡管其水平比血清型6B疾病低一些。這些數據還表明對由于19A引起的侵入性疾病的交叉保護是有限的。
表2.CDC進行的病例對照試驗的初步結果(在2003年ICAAC上給出) ＊比較接種的(≥1劑)對比未接種的疫苗有效性，并對基礎條件調節參照40和個人/機密交流 Prevnar使用的經公布的分析[3]也表明在2歲以下兒童中血清型6A和19A引起的IPD中，血清型6B和19F賦予適度減少([3]中的表1)。在未免疫的成年人中由血清型6A、9A、9L、9N、18A、18B、18F、19A、19B、19C、23A和23B(“都是疫苗相關的血清型”)引起疾病發生率有一定的降低([3]中的表2)。這些數據確定在2歲以下兒童中使用Prevnar的群體免疫力對于血清型6A和19A是中等的，并且提供了在本發明的13vPnC疫苗中包括血清型6A和19A的基礎。
加入6A和19A的結論 在圖1和表2中使用7vPnC疫苗的上市后監視數據和病例-對照研究表明，與上述關于動物中免疫應答和性能的其他信息相一致，可能存在對6A疾病的一定的交叉保護，但是比對6B疾病的交叉保護程度較低。此外，似乎對19A的保護是有限的。因此，含有血清型6A和19A的13vPnC疫苗提供了覆蓋，其不依賴于血清型6B和19F對血清組交叉保護的限制。
因此，本發明提供了包含13種不同的多糖-蛋白質綴合物的多價免疫原性組合物，其中每種綴合物含有綴合到載體蛋白的不同的莢膜多糖綴合物，并且其中從肺炎鏈球菌的血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F制備莢膜多糖，以及生理學上可接受的載體。一種此類載體蛋白是稱作CRM197的白喉類毒素。免疫原性組合物可以還包含佐劑，如基于鋁的佐劑，諸如磷酸鋁、硫酸鋁和氫氧化鋁。
通過本領域技術人員已知的標準技術制備莢膜多糖。在本發明中，從肺炎鏈球菌的血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F制備莢膜多糖。通過單獨的方法制備這些肺炎球菌綴合物并配制成單劑量制劑。例如，在一個實施方案中，在基于大豆的培養基中培養每種肺炎球菌多糖血清型。然后通過離心、沉淀、超濾和柱層析純化各種多糖。將純化的多糖化學活化以使得該糖能夠與載體蛋白反應。
一旦活化，將每種莢膜多糖單獨綴合到載體蛋白以形成復合糖。在一個實施方案中，每種莢膜多糖綴合到相同的載體蛋白。在該實施方案中，通過還原胺化實現綴合。
通過常規方法實現多糖的化學活化和隨后綴合到載體蛋白。見，例如，美國專利號4,673,574和4,902,506[34，35]。
載體蛋白優選是無毒并且非反應原性并且可以以足夠的量和純度得到的蛋白質。載體蛋白應該服從標準的綴合步驟。在本發明的一個具體實施方案中，將CRM197用作載體蛋白。
CRM197(Wyeth，Sanford，NC)是從在基于酪蛋白氨基酸和酵母提取物的培養基中生長的白喉棒桿菌(Corynebacterium diphtheria)菌株C7(β197)的培養物分離的白喉毒素的非毒性變體(即，類毒素)。通過超濾、硫酸銨沉淀和離子交換層析純化CRM197。備選地，根據美國專利號5,614,382重組制備CRM197，將該專利引入本文作為參考。其他白喉類毒素也適于用作載體蛋白。
其他合適的載體蛋白包括滅活的細菌毒素，諸如破傷風類毒素、百日咳類毒素、霍亂類毒素(例如，如國際專利申請WO2004/083251中所述[38])、大腸桿菌LT、大腸桿菌ST、和來自銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的外毒素A。也可以使用細菌外膜蛋白，諸如外膜復合體c(OMPC)、孔蛋白、轉鐵蛋白結合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌黏附素蛋白(PsaA)、來自A組或者B組鏈球菌的C5a肽酶、或者流感嗜血桿菌蛋白D。其他蛋白質，如卵白蛋白、匙孔血藍蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或者結核菌素的純化的蛋白質衍生物(PPD)也可以用作載體蛋白。
莢膜多糖綴合到載體蛋白后，通過多種技術純化多糖-蛋白質綴合物(就多糖-蛋白質綴合物的量而言富集)。這些技術包括濃縮/滲濾操作、沉淀/洗脫、柱層析和深層過濾(depth filtration)。見下面的實施例。
純化各糖綴合物后，將它們混合以配制本發明的免疫原性組合物，其可以用作疫苗。使用本領域公知的方法可以完成本發明的免疫原性組合物的配制。例如，可以用生理學上可接受的載體配制13種各自的肺炎球菌綴合物以制備組合物。此類載體的實例包括，但不限于，水、緩沖鹽水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液體聚乙二醇)和右旋糖(dextrose)溶液。
在一些實施方案中，免疫原性組合物將包含一種或多種佐劑。如本文定義的，“佐劑”是用于增強本發明的免疫原性組合物的免疫原性的物質。因此，通常給予佐劑以加強免疫應答并且佐劑是技術人員公知的。用于增強組合物的有效性的合適的佐劑包括，但不限于 (1)鋁鹽(alum)，諸如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁，等等； (2)水包油乳液制劑(有或者沒有其他特定免疫刺激劑，諸如胞壁酰基肽(下文定義)或者細菌細胞壁組分)，如， (a)MF59(PCT公布號WO 90/14837)，含有5％鯊烯，0.5％吐溫80，和0.5％司盤85(任選含有不同量的MTP-PE(見下文，盡管不是所需的)，使用微流化床裝置諸如110Y型微流化床裝置(Microfluidics，Newton，MA)配制成亞微米顆粒， (b)SAF，含有10％鯊烯，0.4％吐溫80，5％Pluronic嵌段聚合物L121，和thr-MDP(見下文)，微流化成亞微米乳液或者經渦旋以產生較大顆粒大小的乳液，和 (c)RibiTM佐劑系統(RAS)，(Corixa，Hamilton，MT)，含有2％鯊烯，0.2％吐溫80，和選自美國專利號4,912,094中描述的3-O-脫酰化的單磷酸脂A(MPLTM)的一種或多種細菌細胞壁組分(Corixa)，海藻糖二霉菌酸酯(TDM)，和細胞壁骨架(CWS)，優選MPL+CWS(DetoxTM)； (3)皂苷佐劑，可以使用如Quil A或STIMULONTM QS-21(Antigenics，Framingham，MA)(美國專利號5,057,540)或者從其產生的顆粒，如ISCOMs(免疫刺激復合物)； (4)細菌脂多糖，合成的脂類A類似物，如氨基烷基葡糖胺磷酸酯化合物(AGP)，或者其衍生物或類似物，其可以從Corixa得到，并且在美國專利號6,113,918中描述；一種此類AGP是2-[(R)-3-十四酰氧基十四酰基氨基]乙基2-脫氧-4-O-膦酰基-3-O-[(R)-3-十四酰氧基十四酰基]-2-[(R)-3-十四酰氧基十四酰基氨基]-b-D-吡喃葡萄糖苷，其也稱作529(以前稱作RC529)，其配制為水性形式或者穩定的乳劑，合成的多核苷酸，諸如含有CpG基序的寡核苷酸(美國專利號6,207,646)； (5)細胞因子，諸如白介素(例如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18，等)，干擾素(例如，γ干擾素)，粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)，腫瘤壞死因子(TNF)，共刺激分子B7-1和B7-2，等等； (6)細菌ADP-核糖基化毒素的脫毒突變體，諸如野生型或者突變型的霍亂毒素(CT)，例如，其中氨基酸位置29的谷氨酸被另一氨基酸，優選被組氨酸替換(根據公布的國際專利申請號WO 00/18434(也見WO02/098368和WO 02/098369))，百日咳毒素(PT)，或者大腸桿菌不耐熱毒素(LT)，尤其是LT-K63、LT-R72、CT-S109、PT-K9/G129(見例如WO 93/13302和WO 92/19265)；和 (7)作為免疫刺激劑以增強組合物的有效性的其他物質。
胞壁酰基肽包括，但不限于N-乙酰基-胞壁酰基-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正胞壁酰基-L-丙氨酸-2-(1’-2’二棕櫚酰基-sn-甘油-3-羥基磷酰基氧基)-乙胺(MTP-PE)等等。
本發明的疫苗組合物可以用于保護或者治療對肺炎球菌感染易感的人，這可通過全身或者粘膜途徑施用疫苗來完成。這些施用可以包括通過肌內、腹膜內、皮內或者皮下途徑注射，或者通過粘膜施用于口/消化道、呼吸或者泌尿生殖道。在一個實施方案中，鼻內施用用于治療肺炎或者中耳炎(因為肺炎球菌的鼻咽攜帶可以更有效預防，從而減輕在其最早階段的感染)。
選擇每個疫苗劑量中綴合物的量作為誘導免疫保護而無明顯的不利作用的量。此類量可以取決于肺炎球菌血清型而變化。通常，每劑將包含0.1到100μg多糖，尤其0.1到10μg，更尤其1到5μg。
通過包括觀察受試者中合適的免疫應答的標準研究確定具體疫苗的組分的最佳量。最初接種后，受試者可以接受足夠間隔的一次或幾次加強免疫。
在本發明的一個具體實施方案中，13vPnC疫苗是各自綴合到CRM197的血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的肺炎球菌莢膜多糖的無菌液體制劑。每0.5mL劑量被配制成含有除了4μg6B之外，2μg每種糖；約29μg CRM197載體蛋白；0.125mg元素鋁(0.5mg磷酸鋁)佐劑；和作為賦形劑的氯化鈉和琥珀酸鈉緩沖劑。將液體填充到沒有防腐劑的單劑量注射器中。搖動后，疫苗是可用于肌內施用的均勻、白色混懸液。
13vPnC疫苗的劑量水平的選擇類似于上市的7vPnC疫苗(Prevnar)。為所有血清型選擇2μg糖劑量水平，只是對于6B為每劑4μg。7vPnC疫苗對于血清型4、9V、14、18C、19F和23F在2μg糖劑量水平和對于6B在4μg劑量水平已經顯示出對于IPD的所希望的安全性、免疫原性和功效。
免疫方案可以按照為7vPnC疫苗指定的方案。例如，針對肺炎鏈球菌由于13vPnC疫苗中包括的血清型引起的侵入性疾病，嬰兒和剛學步的小孩的常規方案是2、4、6和12-15個月的年齡。本發明的組合物也適于更大的兒童、青少年和成人使用。
本發明的組合物可以還包括一種或多種額外的抗原，其用于抵抗其他細菌感染引起的中耳炎。此類細菌包括非典型流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenza)、粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)(以前稱作粘膜炎布蘭漢球菌(Branhamella catarrhalis))和Alloiococcus otitidis。
適于包括的非典型流感嗜血桿菌抗原的實例包括P4蛋白，也稱作蛋白“e”(美國專利號5,601,831；國際專利申請WO03/078453)，P6蛋白，也稱作PAL或者PBOMP-1蛋白(美國專利號5,110,908；國際專利申請WO0100790)，P5蛋白(美國再版專利號37,741)，嗜血桿菌粘附和穿透蛋白(美國專利號6,245,337和6,676,948)，LKP尖端黏附素蛋白(美國專利號5,643,725)和NucA蛋白(美國專利號6,221,365)。
適于包括的粘膜炎莫拉菌抗原的實例包括UspA2蛋白(美國專利號5,552,146，6,310,190)，CD蛋白(美國專利號5,725,862)，E蛋白(美國專利號5,948,412)和74千道爾頓外膜蛋白(美國專利號6,899,885)。
適于包括的Alloiococcus otitidis抗原的實例包括國際專利申請WO03/048304中鑒定的那些。
本發明的組合物還可以包括一種或多種來自肺炎鏈球菌的蛋白質。適于包括的肺炎鏈球菌蛋白質的實例包括國際專利申請WO02/083855中鑒定的那些以及國際專利申請WO02/053761中描述的那種。
本發明的組合物可以還包括一種或多種來自B型腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)的蛋白質。適于包括的B型腦膜炎奈瑟氏球菌蛋白質的實例包括國際專利申請WO03/063766、WO2004/094596、WO01/85772、WO02/16612和WO01/87939中鑒定的那些。
用于綴合的肺炎球菌血清型3多糖的活化 已有效地應用多糖中碳水化合物的部分氧化來產生醛基，然后使所述醛基與載體蛋白的賴氨酸殘基偶聯以產生免疫原性綴合物(即，用于在脊椎動物中刺激或誘發特異免疫反應的組合物，諸如疫苗)。在許多應用中，通用氧化劑高碘酸鈉提供了在與載體蛋白偶聯之前的多糖中碳水化合物的有效氧化。然而，用高碘酸鈉直接氧化Pn 3多糖可產生幾乎不存在殘余醛的降解的多糖。備選的氧化方案在二價陽離子(例如，Mg2+或Ca2+)的存在下混合高碘酸鈉，并且提供了Pn 3多糖的有效氧化。
表3應用高碘酸/MgCl2的Pn 3的氧化數據 ＊PP3天然的肺炎球菌多糖3型 ＊＊Meq摩爾當量 ＊＊＊DO氧化程度 為了降低粘稠度和相關過濾問題，首先應用溫和的酸使Pn 3多糖進行水解/解聚，所述酸諸如是乙酸、檸檬酸或碳酸。在水解/解聚后，應用控制量的氧化劑進行部分氧化以產生“活化的”Pn3多糖。可以使用將末端羥基氧化為醛的任何選擇性氧化劑，包括特異糖氧化酶(例如，高碘酸鈉或鉀，或高碘酸)。如上面所討論的那樣，優選的氧化劑是在二價陽離子存在下的高碘酸。然后任選地純化活化的Pn 3多糖(例如通過相對緩沖鹽水的滲濾)。
活化的Pn 3多糖可與載體蛋白混合。可以選擇載體蛋白以增加結合的Pn3多糖的免疫原性和/或以誘發針對載體蛋白的抗體，其是診斷、分析和/或治療有益的。將抗原分子(例如，多糖)與載體共價連接賦予增強的免疫原性和T-細胞依賴性(Pozsgay等人(1999)PNAS，965194-97；Lee等人(1976)J.Immunol.，1161711-18；Dintzis等人(1976)PNAS，733671-75)。如本文討論的那樣，有用的載體蛋白包括滅活的細菌毒素，諸如破傷風類毒素、百日咳類毒素、霍亂類毒素(例如，如國際專利申請WO2004/083251中所述)、大腸桿菌LT、大腸桿菌ST、和來自銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的外毒素A。也可以使用細菌外膜蛋白，諸如外膜復合體c、孔蛋白、轉鐵蛋白結合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A、肺炎球菌黏附素蛋白、來自A組或者B組鏈球菌的C5a肽酶、或者流感嗜血桿菌蛋白D。其他蛋白質，諸如卵白蛋白、匙孔血藍蛋白、牛血清白蛋白或者結核菌素的純化的蛋白質衍生物也可以用作載體蛋白。優選的載體蛋白是突變的白喉毒素CRM197。在與載體蛋白混合后，任選地冷凍(例如，滾動冷凍(shell frozen))和共凍干活化的Pn 3多糖/載體蛋白混合物。
通過使活化的Pn 3多糖/載體蛋白混合物與還原劑如氰基硼氫化鈉反應來進行綴合。然后通過硼氫化鈉還原來封閉未反應的醛。純化綴合物(例如，通過相對磷酸緩沖液滲濾，隨后相對緩沖鹽水滲濾)，得到在緩沖鹽水中的終批次濃度的糖綴合物。
上面的公開一般性描述了本發明。通過下面的特定實施例可以更完全地理解本發明。這些實施例僅僅用于闡明的目的并且不意在限定本發明的范圍。
實施例 實施例1 制備肺炎鏈球菌莢膜多糖血清型1 制備主細胞庫和工作細胞庫 從美國典型培養物保藏中心ATCC菌株6301得到肺炎鏈球菌血清型1。產生幾代種子原種以便擴大菌株和除去動物來源的組分(F1、F3和F3代)。產生兩個額外代的種子原種。從F3瓶得到第一額外的世代，從第一個額外世代瓶得到隨后的世代。冷凍保存(＜-70℃)種子瓶，用合成的甘油作為冷藏劑。除了冷凍瓶外，為F4代制備凍干的瓶。為了制備細胞庫，在基于大豆的培養基中培養所有培養物。冷凍前，通過離心濃縮細胞，除去用盡的培養基，將細胞沉淀物重懸浮在含有諸如合成甘油的冷藏劑的新鮮培養基中。
發酵和收獲 來自工作細胞庫的培養物用于接種含有基于大豆的培養基的種子瓶。將瓶子在36℃±2℃、不攪拌下溫育直到滿足生長要求。種子瓶用于接種含有基于大豆的培養基的種子發酵罐。用無菌碳酸鈉溶液保持約7.0的pH。達到目標光密度后，用種子發酵罐接種含有基于大豆的培養基的生產發酵罐。用無菌碳酸鈉溶液保持pH。生長停止后或者達到發酵罐的工作體積后終止發酵。向培養物加入合適量的無菌的12％脫氧膽酸鈉以裂解細菌細胞和釋放細胞相關的多糖。裂解后，冷卻發酵罐內容物。用乙酸調節裂解的培養液的pH到約pH6.6。通過連續流動離心接著深層過濾和0.45μm微量過濾澄清裂解物。
在一個備選方法中，用3N NaOH保持約7.0的發酵pH。達到目的光密度后，用種子發酵罐接種含有基于大豆的培養基的生產發酵罐。用3NNaOH保持pH。生長停止后或者達到發酵罐的工作體積后終止發酵。向培養物加入合適量的無菌的12％脫氧膽酸鈉在培養液中得到0.12％的濃度，以裂解細菌細胞和釋放細胞相關的多糖。裂解后，在7℃到13℃的溫度攪拌下，對發酵罐內容物保持8到24小時之間的時間間隔，以確保已經發生了完全的細胞裂解和多糖釋放。該保持期間的攪拌防止裂解沉積物沉淀在發酵罐壁和pH探頭上，從而允許保持pH探頭完整性。接著，將裂解的細胞培養液的pH用50％乙酸調節到約pH5.0。無攪拌下，在15℃到25℃的溫度下保持12到24小時之間的時間間隔后，顯著部分的之前溶解的蛋白質作為固體沉淀物從溶液析出，多糖幾乎沒有損失或者降解，其保持在溶液中。然后通過連續流動離心，接著通過深層過濾和0.45μm微量過濾澄清具有沉淀物的溶液。
純化 肺炎球菌多糖的純化由幾個濃縮/滲濾操作、沉淀/洗脫、柱層析和深層過濾步驟組成。除非另外指出，所有步驟都在室溫下進行。
將來自肺炎鏈球菌血清型1的發酵罐培養物的澄清的培養液濃縮并用100kDa MWCO(千道爾頓分子量截止)濾器滲濾。使用磷酸鈉緩沖液在中性pH下完成滲濾。滲濾從較高分子量的生物聚合物，諸如核酸、蛋白質和多糖除去了低分子量的培養基組分。
通過加入來自貯存液的十六烷基三甲基溴化銨(HB)以得到1％HB(w/v)的終濃度，從濃縮和滲濾的溶液沉淀多糖。在深層濾器上捕獲多糖/HB沉淀物并丟棄濾液。再溶解多糖沉淀物并通過含有沉淀物的深層濾器再循環氯化鈉溶液進行洗脫。然后用額外的氯化鈉溶液漂洗濾器。
向多糖溶液中加入來自NaI貯存液的碘化鈉(NaI)至終濃度0.5％以沉淀HB。通過深層過濾除去沉淀物。濾液含有目標多糖。用NaCI/NaI溶液漂洗沉淀容器和濾器并將漂洗液與部分純化的多糖溶液合并。丟棄濾器。然后通過0.2μm濾器過濾多糖。
將多糖溶液在30kDa MWCO超濾器上濃縮并用氯化鈉溶液滲濾。
通過浸漬活性炭的深層濾器過濾，進一步純化部分純化的多糖溶液。過濾后，用氯化鈉溶液漂洗碳濾器。將漂洗液與多糖溶液合并，然后將其通過0.2μm濾器過濾。
將多糖溶液在30kDa MWCO超濾器上濃縮并用1M磷酸鈉緩沖液調節以達到0.025M終濃度的磷酸鈉。檢查pH并調節到7.0±0.2。
用含有氯化鈉的磷酸鈉緩沖液平衡陶瓷羥基磷灰石(HA)柱，以得到合適的電導率(＜15μS)。然后將多糖溶液裝載到柱子上。在這些條件下，雜質結合到樹脂并且從柱子的穿過液回收多糖。多糖溶液通過位于柱子之前和之后的0.2μm線內濾器過濾。
使用30kDa MWCO濾器濃縮多糖溶液。然后用注射用水(WFI)滲濾濃縮液。
將滲濾的多糖溶液通過0.2μm濾膜過濾到聚丙烯瓶中。取出樣品用于釋放測試(release testing)并將純化的多糖在-25°±5℃冷凍保藏。
描述特征 通過指定給多糖分子的質子的信號的分配，1H-NMR數據與化學結構相一致。1H-NMR譜顯示一系列分辨率良好的信號(來自甲基的質子)，其用以定量多糖中的O-乙酰基官能團。
使用特異性抗血清，通過對流免疫電泳證實單價多糖的身份。
連接折射率和多角度激光散射(MALLS)檢測器的高效凝膠過濾層析與樣品濃度結合使用以計算分子量。
用大小排阻層析介質(CL-4B)描繪多糖的相對分子大小分布。
實施例2 制備血清型1肺炎球菌糖-CRM197綴合物 活化和綴合 將純化的多糖的容器解凍并在反應容器中合并。向容器中加入pH9.0的0.2M碳酸鈉用于在50℃部分脫乙酰化(水解)3小時。將反應物冷卻到20℃并通過0.2M乙酸進行中和。通過在2-8℃溫育，在高碘酸鈉存在下進行氧化，并攪拌混合物15-21小時。
濃縮活化反應混合物并使用30K MWCO膜用0.9％NaCl滲濾10次。將存留物用0.2μm濾器過濾。將活化的糖裝入100mL玻璃凍干瓶中并在-75℃滾動冷凍并凍干。
“滾動冷凍”(Shell-freezing)是一種制備用于凍干(冷凍干燥)的樣品的方法。在含有醇或任何其他合適的液體的冷凍浴中通過電機驅動的滾筒自動滾動燒瓶。在瓶的內部“殼”周圍均勻冷凍產物的薄涂層，允許在每次冷凍干燥運行期間安全地處理更大體積的物質。這些自動化的冷凍的單位一次提供了簡單和有效的預先冷凍許多燒瓶的方法，在內部產生所希望的涂層，并為有效的冷凍干燥提供了足夠的表面積。
將凍干物質的瓶子恢復到室溫并以2∶1的糖/蛋白質比重懸浮于CRM197溶液中。向該糖/蛋白質混合物中加入1M磷酸鈉緩沖液至最終0.2M離子強度和7.5的pH，然后加入氰基硼氫化鈉。反應物在23℃溫育18小時，接著在37℃再次溫育72小時。氰基硼氫化物溫育后，用冷的鹽水稀釋反應混合物，接著加入1M碳酸鈉以調節反應混合物到pH9.0。通過加入硼氫化鈉，在23℃溫育3-6小時淬滅未反應的醛。
將反應混合物用鹽水稀釋2倍并通過0.45-5μm預過濾器轉移到存留物容器中。用0.15M磷酸鹽緩沖液(pH6)滲濾反應混合物30次，用鹽水滲濾20次。通過0.2μm濾器過濾存留物。
將綴合物溶液用0.9％鹽水稀釋到0.5mg/mL的目標，然后在Class 100通風廚中無菌過濾到最終體相濃縮物(FBC)容器中。綴合物在2-8℃保存。
描述特征 用大小排阻層析介質(CL-4B)描繪綴合物的相對分子大小分布。
使用特異抗血清通過狹線印跡測定法證實綴合物的身份。
分別通過糖醛酸和Lowry測定法測定糖和蛋白質濃度。通過下面的計算得到共價結合的綴合物復合體中糖對蛋白質的比率
通過Hestrin方法(Hestrin等人，J.Biol.Chem.1949，180，p.249)測量O-乙酰基含量。O-乙酰基濃度與總的糖濃度的比率得到微摩爾O-乙酰基/mg糖。
實施例3 制備肺炎鏈球菌莢膜多糖血清型3 制備主細胞庫和工作細胞庫 肺炎鏈球菌血清型3從Robert Austrian博士(University ofPennsylvania，Philadelphia，Pennsylvania)得到。細胞庫系統的制備見實施例1。
發酵和收獲 來自工作細胞庫的培養物用于接種含有基于大豆的培養基的種子瓶。將瓶子在36℃±2℃無攪拌下溫育，直到滿足生長需要。用種子瓶接種含有基于大豆的培養基的種子發酵罐。用無菌碳酸鈉溶液保持pH約7.0。達到目標光密度后，用種子發酵罐接種中間種子發酵罐。達到目標光密度后，用中間種子發酵罐接種生產發酵罐。用無菌碳酸鈉溶液保持pH。達到發酵罐的工作體積后終止發酵。向培養物中加入合適量的無菌12％脫氧膽酸鈉以裂解細菌細胞和釋放細胞相關的多糖。裂解后，冷卻發酵罐內容物。用乙酸調節裂解的培養液的pH到約pH6.6。通過連續流動離心接著深層過濾和0.45μm微量過濾澄清裂解物。
純化 肺炎球菌多糖的純化由幾個濃縮/滲濾操作、沉淀/洗脫、柱層析和深層過濾步驟組成。除非另外指出，所有步驟都在室溫下進行。
將來自肺炎鏈球菌血清型3的發酵罐培養物的澄清的培養液濃縮并用100kDa MWCO濾器滲濾。使用磷酸鈉緩沖液在中性pH下完成滲濾。滲濾從較高分子量的生物聚合物，諸如核酸、蛋白質和多糖除去了低分子量的培養基組分。
加入十六烷基三甲基溴化銨(HB)前，向濃縮并滲濾的多糖溶液中加入計算體積的NaCl貯存液以得到0.25M NaCl的終濃度。然后通過加入來自貯存液的HB得到1％HB(w/v)的終濃度來沉淀多糖。在深層濾器上捕獲多糖/HB沉淀物并丟棄濾液。再溶解多糖沉淀物并通過含有沉淀物的深層濾器再循環氯化鈉溶液進行洗脫。然后用額外的氯化鈉溶液漂洗濾器。
向多糖溶液中加入來自NaI貯存液的碘化鈉(NaI)至終濃度0.5％以沉淀HB。通過深層過濾除去沉淀物。濾液含有目標多糖。用NaCI/NaI溶液漂洗沉淀容器和濾器并將漂洗液與部分純化的多糖溶液合并。丟棄濾器。然后通過0.2μm濾器過濾多糖。
將多糖溶液在30kDa MWCO超濾器上濃縮并用氯化鈉溶液滲濾。
通過浸漬活性炭的深層濾器過濾，進一步純化部分純化的多糖溶液。過濾后，用氯化鈉溶液漂洗碳濾器。將漂洗液與多糖溶液合并，然后將其通過0.2μm濾器過濾。
將多糖溶液在30kDa MWCO超濾膜上濃縮并用1M磷酸鈉緩沖液調節以實現0.025M終濃度的磷酸鈉。檢查pH并調節到7.0±0.2。
用含有氯化鈉的磷酸鈉緩沖液平衡陶瓷羥基磷灰石(HA)柱，以得到合適的電導率(15μS)。然后將多糖溶液裝載到柱子上。在這些條件下，雜質結合到樹脂并且從柱子的穿過液回收多糖。用緩沖液穿過柱子沖洗多糖并通過0.2μm濾器過濾。
使用30kDa MWCO濾器濃縮多糖溶液。然后用WFI滲濾濃縮液。
將滲濾的多糖溶液通過0.2μm濾膜過濾到不銹鋼容器中。取出樣品用于釋放測試并將純化的多糖在-25°±5℃冷凍保藏。
描述特征 通過指定給多糖分子的質子的信號的分配，1H-NMR數據與化學結構相一致。
使用特異性抗血清，通過對流免疫電泳證實單價多糖的身份。
連接折射率和多角度激光散射(MALLS)檢測器的高效凝膠過濾層析與樣品濃度結合使用以計算分子量。
用大小排阻層析介質(CL-4B)描繪多糖的相對分子大小分布。
實施例4 血清型3肺炎球菌糖-CRM197綴合物的制備 活化和綴合 將純化的血清型3糖的容器解凍并在反應容器中合并。向該容器中加入WFI和2M乙酸至終濃度0.2M和2mg/ml糖。將溶液的溫度升高到85℃1小時以水解多糖。冷卻反應物到≤25℃并加入1M氯化鎂至終濃度0.1M。通過在23℃溫育16-24小時，在高碘酸鈉存在下進行氧化。
濃縮活化反應混合物，并使用100K MWCO膜，用WFI滲濾10次。通過0.2-μm濾器過濾存留物。
為了配制，向活化的糖中加入0.2M磷酸鈉(pH7.0)至10mM終濃度和6.0-6.5的pH。將CRM197載體蛋白與糖溶液混合至2g糖/1g CRM197的比率。將合并的糖/蛋白質溶液裝入100mL玻璃凍干瓶中，目標填充為50mL，在-75℃滾動冷凍，并凍干。
使共同凍干的糖/蛋白質物質瓶恢復室溫，并重懸浮在0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7.0)中至20mg/mL的最終糖濃度。調節pH到6.5，然后加入0.5摩爾當量的氰基硼氫化鈉。在37℃溫育反應物48小時。氰基硼氫化物溫育后，用冷的5mM琥珀酸鹽/0.9％鹽水緩沖液稀釋反應混合物。通過加入硼氫化鈉并在23℃溫育3-6小時淬滅未反應的醛。通過0.45-5μm預過濾器轉移反應混合物到存留物容器中。
用0.1M磷酸鹽緩沖液(pH9)滲濾反應混合物30次，用0.15M磷酸鹽緩沖液(pH6)滲濾反應混合物20次，用5mM琥珀酸鹽/0.9％鹽水滲濾反應混合物20次。通過0.2-μm濾器過濾存留物。
將綴合物溶液稀釋到0.5mg/mL的糖靶標，然后在Class 100通風廚中無菌過濾到FBC容器中。在2-8℃保存綴合物。
描述特征 用大小排阻層析介質(CL-4B)描繪綴合物的相對分子大小分布。
使用特異抗血清通過狹線印跡測定法證實綴合物的身份。
分別通過蒽酮測定法和Lowry測定法測定糖和蛋白質濃度。通過下面的計算得到共價結合的綴合物復合體中糖對蛋白質的比率
實施例5 制備肺炎鏈球菌莢膜多糖血清型5 肺炎鏈球菌血清型5從Gerald Schiffman博士(State University ofNew York，Brooklyn，New York)得到。細胞庫系統的制備見實施例1。發酵、收獲、多糖的純化和表征見實施例1。
備選的發酵方法 來自工作細胞庫的培養物用于接種含有基于大豆的培養基和10mM無菌NaHCO3溶液的種子瓶。將瓶子在36℃±2℃無攪拌下溫育直到滿足生長要求。用種子瓶接種含有基于大豆的培養基和10mM無菌NaHCO3溶液的種子發酵罐。用3N NaOH保持pH約7.0。達到目標光密度后，用種子發酵罐接種含有10mM NaHCO3濃度的基于大豆的培養基的生產發酵罐。用3N NaOH保持pH。生長停止后或者達到發酵罐的工作體積時停止發酵。向培養物中加入合適量的無菌12％脫氧膽酸鈉得到培養液中0.12％的濃度，以裂解細菌細胞和釋放細胞相關的多糖。裂解后，攪拌下，在7℃到13℃的溫度之間保持發酵罐內容物8到24小時之間的時間間隔，以確保已經發生了完全細胞裂解和多糖釋放。該保持期間的攪拌防止裂解沉積物沉淀在發酵罐壁和pH探頭上，從而允許保持pH探頭完整性。接著，將裂解的細胞培養液的pH用50％乙酸調節到約pH4.5。無攪拌下，在15℃到25℃的溫度下保持12到24小時的時間間隔后，顯著部分的以前溶解的蛋白質作為固體沉淀物從溶液析出，多糖幾乎沒有損失或者降解，其保持在溶液中。然后通過連續流動離心，接著通過深層過濾和0.45μm微量過濾澄清具有沉淀物的溶液。
實施例6 制備血清型5肺炎球菌糖-CRM197綴合物 活化和綴合 將血清型5糖的容器解凍并在反應容器中合并。向該容器中加入0.1M乙酸鈉(pH4.7)，接著在高碘酸鈉存在下通過在23℃溫育16-22小時進行氧化。
濃縮活化反應混合物，并使用100K MWCO膜，用WFI滲濾10次。通過0.2μm濾器過濾存留物。
將血清型5活化的糖與CRM197以0.8∶1的比例合并。將合并的糖/蛋白質溶液裝入100mL玻璃凍干瓶(50mL目標填充)中并在-75℃滾動冷凍，并共同凍干。
讓共同凍干的物質的瓶子恢復到室溫并重懸浮在0.1M磷酸鈉(pH7.5)中，加入氰基硼氫化鈉。反應物在30℃溫育72小時，接著再次加入氰基硼氫化物并在30℃溫育20-28小時。
氰基硼氫化鈉溫育后，用鹽水稀釋反應混合物2倍并通過0.45-5μm預過濾器轉移到存留物容器中。將反應混合物用0.01M磷酸鹽緩沖液(pH8)滲濾30次，用0.15M磷酸鹽緩沖液(pH6)滲濾20次，并用鹽水滲濾20次。通過0.2μm濾器過濾存留物。
將綴合物溶液稀釋到0.5mg/mL的糖靶標，然后在Class 100通風廚中無菌過濾到FBC容器中。在2-8℃保存綴合物。
綴合物的表征見實施例2。
實施例7 制備肺炎鏈球菌莢膜多糖血清型6A 從Gerald Schiffman博士(State University of New York，Brooklyn，New York)得到肺炎鏈球菌血清型6A。細胞庫系統的制備見實施例1。發酵、收獲和多糖的純化見實施例1，只是在純化期間，在層析步驟前的30kDa MWCO濃縮步驟被省略。
實施例8 制備血清型6A肺炎球菌糖-CRM197綴合物 活化和綴合 血清型6A多糖是高分子量聚合物，其必須在氧化前減小大小。解凍血清型6A糖的容器并在反應容器中合并。向容器中加入2M乙酸至0.1M的終濃度，用于在60℃水解1.5小時。將反應物冷卻到23℃并通過用1MNaOH調節反應混合物至pH6進行中和。在高碘酸鈉存在下，通過在23℃溫育14-22小時進行氧化。
濃縮活化反應混合物并使用100K MWCO膜用WFI滲濾10次。通過0.2μm濾器過濾存留物。
將血清型6A與蔗糖混合并填充到100mL玻璃凍干瓶(50mL目標填充)并在-75℃滾動冷凍并凍干。
將凍干物質的瓶子恢復到室溫并以1∶1的糖/蛋白質比率重懸浮在二甲亞砜(DMSO)中。加入氰基硼氫化鈉后，在23℃溫育反應混合物18小時。氰基硼氫化物溫育后，用冷鹽水稀釋反應混合物。通過加入硼氫化鈉，通過在23℃溫育3-20小時淬滅未反應的醛。
通過5μm預過濾器將稀釋的反應混合物轉移到存留物容器中。將反應混合物用0.9％NaCl滲濾10次，用琥珀酸鹽緩沖的NaCl滲濾30次。通過0.2μm濾器過濾存留物。
將綴合物溶液稀釋到0.5mg/mL的糖目標，然后在Class 100通風廚中無菌過濾到FBC容器中。在2-8℃保存綴合物。
綴合物的表征見實施例2。
實施例9 制備肺炎鏈球菌莢膜多糖血清型7F 肺炎鏈球菌血清型7F從Gerald Schiffman博士(State University ofNew York，Brooklyn，New York)得到。細胞庫系統的制備和發酵和多糖的收獲見實施例3。關于備選的發酵和收獲方法，見實施例1中描述的備選方法。
純化 肺炎球菌多糖的純化由幾個濃縮/滲濾操作、沉淀/洗脫、柱層析和深層過濾步驟組成。除非另外指出，所有步驟都在室溫下進行。
將來自肺炎鏈球菌血清型7F的發酵罐培養物的澄清的培養液濃縮并用100kDa MWCO濾器滲濾。使用磷酸鈉緩沖液在中性pH下完成滲濾。滲濾從較高分子量的生物聚合物，諸如核酸、蛋白質和多糖除去了低分子量的培養基組分。
血清型7F不與HB形成沉淀。而是，通過加入來自貯存液的HB至1％HB的終濃度從濃縮并滲濾的溶液沉淀雜質。在深層濾器上捕獲沉淀物并丟棄濾器。多糖包含在濾液中。
向多糖溶液中加入來自NaI貯存液的碘化鈉(NaI)至終濃度0.5％以沉淀HB。通過深層過濾除去沉淀物。濾液含有目標多糖。用NaCI/NaI溶液漂洗沉淀容器和濾器并將漂洗液與部分純化的多糖溶液合并。丟棄濾器。然后通過0.2μm濾器過濾多糖。
將多糖溶液在30kDa MWCO超濾器上濃縮并用氯化鈉溶液滲濾。
通過浸漬活性炭的深層濾器過濾，進一步純化部分純化的多糖溶液。過濾后，用氯化鈉溶液漂洗碳濾器。將漂洗液與多糖溶液合并，然后將其通過0.2μm濾器過濾。
將多糖溶液在30kDa MWCO超濾器上濃縮并用1M磷酸鈉緩沖液調節以達到0.025M終濃度的磷酸鈉。檢查pH并調節到7.0±0.2。
用含有氯化鈉的磷酸鈉緩沖液平衡陶瓷羥基磷灰石(HA)柱，以得到合適的電導率(15μS)。然后將多糖溶液裝載到柱子上。在這些條件下，雜質結合到樹脂并且從柱子的穿過液回收多糖。用緩沖液穿過柱子沖洗多糖并通過0.2μm濾器過濾。
使用30kDa MWCO濾器濃縮多糖溶液。然后用WFI滲濾濃縮液。
將滲濾的多糖溶液通過0.2μm濾膜過濾到不銹鋼容器中。取出樣品用于釋放測試并將純化的多糖在2°-8℃冷凍保藏。
多糖的表征見實施例3。
實施例10 制備血清型7F肺炎球菌糖-CRM197綴合物 活化和綴合 通過在23℃溫育16-24小時，在高碘酸鈉存在下進行氧化。
濃縮活化反應混合物并使用100K MWCO膜，用10mM NaOAc(pH4.5)滲濾10次。通過0.2μm濾器過濾存留物。
將血清型7F填充到100mL玻璃凍干瓶(50ml目標填充)，在-75℃滾動冷凍并凍干。
將凍干的血清型7F和CRM197的瓶子恢復室溫并以1.5∶1的糖/蛋白質比例重懸浮在DMSO中。加入氰基硼氫化鈉后，在23℃溫育反應物8-10小時。通過加入硼氫化鈉，在23℃溫育16小時淬滅未反應的醛。
將反應混合物用冷鹽水稀釋10倍，并通過5μm預過濾器轉移到存留物容器中。將反應混合物用0.9％鹽水滲濾10次并用琥珀酸緩沖的鹽水滲濾30次。通過0.2μm濾器過濾存留物。
將綴合物溶液用0.9％鹽水稀釋到0.5mg/mL的糖目標，然后在Class100通風廚中無菌過濾到FBC容器中。在2-8℃保存綴合物。
綴合物的表征見實施例4。
實施例11 制備肺炎鏈球菌莢膜多糖血清型19A 從Gerald Schiffman博士(State University of New York，Brooklyn，New York)得到肺炎鏈球菌血清型19A。關于制備細胞庫系統，見實施例1。多糖的發酵、收獲和純化見實施例7。表征見實施例3。
實施例12 血清型19A肺炎球菌糖-CRM197綴合物的制備 活化和綴合 將血清型19A糖的容器解凍并在反應容器中合并。加入乙酸鈉至10mM(pH5.0)并在高碘酸鈉存在下通過在23℃溫育16-24小時進行氧化。
濃縮活化反應混合物并使用100K MWCO膜，用10mM乙酸鹽(pH5.0)滲濾10次。通過0.2μm濾器過濾存留物。
用蔗糖混合活化的糖接著加入CRM197。將血清型19A活化的糖和CRM197混合物(0.8∶1比例)填充到100ml玻璃凍干瓶(50mL目標填充)并在-75℃滾動冷凍并凍干。
將凍干物質的瓶子恢復到室溫并重懸浮在DMSO中。向糖/蛋白質混合物中加入氰基硼氫化鈉(100mg/ml)。將反應物在23℃溫育15小時。氰基硼氫化物溫育后，通過加入硼氫化鈉，在23℃溫育3-20小時淬滅未反應的醛。
將反應混合物用冷鹽水稀釋10倍并通過5μm預過濾器轉移到存留物容器中。將反應混合物用0.9％NaCl滲濾10次，0.45μm過濾，并用5mM琥珀酸鹽/0.9％NaCl緩沖液(pH6)滲濾30次。通過0.2μm濾器過濾存留物。
用5mM琥珀酸鹽/0.9％鹽水將綴合物溶液稀釋到0.5mg/mL的靶標，然后在Class 100通風廚中無菌過濾到FBC容器中。在2-8℃保存綴合物。
綴合物的表征見實施例4。
實施例13 制備肺炎鏈球菌莢膜多糖血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F 制備肺炎鏈球菌種子培養物 從Gerald Schiffman博士(State University of New York，Brooklyn，New York)得到肺炎鏈球菌血清型4、6B、9V、18C、19F和23F。肺炎鏈球菌血清型14從ATCC菌株6314得到。
單獨地將一瓶每種希望的血清型的肺炎鏈球菌用于開始發酵批次。用碳酸鈉將含有基于大豆的培養基和酚紅的兩瓶調節到7.4±0.2的pH范圍，然后向瓶中加入所需體積的50％右旋糖/1％硫酸鎂溶液。將兩個瓶子接種不同量的種子。瓶子在36℃±2℃培育直到培養基變成黃色。培育后，從每個瓶子移出樣品，并測試光密度(OD)(0.3到0.9)和pH(4.6到5.5)。選擇兩個瓶子之一用于接種種子發酵罐。
將基于大豆的培養基轉移到種子發酵罐并消毒。然后向發酵罐中加入一體積的50％右旋糖/1％硫酸鎂溶液。監視并控制種子發酵罐的pH(pH6.7到7.4)和攪拌。溫度保持在36℃±2℃。種子接種物(瓶)無菌連接到種子發酵罐并轉移接種物。保持發酵罐處于pH控制下并定期取出樣品并測試OD和pH。當在600nm達到所需的OD0.5時，用來自種子發酵罐的發酵液接種中間發酵罐。
將基于大豆的培養基轉移到中間發酵罐并消毒。然后向發酵罐加入一體積的50％右旋糖/1％硫酸鎂溶液。監視并控制中間發酵罐的pH(pH6.7到7.4)和攪拌。溫度保持在36℃±2℃。將種子發酵罐的內含物轉移到中間發酵罐中。保持發酵罐處于pH控制下并定期取出樣品并測試OD和pH。當在600nm達到所需的OD0.5時，用來自中間發酵罐的發酵液接種生產發酵罐。
將基于大豆的培養基轉移到生產發酵罐并消毒。然后向發酵罐加入一體積的50％右旋糖/1％硫酸鎂溶液。監視并控制生產發酵罐的pH(pH6.7到7.4)和攪拌。溫度保持在36℃±2℃。保持發酵罐處于pH控制下并定期取出樣品并測試OD和pH，直到發酵完成。
向發酵罐中加入脫氧膽酸鈉至約0.12％w/v的終濃度。將培養物混合最少30分鐘并將溫度設置點降低至10℃。過夜溫育培養物并且證實失活后，根據需要，用50％乙酸調節培養物的pH到6.4至6.8。升高發酵罐的溫度至20°±5℃并將內含物轉移到澄清保持槽中。
通過以每小時25到600升的流速離心處理澄清保持槽的內含物(包括細胞殘渣)(血清型4除外，其中丟棄細胞殘渣并將流速固定到25到250升/小時)。取出上清液的樣品并測試OD。在離心期間期望的OD為≤0.15。
最初，通過深層濾器裝置再循環上清液，直到達到0.05±0.03的OD。然后，上清液穿過深層濾器裝置并且通過0.45μm濾膜以過濾濾液保持槽。
隨后，產物通過閉管轉移到純化區用于處理。
所有上面的操作(離心、過濾和轉移)都在10℃到30℃之間進行。
關于血清型4和6B的備選發酵和收獲方法，見實施例1中描述的備選方法。
純化 每種肺炎球菌多糖的純化由幾個濃縮/滲濾操作、沉淀/洗脫、柱層析和深層過濾步驟組成。除非另外指出，所有步驟都在室溫下進行。
將來自所希望的肺炎鏈球菌血清型的發酵罐培養物的澄清的培養液濃縮并用100kDa MWCO濾器滲濾。使用磷酸鈉緩沖液在pH＜9.0下完成滲濾。滲濾從較高分子量的生物聚合物，諸如核酸、蛋白質和多糖除去了低分子量的培養基組分。
通過加入來自貯存液的HB得到1％HB(w/v)的終濃度(血清型23F除外，其具有2.5％的終濃度)，以從濃縮并滲濾的溶液沉淀多糖。在深層濾器上捕獲多糖/HB沉淀物并丟棄濾液(注意血清型14不沉淀；因此保留濾液)。再溶解多糖沉淀物并通過含有沉淀物的深層濾器再循環氯化鈉溶液進行洗脫。然后用額外的氯化鈉溶液漂洗濾器。
向多糖溶液中加入來自NaI貯存液的碘化鈉(NaI)至終濃度0.5％以沉淀HB(血清型6B除外，其具有0.25％的終濃度)。通過深層過濾除去沉淀物。濾液含有目標多糖。丟棄濾器。然后通過0.2μm濾器過濾多糖。
將多糖溶液在30kDa MWCO超濾膜上濃縮并用氯化鈉溶液滲濾。
通過浸漬活性炭的深層濾器過濾，進一步純化部分純化的多糖溶液。過濾后，用氯化鈉溶液漂洗碳濾器。將漂洗液與多糖溶液合并，然后將其通過0.2μm濾器過濾。
將多糖溶液在30kDa MWCO超濾膜上濃縮并用氯化鈉溶液漂洗濾器。檢查pH并調節到7.0±0.3。
用含有氯化鈉的磷酸鈉緩沖液平衡陶瓷羥基磷灰石(HA)柱，直到pH為7.0±0.3并且電導率為26±4μS。然后將多糖溶液裝載到柱子上。在這些條件下，雜質結合到樹脂并且從柱子的穿過液回收多糖。多糖溶液通過0.2μm濾器過濾。
使用30kDa MWCO濾器濃縮多糖溶液。然后用WFI滲濾濃縮液直到電導率＜15μS。
將滲濾的多糖溶液通過0.2μm濾膜過濾到主體容器(bulk container)中并在2-8℃保存。
實施例14 制備用于血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的肺炎球菌糖-CRM197綴合物 活化方法 不同的血清型糖按照不同的途徑用于活化(活化前水解或者不水解)和綴合(水性或者DMSO反應)，如該實施例所述。
將多糖從主體容器轉移到反應器容器中。然后用WFI和磷酸鈉稀釋多糖至1.6-2.4mg/mL的終濃度范圍。
步驟1 對于血清型6B、9V、14、19F和23F，調節pH至pH6.0±0.3。
對于血清型4，加入鹽酸(0.01M最終酸濃度)并在45°±2℃下溫育25-35分鐘。通過冷卻到21-25℃并加入1M磷酸鈉至目標pH6.7±0.2終止水解。進行過程中測試以證實合適水平的脫丙酮酸化(depyruvylation)。
對于血清型18C，加入冰乙酸(0.2M最終酸濃度)并在94°±2℃下溫育溶液205-215分鐘。然后降低溫度至21-25℃并加入1-2M磷酸鈉至目標pH6.8±0.2。
步驟2高碘酸鹽反應 使用總的糖含量(除了血清型4之外)確定肺炎球菌糖活化所需的高碘酸鈉摩爾當量。對于血清型4，使用每摩爾糖0.8-1.2摩爾高碘酸鈉的比例。通過充分混合，對于除了19F的所有血清型，讓氧化反應在21-25℃下進行16到20小時，對于19F的氧化反應溫度≤15℃。
步驟3超濾 濃縮氧化的糖并在100kDa MWCO超濾器(對于18C使用5kDa超濾器)上用WFI(對于血清型19F使用0.01M磷酸鈉緩沖液pH6.0)滲濾。丟棄滲透液并通過0.22μm濾器過濾存留物。
步驟4凍干 對于血清型4、9V和14，將濃縮的糖與CRM197載體蛋白混合，裝入玻璃瓶中，滾動冷凍并在≤-65℃保存。凍干冷凍濃縮的糖-CRM197并在-25°±5℃保存。
對于血清型6B、19F和23F，加入特定量的蔗糖，所述量經計算為在綴合反應混合物中達到5％±3％的蔗糖濃度。血清型18C不需要添加蔗糖。然后將濃縮的糖裝入玻璃瓶中，滾動冷凍并在≤-65℃保存。凍干冷凍濃縮的糖并在-25°±5℃保存。
綴合方法 使用兩種綴合方法水性綴合用于血清型4、9V、14和18C，DMSO綴合用于血清型6B、19F和23F。
水性綴合 步驟1溶解 對于血清型4、9V和14，解凍凍干的活化的糖-CRM197混合物并在室溫平衡。然后以特定比例用0.1M磷酸鈉緩沖液重構凍干的活化的糖-CRM197 ·對于血清型4和9V，每16-24g糖1L緩沖液 ·對于血清型14，每6-10g糖1L緩沖液 對于血清型9V，在37°±2℃溫育反應混合物直到完全溶解，對于血清型4和14，在23°±2℃溫育反應混合物直到完全溶解。
對于血清型18C，在CRM197于1M磷酸氫二鈉的溶液中以每1LCRM197溶液0.11L磷酸鈉的典型比例重構凍干的糖。在23°±2℃溫育反應混合物(8-12g/L糖濃度)直到完全溶解。
在該階段檢測pH作為過程中控制。
步驟2綴合反應 對于血清型4和9V，通過加入氰基硼氫化鈉溶液(100mg/mL)以達到每摩爾糖1.0-1.4摩爾氰基硼氫化鈉，啟動綴合反應。在37°±2℃溫育反應混合物44-52小時。然后降低溫度至23°±2℃并向反應器中加入0.9％氯化鈉。加入硼氫化鈉溶液(100mg/mL)以達到每摩爾糖1.8-2.2摩爾當量的硼氫化鈉。在23°±2℃溫育混合物3-6小時。用0.9％氯化鈉稀釋混合物并漂洗反應器。使用1.2μm預過濾器將稀釋的綴合混合物過濾到儲存容器中。
對于血清型14和18C，通過加入氰基硼氫化物溶液(100mg/mL)以達到每摩爾糖1.0-1.4摩爾氰基硼氫化鈉，啟動綴合反應。在23°±2℃溫育反應混合物12-24小時。然后升高溫度至37°±2℃并將反應物溫育72-96小時。然后降低溫度至23°±2℃并向反應器中加入0.9％氯化鈉。加入硼氫化鈉溶液(100mg/mL)以達到每摩爾糖1.8-2.2摩爾當量的硼氫化鈉。在23°±2℃溫育混合物3-6小時。用0.9％氯化鈉稀釋混合物并漂洗反應器。使用1.2μm預過濾器將稀釋的綴合混合物過濾到儲存容器中。
步驟3超濾100kDa 濃縮稀釋的綴合混合物并使用最小15體積(血清型4)或者40體積(血清型9V、14和18C)的0.9％氯化鈉在100kDa MWCO超濾器上滲濾。
丟棄滲透液。
對于血清型4，通過0.45μm濾器過濾存留物。
在該步驟進行過程中控制(糖含量)。
步驟4HA柱純化 該步驟僅對于血清型4綴合物進行。
首先用0.5M磷酸鈉緩沖液中和HA柱(pH7.0±0.3)，然后用0.9％氯化鈉平衡。將過濾的存留物(血清型4)以1.0L/分鐘的流速加到柱上。用0.9％氯化鈉以≤2.0L/分鐘流速洗滌柱子。然后用0.5M磷酸鈉緩沖液以≤2.0L/分鐘流速洗脫產物。
然后濃縮HA級分并用最小20體積的0.9％氯化鈉在100kDa MWCO膜上滲濾。丟棄滲濾液。
步驟5過濾除菌 100kDa MWCO滲濾后的存留物通過0.22μm濾器過濾。對過濾的產物進行過程中控制(糖含量，游離蛋白質，游離糖和氰化物)。對過濾的存留物進行過程中控制以確定是否需要額外的濃縮、滲濾和/或稀釋以滿足FBC靶標。用FBC樣品重復這些和額外的測試。
如需要，用0.9％氯化鈉稀釋過濾的綴合物以便達到小于0.55g/L的終濃度。在該階段進行糖含量、蛋白質含量和糖蛋白質比例的釋放測試。
最后，過濾綴合物(0.22μm)并以2.64g/罐的典型量裝入10L不銹鋼罐中。在該階段，進行產率、糖含量、蛋白質含量、pH、糖蛋白質比例和賴氨酸含量作為過程中控制。在該階段進行釋放測試(外觀、游離蛋白質、游離糖、內毒素、分子大小測定、殘留氰化物、糖鑒定、CRM197鑒定)。
DMSO綴合 步驟I溶解 將凍干活化的糖血清型6B、19F、23F和凍干的CRM197載體蛋白在室溫平衡并在DMSO中重構。稀釋濃度通常為2-3g糖(2-2.5g蛋白質)/升DMSO。
步驟II綴合反應 將活化的糖和CRM197載體蛋白在23°±2℃以0.6g-1.0g糖/gCRM197(對于血清型6B和19F)或者1.2到1.8g糖/gCRM197(對于血清型23F)的比例范圍混合60-75分鐘。
通過以0.8-1.2摩爾當量的氰基硼氫化鈉對1摩爾活化糖的比例加入氰基硼氫化鈉溶液(100mg/ml)啟動綴合反應。向反應混合物加入WIF至1％(v/v)的目標并在23°±2℃溫育混合物40小時以上。
向反應物中加入硼氫化鈉溶液100mg/mL(通常每摩爾活化糖1.8-2.2摩爾當量硼氫化鈉)和WFI(目標5％v/v)并在23°±2℃溫育混合物3-6小時。該步驟還原糖上存在的任何未反應的醛。然后在＜15℃將反應混合物轉移到含有0.9％氯化鈉的稀釋罐中。
步驟III100kDa超濾 將稀釋的綴合物混合物通過1.2μm濾器過濾并濃縮，并在100kDaMWCO膜上用最少15體積的0.9％氯化鈉滲濾(0.01M磷酸鈉/0.05M NaCl緩沖液用于血清型23F)。丟棄滲透液。通過0.45μm濾器過濾存留物。在該階段取過程中糖含量樣品。
步驟IVDEAE柱純化 該步驟僅對血清型23F進行。
用0.01M磷酸鈉/0.05M氯化鈉緩沖液平衡DEAE柱。將過濾的存留物(血清型23F)裝載到柱上并用0.01M磷酸鈉/0.05M氯化鈉緩沖液洗滌。用0.01M磷酸鈉/0.9％NaCl緩沖液洗滌柱子。然后用0.01M磷酸鈉/0.5M氯化鈉緩沖液洗脫產物。
步驟V100kDa超濾 濃縮來自6B和19F的存留物并用至少30體積的0.9％氯化鈉滲濾。丟棄滲透液。
濃縮來自血清型23F的洗脫物并用最少20體積的0.9％氯化鈉滲濾。丟棄滲透液。
步驟VI過濾除菌 100kDa MWCO滲濾后的存留物通過0.22μm濾器過濾。對過濾的產物進行過程中控制(糖含量、游離蛋白質、游離糖、殘留DMSO和殘留的氰化物)。對過濾的存留物進行過程中控制以確定是否需要額外的濃縮、滲濾和/或稀釋以滿足FBC目標。用FBC樣品重復這些和額外的測試。
如需要，用0.9％氯化鈉稀釋過濾的綴合物以便達到小于0.55g/L的終濃度。在該階段進行糖含量、蛋白質含量和糖蛋白質比例的釋放測試。
最后，過濾綴合物(0.22μm)并以2.64g/罐的量裝入10L不銹鋼罐中。在該階段，進行產率、糖含量、蛋白質含量、pH、糖蛋白質比例和賴氨酸含量作為過程中控制。在該階段進行釋放測試(外觀、游離蛋白質、游離糖、內毒素、分子大小測定、殘留氰化物、殘留DMSO、糖鑒定、和CRM197鑒定)。
實施例15 多價肺炎球菌綴合物疫苗的配制 13種綴合物的最終本體(bulk)濃縮物含有0.85％氯化鈉。3、6A、7F和19A型本體濃縮物也含有5mM pH5.8的琥珀酸鈉緩沖劑。基于批體積和本體糖濃度計算本體濃縮物的所需體積。向貼標簽前的制劑容器加入80％的0.85％氯化鈉(生理鹽水)和所需量的琥珀酸鹽緩沖液后，加入本體濃縮物。然后使用Millipore Durapore膜濾器單元，將制備物通過0.22μm膜無菌過濾到第二個容器中。用剩余的20％的0.85％氯化鈉洗滌第一個容器并將容器穿過相同的濾器并收集到所述第二個容器中。在加入本體磷酸鋁期間和之后，溫和混合配制的本體。檢查pH并且如果需要，調節pH。將配制的本體產品在2-8℃保存。
將配制的本體產品裝入從Becton Dickinson得到的1型硼硅酸鹽玻璃注射器中。定期監測疫苗的混濁度以確保填充操作的均勻性。填充的疫苗(最終產品)在2-8℃保存。
實施例16 13價綴合物疫苗的免疫原性 迄今，已經在兔中對13vPnC疫苗進行了臨床前研究。設計研究#HT01-0021和#HT01-0036以獨立地檢查來自肺炎鏈球菌的莢膜多糖(PS)與CRM197的化學綴合和磷酸鋁(AlPO4)佐劑對兔中13vPnC疫苗的免疫應答的影響。這些效果通過抗原特異性ELISA測定血清IgG濃度和通過調理吞噬測定法(OPA)測定抗體功能來表征。
研究#HT01-0021 研究#HT01-0021檢查具有AlPO4佐劑的13vPnC疫苗引起疫苗血清型特異性免疫應答的能力。在13vPnC疫苗中代表的肺炎球菌血清型包括1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F型。第二個目標包括評估抗體應答的動力學和持續時間。在第0周和第2周用計劃的人臨床劑量的用或不用AlPO4(100μg/劑)配制的每種多糖(2μg每種PS，只是4μg 6B)肌內免疫新西蘭白兔(New Zealand White rabbits)。在不同時間點收集血清。通過ELISA測量血清特異性IgG并通過OPA評估功能活性。
表4顯示了在兩劑13vPnC疫苗后，在合并的血清樣品中達到的幾何平均效價(GMT)。用IgG GMT的比率比較來自第4周到第0周的應答。這些數據表明在13vPnC制劑中包括AlPO4與沒有佐劑的相同疫苗相比引起了更高水平的IgG抗體。盡管當在制劑中包括AlPO4時抗體應答更大，但是這些增加不是統計學上顯著的。
用這兩種13vPnC制劑免疫后，還在兔中評估了功能抗體應答(表5)。當比較有或者沒有佐劑的疫苗制劑時，在13vPnC+AlPO4疫苗處理組中觀察到更高的OPA GMT。在兩個組中，在第4周合并血清中對所有疫苗血清型都檢測到OPA效價。對于多數血清型，在第4周測量的OPA效價比第0周的OPA效價(基線)高至少4倍。
從來自兩個處理組的合并血清評估了對每種13vPnC疫苗血清型的動力學反應。從第0周和第1、2、3、4、8、12、26和39周抽取的血液測量了對每種血清型的IgG效價，然后比較。除了血清型1之外，在接受加佐劑的疫苗的動物中的抗體應答好于接受無佐劑的疫苗并且在免疫方案的第二周達到峰值(數據未顯示)。
總之，數據表明用磷酸鋁配制的13vPnC疫苗在兔中是免疫原性的，引起針對疫苗中所含的肺炎球菌莢膜多糖的實質性抗體應答并且這些應答與功能活性有關。用13vPnC+AlPO4免疫后對7種核心血清型觀察到的應答與兔對7價制劑的歷史應答相一致。
表4.用兩劑13價肺炎球菌糖綴合物免疫后的兔IgG免疫應答(GMT)
a來自組內每只兔的等體積的血清組成的合并血清的GMT b與沒有AlPO4的處理組統計學上不同(p＝0.022) 表5.用2劑13價肺炎球菌糖綴合物免疫后NZW兔合并血清的肺炎鏈球菌OPA GMT
a由處理組(n＝12)內各只兔的等體積的血清組成的合并物 研究#HT01-0036 研究#HT01-0036比較用綴合或不綴合CRM197蛋白質的13vPnC疫苗免疫后，兔對疫苗中所含的多糖(PS)的免疫應答。在第0周和第2周時，用一劑2.2μg每種PS(除6B是4.4μg外)肌內免疫新西蘭白兔。動物接受三種疫苗制劑之一(a)13vPnC(PS直接綴合到CRM197)，(b)13vPnPS(游離PS)或者(c)13vPnPS+CRM197(游離PS與CRM197混合)。所有疫苗制劑都含有作為佐劑的125μg/劑量的AlPO4。
在IgG ELISA和用補體介導的OPA測量功能性抗體中評估對所有疫苗制劑的血清型特異性免疫應答。比較處理組之間的免疫應答。
表6給出了用抗原特異性IgG ELISA分析的從第4周取血得到的GMT數據。額外的分析顯示了在第4周和第0周GMT值的比率。數據表明綴合物疫苗制劑比游離的PS或者游離的PS+CRM197疫苗引起了更高的血清IgG效價。除了14型肺炎鏈球菌之外，13vPnC疫苗能夠在OPA中誘導針對肺炎鏈球菌的代表性菌株的功能性抗體(表7)。用13vPnPS或13vPnPS+CRM197疫苗免疫兩次后，兩種疫苗都不能對于所測量的13種血清型中的10種在第4周時相對于第0周誘導≥8倍的OPA效價(表7)。
總之，這些結果表明13價肺炎球菌疫苗多糖的綴合比僅僅使用游離多糖或者與未綴合的CRM197混合的多糖所看到的產生更高的血清IgG效價和總的更大的功能性抗體活性。
表6.用2劑13價肺炎球菌糖綴合物免疫后，通過ELISA測量的對PnPS的兔IgG應答(GMT)
表7.用2劑13價肺炎球菌疫苗免疫后，兔血清合并物的肺炎鏈球菌OPA效價
a用作所有組的第0周值 實施例17 用于血清型3肺炎球菌糖-CRM197綴合物的備選方法 解凍純化的多糖的容器并在反應容器中合并，并加熱至85℃的溫度。當在溫度上升期間混合物的溫度達到約35℃時，加入2M乙酸以達到0.1M乙酸濃度。當混合物溫度達到85℃時，在這一溫度維持1小時以完成水解/解聚。將經水解/解聚的多糖冷卻至23℃并加入1M MgCl2以達到0.1MMgCl2的濃度。應用1-1.25摩爾當量的高碘酸(作為在WFI中50mg/mL的溶液添加)進行氧化。將混合物在23℃溫育16-24小時。
通過應用100K MWCO聚醚砜(PES)膜針對10倍體積的WFI滲濾純化反應混合物。應用0.2M磷酸鹽緩沖液(pH7.0)將經純化的活化的多糖調節至6.0的pH，以2∶1的多糖/蛋白質比率與CRM197混合，在-75℃滾動冷凍，并共同凍干71小時。共同凍干后，將多糖/CRM197混合物儲存于-25℃±5℃，直到綴合。為了綴合，將共同凍干的多糖/CRM197混合物以20mg/mL多糖的濃度溶解于0.1M磷酸鹽緩沖液中，并用0.2M磷酸鹽緩沖液(pH 4.6)和1M NaOH的組合將pH調節至6.2，隨后作為在0.15M磷酸鹽緩沖液(pH7.5)中的100mg/mL溶液添加0.5摩爾當量的氰基硼氫化鈉。攪拌反應混合物并在37℃溫育44小時。在氰基硼氫化鈉溫育后，用冷(2-8℃)0.9％鹽水稀釋反應混合物1倍，隨后作為在WFI中的100mg/mL溶液加入1摩爾當量的硼氫化鈉，以在23℃封閉未反應的醛3-6小時。
將反應混合物通過0.45-5μm預過濾器轉移到存留物容器中，并然后通過應用100K MWCO再生纖維素膜滲濾而純化。然后針對0.1M磷酸鹽緩沖液(pH9.0)滲濾30次，并針對0.15M磷酸鹽緩沖液(pH6.0)滲濾20次。最后針對5mM琥珀酸鹽/0.9％鹽水(pH6.0)滲濾20次。通過0.2μm濾器過濾經滲濾的綴合物并測定糖含量。基于糖分析，用5mM琥珀酸鹽/0.9％鹽水(pH6.0)將綴合物溶液稀釋至0.5mg/mL的目標，并再次無菌過濾(0.2μm)以得到終批濃度的綴合物。將綴合物儲存在2-8℃。
對于綴合物的表征，見實施例4。
應該理解前面的討論和實施例僅僅給出了一些實施方案的詳細描述。因此本領域技術人員顯而易見的是，可以做出多種修改和等同方案而不背離本發明的精神和范圍。
本專利申請中指出的所有雜志文章、其他參考文獻、專利和專利申請都完整引入本文作為參考。
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34.美國專利號4,673,574.
35.美國專利號4,902,506.
權利要求
1.制備包含與載體蛋白共價連接的肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)血清型3多糖的免疫原性綴合物的方法，所述方法包括
(a)使純化的血清型3多糖與溫和的酸反應，得到水解的血清型3多糖；
(b)在二價陽離子的存在下使水解的血清型3多糖與氧化劑反應，得到活化的血清型3多糖；
(c)使活化的血清型3多糖與載體蛋白混合；
(d)使混合且活化的血清型3多糖和載體蛋白與還原劑反應，得到血清型3多糖載體蛋白綴合物；和
(e)封閉血清型3多糖載體蛋白綴合物中未反應的醛，得到包含與載體蛋白共價連接的肺炎鏈球菌血清型3多糖的免疫原性綴合物。
2.權利要求1的方法，還包括在與載體蛋白混合前純化活化的血清型3多糖。
3.權利要求1的方法，還包括在與還原劑反應前，共同凍干所述混合且活化的血清型3多糖和載體蛋白。
4.權利要求1的方法，還包括純化免疫原性綴合物。
5.權利要求1的方法，其中所述的溫和的酸是乙酸。
6.權利要求1的方法，其中所述的氧化劑是高碘酸且二價陽離子是Mg2+。
7.權利要求1的方法，其中所述的載體蛋白是CRM197。
8.權利要求1的方法，其中所述的還原劑是氰基硼氫化鈉。
9.權利要求1的方法，其中封閉未反應的醛包括使血清型3多糖載體蛋白綴合物與硼氫化鈉反應。
10.制備包含與載體蛋白共價連接的肺炎鏈球菌血清型3多糖的免疫原性綴合物的方法，所述方法包括
(a)使純化的血清型3多糖與乙酸反應，得到水解的血清型3多糖；
(b)在MgCl2的存在下使水解的血清型3多糖與高碘酸反應，得到活化的血清型3多糖；
(c)純化活化的血清型3多糖；
(d)使活化的血清型3多糖與載體蛋白混合；
(e)共同凍干混合且活化的血清型3多糖和載體蛋白；
(f)使共同凍干且活化的血清型3多糖和載體蛋白與氰基硼氫化鈉反應，得到血清型3多糖載體蛋白綴合物；和
(g)用硼氫化鈉封閉血清型3多糖載體蛋白綴合物中未反應的醛，得到包含與載體蛋白共價連接的肺炎鏈球菌血清型3多糖的免疫原性綴合物。
11.權利要求10的方法，還包括純化所述免疫原性綴合物。
12.權利要求10的方法，其中所述的載體蛋白是CRM197。
13.制備活化的肺炎鏈球菌血清型3多糖的方法，所述方法包括
(a)使純化的血清型3多糖與溫和的酸反應，得到水解的血清型3多糖；和
(b)在二價陽離子的存在下使水解的血清型3多糖與氧化劑反應，得到活化的血清型3多糖。
14.權利要求13的方法，還包括在氧化后純化活化的血清型3多糖。
15.權利要求13的方法，其中所述的溫和的酸是乙酸。
16.權利要求13的方法，其中所述的氧化劑是高碘酸且二價陽離子是Mg2+。
全文摘要
描述了具有13種不同的多糖-蛋白質綴合物和任選地基于鋁的佐劑的免疫原性組合物。每種綴合物含有綴合到載體蛋白的從肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)的不同血清型(1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F)制備的莢膜多糖。配制為疫苗的免疫原性組合物總體上增加對嬰兒和幼兒中肺炎球菌疾病的覆蓋，并且提供了對血清型6A和19A的覆蓋，其中所述血清型6A和19A不依賴于血清組交叉保護的限制。還描述了制備包含與載體蛋白共價連接的肺炎鏈球菌血清型3多糖的免疫原性綴合物的方法，該方法包括在二價陽離子的存在下用高碘酸氧化所述多糖。
文檔編號A61K39/09GK101610785SQ200780051661
公開日2009年12月23日 申請日期2007年12月10日 優先權日2006年12月22日
發明者W·P·豪斯多夫, G·R·西貝爾, P·R·帕拉迪索, A·K·普拉薩德 申請人:惠氏公司