專利名稱：造影劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及一類對蛋白聚糖具有親和性的化合物和含有此類化合物的 藥物組合物。更具體地說，該化合物可用作靼向此類蛋白聚糖的造影劑。
本發明還涉及如上所述的藥物組合物在診斷成像中作為造影劑的用途。
背景技術：
蛋白聚糖是分布在身體內的大分子。可在細胞內、細胞表面上和細胞外基 質中發現蛋白聚糖。蛋白聚糖代表高度糖基化的一類特殊的糖蛋白。它們由核
心蛋白和一種或多種共價結合的糖胺聚糖鏈組成。這些糖胺聚糖(GAG)鏈是長 的線形糖類多聚物(carbohydratepolymer),其由于硫酸鹽和糖醛脧基團的存 在而在生理條件下帶負電荷。
硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)是一組蛋白聚糖。它們含有連接于核心蛋白 的D-葡糖醛酸(GlcUA)和N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的重復二糖(GAGs)。單獨 的GAG的大小可達100 kDa。由于在很多糖殘基上存在硫酸鹽或羧基或兩者， GAGs帶負電荷的程度4艮高，導致HSPG整體上帶負電荷。
糖胺聚糖(GAGs)或粘多糖是由重復的二糖單元組成的長的、無分支多糖。 所述單元由N-乙酰-己糖胺和己糖或己糖醛酸組成，其中之一或兩者可硫酸化。 糖胺聚糖家族成員含有的己糖胺、己糖或己糖醛酸單元類型(例如葡糖醛酸、 艾杜糖醛酸、半乳糖、半乳糖胺、葡糖胺)不同。它們糖苷鍵的幾何學也不同。 該糖家族對于脊推動物和多種低等動物的生活是必需的或重要的。
GAG形成了結締組織的重要成分。
蛋白聚糖(表達)的上調與多種疾病和病癥有關，例如阿爾茲海默氏病、主動 脈動脈瘤(aneurismal aortas)、動脈粥樣硬化、肝纖維化、微血管內皮 (microvascular endothelia)和癌癥例如乳腺癌、子宮頸癌、結腸腫瘤、結腸直 腸癌、胰腺癌、前列腺癌和韋爾斯氏肺瘤。
很多研究小組已經在積極地尋找用于體內鑒定蛋白聚糖的產品和方法，例 如以下出版物WO 00/23109 (加州大學董事會)提議了用于人癌癥的診斷劑，其含有結合 于報告分子的結合分子(具體講是一種抗體)，該診斷劑結合于磷脂酰肌醇蛋 白聚糖(glypican) -1和多配體蛋白聚糖(syndecan) -1之一。
US 2002/0122806 (Chinnaiyan等)提議了嵌合分子(例如，重組多肽和包含 熒光或化學發光的多肽和硫酸軟骨素蛋白聚糖結合多肽的藥物組合物)及其在診 斷成像中的應用。
WO 88/03413 (新英格蘭Deaconess醫院)^^開了一種尋找把標的、生物 活性分子，該分子與血管系統中用放射性核素標記的異常或核磁共振成像實體 相關。該生物活性抗體對例如硫酸軟骨素蛋白聚糖具有親和性，該抗體優選是 單克隆抗體。
WO 91/13919 (新英格蘭Deaconess醫院)涉及衍生自脈管相關蛋白的肽， 其對血管壁成分(可以是蛋白聚糖，可孝皮可檢測標記物標記)有親和性。
US 6,991,778 (Nitrosci)提議了用于增強關節成像的MR成像方法，其中使 用水溶性、帶正電荷的硝酰-官能化樹型化合物使關節中存在的軟骨蛋白聚糖顯 像。
如上所述，蛋白聚糖(尤其HSPG)是用于診斷多種疾病的有吸引力的標 記物。HSPG的有效耙向和成像需要在化學性質上強效(robust)和穩定且對靶 結構具有高親和性的載體。本發明的化合物滿足了這些條件。
發明概述
本發明提供新穎的化合物和含有此類化合物的藥物組合物，所述化合物 對蛋白聚糖具有親和性。該化合物包含連接有帶正電荷部分(positively charged moieties )的核心單元。該化合物還包含至少一種在體內成像中可檢 測到的成像部分，使該化合物用作蛋白聚糖成像中的診斷造影劑，從而用于 例如以下醫學狀況的診斷變性疾病、心血管疾病和癌癥。
包含本發明所述化合物的藥物組合物、其用途和成像方法也是本發明的一 部分。
發明詳述
第一種實施方式中，本發明提供對蛋白聚糖具有親和性的式I所定義的 化合物和其藥學上可接受的鹽，
R-Sp - C - (L - P)n (I)
其中C代表包含氨基酸殘基的核心單元，其連接于L單元，且當S存在時連 接于S單元或當S不存在時連接于R部分(moiety);
L相同或不同，并代表雙官能接頭單元(bifunctional linker unit);
P相同或不同，并代表帶正電荷的肽單元；
S代表間隔單元(spacer unit) 5
R代表成像部分(imaging moiety );
p代表0或1的整數；
n代表1-16的整數。
所附權利要求書中進一步說明了本發明的各個方面。
C代表包含氨基酸殘基的核心單元，其連接于L單元，且當S存在時連 接于S單元或當S不存在時連接于R部分，所述氨基酸殘基是天然氨基酸、 非天然氨基酸和任選的胺的氨基酸殘基。所述氨基酸是D或L氨基酸，優 選是D氨基酸。所述氨基酸是賴氨酸、鳥氨酸、二氨基丙酸以及胺，例如優 選下式的那些胺
NH2
胺基優選接枝在氨基酸鏈上。優選C含有2-16個氨基酸殘基，最優選2-8 個氨基酸殘基。
甚至更優選地，單元C包含賴氨酸殘基，任選還含有其它單元，例如含 有促進與單元L和單元S或所迷部分R位點特異性綴合(site specific conjugation)的官能團的其它氨基酸。此類官能團的例子是NH2、 OH、 SH、 ONH2、 NHNH2o
在尤其優選的實施方案中，所迷單元C含有2-4個氨基酸殘基。所述氨 基酸殘基最優選是賴氨酸殘基，其中任何游離的C末端羥基殘基可通過形成 酰胺殘基而^t官能化。
所述優選的C單元的例子包括
核心單元C也可包含改進(modify)式(I)化合物的生物分布的單元。此 類單元稱為生物修飾單元(biomodifierunits)。因此，引入例如醚將有助于使 血漿蛋白結合最小化。生物修飾單元還可包含聚乙二醇(PEG)結構單元(buildingblock)或1-10個氬基酸殘基的肽鏈或它們的組合，生物修飾單元的 作用是改進式(I)化合物的體內藥代動力學和血液清除率。此類生物修飾單元 的存在加速或減少顯影劑從背景組織(例如肌肉或肝臟)和/或血液中的清除，因 此由于背景干擾較少而使診斷成像效果更好。當用于增加血液滯留時間時，對 于化合物在病理學位點與靶實體相互作用的最大化是有益的。生物修飾單元也 可用于促進特定的排泄途徑，例如經由腎臟排泄而非通過肝臟排泄。
如上所述，L相同或不同，并代表將P單元與C單元連接的雙官能接頭 單元，優選L是中性的或帶負電荷。PEG接頭單元是優選的。PEG接頭可 在末端基團官能化以促進與C和P單元的結合。此類官能化的例子包括羧基 化和酰胺化。
當L含有PEG單元時，優選含有衍生自式(II)的單^t性PEG樣結構 (monodisperse PEG- like structure )17 -#^-5-氧代國6-氮雜-3，9，12，15-四氧雜十 七酸(tetraoxaheptadecanoic)的寡聚的單元
式(II)
其中，q等于l-10的整數，其結合于氨基酸的g和JL^部分。 還優選稱為"PEG 12"的下式的單元L
o
如上所述，各P單元相同或不同，并含有至多20個氨基酸，優選2-16 個氨基酸。所述氨基酸是D或L氨基酸。
各P單元整體上帶正電荷。因此，P含有至少一個氨基酸(優選至少兩個 氨基酸)，所述氨基酸是在生理pH值下帶正電荷的常見氨基酸或非常見氨基 酸。P可含有在生理pH值下呈中性的氨基酸以及任選帶有一個或兩個負電 荷的氨基酸，只要該P單元在生理pH值下保持整體正電性。特別優選的氨 基酸還包括氨基酸模擬物(mimetics)。優選實施方案中，P包含選自以下 的至少一種氨基酸精氨酸、精氨酸模擬物、賴氨酸、甘氨酸、脯氨酸、鳥 氨酸和組氨酸，但對于本領域技術人員顯而易見的是，可使用各種其他的氨 基酸，并且氨基酸序列可根據受體位點的親和性和體內結合位點的pH值而變化。
另一種優選實施方案中，各單元P具有至少2個正電荷，更優選至少3 個正電荷，最優選至少4個正電荷。整體而言，式(I)化合物應具有最少8 個正電荷，優選8-32個正電荷。
最優選地，P包含至少一種含有胍基或胍衍生基團的氨基酸。胍具有結 構式(H2N)2C=NH,在中性pH下帶正電荷，為胍離子形式。含有此類胍基 或胍衍生基團的氨基酸例子是精氨酸和精氨酸模擬物(例如正精氨酸 (norArg)、苯丙氨酸(4-胍)、高精氨酸和反式脯氨酸(transPro ) (4-胍)。 也可使用其他帶正電荷的非常見氨基酸。肽單元P的N末端可任選加帽 (capped)。
單元S是使單元C遠離成像部分R的間隔。這種間隔在成像部分相對 龐大時(例如當成像部分含有金屬絡合物或放射性碘原子時)尤其重要，以 致式(I)化合物的結合不受成像部分的妨害。這可通過柔性結合來實現，例 如通過包含烷基鏈，從而使得成像部分能夠自由地將自己定位在遠離結合位 點的地方。單元S可與單元L相同或相似，即，它可以是PEG單元。
成像部分R包含"成像實體(entity)",該成像實體可在哺乳動物身 體外部檢測到，或可通過使用設計用于體內的檢測器(例如設計用于體內操 作使用的血管內放射或光檢測器，例如內窺鏡或輻射檢測器)檢測到。
測到的成像實體。R優選包含可在MR、 SPECT、 PET、光學或X射線成像 模式中成像的成像實體。最優選的是放射性成像實體，尤其是放射性金屬離 子、發射Y射線的放射性卣素(gamma-emitting radioactive halogen)和發 射正電子的放射'性非金屬(positron-emitting radioactive non-metals)， 尤 其是適于用SPECT或PET成像的那些。還特別優選包含用于光學成像的染 料的成像實體。
所述成像部分可由直接結合于式(I)的S或C單元的成像實體本身組 成，例如非金屬化學實體，如卣素原子或染料。當所述成像實體是金屬化合 物(例如金屬離子)時，該成像實體是結合于S或C的成像部分的一部分， 例如絡合劑。這種情況下，成像部分R包含成像實體。
成像實體優選選自
(i)放射性金屬離子；
15(ii)順磁性金屬離子；
(Hi)發射Y射線的放射性鹵素；
(iv) 發射正電子的放射性非金屬；
(v) 超極化NMR-活性核；
(vi) 適于體內光學成像的報告物(reporter);
(vii) 適于血管內檢測的P射線發射體。
當成像實體是放射性金屬離子，即射電金屬(radiometal)時，術語射 電金屬包括放射性的過渡元素、鑭系元素、錒系元素和金屬主族元素。排除 半金屬砷、硒和碲。合適的射電金屬可以是正電子發射體，例如"Cu、 48V、 52Fe、 ssCo、 9ViTc或68Ga;Y射線發射體，例如"mTc、 mIn、 113mIn或67Ga。 優選的射電金屬是"，c、 "Cu、 68Ga和111111。最優選的射電金屬是Y射線 發射體，尤其是""^c。
當成像實體是順磁性金屬離子時，適合的此類金屬離子包括Gd(III)、 Mn(II)、 Cu(II)、 Cr(III)、 Fe(III)、 Co(II)、 Er(II)、 Ni(II)、 Eu(III)或Dy(III)。 優選的順磁性金屬離子是Gd(III)、 Mn(II)和Fe(III)，其中特別優選Gd(III)。
當成像實體是發射Y射線的放射性卣素時，該放射性鹵素適宜地選自 1231、 ^I或"Br。優選的發射Y射線的放射性鹵素是1231。
當成像實體是發射正電子的放射性非金屬時，適合的此類正電子發射體 包括"C、 13N、 150、 17F、 18F、 75Br、 76Br或124I。優選的發射正電子的放 射性非金屬是"C、 13N、 "F和1241，尤其優選"C和"F，最特別優選"F。
當成像實體是超極化NMR-活性核時，此類NMR-活性核具有非零核自 旋，包括13C、 15N、 19F、 29Si和31P。其中優選13C。術語"超極化"表示 NMR-活性核的極化程度增強，超過其平衡極化程度，13c (相對于12<:)的天 然豐度為約1%,合適的130標記的化合物在超極化之前，適合地富集至豐 度為至少5%，優選至少50%,最優選至少90%。
當成像實體是適于體內光學成像的報告物時，該報告物是能夠直接地或 者間接地在光學成像程序中檢測到的任何實體。該報告物可以是光散射體 (例如有色或無色粒子)、光吸收體或光發射體。更優選該報告物是染料， 例如發色團或熒光化合物。染料可以是與波長為從紫外光到近紅外光的電磁 波鐠中的光相互作用的任何染料。最優選報告物具有熒光特性。
優選的有機發色和發熒光(fluorophoric)的報告物包括具有廣泛離域電子系統(extensive delocalized electron)的報告物，例如花青、部花青、丐l咮菁(indocyanines )、 酞菁、萘肽菁(naphthalocyanines )、三苯基次甲基染料(triphenylmethines) 、 ？卜琳、pyrilium染料、thiapyriliup染料、squarylium染料、croconium染料、azulenium染料、欷苯胺(indoanilines )、苯并吩噁秦鎗(benzophenoxazinium )染料、苯并硫雜吩漆秦鎗(benzothiaphenothiazinium )染料、蒽醌、napthoquinones 、 陰丹士林(indathrenes )、鄰苯二甲跣吖咬酮(pMhaloylacridones )、三(苯盼合苯醌)(trisphenoquinones )、偶氮染料、分子內和分子間電荷傳遞染料和染料絡合物、環庚三烯酮、四溱、二(二硫醇烯(dithiolene)絡合物、雙(苯-二硫羥酸鹽(ditWolate))絡合物、碘苯胺(iodoaniline)染料、二( S，O-二硫醇烯)絡合物。也可用熒光蛋白，例如綠色熒光蛋白(GFP)和具有不同的吸收/發射特性的改性GFP。某些情況下，也可使用某些稀土金屬(例如銪、衫、鋱或鏑)絡合物，如焚光納米晶體(量子點)。
可使用的發色團的具體例子包括熒光素、磺基羅丹明(sulforhodamine)101 (德克薩斯紅)、羅丹明B、羅丹明6G、羅丹明19、吲哚花青綠、Cy2、Cy3、 Cy3.5、 Cy5、 Cy5.5、 Cy5**、 Cy7、 Marina Blue, Pacific Blue、 OregonGreen 88、 Oregon Green 514、四甲基羅丹明和Alexa Fluor 350、 Alexa Fluor430、 Alexa Fluor 532、 Alexa Fluor 546、 Alexa Fluor 555、 Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、 Alexa Fluor 633、 Alexa Fluor 647、 Alexa Fluor 660、 AlexaFluor 680、 Alexa Fluor 700、 Alexa Fluor 750、及它們的衍生物。
尤其優選的是在400納米~3微米之間(尤其在600-1300納米之間)的可見光或近紅外區域具有最大吸收的染料。光學成像方式和測量技術包括但不限于發光成像；內窺鏡術；熒光內窺鏡術；光學相干斷層攝影(coherencetomography);透射成《象；時間分辨透射成像；共焦成〗象；非線性顯微術；光聲成像；聲光成像；分光術；反射光譜法；干涉量度；相千千涉量度(coherence interferometry ); 擴散光學斷層攝影 (diffuse opticaltomography)和熒光調節的擴散光學斷層攝影(連續波、時域與頻域系統)和光散射、吸收、極化、發光、熒光壽命、量子產率和猝滅的檢測。
當成像實體是P射線發射體，例如適于血管內檢測的P射線發射體時，此類13射線發射體包括射電金屬67Cn、 89Sr、 90Y、 153Sm、 186Re、 188Re或192Ir以及非金屬32p、 33P、 38S、 38C1、 39C1、 82Br*83B。當成像部分包含金屬離子時，金屬離子作為金屬絡合物存在。術語"金屬絡合物"指金屬離子與一種或多種配體的配位絡合物。強烈優選金屬絡合
物是動力學穩定的，因此抗轉移螯合(transchelation),也就是說不容易與針對金屬配位點的其他可能的竟爭性配體發生配位體變換。
用于本發明中、形成抗轉移螯合的金屬絡合物的合適配體包括螯合劑，其中2-6個(優選2-4個)金屬供體原子排列形成5元或6元的螯環(通過具有連接金屬供體原子的碳原子或非配位雜原子的非配位骨架)；或包含強烈結合金屬離子的供體原子的單齒配體，例如異腈、膦或二氮烯化物(diazenides )。作為螯合劑的一部分很好地結合金屬的供體原子類型的實例為胺、硫醇、酰胺、肝和膦。膦形成非常穩固的金屬絡合物，即使單齒膦或二齒膦也形成合適的金屬絡合物。異腈和二氮烯化物的線形幾何學使它們自己不易并入螯合劑中，因此通常用作單齒配體。合適的異腈的例子包括簡單的烷基異腈，例如叔丁基異腈；瞇取代的異腈，例如mibi(即1-異氰基-2-甲氧基-2-甲基丙烷)。合適的膦的例子包括Tetrofosmin和單齒配體膦，例如三(3-甲氧基丙基)膦。合適的二氮烯化物的例子包括HYNIC系列配體，即肼取代的吡啶或煙酰胺。
優選的配基是形成動力學穩定的金屬絡合物的螯合劑和單齒配體，例如膦、異腈和二氮烯化物。最優選的配體是如上所定義的螯合劑。
形成抗轉移螯合金屬絡合物的合適锝螯合劑的例子包括但不限于
(i)式(III)的二胺二肝(diaminedioximes ):
其中E、E6各自獨立地是R，基團；各R'是H或Cw()烷基、C3-10烷基芳基、C2.1()烷氧基烷基、Cw。羥基烷基、Cm。氟代烷基、C2-1G羧基烷基或Cwo氨基烷基，或兩個或多個R，基團與它們所連接的原子形成飽和或不飽和的碳環、雜環，其中一個或多個R，基團與分支單元綴合(conjugated) ， Q是式-(J)f的橋連(bridging)基團，其中f是3、 4或5,各J獨立地是-O-、-NR'-或-C(R')2-，條件是-(J)f含有最大的一個J基團(a maximum of one J
式(m)group)，其為-O-或-NR'-。優選的Q基團如下
Q =-(CH2)(CHR')(CH2)-，即，丙二胺肝(propyleneamine oxime )或PnAO衍生物；
Q =-(CH2)2(CHR')(CH2)2-，即，戊二胺肟(pentyleneamine oxime)或PentAO衍生物；
Q=-CH2)2NR (CH2)2-。
E^EG優選選自Cw烷基、烷基芳基、烷氧基烷基、羥基烷基、氟代烷基、羧基烷基或氨基烷基。最優選各E^ES基團是CH3。
分支單元優選是在Ei或EG基團，或Q基團的R'基團綴合。當分支單元綴合至Q基團的R，基團時，R，基團優選在橋頭(bridgehead)位置。這種情況下，Q 優選為-(CH2)(CHR)(CH2)- 、 -(CH2)2(CHR')(CH2)2-或-(CH2)2NR'(CH2)2-，最優選國(CH2)2(CHR)(CH2)2國。
一種特別優選的雙官能二胺二肟螯合劑具有式
其中單元C或S之一通過橋頭-CH2CH2NH2基團綴合。進一步優選的螯合劑是
(ii) N3S配體，其具有硫醇三酖胺(thioltriamide)供體組件(donor set),例如MAG3 (巰基乙酰基次氨基三乙酸(mercaptoacetyltriglycine ))的及相關配體；或具有二酰胺吡咬硫醇(diamidepyridinethiol )供體組件，例如Pica;
(iii) N2S2配體，其具有二胺二硫醇(diaminedi也iol)供體組件，例如BAT或ECD (即雙半胱氨酸乙酯(ethylcysteinate) 二聚物)或酰胺胺二硫醇供體組件，例如MAMA;
(iv) N4配體，其為具有四胺、酰胺三胺或二酰胺二胺供體組件的開鏈或大環配體,例如cyclam、單氧代cyclam或二氧代cyclam;(v)N202配體，其具有二胺二酚供體組件。 上述配體特別適用于絡合锝例如MmTc或"mTc, Jurisson等[Chem. Rev.: 99， 2205 2218 (1999)1中有更詳細的描述。這些配體也用于其他金屬，例如銅 (64Cu或67Cu)、釩(例如48V)、鐵(例如"Fe)或鈷(例如55Co)。其他合適的配 體描述于Sandoz WO 91/01144中，其中包括特別適用于銦、釔和釓的配體， 尤其是大環氨基羧酸酯(aminocarboxylate )和氨基膦酸配體。形成釓的非 離子(即，中性)金屬絡合物的配體是已知的，并描述于US 4885363中。 當射電金屬離子是锝時，配體優選是四齒螯合劑。優選的锝螯合劑是二胺二
肟，或如上所述具有N2S2或N3S供體組件的螯合劑。
優選地，單元P結合于金屬絡合物的方式使得這種鍵合(linkages)不容 易在血液中發生代謝，因為否則將導致標記化合物到達所需的體內靶位點之 前金屬絡合物裂解。因此，單元P可通過不容易代謝的鍵S共價鍵合于金屬 絡合物。當成像實體是放射性卣素例如碘時，合適地選擇分支單元以包括 非放射性卣素原子，例如芳基碘化物或溴化物(以允許放射性碘交換)；活 化芳環(例如酚基)；有機金屬前體化合物(例如三烷基錫或三烷基曱硅烷 基)；有機前體，例如三氮烯或用于親核取代的良好離去基團，例如碘鎿鹽。 引入放射性卣素(包括HI及OFF)的方法描述于Bolton [J. Lab. Comp. Radiopharm.， 45, 485-528 (2002)。可連接放射性卣素(特別碘)的合適的芳 基實例為
這兩種實體均含有允許將放射性碘容易地置換到芳環上的取代基。可經 由放射性鹵素交換，通過直接碘化作用來合成含有放射性碘的可供選取的代 基。當成像實體是碘放射性同位素時，放射性碘原子優選經由直接共價鍵連 接于芳環(例如苯環)或連接于乙烯基，因為已知健合于飽和脂族系統的碘 原子易于在體內代謝，并因此損失放射性碘。
當成像部分包含氟放射性同位素(例如"F)時，可使用"F-氟化物與具有 良好離去基團(例如烷基溴、甲磺酸烷基醋或甲苯磺酸烷基酯)的合適前體反應而進行直接標記，從而實現放射卣化。也可通過胺前體與烷化劑(例如
18F(CH2)3OMs (其中Ms是甲磺酸酯(mesylate ))的N-烷基化來引入18F，得 到N-(CH2)318F，或與F(CH2)3OMs或18F(CH2) 3Br進行羥基的O-烷基化來 引入18F。也可通過18F(CH2)3OH反應物將N-卣代乙酰基團烷基化來引入18F, 得到-NH(CO)ch20(ch2),F衍生物。對芳基系統而言，"F-氟化物從芳基 重氮鹽、芳基硝基化合物或芳基季銨鹽中進行親核置換是產生芳基-"F衍生 物的合適路線。
本發明的優選實施方案中，提供式(I)化合物和藥學上可接受的鹽，其
中
核心單元C包含氨基酸賴氨酸、鳥氨酸、二氨基丙酸及胺； 接頭L相同，并包含PEG連接單元； 單元P相同，并帶有2-8個正電荷和至多20個氨基酸； S存在或不存在，當S存在時包含烷基鏈或PEG單元； R包含成像實體(i) (vii)之一；
(i) 放射性金屬離子；
(ii) 順磁性金屬離子；
(iii) 發射y射線的放射性鹵素；
(iv) 發射正電子的放射性非金屬；
(v) 超極化NMR-活性核；
(vi) 適于體內光學成像的報告物；
(vii) 適于血管內檢測的P射線發射體； p代表0或l的整數；和
n代表l-4的整數。
可通過本領域技術人員已知的幾種合成途徑，由可通過商業途徑獲得的 起始原料合成通式(I)的化合物。可使用化學合成領域的已知方法合成單元 C和P。使用自動肽合成儀的Merrifield固相方法(J. Am. Chem. Soc" 85: 2149 (1964))特別有用。合成策略的標準程序描述于E. Atherton & R. C. Sheppard "Solid phase peptide synthesis: a practical approach, 1989， IRL prcss， Oxford中《
通過固相技術進行肽合成是基于任選通過接頭單元連接至固相支持物 的受保護的氨基酸的順序加入(equential addition)。在一種通常使用的方
21法中，用對酸敏感或對堿敏感的保護基適宜地保護OC-氨基。加入并偶合第一 個氨基酸殘基后，脫除ct-氨基保護基。通過順序加成其它受保護的氨基酸衍
生物或肽片段來延伸肽鏈。
式(la )化合物
Sp國C-(L-P)n
式(la)
其中，S、 p、 C、 L、 P和n具有如上定義，并包括非肽接頭單元，可使用完 全自動合成程序組裝S (當存在時)和P。下一步中，通過常規合成方法將 成像部分R與S或C單元偶合。如上所述，非金屬成像實體可與C單元直 接偶合，或者它可結合于載體，例如結合于用于碘元素的芳基實體。當成像 實體是金屬離子時，將合適的絡合劑偶合于S或C單元，根據本領域已知方 法程序例如WO 03/006070所述方法，將鹽或氧化物形式的金屬離子加成到 帶有絡合劑的化合物。
本發明化合物的制備可基于結構單元(building blocks)和分步合成。 核心單元C用作笫一結構單元，其中所述核心被活性基團取代，所述活性基 團允許連接L以及Sp或R。 L或其前體與取代的第一結構單元反應形成由核 心C和L組成的第二結構單元。對于該反應，L包含可與第一結構單元的活 性基團反應的活性基團以使L連接于所述第一結構單元。在接下來的步驟中， P或其前體連接于第二結構單元，形成由核心C、 L和P組成的第三結構單 元。當存在時，Sp或其前體連接于第三結構單元，形成由核心Sp、 C、 L和 P組成的第四結構單元。取決于Sp是否存在，R或其前體連接于第三或第四 結構單元。
因此，制備本發明化合物的方法包括
f) 使用被活性基團取代的核心單元C作為第一結構單元，該活性基團允 許連接L以及Sp或R;
g) 使L或其前體與所述第一結構單元反應，形成由核心C和L組成的第 二結構單元；
h) 4吏P或其前體與所述笫二結構單元反應，形成由核心C、 L和P組成 的第三結構單元；
i) 任選地使Sp或其前體與所述第三結構單元反應，形成由核心Sp、 C、 L和P組成的第四結構單元；j)使R或其前體與所述笫三或第四結構單元反應。
本發明的式(I)化合物對蛋白聚糖具有親和性。蛋白聚糖的例子是多 配體蛋白聚糖-1和GPC1 (在胰腺癌中上調)、多配體蛋白聚糖-2 (在結腸 癌中上調)和多配體蛋白聚糖-4 (在肝細胞癌中上調)。優選的本發明化合 物對HSPG有親和性，并通過與葡糖胺聚糖的負電荷相互作用而靶向HSPG 的葡糖胺聚糖(GAG)。式(I)化合物的結構肽序列P與GAG的重復棒 樣(stick-like)結構相配，形成交叉結合的靶向效應。肽結構P可結合一個 GAG的幾個區域或交叉結合于幾個GAG鏈。這可提供比具有一個帶正電荷 的單一肽鏈的那些化合物更高的結合親和性。
給予本發明化合物至哺乳動物體內后，可檢測到成像部分。為了給藥， 將式(I)化合物配制為適于體內注射的無菌組合物或適于口服的組合物，或 適于給予到體內管腔(例如直腸和子宮)中的組合物。
第二方面中，本發明提供適于哺乳動物給藥形式的藥物組合物，其包含如 上所述化合物和生物相容性載體。"生物相容性載體"是流體，特別是液體， 化合物可懸浮或溶解于其中，提供生理上可耐受形式的組合物，該組合物可給 藥至哺乳動物體內而無毒性或過度的不適。生物相容性載體宜為可注射的載體 液體，例如無菌的、無熱原的注射用水；水溶液，例如鹽水(可有利地平衡以 使用于注射的成品是等滲的或非低滲的)； 一種或多種毒性調節物質的水溶液 (例如具有生物相容性平衡離子的血漿陽離子鹽(salts of plasma cations with biocompatible coimterions));糖(例如葡萄糖或蔗糖)；糖醇(例如山梨糖 醇或甘露糖醇)；甘醇(例如甘油)；或其他非離子多元醇物質(例如聚乙二 醇、丙二醇等等)。
本發明還提供所述藥物組合物在診斷成像方法中的應用。該方法包括將 藥物組合物給予人體或非人體。所述人體或非人體用診斷裝置檢查，從檢查 中收集數據。如果需要，所迷數據可進一步處理以便于這些數據可用于產生 影像并用于獲得診斷。這些數據可用于如上所述的與蛋白聚糖上調相關疾病 和病癥的可視化和鑒定。可通過注射或輸注無菌組合物來給予所述化合物， 或作為適于口服的組合物給藥，或給予到體內管腔例如直腸和子宮中。
另一方面，本發明還提供人體或非人體的診斷成像方法，其包括對之前 已給予上述藥物組合物的人體或非人體成像。這種實施方式中，本發明藥物 組合物用于成像方法或成像過程，其中術語"之前已給予"指已經進行了需要醫學上合格的人員將所述組合物給予患者的任何步驟。
另一方面，本發明提供產生人體或動物體的影像的方法，其中將本文公 開的化合物或包含此類化合物的藥物組合物給予人體或非人體，其中產生已 經分布有所述化合物的至少一部分至所述人體或非人體的影像。
實施例
使用以下縮寫
Ac: 乙耽基 Arg: 精氨酸 Boc: 叔丁氧羰基
Dde: l-( 4,4 -二甲基-2，6-二氧代環己-l-亞基-(ylidene ))乙基
DMF: 二甲基甲酰胺 Fmoc: 9-芴基甲氧羰基 Glu: 谷氨酸 Gly: 甘氨酸
HATU: N-[(二甲基氨基)-lH-l，2，3三唑并[4，5-b吡啶-l-基亞甲
基-N-甲基六氟磷酸甲銨 N-氧化物 (N-methylmethanaminium hexafluorophosohate N畫oxide )
HBTU: 2-(lH-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯
(tetramethyluronium hexafluorophosphate )
HOAt: l-羥基-7-氮雜苯并三唑
HPLC: 高效液相色譜法
Lys: 賴氨酸
NMM: 4-甲基嗎淋
Ot-Bu: 叔丁醇鹽(Tert butoxide)
Pbf: 2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰
PEG: 聚乙二醇
PEG4: 17-氨基-5-氧代-6-氮雜-3，9，12，15-四氧雜十七酸
PEG12: 39腸氨基誦4，7,10，13，16，19，22，25，28，31，34,37誦十二氧雜丙酸
(dodecaoxapropionic acid ) PyAOP: [7-氮雜苯并三唑-1-基氧基三(吡咯烷)膦鎗
((pyrrolidino)phosphonium )國六氟褲酸鹽
24TFA:
脯氨酸
三氟乙酸
三異丙基硅烷
Rink amide (TM) 聚笨乙烯基樹脂
實施例l-8說明了對應于上述式(la)化合物(當p等于0時)的式C-(L-P)n的中間體的制備。實施例9-13說明式(I)化合物。
實施例1
Ac-D-Arg-D隱Arg-D誦Arg-Glv-Glv-Glv-D-Arg-PEG12隱D-LvsfPEG12-D-A rg-Glv-Glv-Glv-D-Arg-D國Arg-D-Arg-Ac、-D-Lvs-NHL的合成
Ac-r-r-r-G-G-G-r-PEG12-k-k-NH2
I
Ac-r-r-r-G-G-G扁r-PEG12
用Rink Amide MBHA樹脂(Novabiochem， 0.58毫摩爾/g;標稱 (scale)=0.10亳摩爾)-0.172g作為起始材料手動組裝Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、 Fmoc-D-Lys(Dde)-OH和Fmoc PEG12。在肽合成期間，使用含20%哌啶 (Fluka)的二甲基甲酰胺(Rathburn)脫除Fmoc基團，使用含2%肼(Aldrich) 的DMF脫除Dde保護基。用含HATU (Applied biosystems， 114 mg， 0.3毫 摩爾)和4-甲基嗎啉(Fluka， 66 M L， 0.6毫摩爾)的DMF預活化 Fmoc-D-Lys(Boc)-OH (Novabiochem， 141 mg, 0.3亳摩爾)，然后將預活化的 Fmoc-D-Lys(Boc)-OH與樹脂偶合。以同樣方式，使用Fmoc-D-Lys(Dde)-OH (Novabiochem， 266.3 mg, 0.5毫摩爾)、配制在DMF中的HATU (Appliedbiosystems， 190 mg， 0.5毫摩爾)和4-甲基嗎啉(Fluka，110 p L， 1.0毫摩爾)以 及39-(Fmoc-氨基酸)-4，7，10，13,16，19，22，25,28，31，34，37-十二氧雜丙酸 (Polypure， 336 mg， 0.4亳摩爾)、DMF中配制的HATU (Applied biosystems, 152mg，0.4亳摩爾)和4-甲基嗎啉(Fluka， 88 pL，0.8毫摩爾)進行接下來 的氨基酸偶合。使用購自Applied Biosystems的1亳摩爾氨基酸柱 (cartridges)利用完全自動合成(ABI 433A )進行其余氨基酸序列 (D誦Arg(Pbf)-D國Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)畫Gly國Gly-Gly-D-Arg(Pbf))的組裝。在偶 合之前用HBTU (Applied biosystems )預活化氨基酸。用含乙酸酐(Merck， 10 eq.)和4-甲基嗎啉(Fluka， 20 eq.)的DMF將樹脂乙酰化。在含有2.5 % 水和2.5 。/。三異丙基硅烷(Aldrich)的三氟乙酸(Fluka)中同時進行側鏈保護基 的脫除和肽從樹脂的脫除，持續6小時。通過過濾和真空蒸發濾液除去樹脂。 將二乙醚(Eternell)加到殘留物中。得到的沉淀物用乙醚洗滌并風干。用反 相制備色譜(Phenomenex Luna C18柱，00G-4252-P0;溶劑A-水/ 0.1% TFA 和B= CH3CN/0.1% TFA;梯度10-25 % B,經60 min;流速10 ml /分鐘;在214 和254nm處檢測)純化粗制品。用分析HPLC表征化合物:Phenomenex Luna C18柱，00G-4252-E0;溶劑A-水+0."/。TFA和B=CH3CN+0.1% TFA;梯度 10-25 % B,經20 min;流速1.0 ml /分鐘;保留時間11.8分鐘；在214和254nm 處檢測)。用質譜法進一步表征，得到m/z值1050.7 [M-3H+1。
實施例2
Ac隱r-r-r-G國G-G-r-G-e-PEG12-k-k-NH: Ac-r-r-r-G-G-G-r-G-e-PEG12<formula>formula see original document page 27</formula>
使用NovaPEG Rink Amide樹脂(Novabiochem， 0.62毫摩爾/g;標稱= 0.05毫摩爾)=0.081 g)，利用完全自動合成方法(Liberty CEM微波肽合成) 組裝氨基酸序列D國Arg(Pbf)-D國Arg(Pbf)-D國Arg(Pbf)-Gly-Gly-Gly畫D-Arg (Pbf)-Gly國D-Glu(Ot-Bu)-PEG12-D-Lys(-PEG12-D漏Glu(Ot-Bu)-Gly畫D-Arg(P bf)國Gly-Gly國Gly-D國Arg(Pbf)-D國Arg(Pbf)曙D-Arg(Pbf)-D-Lys(Boc)。在偶合之 前用HBTU ( Applied Wosystems )預活^ffc氨基酸(Iris Biotech和 Novabiochem)。用二曱基甲酰胺(Rathburn)中的乙酸酐(Merck, 10 eq.) 和4-甲基嗎啉(Fluka， 20 eq.)將樹脂乙酰化。在含有2.5 %水和2.5 %三異 丙基硅烷(Aldrich)的三氟乙酸(Fluka)中同時進行側鏈保護基的脫除和肽從 樹脂的脫除，持續過夜。通過過濾和真空蒸發濾液除去樹脂。將二乙醚 (Eternell)加到殘留物中。得到的沉淀物用乙醚洗滌并風干。用反相制備色 語(Phenomenex Luna C18柱，00G隱4252誦P0;溶劑A-水/0.10/。 TFA和B= CH3CN/0.1% TFA;梯度00-30 % B,經40 min;流速10 ml /分鐘;檢測214 和254 nm)純化一半的粗制品，獲得13.1 mg純化合物。用分析HPLC表 征化合物:Phenomenex Luna C18柱，00G-4252-E0;溶劑人=水+0.1% TFA / B= CH3CN + 0.1°/。 TFA;梯度10-45 % B,經20 min;流速1.0 ml /分鐘;保留 時間8.8分鐘；檢測214和254 nm )。用質諉法進一步表征，得到m/z值 1761.8 [M誦2H+1。
實施例3
Ac畫D-Arg誦D-Pro-D-Arg-D-Pro-D國Arg畫D-Pro-D-Arg-D國Pro-PEG4畫D-Lvs 0PEG4-D國Pro-D國Arg-D-Pro國D-Arg-D國Pro-D畫Arg-D-Pro-D-Arg-Ac、-D-Lvs-N
H^的合成<formula>formula see original document page 28</formula>
使用NovaPEG Rink Amide樹脂(Novabiochem， 0.62毫摩爾/g;標稱=0.05 毫摩爾)=0.081g)，利用完全自動合成方法(Liberty CEM微波肽合成)組裝氨 基,列(D-Arg(Pbf)畫D-Pro國D國Arg(Pbf)-D-Pro國D-Arg(Pbf)-D國Pro-D-Arg (Pbf)國D國Pro-PEG4-D國Lys(PEG4國D畫Pro國D-Arg(Pbf)謹D-Pro畫D-Arg(Pbf)-D-Pr o-D-Arg(Pbf)-D-Pro-D-Arg(Pbf))國D-Lys(Boc)。在偶合之前用HBTU( Applied biosystems)預活化氨基酸(Iris Biotech和Novabiochem )。用含乙酸酐 (Merck, 10 eq.)和4-甲基嗎啉(Fluka， 20 eq.)的二曱基曱酰胺(Rathburn ) 將樹脂乙酰化。在含有2.5 %水和2.5 。/。三異丙基硅烷(Aldrich)的三氟乙酸 (Fluka)中同時進行側鏈保護基的脫除和肽從樹脂的脫除，持續過夜。通過過 濾和真空蒸發濾液除去樹脂。將二乙醚(Eternell)加到殘留物中。得到的沉 淀物用乙醚洗滌并風干。用反相制備色諳(Phenomenex Lima C18柱， 00G-4252誦P0;溶劑A-水/ 0.1% TFA和B= CH3CN / 0.1% TFA;梯度10-30 % B,經40min;流速10ml/分鐘;檢測214和254 nm )純化一半的粗制品， 獲得21.8 mg純化合物。用分析HPLC表征化合物:Phenomenex Luna C18 柱，00G-4252-E0;溶劑A-水十0.1% TFA和B= CH3CN + 0.1% TFA;梯度 10-25 % B,經20 min;流速1.0 ml /分鐘;保留時間9.6分鐘；檢測214和254nm )。用質譜法進一步表征，得到m/z值1824.4 [M-2H+ + 3TFA。 實施例4
Ac-D-Arg國D國Arg-D國Arg-Glv誦GW-Glv國D-Arg畫PEG12-D畫Lvsn EG12-D-A rg-Glv國Glv-Glv-D-Arg-D-Arg國D-Arg國Ac、-WAc-D國Arg-D-Arg畫D-Arg國Glv-Glv -GIv-D-Arg-PEGU-D-LvsfPEGU-D-Arg-Glv-Glv-Glv-D-Arg-D-Arg-D-Arg-Ac))-D-Lvs-NH^的合成
Ac-r-r-r-G-G-G-r-PEG12
Ac-r-r-r-G-G-G-r-PEG12-k-k-k-N
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Ac-r-r-r-G-G-G-r-PEG12-k Ac-r-r國r-G-G-G-r-P E G12
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使用NovaPEG Rink Amide樹脂(Novabiochem， 0.62亳摩爾/g;標稱=0.025 毫摩爾)=0.040 g)，利用完全自動合成方法(Liberty CEM微波肽合成)組裝氨 基 酸 序 列
(D畫Arg(Pbf)-D-Arg(Pbi)-D-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Gly-D-Arg(Pbf)-PEG12國D-Lys(PEG12國D國Arg(Pbf)國Gly-Gly-Gly-D-Arg(Pbi)國D畫Arg(Pbf)國D-Arg(Pbf))-D-Lys(D-Arg(Pbi)-D畫Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Gly誦D-Arg(Pbf)國PEG12-D陽Lys(PEG12-D-Arg(Pbf)-Gly畫Gly-Gly-D垂Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbi)))扁D-Lys(Boc)。在偶合之前用HBTU (Applied biosystems )預活化氨基酸(Iris Biotech和Novabiochem )。用含乙酸酐(Merely 10 eq.)和4 -甲基嗎琳(Fluka， 20 eq.)的二甲基甲酰胺(Rathbura)將樹脂乙跣化。在含有2.5 %水和2.5 %三異丙基硅烷(Aldrich)的三氟乙酸(Fluka)中同時進行側鏈保護基的脫除和肽從樹脂的脫除，持續過夜。通過過濾和真空蒸發濾液除去樹脂。將二乙醚(Eternell)加到殘留物中。得到的沉淀物用乙醚洗滌并風干。用反相制備色譜(PhenomenexLuna C18柱，00G-4252-P0;溶劑A-水/ 0.1% TFA和B=CH3CN / 0.1% TFA;梯度00-30 %B，經40min;流速10ml/分鐘;檢測214和254 nm )純化1/4的粗制品，獲得2.8 mg純化合物。用分析HPLC表征化合物:Phenomenex Luna C18柱，00G-4252-E0;溶劑入=水+ 0.1% TFA和B= CH3CN + 0.1% TFA;梯度10-40 %B，經20min;流速1.0ml/分鐘;保留時間9.0分鐘；檢測214和254nm )。
實施例5
Ac-D國Arg-D-Pro-D畫Arg-D-Pro-D-Arg-D國Pro-D誦Arg-D-Pro-PEG4fPEG4-D國Pro-D國Arg-D國Pro-D-Arg-D-Pro-D國Arg-D國Pro國D-Arg隱Ac)-kfAc-D國Arg-D-Pro-D-Arg-D-Pro-D-Arg-D-Pro-D-Arg-D-Pro-PEG4-D-Lvs(PEG4-D-Pro-D-Arg隱D-Pro-D-Arg-D-Pro畫D-Arg曙D-Pro-D-Arg-Ac))-D國Lvs-NHi的合成
Ac-r-p-r扁p-r-p-r-p-PEG4Ac-r-p-r-p-r-p-r-p-P EG4-k-k-k-N HAc-r-p-r-p-r-p-r陽p-P E G4-kAc-r-p-r-p-r-p-r-p-PEG4
30<formula>formula see original document page 31</formula>
使用NovaPEG Rink Amide樹脂(NovaWochem， 0.62毫摩爾/g;標稱=0.025毫摩爾)=0.040 g)和完全自動合成方法(Liberty CEM微波肽合成)組 裝 氨 基 酸 序 列
(D-Arg(Pbf)-D-Pro誦D-Arg(Pbf)-D-Pro國D-Arg(Pbf)國D國Pro-D-Arg(Pbf)-D國Pro誦PEG4 (PEG4國D-Pro國D-Arg(Pbf)-D-Pro畫D-Arg(Pbf)-D國Pro-D畫Arg(Pbf)
國D-Pro-D-Arg(Pbf))-D-Lys(D-Arg(Pbf)-D-Pro-D-Arg(Fbf)誦D-Pro墨D-Arg(Pbf)畫D-Pro-D-Arg(Pbf)國D-Pro誦PEG4國D畫Lys(PEG4國D國Pro國D-Arg(Pbf)-D-Pro-D-Arg(Pbf)國D-Pro國D國Arg(Pbf)-D誦Pro-D-Arg(Pbf)))-D國Lys(Boc))。在偶合之前用HBTU ( Applied biosystems )預活4乜氨基酸(Iris Biotech和Novabiochem )。用含乙酸酐(Merck, 10 eq.)和4 -甲基嗎啉(Fluka， 20 eq.)的二甲基曱酰胺(Rathburn)將樹脂乙酰化。在含有2.5 %水和2.5 %三異丙基硅烷(Aldrich)的三氟乙酸(Fluka)中同時進行側鏈保護基的脫除和肽從樹脂的脫除，持續過夜。通過過濾和真空蒸發濾液除去樹脂。將二乙醚(Eternell)加到殘留物中。得到的沉淀物用乙醚洗滌并風干。用反相制備色譜(Phenomenex Luna C18柱，00G-4252-P0;溶劑入=水/0.1% TFA和B=CH3CN/0.1% TFA;梯度00-30 % B，經40 min;流速10 ml/分鐘;檢測214和254nm)純化一半的粗制品，獲得6.8mg純化合物。用分析HPLC表征化合物:Phenomenex Luna C18柱，00G-4252-E0;溶劑A-水十0.1% TFA和B= CH3CN + 0.1% TFA;梯度10-25 % B,經20 min;流速1.0 ml /分鐘;保留時間10.5分鐘；檢測214和254 nm )。實施例6
Ac-D-Arg-D-Lvs-D-Lvs國D-Arg-D-Arg-D-Orn-D-Arg-D-Arg-D-Arg-Gly-D-Glu國D-Glu-PEG12-D國LvsrPEG12國D-Glu國D-Glu國D-Glv-D-Arg-D-Arg-D-Arg國D-Orn國D-Arg-D畫Arg-D陽Lvs,D國Lvs-D陽Arg-Ac、-D國Os國NH，的合成
<formula>formula see original document page 32</formula>用0.05 mmolNovaPEG Rink Amide樹脂(Novabiochem)作為起始材料，使 用Fmoc化學在CEM Liberty微波肽合成儀上組裝氨基酸序列 D國Arg(Pbf)國D畫Lys(Boc)國D國Lys(Boc)-D-Arg(Pbf)國D-Arg(Pbf)誦D-Orn(Boc)-D-Arg (Pbf)-D-Arg(Pbf)-D國Arg(Pbf)幽Gly-D國Glu(OtBu)-D-Glu(OtBu)-PEG12-D-Lys(P EG12-D-Glu(OtBu)-D國Glu(OtBu)-Gly畫D-Arg(Pbf)-D隱Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)陽D-0 rn(Boc)國D誦Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Lys(Boc)-D-Lys(Boc)-D-Arg(Pbf))-D-Cys(Tr t)。各偶合步驟中使用0.4 mmol氨基酸(Iris Biotech, Fluka和Novabiochem)， 用HATU (GenScript Corp.)、 HOAt (GenScript Corp.)和DIEA (Fluka)進行原 位活化。用含乙酸酐(Merely 10 eq.)和DIEA (Fluka, lleq.)的二甲基曱酰胺 (Rathburn)將樹脂乙酰化。在含有2.5 %水和2.5 。/。三異丙基硅烷(Aldrich) 的三氟乙酸(Fluka)中同時進行側鏈保護基的脫除和肽從樹脂的脫除，持續過 夜。通過過濾和真空蒸發濾液除去樹脂。將二乙醚(Eterndl)加到殘留物中。 得到的沉淀物用乙醚洗滌并風干。用反相制備色譜(Phenomenex Luna C18柱， 00G-4252隱P0;溶劑入=水/0.1% TFA和B= CH3CN / 0.1% TFA;梯度10-50 % B，經40min;流速10ml/分鐘;檢測214和254 nm)純化一半的粗制品，獲 得純化合物。用分析HPLC表征化合物:Phe加menex Luna 3 n C18 (2) 20 x 2 mm;溶劑A-水+ 0.1% TFA/ B= CH3CN + 0.1% TFA;梯度10-50 % B,經5 min;流速0.6ml/分鐘;保留時間1.77分鐘；檢測214 nm)。用質譜法進一步 表征，得到m/z值1593.3 [M3H3+I。
實施例7
Ac-D-Arg國D-Lvs陽D-Lvs-D-Arg-D國Arg-D-Orn國D畫Arg-D-Arg誦D-Arg畫PEG 12國D-LvsfPEG12-D-D畫Arg-D-Arg國D畫Arg-D-Orn國D-Arg國D-Arg-D-Lvs-D-Lvs -D-Arg扁Ac)-D-Os-NH，的合成
Ac-r-k-k-r-r-o-r-r-r-PEG12-k-c-NH2
i
Ac-r-k-k-r-r-o-r-r-r-PEG12, 000 000 000 0^0 000 0^V^V^
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用0.05 mmolNovaPEGRink Amide樹脂(Novabiochem)作為起始材料，使 用Fmoc化學在CEM Liberty微波肽合成儀上組裝氨基酸序列 D-Arg(Pbf)-D-Lys(Boc)-D-Lys(Boc)-D-Arg(Pbf)國D-Arg(Pbf)-D-Orn(Boc)-D國Arg (Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-PEG12-D-Lys(PEG12-D-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)國D-Orn(Boc)國D-Arg(Pbf)陽D-Arg(Pbf)-D國Lys(Boc)國D-Lys(Boc)-D-Arg (Pbf))-D-Cys(Trt)。各偶合步驟中使用0.4 mmol #^酸(Iris Biotech, Fluka和 Novabiochem),用HATU (GenScript Corp.)、 HO At (GenScript Corp.)和 DIEA (Fluka)進行原位活化。用含乙酸酐(Merely 10 eq.)和DIEA ( Fluka， lleq.)的二曱基甲酰胺(Rathburn)將樹脂乙酰化。在含有2.5 %水和2.5 % 三異丙基硅烷(Aldrich)的三氟乙酸(Fluka)中同時進行側鏈保護基的脫除和肽從 樹脂的脫除，持續過夜。通過過濾和真空蒸發濾液除去樹脂。將二乙醚 (Eteraell)加到殘留物中。得到的沉淀物用乙醚洗滌并風干。用反相制備色譜 (Phenomenex Luna C18柱，00G-4252-P0;溶劑A-水/0.10/。 TFA和B= CH3CN / 0.1% TFA;梯度10-35 % B,經40 min;流速10 ml /分鐘;檢測214和254 nm )純化一半的粗制品，獲得純化合物。用分析HPLC表征化合 物:Phenomenex Luna3 p C18 (2) 20 x 2 mm;溶劑A-水+ 0.1% TFA/ B= CH3CN + 0.1% TFA;梯度10-30 % B，經5 min;流速0.6 ml /分鐘；保留時間 2.80分鐘；檢測214mn)。用質譜法進一步表征，得到m/z值1265.3 [(M4H + 8TFA)4+。 實施例8
Ac-D-Arg-D-Arg-D-Arg-Glv畫Glv-D畫Arg誦D-Arg畫D-Arg-Glv-Glv-D-Arg醫D-Arg-PEG12-D-LvsfPEG12-D-Arg畫D-Arg-Glv-Glv誦D-Arg誦D-Arg-D誦Arg-Gl v-Glv-D-Arg-D-Arg國D國Arg國Ac、-D-Lvs國NH^的合成
Ac-r-r-r-G-G-r-r-r-G-G-r-r-PEG12-k-k-NH2
i
Ac-r-r-r隱G-G-r-r-r-G-G-r-r-PEG12
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用0.05 mmol NovaPEG Rink Amide樹脂(Novabiochem)作為起始材 料，使用Fmoc化學在CEM Liberty微波肽合成儀上組裝氨基酸序列 D誦Arg(Pbf)隱D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-Gly誦Gly-D-Arg(Pbf)畫D國Arg(Pbf)畫D-Arg( Pbf)-Gly-Gly-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-PEG12-D-Lys(PEG12-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-Gly-Gly國D畫Arg(Pbf)陽D國Arg(Pbf)誦D-Arg(Pbf)-Gly-Gly-D-Arg(Pbf)國 D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf))-D國Lys(Boc)。各偶合步驟中使用0.4 mmol氨基酸 (Iris Biotech, Fluka和Novabiochem )，用HATU (GenScript Corp.)、 HOAt (GenScript Corp.)和DIEA (Fluka)進行原位活化。用含乙酸酐(Merck, 10 eq.)和DIEA ( Fluka， lleq.)的二甲基甲酰胺(Rathburn )將樹脂乙酰化。 在含有2.5 %水和2.5 。/o三異丙基硅烷(Aldrich)的三氟乙酸(Fluka)中同時進 行側鏈保護基的脫除和肽從樹脂的脫除，持續過夜。通過過濾和真空蒸發濾 液除去樹脂。將二乙醚(Eternell)加到殘留物中。得到的沉淀物用乙醚洗滌 并風干。用反相制備色譜(Phenomenex Luna C18柱，00G-4252-P0;溶劑A= 水/ 0.1% TFA和B= CH3CN / 0.1% TFA;梯度10-35 % B,經40 min;流速 10ml/分鐘;檢測214和254 nm)純化一半的粗制品，獲得純化合物。用 分析HPLC表征化合物:Phenomenex Luna3 m C18 (2) 20 x 2 mm;溶劑A-水 + 0.1% TFA/ B= CH3CN + 0.1% TFA;梯度10-30 % B，經5 min;流速0.6 ml
35/分鐘;保留時間2.19分鐘；檢測214 nm)。用質譜法進一步表征，得到 m/z值808.5 [(M6H + 3TFA)"。
實施例9
<formula>formula see original document page 36</formula>
將實施例1組裝的肽(3.4mg, 1.1微摩爾)加入到含(S)-2(叔丁氧Hl^-羧甲基 畫^^)-3-(l-三苯甲基-lH-咪唑-4-基)-丙酸叔丁酯(1.0 mg， 1.6微摩爾)、PyAOP (Applied Biosystems， 0.86 mg， 1.6 ^#爾)和二異丙基乙胺(Fluka， 0,55 ^L， 3.2 微摩爾)的二甲基曱酰胺(Ra也bura， 0.6 mL)中。將該溶液靜置過夜，然后用反 相制備色譜(Phenomenex Lima C18柱，00G-4252-P0;溶劑A-水/ 0.1% TFA 和B= CH3CN / 0.1% TFA;梯度10-40 % B,經40 min;流速10 ml /分鐘;檢測 214和254 nm)純化粗制品(含有二甲基甲酰胺)。用質譜法進一步表征，得 到m/z值1438.0 [M-3H+ + 5TFAj 。使用三氟乙酸(Fluka) ( 95% )、水(2.5 % ) 和三異丙基硅烷(Aldrich) (2.5 % )脫除螯合物上的保護基。1小時后減壓蒸發 TFA，用反相制備色譜(Phenomenex Luna C18柱，00G-4252-N0;溶劑A-水/0.1。/oHCOOH和B=CH3CN/0.1% HCOOH;梯度00-20 %B,經30min;流速 5ml/分鐘;檢測214和254 nm )純化粗制品，獲得1.5 mg純化合物。用分析 HPLC表征化合物:Phenomenex Luna C18柱，00G陽4252-E0;溶劑A-水+ 0.1% TFA和B= CH3CN + 0.1% TFA;梯度10-40 % B,經20 min;流速1.0 ml /分鐘； 保留時間8.7分鐘；檢測214和254 nm)。用質譜法進一步表征，得到m/z 值1672.3 [M畫2H+I。
將由此獲得的下式
Ac國D國Arg-D-Arg隱D-Arg-Gly-Gly國Gly隱D國Arg國PEG12-D隱Lys(-PEG12國D-Arg國 Gly-Gly-Gly-D-Arg-D-Arg-D-Arg-Ac)-D-Lys(COCH2NH-His-OH)-NH2的產
物通過羧酸基團和咪唑與99mTc配位。
實施例10
Ac-D-Arg-D-Arg-D畫Arg-Glv-Glv-Glv-D-Arg-PEG12-D國Lvs(-PEG12-D-Arg-Glv-Glv誦Glv-D誦Arg-D國Arg-D-Arg-Ac、-D-LvsfCOCH2CHfCH2NHCH2C H,NH+、-NH,及其"mTc絡合物的合成
Ac-r-r-r-G-G-G-r-PEG12-k-k(COCH2CH(CH2NHCH2CH2NH2)2)-NH2 Ac-r-r-r-G-G-G-r-PEG12
<formula>formula see original document page 37</formula>一
將實施例1組裝的肽(3.4mg, 1.1微摩爾)加入到含N-琥珀酰亞胺基 (Succinimidyl) 4-(2-#J^-乙#^)-3-[(2-#^-乙#^)-甲基-丁酸酯(1.2 mg， 1.6微摩爾)、HOAt (Genscript Corp, 0.20 mg， 1.6微摩爾)和二異丙基乙胺(Fluka，0，SS^iL，i2微摩爾)的二甲基甲酰胺(Rathburn, 0.6 mL)中。將該溶液 靜置過夜，然后用反相制備色語(Phenomenex Luna C18柱，00G-4252-P0;溶劑 A-水/ 0.1°/。 TFA和B= CH3CN / 0.1% TFA;梯度10-50 % B,經40 min;流速 10ml/分鐘;檢測214和254 nm)純化粗制品(含二甲基甲酰胺)。用質譜進 一步表征，得到m/z值1440.2 [M-3H+ + 5TFA。使用三氟乙酸(Fluka)( 97.5% ) 和水(2.5 % )脫除螯合物上的保護基。1小時后減壓蒸發TFA，用反相制備色 譜(Phe加menex Lima C18柱，10G-42102-P0;溶劑A-水/0.1。/。 TFA和B-CH3CN/0.1% TFA;梯度10-40 %B,經40 min;流速10 ml/分鐘;檢測214和 2104 mn)純化粗制品，獲得1.9 mg純化合物。用分析HPLC表征化合 物:Phenomenex Luna C18柱，00G-4252-E0;溶劑A-水+ 0.1% TFA和B= CH3CN + 0.1% TFA;梯度10-40 % B,經20 min;流速1.0 ml /分鐘;保留時間8.5 分鐘；檢測214和254 nm)。用質譜法進一步表征，得到m/z值1674.8 [M-2H+]。
可用已知方法例如WO 03/006070所述方法加入放射性成像實體(優選 99mTc)。
實施例11
Ac-D-Arg-D-Arg-D-Arg-Glv-Glv-Glv-D-Arg-PEG12-D-Lvs"PEG12-D-Arg-Glv-Glv-Glv-D-Arg-D-Arg-D-Arg-Ac、國D-Lvs"3"4-hvdroxv-Dhenvl)Dro Dionvl)-NH2及其碘化(iodinated)衍生物的合成
Ac-r-r-r-G-G-G-r-PEG12-k-k(3-(4-hydroxy-phenyl)propionyl)-NH2 Ac-r-r-r-G-G-G-r-PEG12氣 ,
久V^^M人V1^ 110。 。0。 。0。 。0。 。0。 。0。 。11
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入N、 1 H O H O 、
將實施例1組裝的肽(3.4mg， 1.1微摩爾)加入到含3-(4-羥基苯基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(Sigma， 0.40 mg， 1.6微摩爾)和二異丙基乙胺(Fluka， 0，55 ^L， 3.2微摩爾)的二甲基甲酰胺(Ra也burn， 0.6mL)中。將該溶液靜置過夜，然后 利用反相制備色譜(Phenomenex Lima C18柱，00G-4252-P0;溶劑A二水/ 0.1% TFA和B= CH3CN / 0.1% TFA;梯度10-50 % B，經40 min;流速10 ml /分鐘; 檢測214和254nm)純化粗制品(含二甲基甲酰胺)，得到2.0 mg純化合物。 用分析HPLC表征化合物:Phenomenex Lima C18柱,00G-4252-E0;溶劑A-水+ 0.1% TFA和B= CH3CN + 0.1% TFA;梯度10-40 % B,經20 min;流速1.0 ml / 分鐘;保留時間9.7分鐘；檢測214和254nm)。用質鐠法進一步表征，得到 m/z值1289.4 [M-3H+ + 5TFA]。
碘化衍生物
>.、<formula>formula see original document page 40</formula>
為制備碘化衍生物，可采用Bolton, [J丄ab.Comp.Radiopharm.， 45 485-528 (2002)1所述方法在酚基的鄰位上51入碘原子。
實施例12
Ac-D隱Arg-D誦Arg-D-Arg-Glv-Glv-Glv-D國Arg-PEG12-D丄vs"PEG12-D-Arg-Glv誦Glv-Glv-D國Arg-D-Arg-D-Arg-Ac)-D誦LvsfQ5.5)國NH,的合成
Ac-r-r-r-G-G-G-r-PEG12-k-k(Cy5.5)-NH2 Ac-r-r-r國G-G-G-r-P EG 12h nh
hn、 hm、
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< ，H s L" 。z。
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將溶解在二甲基曱酰胺(Rathburn， 0.25 mL)中的實施例1組裝的肽(2.8 mg， 0.89##爾)加入到溶解在1\-曱基吡咯烷酮(Applied biosystems， 0.25 mL) 中的Cy5.5 NHS酯(GE Healthcare, 1.5 mg， 1.3微摩爾)和對稱可力丁 (sym,collidine) (Fluka， 1.2 jiL， 9.1微摩爾)的溶液中，將澄清的藍色反應混合 物避光并攪拌過夜。然后該反應混合物用水/ 0.1 % TFA ( 6 mL)稀釋，利用制 備HPLC提供反相制備色譜(Phenomenex Luna C18柱，00G-4252畫P0;溶劑A= 水/ 0.1% TFA和B= CH3CN / 0.1% TFA;梯度00-40 % B,經40 min;流速10 ml /分鐘;檢測214和254 nm)純化產品，得到1.1 mg純化合物。用分析 HPLC表征化合物:Phenomenex Luna C18柱，00G-4252-E0;溶劑A-水+ 0.1% TFA和B= CH3CN + 0.1% TFA;梯度10-25 % B，經20 min;流速1.0 ml /分鐘； 保留時間16.5分鐘；檢測214和254 nm)。 用質鐠法進一步表征，得到m/z 值1350.4 [M國3H+。
實施例13
Ac-D-Arg-D-Arg-D-Arg-Glv-GW-Glv-D-Arg-PEG12-D-Lvsf-PEG12-D-Arg國Glv-Glv-Glv-D畫Arg-D-Arg-D-Arg國Ac)-D畫LvsfCv5")-NH二的合成
Ac-r-r-r-G-G-G-r-PEG12-k-k(Cy5**)-NH2 Ac-r-r-r-G-G-G-r-PEG12<formula>formula see original document page 42</formula>
將溶解在二甲基甲酰胺(Rathburn， 0.25 mL)中的實施例1組裝的肽(2.8 mg， 0.89微摩爾)加入溶解在N-甲基吡咯烷酮(Applied biosystems， 0.25 mL)中 的Cy5** NHS酯(GE Healthcare, 1.8 mg， 1.3微摩爾)和對稱可力丁(Fluka， 1.2 ^L，9.1微摩爾)的溶液，將澄清的藍色反應混合物避光并攪拌過夜。然后該反應 混合物用水/ 0.1 % TFA (6mL)稀釋，利用制備HPLC提供反相制備色鐠 (Phenomenex Luna C18柱，00G畫4252國P0;溶劑A-水/ 0.1% TFA和B= CH3CN/0.1% TFA;梯度10-40 %B,經40 min;流速10 ml/分鐘;檢測214和 254 nm)純化產品，得到1.2 mg純化合物。用分析HPLC表征化合物 Phenomenex Lima C18柱，00G-4252-E0;溶劑人=水+ 0.1% TFA和B= CH3CN + 0.1% TFA;梯度10-25 % B，經20 min;流速1.0 ml/分鐘;保留時間14.5分鐘； 檢測214和254 nm)。用質譜法進一步表征，得到m/z值1340.6 [M-3H+。
權利要求
1.對蛋白聚糖具有親和性的式I化合物和其藥學上可接受的鹽R-Sp-C-(L-P)n(I)其中C代表包含氨基酸殘基的核心單元，其連接于L單元，且當S存在時連接于S單元或當S不存在時連接于R部分；L相同或不同，并代表雙官能接頭單元；P相同或不同，并代表帶正電荷的肽單元；S代表間隔單元；R代表成像部分；p代表0或1的整數；n代表1-16的整數。
2. 如權利要求l所述的化合物，其中，核心單元C包含氨基酸賴氨酸、鳥氨酸、二氨基丙酸及胺； 接頭L相同，并包含PEG連接單元； 單元P相同，并帶有2-8個正電荷和至多20個氨基酸； S存在或不存在，存在時包含烷基鏈或PEG單元； R包含成像實體(i) - (vii)之一(i) 放射性金屬離子；(ii) 順磁性金屬離子；(iii) 發射Y射線的放射性鹵素；(iv) 發射正電子的放射性非金屬；(v) 超極化NMR-活性核；(vi) 適于體內光學成像的報告物；(vii) 適于血管內檢測的P射線發射體； p代表O或1的整數；和n代表l-4的整數。
3. 如權利要求1-2所述的化合物，其中，C包含2-16個氨基酸殘基。
4. 如權利要求l-3所述的化合物，其中，C包含2-4個賴氨酸殘基，其中 游離的末端羧基殘基通過形成酰胺殘基而被官能化。
5. 如權利要求1-2所述的化合物，其中，L包含PEG接頭，該PEG接 頭在末端基團通過羧基化和/或酰胺化而被官能化。
6. 如權利要求5所述的化合物，其中，L包含式(II)的PEG接頭其中，q等于l-10的整數，其結合于氨基酸的氯基和氨基實體。
7.如權利要求5所述的化合物，其中，L包含下式的PEG接頭
8. 如權利要求1-2所述的化合物，其中，P含有2-16個氨基酸，其中至 少2個氨基酸在生理pH下帶正電荷。
9. 如權利要求1-2所述的化合物，其中，R選自(i)放射性金屬離子；(ii) 順磁性金屬離子；或(iii)發射Y射線的放射性卣素；其中金屬離子通過螯合實 體結合。
10. 如權利要求9所述的化合物，其中，R選自被式(III)的螯合劑螯合 的放射性金屬離子其中E^E6各自獨立地是R，基團；各R，是H或Cwo烷基、C3-10烷基芳基、 (:2.1()烷氧基烷基、Cwo羥基烷基、Cwo氟代烷基、<:2.1()羧基烷基或Cwo氨 基烷基，或兩個或多個R，基團與它們所連接的原子形成飽和或不飽和的碳 環、雜環，其中一個或多個R，基團與分支單元綴合，Q是式-(J)f的橋連基團， 其中f是3、 4或5,各J獨立地是-O-、 -NR'-或-C(R')2-，條件是-(J)f含有最 大的一個J基團，其為-O-或-NR'-。
11.如權利要求2所述的化合物，其中，p代表整數0;和式(II)式(m)n代表2或4的整數。
12.與放射性金屬實體，優選"mTc螯合的、具有以下結構的式(I)化合物<formula>formula see original document page 4</formula>
13.適于光學成像的、具有以下結構的式(I)化合物
14.具有以下結構的、式(Ia)的中間體<formula>formula see original document page 5</formula>式(Ia)<formula>formula see original document page 5</formula><formula>formula see original document page 6</formula><formula>formula see original document page 7</formula><formula>formula see original document page 8</formula><formula>formula see original document page 9</formula>
15.如權利要求l-12所述的化合物，其對硫酸乙酰肝素蛋白聚糖有親和性,
16. 含有如權利要求1-13所述的化合物和一種或多種藥學上可接受的栽 體或賦形劑的藥物組合物。
17. 產生人體或動物體的影像的方法，其中，將如任何權利要求1-13所 述的化合物給予人體或非人體，其中產生已經分布有所迷化合物的至少一部 分所述人體或非人體的影像。
18. 使之前已給予包含權利要求1-13中任一項所述化合物的藥物組合物 的人體或非人體成像的方法，包括產生已經分布有所述造影劑組合物的至少 一部分所述人體或非人體的影像。
19. 制備權利要求l-12所述化合物的方法，其包括 a)使用被活性基團取代的核心羊元C作為笫一結構羊元，該活性基團允許連接L以及Sp或R;b) 使L或其前體與所述第一結構單元反應，形成由核心C和L組成的第 二結構單元；c) 使P或其前體與所述第二結構單元反應，形成由核心C、 L和P組成 的第三結構單元；d) 任選地使Sp或其前體與所述第三結構單元反應，形成由核心Sp、 C、 L和P組成的第四結構單元；e) 使R或其前體與所述第三或第四結構單元反應。
全文摘要
本發明提供新穎的化合物和含有此類化合物的藥物組合物，其中所述化合物對蛋白聚糖具有親和性。所述化合物包含基于氨基酸的核心單元，該核心單元與帶正電荷的部分相連。該化合物還包含至少一種成像部分，該成像部分可在體內成像中檢測到，從而使所述化合物可用作蛋白聚糖例如硫酸乙酰肝素蛋白聚糖成像的診斷造影劑。
文檔編號A61K49/00GK101641119SQ200780047610
公開日2010年2月3日 申請日期2007年12月19日 優先權日2006年12月20日
發明者A·庫思伯特森, H·卡爾森, H·托萊肖格 申請人:通用電氣醫療集團股份有限公司