專利名稱：：電穿孔裝置及用其進行哺乳動物細胞電穿孔的方法
技術領域：
：除其他內容外，在本發明涉及電穿孔裝置和它們在輔助向
背景技術：
：^;哺乳動物皮膚或皮膚組織的特點為具有細胞層并分為不同的區域(見圖l)。最表面的區域為表皮(1.1),其可分為5個亞層角質層(l丄l)、,束層(l丄2)、透明層(l丄3)、顆并立層(l丄4)和基底層(1丄5)。真皮(1.2)位于表皮之下，是血管化非常豐富的區域；毛根和汗腺均位于這一層。皮下層位于真皮之下。中的功能發揮保護作用。作為宿主防御病原體的前線，皮膚有足夠的裝備進行免疫監督。舉例而言，與其他組織相比，皮膚的表皮包含大量的郎格罕細胞，其為非常強效的未成熟樹突狀細胞("DC")。因此，將抗原靼向皮膚真皮可有效誘導強免疫應答。但是，表皮(1.1)(見圖1)的角質層(l丄l)建立的屏障傾向于阻止抗原至表皮的有效進入。樹突狀細胞是皮膚中的主要抗原遞呈細胞。皮膚中大量種群的DC使真皮內(intradermic,"ID")免疫稱為具有吸引力的途徑。體內質粒轉移技術，尤其是當其涉及轉移質粒至真皮內("ID")或皮下("SQ")組織或細胞，已傳統地受到局限，因為棵露DNA(質粒)轉移引起的體內表達水平一直較低，僅有部分是通過病毒基因轉移完成。與可用于肌肉內注射("IM")的劑量相比以適用于ID或SQ的體積給予的質粒劑量較小。許多研究均已表明對向動物和人注射病毒作為DNA載體的安全性和毒理學的關注(Frederickson等，Mol.Ther.8:8-10(2003))。因此，直接注射質粒DNA已成為期望的遞送技術，然而，有效傳送至細胞和蛋白表達水平是一大難題。骨骼肌細胞提供了直接質粒轉移DNA疫苗和其他應用的主要耙標(Prud'homme等，Curr.GeneTher.6:243-273(2006))。質粒體內遞送的最近進展為電穿孔("EP")。EP可用于遞送各種分子從離子到藥物、染料、示蹤劑、抗體和寡聚核苷酸至RNA和DNA(Gehl，ActaPhysiolScand.177:437-447(2003))。該方法將目標組織暴露于簡單的電場脈沖下，其可誘導在細胞膜中形成瞬時和可逆的孔。在膜去穩定化過程中，分子例如質粒可進入細胞內。之前，報導已顯示對EP方法的改良可增加轉移效率并降低通過使用恒流裝置體內產生目標水平抗原所需的質粒量(Draghia-Akli和Smith,GeneTherapy第245頁-TherapeuticMechanismsandStrategies,N.S.Templeton和D.D.Lasic編輯，MarcelDekker,Inc.,NewYork.(2003》。使用EP增強質粒傳送使得被注射組織可用做大量生產和向血流中分泌蛋白質的生物反應器和/或用于抗原遞呈。與單獨質粒注射相比表達水平增加了二至三個數量級，增加至可與腺病毒介導的基因傳送可比的水平并且在一些情況下可達到生理學范圍。電穿孔已成為基礎研究的可用工具，可應用于基因傳送和DNA接種領域。已成功使用電穿孔在注射質粒后轉染胂瘤細胞或向人皮膚和皮下腫瘤遞送抗腫瘤藥物博萊霉素。電穿孔已用于在小鼠、大鼠、狗和豬中遞送編碼各種激素、細胞因子、酶或抗原的治療基因。被靶向的大量的組織和器官包括肝、眼、睪丸、心肌、平滑肌、不同位置的胂瘤和骨骼肌。大型哺乳動物和人的皮膚EP的一大難題是皮膚厚度的個體差異，以及不同解剖學區域皮膚厚度的差異。例如，人三角肌皮膚厚度約為2毫米("mm"),而肩胛水平約2.6mm,腰部約1.7-1.9mm,大腿為約1.6-1.7mm。皮膚是敏感的，因此也需要調節電極規格(gauge)和配置(configuration)將不適降至最低。當用于治療目的時，在治療中一定程度的不適對于患者而言有時是可接受的，已建議只有相對無痛的方法可用于預防接種。針對這一難題已調整電極陣列結構和特性以及裝置脈沖才莫式。已知在電穿孔中從電極尖端約2mm至距其尖端三分之一電極處的位點可產生最大均一電場。Draghia-Akli等的美國專利7245963號描述了模塊電極系統模塊電極系統[含多^針狀電極；皮下針；可提供程序控制型'i流脈沖控制器與多個針狀電極之間傳導性連接的電連接器；和一個能量源。操縱器可抓起這些安裝在支撐結構上的針狀電極并將它們插入所選身體組織或植物。接著通過皮下針將生物分子遞送至所選組織。程序控制型恒流脈沖控制器被激活并將恒流電脈沖施加至多個針狀電極。所施加的恒流電脈沖輔助將生物分子引入多個電極之間的組織中。美國專利7245963的完整內容以參考形式并于本文。Smith等提交的美國專利出版物2005/0052630描述了可用于有效輔助將生物分子引入所選身體組織或植物細胞的電穿孔裝置。該電穿孔裝置包含電動(electro-kinetic)裝置("EKD"裝置)，其操作由軟件或固件(firmware)設定。EKD裝置基于使用者控制和脈沖參數輸入在任何陣列的電極之間產生一系列的程序可控型恒流脈沖模式并允許存儲和采集電流波形數據。該電穿孔裝置也包含具有針狀電極陣列的可替換電極盤、注射針的中心注射管道以及可移除的導盤。美國專利出版物2005/0052630的完整內容以參考形式并于本文。調整美國專利7245963和美國專利出版物2005/0052630描述的電極陣列和方法使其不僅可以深度刺入組織例如肌肉也可刺入其它組織或器官。由于電極陣列的結構，注射針(用于遞送所選生物分子)也^R完全插入目標器官中，并且在電極預描繪的區域內垂直于目標組織注射。美國專利7245963和美國專利出版物2005/0052630描述的電極優選長20mm和規格為21。—般而言，電穿孔是使用跨膜電場脈沖誘導生物膜中的顯微可見路徑(孔)。這些孔通常稱作"電孔"。它們的存在使得生物分子、離子和水從膜的一邊通過至另一邊。因此，電穿孔已被用于向多細胞組織引入藥物、DNA或其他分子并證明對于某些疾病的治療是有效的。然而，在活體內使用EP存在若干問題，包括所產生的熱量和電孔不能重新閉合引起的細胞死亡。在發生過量細胞加熱和細胞死亡的EP方法中藥物或生物分子的有效作用非常有限。為了更好地理解電穿孔過程，需要了解一些簡單的方程式。當在植入組織中的電極施加電勢差(電壓)時，它會產生電場("E"),其為施加電壓("V")除以電極之間的距離("d")。E=V/d當設計電穿孔方案用于遞送藥物或生物分子至受試者細胞時電場強度E是一個非常重要的數值。在給定電壓下電場強度與電極間距離成反比，當電極間距離減小時電場強度增加。但是，值得注意的是可在具有絕緣電極的組織中產生電場(即離子的流動不一定產生電場)。雖然不愿意受到理論的束綽，人們認為離子流打開了電孔并使得在電穿孔過程中分子運動至受試者細胞內。在導體中和具有電勢差的兩點之間的介質中電荷的流動稱作電流。電才及間的電流由組織中的離子或帶電顆粒實現，其在組織和患者之間存在差異。而且，組織中導電離子的流動可從電脈沖開始至電脈沖結束在電極之間變化。當組織具有小比例的導電離子時電阻增加，產生熱量并殺死細胞。歐姆(Ohm's)定律表達了電流('T，)、電壓("V")和電阻("R")之間的關系R=V/I兩個電極之間組織中的電阻隨著其中存在的帶電顆粒而變化。因此，組織中的電阻從電脈沖開始至電脈沖結束發生變化。加熱是電極間阻抗的乘積(即電阻與電抗的組合并以歐姆測量)并與電流乘積、電壓和月永沖時間成正比。加熱也可表示為電流的平方和脈沖時間("t",時間)。例如，在電穿孔中，支持組織中產生的加熱或功率("W",瓦)可由下列等式表示W=I2Rt—般而言，將金屬或電解質電極與組織接觸并在電極上施加預定電壓的短脈沖使細胞開始瞬時開放膜孔。目前描述的電穿孔方案就所得電場強度E定義，其取決于與電極間距離成正比的電壓的短脈沖并與電流或組織電阻無關。因此，無法測定凈皮電穿孔組織的阻力或加熱，這導致不同脈沖電壓電穿孔方案各種各樣的(varied)成功。確定的是，可輔助有效電穿孔的電穿孔方案和引起細胞死亡的電穿孔方案之間的電壓脈沖的上限振幅差異是很小的。此外，已觀察到由短電壓脈沖的上限振幅引起的細胞死亡和加熱之間的確定聯系。因此電極間細胞的過度加熱成為任何給定電穿孔電壓脈沖方案無效的主要原因。此外，電極間電流而不是電才及間的電壓成為任何給定脈沖方案有效性的主要決定因素。當電流遞送至受試者細胞時，電流的劑量可根據下式由電荷("Q，，)精確描述，其為電流('T，)和時間("t"):Q=It如果電流不是桓定的，Q表示I的時間積分。在這一方面，帶電顆粒，無論是離子或分子，具有相似的行為方式。舉例而言，當將銀離子沉積在電極上以定義電荷的標準單位(庫倫)時，只有電荷(如上所定義)是重要的。必須存在某一最小電壓以產生電流，但不能從預測定電壓測定沉積離子的量。相應地，遞送至電穿孔器中細胞的帶電顆粒的量也不能衍生自施加于電極的電壓。電穿孔的有效性受限于這一事實脈沖強度存在閾值和上限，閾值之下不發生電穿孔而高于上限會破壞細胞。實驗數據顯示上限和下限之間的差異;[艮小以致于;f艮難設計有效的脈沖方案而不存在不適當的實驗。這使得該技術使用困難，主要是當目標組織天然具有非均一的細胞組分時，例如不同厚度的表皮和真皮中的皮膚細胞以及層(strata)、脂肪、筋膜(fascia)的數量，不同大小的血管從毛細血管至小血管；只有可以即時(instantaneously)分析個體與個體之間以及個體皮膚表面位點之間的即時條件變化的精確(true)軟件驅動裝置可以滿足這些要求。而且，電極應該適應皮膚形態學并防止皮膚損傷和出血。針對電穿孔裝置的參考文獻例證了電極裝置和體內電穿孔方法的可用性。相應地有4艮多美國專利主張特異電極或電穿孔方法。例如，Zhang,等人的美國專利6302874描述了電輔助局部遞送用于美容應用的試劑的方法。Hofman等人的美國專利5676646教導了經電穿孔裝置的流動將分子植入患者的活血細胞中。Hofman等人的美國專利6241701和6233482描述了電穿孔介導的遞送藥物和基因的方法和裝置。更具體而言，他們描述了用電穿孔和化療劑組合治療腫瘤以產生體內胂瘤退化的電穿孔療法("EPT，，)的方法和裝置。Hofman等人的美國專利6216034描述了編程用于組織電穿孔療法的針狀電極陣列的程序化方法。Hofman等人的美國專利6208893描述了具有連接電極才莫板的電穿孔裝置。Hofman等人的美國專利6192270描述了裝置的電才及組件和3爭表面分子遞送的方法。Hofman等人的美國專利6181964描述了最小侵入性裝置和電穿孔遞送藥物和基因至組織的方法。Nanda等人的美國專利6150148描述了根據使用者特定脈沖和溫度曲線方案通過產生和應用電場以控制過程中的溫度的電穿孔裝置。Hofman等人的美國專利6120493描述了使用電場電穿孔裝置引入治療藥劑的方法。Hofman等人的美國專利6096020描述了根據使用者特定脈沖方案以產生和施加電場的電穿孔方法和裝置。Hofman等人的美國專利6068650描述了用于體內電穿孔療法的選擇性應用針陣列結構的方法以及Hofman等人的美國專利5702359描述了應用電穿孔至患者身體的一部分并具有感應元件感應電極間距離并產生與所述電才及之間的距離成正比的距離信號的電極裝置，以及對所述距離信號具有響應性用于應用高振幅電信號脈沖至與所述電極間距離成比例的電極的方法。Mathiesen等人的美國專利出版物2005/0070841公開了電穿孔裝置和注射裝置。所有這些引用專利均以參考形式并于本文。與本文所示新穎皮膚電極組合使用并用于本文所述實驗中的裝置主張于美國專利出版物2004/0167458和美國專利出版物2005/0052630,其各自的完整內容以參考形式并于本文。最近報導了通過使用電穿孔增強體內質粒表達以及分泌型蛋白所達到生理學水平的進展(Draghia-Akli等，TechnologyinCancerResearch&Treatment1:365-371(2002)。研究顯示注射表達生長激素釋放激素("GHRH")的質粒然后電穿孔是可擴展的并且代表了用于穩定生產治療大型哺乳動物的分泌蛋白的方法(Dmghia-Akli等，JournalofAnimalScience81:2301-2310(2003);Dmghia-Akli等，FASEBJ17S26-528(2003))。仍然需要電穿孔技術的其他改進，尤其是用于接種目的和基因治療的有效皮膚電穿孔以及侵入性和疼痛降低的電穿孔。之前的研究者已使用電穿孔裝置用于質粒DNA轉移，其概念性的基于恒定電壓系統，使用電極間的預設定電壓。因為包埋在組織中的電極之間的阻抗在不同情況下和不同組織中存在差異，預設定電壓不能產生預定電流。除了喪失完美的方波功能，預定電壓脈沖引起在脈沖持續中流經肌肉組織的電流未經調節的增長。相反，恒流電源事實上可以維持流經肌肉組織的方波功能恒定電流。但是，現有的市售電穿孔裝置不具有經設計可測定細胞所暴露的精確電流量的固件。傳統電穿孔裝置產生的未調節電流可能在在組織中生成很容易殺死細胞的大量熱量。例如，流經典型的25歐姆("。")負載阻抗的平均電流為5安培("A"或"Amp")的典型的50毫秒(ms)電脈沖理論上可將組織溫度升高7.5。C,這足以殺死細胞。Lee等人綜述了電休克引起的組織損傷物理學(Lee等，Annu.Rev.Biomed.Eng2:477-509.:477-509(2000))。因此，需要通過提供有效控制遞送至細胞的電量避免與恒定電壓電穿孔相關的技術問題并藉此達到熟練的電穿孔同時限制對細胞的破壞。許多電極存在的問題根源于這一事實脈沖能量濃縮在陣列中央，即放置被轉染材料的位點。結果，能量傳送的空間分布具有非常不均一的特性。因此，只有電極組件所包容體積中的一部分細胞被電穿孔。因此也需要一些應用以通過精確控制與細胞膜中的管道碰撞的離子流提供有效控制遞送至電極間空間的細胞的電流量的方法。而且，用于大型動物應用和人類的現有市售電極都不允許ID或SQ粑向樹突狀細胞，因為它們通常太長并且具有不適當的規格和不適宜的斜面方向。因此，需要皮膚電穿孔儀的某些應用，可以輔助內體遞送生物分子(例如質粒)至皮膚組織，例如動物的ID或SQ空間。此外，可商業購買的電穿孔裝置和針陣列不允許控制組織電阻、厚度和局部條件的個體間和個體內差異。使用這些儀器，將預設定電壓遞送至電極，不考慮個體的組織電阻或厚度。因此，需要允許能考慮到脈沖之前或過程中個體差異的適應性電穿孔的電穿孔裝置和皮膚電才及。此外，使用皮膚和肌肉侵入性可替換針陣列作為電極遞送電流的電穿孔裝置在發生針陣列替換時需要維持無菌條件。這從醫療實踐和調控順應性角度而言都是必要的。同時，需要一次性(disposable)皮膚電極以允許更低的生產成本和在治療和預防目的的大規模接種中使用。因此，需要提供允許簡易替換針皮膚陣列(needleskinarray)的皮膚電極盤。發明概述在本發明的一方面提供了通過向組織遞送恒定電流對哺乳動物組織進行電穿孔的電穿孔裝置，其中該組織優選皮膚組織。在一些實施方案中，將電穿孔裝置配置成可以向期望的哺乳動物組織遞送能量脈沖并產生與使用者輸入的預設定電流相似的恒定電流。電穿孔裝置包含電穿孔組件和皮膚電極組件。電穿孔組件可遞送在期望組織中產生恒定電流的能量脈沖并包括反饋機制。皮膚電極組件包括在空間排布中具有多個皮膚電極的電極陣列，其中所述皮膚電極組件接受來自電穿孔組件的能量脈沖并將其通過皮膚電極遞送至期望組織。在能量脈沖傳送中多個皮膚電極的至少一個為中性(neutral)并測定期望組織中的阻抗并將該阻抗傳遞至電穿孔組件。反々貴才幾制可接受已測定的阻抗并可調節由電穿孔組件遞送的能量脈沖以維持恒流。在本發明的一方面提供了經配置向期望哺乳動物組織遞送能量脈沖以在期望組織產生與使用者輸入的預設定電流相似的電穿孔手柄組件。該手柄組件包含在空間排布中具有多個皮膚電極的電極陣列，其中所述皮膚電極組件接受來自電穿孔組件的能量脈沖并將其通過皮膚電極遞送至期望組織。與皮膚電極陣列聯通的控制器。該控制器可控制經皮膚電極的能量脈沖的傳送；以及實施反饋機制的方法，其中通過軟件或硬件實施反饋機制，其接受來自中性皮膚電極的已測定阻抗并按需要調節所遞送的能量脈沖以維持恒定電流。在本發明的一個方面提供了使用本發明的電穿孔裝置向哺乳動物的組織細J包遞送生物分子的方法。在一些實施方案中，該方法包括使用本文描述的皮膚電穿孔裝置向期望皮膚組織遞送能量脈沖以產生與使用者輸入的預設定電流相似的恒定電流。該類方法包括將多個針狀皮膚電極插入皮膚組織中而基本不刺入肌肉組織；將能量脈沖施加至多個針狀皮膚電極以遞送與皮膚組織中預設定電流相同的電流；用多個針狀皮膚電極中的一個中性電極測量阻抗并使用電穿孔裝置中的反饋機制響應已測阻抗調節施加的能量脈沖以維持遞送至皮膚組織的電流恒定。在本發明的一些實施方案中提供了包含以下步驟的方法提供具有多個針狀皮膚電極的皮膚電極組件；與電流波形發生器電連接的皮膚電極組件；將哺乳動物皮膚與多個針狀皮膚電極接觸而基本上不刺入哺乳動物的肌肉組織；將電流波形發生器的電能量脈沖施加至多個針狀皮膚電極一段時間并在可將所接觸皮膚組織有效暴露在基本恒定電流的條件下進行。附圖簡述通過參考附圖本領域技術人員可更好地理解本發明的多個目標和優點。圖1顯示了皮膚結構示意圖。最表面的區域為表皮(1.1),其可進一步分為5層角質層(l丄l)、岸束層(l丄2)、透明層(l丄3)、顆粒層(l丄4)和基底層(l丄5)。真皮(1.2)位于表皮之下，是血管化非常豐富的區域；毛根和汗腺均位于這一層。皮下層位于真皮之下。圖2A顯示了本文所述EP裝置優選實施方案的圖解。圖2B顯示了可為本文所述EP裝置一部分的控制器的實例。圖2C顯示了在脈沖序列末端下載的實際脈沖序列記錄，使射至25kg豬的ro和SQ皮^層之后遞送電脈沖；("2.1")、顯示通過紅外線端口下載至個人電腦上或便攜裝置上的文件名；("2.2")顯示了受試者數量，通過數字鍵盤直接輸入皮膚EP裝置，作為EP過程可以開始之前的前提條件；("2.3")顯示了操作人員選擇的電脈沖特性，包括脈沖序列中的脈沖數量，脈沖之前和之間的等待時間(以秒計算，"s，，)，脈沖寬度(以毫秒計，"ms"),脈沖電流振幅(以安培計，"A");("2.4")顯示了在各次脈沖中各電極的電荷國對于各皮膚電極l、2、3任何下列位置都是可能的"正極"，"pos";負極，"neg";或關閉"off，-"關閉，，電極在各次脈沖之前、過程中和之后向裝置輸入信息("反饋")；("2.5")顯示了在脈沖序列的各次脈沖中的實際安培("A")、電壓("V")和注射區域的皮膚電阻，Z("歐姆")；由于每0.1-0.2ms(并且這種情況下脈沖長度為52ms)產生反饋，所以為了舉例目的僅包括了一小部分反饋文件。圖3顯示了通過皮膚EP裝置使用皮膚電極遞送電脈沖時所下載數據的圖解顯示實例。該圖描述了脈沖1("3.1")中皮膚EP裝置測定的電壓("3.1.1")和電流("3.1.2")以及脈沖2("3.2")中通過皮膚EP裝置測定的電壓("3.2.1")和電流("3.2.2")。也顯示了脈沖l("3.1")和脈沖2("3.2")的組織電阻(在電脈沖過程中測定)。圖4顯示了通過皮膚EP裝置使用大電極陣列向皮膚遞送電脈沖時所下載數據的圖解顯示實例。該圖描述了脈沖1("4.1")中皮膚EP裝置測定的電壓("4.1.1")和電流("4丄2"),脈沖2("4.2")中通過皮膚EP裝置測定的電壓("4.2.1")和電流("4.2.2")以及脈沖3("4.3")中通過皮膚EP裝置測定的電壓("4.3.1")和電流("4.3.2")。也顯示了脈沖1("4.1")、脈沖2("4.2")和脈沖3("4.3")的組織電阻(在電脈沖過程中測定)。圖5顯示了皮膚電極陣列的圖解表示，包括詳細的特性("5.1")側視圖描述了單個針狀電極的長度和插入末端的角度；("5.2")前視圖描述了反套針點(revere-trocharpoint)的角度和程度；("5.3")表明了針狀電極的規格。圖6顯示了皮膚電極手柄的視覺展示("6.1")和圖解("6丄1")用于活化阻抗檢查和電穿孔序列的觸發器；("6.1.2")當皮膚EP裝置準備治療或出現錯誤時"LED"分別顯示綠色或紅色。("6.1.3")固定于位置的皮膚電極陣列；("6丄4")包含單股電線的電纜以及皮膚電穿孔手柄和皮膚EP裝置單位之間的信號；("6丄5")單股電線，其細節描述于圖8的電線圖解中；("6.2.1")觸發器圖解；("6.2.2")LED圖解；("6.2.3")描述了用于在完的脊(raisedridge)的圖解；("6.2.4")皮膚電極陣列的針狀電極圖解；("6.2.5")固定于手柄上的皮膚電極陣列的側視解；("6.2.6")鎖臂和鎖銷(手柄上)的圖解；("6.2.7")描述用于接收和進行回路連接接觸的皮膚電極內部插座的圖解；("6.2.8")描述包含單股電線的電纜的圖解，該電線的細節顯示于圖8。圖7顯示了安裝于手柄上的皮膚電極陣列("7.1")用于接的單個插座的側視解。圖8顯示陣列和手柄組件的電線圖解。圖9顯示了允許治療受試者之間無菌加載手柄的多個皮膚電極陣列蛤殼式折疊包裝容器("9.1")蓋子；("9.2")基底，包括用戶設計的用于放置陣列的單個的孔；("9.3")孔的側視圖；以及圖IO顯示了GEP在注射了不同量的質粒pSP5-12-GFP并使用皮膚電極陣列和皮膚特異性EP條件(MA)用EP裝置電穿孔的動物中的平均表達水平，與通常用于向骨骼肌(LA)遞送質粒的電極和條件相比。圖11顯示了三電極針陣列，其中距離L-kxn,其中n表示電極數量而k表示比例常數。始11天中SEAP表達水平(pg/mL/kg)的圖片。、^圖13顯示了多個樣品第11天的SEAP表達水平以及相關ELISA結果(平均抗體稀釋)一起的圖片。圖14顯示了使用各自的表達IGF-1質粒從電穿孔的時間開始11天中IGF-1表達水平(mg/mL)的圖片。圖15展示了在豬的皮膚中給予ID/SQ質粒接著進行電穿孔(EP)之后的綠色熒光蛋白的熒光圖像。以不同劑量和體積使用通常用于IM+EP(A)的較大EP陣列或皮膚EP(B)遞送質粒。圖16展示的圖片顯示了給予pSEAP之后的4-11天豬血清中檢測到的分泌型胚胎堿性磷酸酶(SEAP)的水平。動物以濃縮制劑(10mg/mL)或常規制劑(2mg/mL)(n-5/組)接受相同的質粒劑量(lmg)。數據以小組平均應答土SEM表示。圖17圖解了非人靈長類的實驗設計圖17A顯示了在第0和第4周用低劑量(各抗原0.2mg)HIV-1免疫原和質粒編碼的獼猴IL-12免疫獼猴兩次；接著在第8和12周用高劑量(各抗原1.0mg)免疫兩次。約每兩周采集血樣用于免疫分析。每次免疫之后的兩周進行ELISpots并且在第O、4、8、12和18周進行ELISAs。圖17B展示了電極陣列和手柄的圖解。皮膚EP由具有3個無菌不銹鋼，規格26電極(3-5nm長)的單次使用陣列組成。將陣列連接至裝置的手柄施用器；可通過按壓手柄施用器上的觸發器按鈕啟動EP過程。圖18展示的圖片顯示了ID/SQ共注射質粒編碼的IL-12之后進行EP對HIV-1免疫原的細胞免疫應答增強。各次免疫后兩周進行IFNyELISpots。對env的應答用白色柱形表示而gag表示為黑色柱形，數據以疊加小組平均應答±SEM表示。圖19的圖片顯示了使用ID/SQEP對HIV-1免疫原的記憶應答增強。最后一次免疫后10周進行ELISpost測定法以檢測ID/SQ和ID/SQ+EP組中對gag和env的抗原特異性記憶應答。數據以小組平均應答±SEM。圖20的圖片顯示了ID/SQ免疫HIV-lgag、env和質粒rhlL-12之后對Tpd而不是TH2介導的細胞應答的誘導。10周時進行IL-4ELISpot以檢測對gag或evn-特異TH2應答的誘導。對env的應答以白色柱形表示，gag以黑色柱形表示，數據以疊加小組平均應答土SEM。圖21的圖片展示了p24(21A)和gpl60(21B)抗體的誘導。在第0、4、8、12和18周收集血清。分別通過p24和gpl60ELISA測定ID/SQ和ID/SQ+EP免疫組中的gag和env抗體滴度。數據以小組平均應答±SEM表示。圖22的柱形圖顯示了在不同小鼠肌肉中測定的SEAP表達。將10pgC5-12-SEAP質粒注射入小鼠的脛骨前肌(TA)和腓腸肌(G)并在4s或80s延遲后進行EP。也給小鼠注射IO|ugC5-12-SEAP而不進行EP(未EP)。與接受質粒而未EP的對照小鼠相比TA肌和G肌注射小鼠的血清SEAP水平更高(*P<1.3E-21)。注射了不含質粒骨架(NB)的表達盒并接著進行電穿孔的小鼠比未EP的NB組具有更高的SEAP水平。但是，NB組顯著低于在相同肌肉給予C5-12-SEAP的小鼠(NB4s與TA4s相比"P<0.008;NB80s與TA80s相比一P<0.004)。進行TA肌注射的小鼠比進行G肌注射的小鼠產生更高的表達并且將TA肌注射與EP之間的延遲從80s降低至4s不影響表達。圖23的條形圖顯示了分別以2mg/mL或1Omg/mL以總體積25或5j^L肌肉(IM)或皮下(ID)注射50|ugCMV-EGFP質粒之后在小鼠中定量的平均GFP表達。與給予2mg/mL濃度((ID和IM/P=0.01)的動物相比給予1Omg/mL濃度的小組中GFP表達最高，盡管相互比較時ID和IM注射位點得到相似的總體評分。圖24的柱形圖顯示了由普遍存在的CMV啟動子驅動在各種電流設置下在小鼠不同肌肉中測定的SEAP表達。檢測質粒制劑鹽水、鹽水+LGS或水+LGS。TA肌肉中于0.1A的鹽水+LGS制劑產生最高表達。接受配制于水中的質粒并以0.2A電穿孔的動物產生與相同肌肉接受0.1A的動物相比顯著較低的SEAP水平(TA，*P<0.05;G，"P<0.001)。當水+LGS用作質粒制劑時，TA肌肉的血清SEAP水平的差異不顯著，而G肌肉的差異顯著(一P〈0.04)。圖25顯示了治療后14天測定的抗SEAP抗體的滴度，其在用O.IA電流在G肌肉(當質粒配制于(A)鹽水+LGS中時)和在TA肌肉(當配置于水+LGS中時)處理的小鼠中最高。圖26顯示了繼電接觸矩陣實施方案的圖解。圖27A顯示了電穿孔功能性電流流程圖的第一部分。圖27B顯示了電穿孔功能性電流流程圖的第二部分。優選實施方案詳述提供以下縮略或簡寫定義以幫助理解本發明的優選實施方案。本文提供的縮略定義并不是詳盡的并且不與本領域所理解的定義或字典意義相悖。本文提供縮寫定義以補充或更明確地定義本領域已知的定義。術語"恒定電流，，在本文中用于定義組織或組成所述組織的細胞在遞送至相同組織的電脈沖過程中接受或經受的電流。電脈沖遞送自本文所述電穿孔裝置。該電流在電脈沖過程中在所述組織中維持恒定安培因為本文提供的電穿孔裝置具有反饋元件，優選即時反饋。反饋元件可測定在整個脈沖過程中組織(或細胞)的電阻并使電穿孔裝置改變其電能輸出(例如增加電壓)使得相同組織中的電流在整個電脈沖過程中以及脈沖與脈沖之間保持恒定。在一些實施方案中，反饋元件包含控制器。術語"反饋"或"電流反饋"可替換使用并意指所提供皮膚EP裝置的活性應答，其包括測定電極之間組織的電流并據此改變由EP裝置遞送的能量輸出以將電流維持在恒定水平。恒定水平由使用者在起始脈沖序列或電子治療之前預先設定。優選通過皮膚EP裝置的電穿孔組件例如控制器完成反饋，因為其中的電流回路可以持續監控電極間組織的電流并將所監測電流(或組織內的電流)與預設定電流對比并持續進行能量輸出調節以維持所檢測電流在預設定水平。在一些實施方案中，反饋環為即時的因為其為類比(analog)閉環反饋。本文術語"生物分子"用于指核酸序列、蛋白質、脂類、微泡(例如載藥嚢泡)和藥物。術語"電穿孔"、"電透化作用，，或"電動(electro-kinetic)增強，，("EP")在本文中可替換使用并指使用跨膜電場脈沖誘導生物膜中的顯微路徑(孔)；它們的存在允許生物分子例如質粒、寡聚核苷酸、siRNA、藥物、離子和水從細胞膜的一邊通過至另一邊。術語"分散(decentralized)電流"在本文中用于定于由本文描述的電穿孔裝置的各種針狀電極陣列遞送的電流模式(pattern),其中該模式最小化或優選消除在被電穿孔組織任何區域電穿孔相關加熱的發生。術語"皮膚區域"(或"皮膚組織")在本文中用于指皮膚組織、真皮、真皮下和真皮內("ID")、皮內，皮下("SQ")層。皮膚區域不包括肌肉組織。術語"基本不刺入"在本文中指所關注物體(例如針)刺入不超過約lmm至2mm,并優選不超過約5mm。術語"反饋機制，，在本文中用之于指由軟件或硬件(或固件)執行的過程，該過程接受和對比期望組織的阻抗(遞送脈沖能量之前，之間和/或之后)與現有數值，優選電流，并調節所遞送的脈沖能量以達到預設定的數值。術語"阻抗"在本文中在描述反饋機制時使用并可根據歐姆定律轉化成電流值，從而可與現有電流比較。在優選的實施方案中，通過類比閉環回路進行"反饋機制"。本發明的一方面設計本發明的電穿孔裝置和它們向期望哺乳動物組織遞送能量脈沖并維持其中的恒定電流的能力，該組織優選為皮內或皮下組織。優選地，電穿孔裝置為皮膚電穿孔裝置("皮膚EP裝置")。皮膚EP裝置在EP過程中優選刺入皮膚組織而基本不刺入肌肉組織。該裝置通過可此圖皮膚組織例如皮內和皮下組織的皮膚針狀電極遞送能量脈沖并傳送能量脈沖以及在能量脈沖過程中和整個電穿孔過程中維持組織中的恒定電流。本文描述的可維持被處理組織中恒定電流的皮膚EP裝置的響應性通過皮膚EP裝置的反饋機制達成，其可防止組織加熱并降低組織受損、疼痛以及促進所提供皮膚電穿孔技術的整體成功。該反饋機制是本文描述的某些軟件或硬件(或固件)的功能并優選為硬件的功能。在反饋機制為軟件一部分的實施方案中，該類軟件與控制皮膚EP裝置操作的控制器電子連接并接受來自中樞皮膚電極的阻抗、比較現有電流與該阻抗并調節遞送至期望組織的脈沖以在組織中維持恒定電流。在本發明的一個實施方案中提供了經裝配可向期望組織遞送能量脈沖并產生與使用者輸入的現有電流相似的恒定電流的電穿孔裝置。該電穿孔裝置包含電穿孔組件和皮膚電極組件。電穿孔組件可包括以及并入一個或多個皮膚EP裝置的各種元件，包括控制器、電流波形發生器、阻抗檢測器、波形記錄器、輸入元件、狀態報告元件、通信端口、記憶組件、電源和電源開關。在一些實施方案中，電穿孔組件可作為皮膚EP裝置的一個元件發揮功能，其它元件為與電穿孔組件相連的單獨元件(或組件)。在一些實施方案中，電穿孔組件可作為皮膚EP裝置的一個或多個元件發揮作用，其可進一步連接至與該電穿孔組件分離的皮膚EP裝置的其他元件。本發明不受作為機電或機械裝置一部分的皮膚EP裝置的限制，因為這些元件可作為相互之間相連的裝置或分離元件。電穿孔組件可遞送在期望組織中產生恒定電流的能量脈沖并包括反饋機制。皮膚電極組件包括在空間排布中具有多個皮膚電極的電極陣列，其中該皮膚電極組件接受來自電穿孔組件的能量脈沖并通過皮膚電極將其遞送至期望組織。在能量脈沖遞送中至少多個皮膚電極之一為中性的，測定期望組織中的阻抗并將阻抗傳遞至電穿孔組件。該反饋機制可接受已測定的阻抗并可調節電穿孔組件遞送的能量脈沖以維持恒定電流。在一些實施方案中，期望組織為皮膚組織并優選皮下組織或皮內組織。圖2A顯示了本文提供的EP裝置的優選實施方案的體系圖解。該圖解顯示了EP裝置的主要功能元件，但是僅用做說明目的因為并不是所有功能元件對于所有的實施方案都是必需的。以各元件的硬件功能描述各元件。由硬件啟用的事件序列可由軟件控制，如本文所述。該裝置的中心元件為該實施例中的控制器。控制器的一個實例圖解顯示于圖2B,其為微控制器，其在一些實施方案中為TexasInstrumentsmsp43OF149或Motorola68HC908AZ60A。其它可選擇的控制器為電子工程領域技術人員已知并可輕易取代上述例證性實例。在一些實施方案中，皮膚電極為針狀電極、導電桿或導電薄膜區域并優選針狀電極。優選地，針狀電極可與皮內或皮下組織接觸并基本不刺入肌肉組織。在一些實施方案中，該組織電才及可安裝于基座上，其可為塑料材料，形成具有皮膚電極陣列(或皮膚陣列或皮膚針陣列)的可替代或可替換皮膚電極，其可與本文所述的皮膚EP裝置相連使用。在一些實施方案中，該皮膚電極的長度可為約lmm至20mm;lmm至12mm;2mm至10mm;2mm至7mm;或長約5mm。在一些實施方案中該皮膚電極可為規格22或28;規才各23至27;規格24至27,或約規格26。優選地，該皮膚電極長約5mm并為規格26。在一些實施方案中該皮膚電極僅為真正與患者皮膚接觸的皮膚EP裝置的一部分(以防止交叉污染)。可向所選區域遞送疫苗制劑，該區域;故皮膚陣列包圍并且皮膚電極插入皮膚中。該皮膚陣列優選在插入皮膚的皮膚電極四周產生均一壓力，并藉此輔助在目標區域的EP過程中生成均一的電場。在一些實施方案中，該皮膚電極組件進一步包含活化器開關以及可報告皮膚電極組件活化的狀態指示器。在一些實施方案中，該電極陣列包含至少三個皮膚電極并優選具有三角形空間排布的三個電極。優選地，該三角形為等腰三角形。在一些實施方案中，電極陣列包含空間排列成等腰三角形的三個皮膚電極，其腰長為5mm并且底邊長3mm。在一些實施方案中，該電極陣列為一次性的并與皮膚電極組件可移除性地相連。優選地，該一次性電極陣列為皮膚電極盤并更優選該皮膚電極盤為無菌的。在一些實施方案中，多個皮膚電極可以分散模式遞送能量脈沖。在一些實施方案中，該多個皮膚電極可在程序化序列下通過控制皮膚電極以分散方式遞送能量脈沖，并且該程序化序列由使用者輸入值電穿孔組件中。在一些實施方案中，該程序化序列包含按序列傳送的多個脈沖，其中多個脈沖的各脈沖由至少兩個(一個中性電極測定阻抗)活性皮膚電極遞送，并且其中多個脈沖的后續脈沖由至少兩個活性電極的另外一個遞送并具有一個中性皮膚電極測定阻抗。在一些實施方案中，反饋機制由硬件或軟件執行。優選地，該反饋裝置由類比閉環回路執行。優選地，該反饋每50ius、20|iis、10)US或1JLIS發生但是優選實時反饋或即時(即由測定響應時間的可用技術測定為基本即時)。在一些實施方案中，中性電極測量期望組織中的阻抗并將阻抗傳遞至反饋機制，反饋機制響應該阻抗并調節能量脈沖以將恒定電流維持在與現有電流相似的數值。在一些實施方案中，該反饋機制可在能量脈沖的傳遞中持續和即時維持恒定電流。在一些實施方案中，該皮膚電穿孔裝置也包括接受來自使用者的輸入的控制器并控制電穿孔組件根據輸入遞送能量脈沖。在一些實施方案中，該控制器接受來自使用者的輸入并控制電穿孔組件根據輸入遞送能量脈沖。優選該控制器為單芯片微控制器。在一些實施方案中，皮膚EP的元件為控制器，其可控制與其連接或與其相連的各種外接裝置。該控制器用于管理電穿孔程序，其包括以下操作(1)通過控制電流波形生成器為電極組件生成電穿孔點火序列或恒定電流脈沖模式；(2)進行阻抗檢測以確定是否進行電脈沖；(3)傳感和處理使用者指令；(4)提供使用者狀態信息；(5)通過通信端口將電穿孔數據傳遞至外部電子裝置；(6)保存和檢索電穿孔數據(例如，電壓和電流曲線)至存儲器。控制器可通過軟件或固件應用操作，其允許使用者輸入期望脈沖參數和程序化序列(包括電極點火序列)并控制皮膚EP裝置的操作。在一些實施方案中，該控制器包括或使用可有效處理來自使用者和進行皮膚EP的組織的信息并控制電能量輸出以向組織遞送恒定電流的軟件程序化。程序化內容可包括在電穿孔之前預選的多個脈沖參數任何之一，包括預設定電流、程序化序列(電極點火序列)、脈沖持續時間、脈沖數量(在脈沖串(train)中)，預設定電流周圍的允許誤差。該接受和加工輸入并產生相同的以確定電子輸出的過程可發生在電脈沖持續期間并可優選發生在l毫秒(ms)之內，更優選100毫秒(ius)之內，更優選IOius之內并且甚至更優選lilis之內。在一些實施方案中，該過程實時或即時發生。在本文描述的EP皮膚裝置操作的實例中，該控制器可根據程序化序列通過至少將期望恒定電流設置成現有電流遞送能量脈沖。在一個實施方案中，類比閉環反饋回路通過調節施加至電極的電壓(由于目標組織電阻變化，優選皮膚)維持期望的恒定電流。當通過設定期望輸出電流至O滿足脈沖時長時控制器可結束脈沖。當脈沖序列結束時，控制器可復查波形數據并在期望組織的電流超出電穿孔序列中預定電流周圍的誤差時提醒使用者。控制器可為單芯片微控制器，優選具有一個或更多以下性質的處理器充足的I/0,板上外設(on-boardperipherals),低耗電和大記憶容量。在一些實施方案中，該控制器包含TexasInstrumentsprocessormsp43OF149。軟件可指導電穿孔過程的步驟并指導與硬件的連接步驟，優選固件因為其永存其中并從單芯片微控制器運行。在一些實施方案中，該軟件執行一種算法，其包括接受裝置使用者的輸入，接受脈沖接受組織中電阻上的來自針狀電極的信息或其中的電流并基于在各電脈沖中的輸入調節電流輸出。在一些實施方案中，皮膚電穿孔裝置也包括與電穿孔組件連接并與皮膚電極組件電子連接的電流波形發生器；該電流波形發生器生成經皮膚電極組件遞送的電流脈沖串波形的電流波形發生器。在一些實施方案中，使用者輸入程序化序列至電穿孔組件，其將程序化序列傳遞至電流波形發生器；其中該電流波形發生器可根據所提供的程序化序列生成電脈沖串波形。優選地，該電流波形生成器為功率晶體管類比回路。該電流波形生成器可根據程序化序列生成通過電極陣列電極的電脈沖串波形。該脈沖串優選方形并且脈沖的數量受限于軟件或固件并優選1至10個脈沖，更優選2至5個脈沖，更優選2至3個脈沖。向各電極組合施加一個脈沖。在一些實施方案中，脈沖持續時間為20ms至52ms并且以lHz的速率發生。該脈沖串的振幅可由操作者程序設計并且范圍從0.1安培(A或Amp)至1.5A增量為0.1A。在本發明的一個實施方案中，脈沖振幅低于0.4A并優選0.1至0.2A之間(見圖2和3)。可以個體組織電阻(個體之間以及相同個體身體不同區域，優選皮膚組織)調節脈沖串的振幅。電流波形發生器可包含一般功率晶體管類比回路，其可在控制器的指導下發揮功能。在一些實施方案中，皮膚電穿孔裝置也包括可檢測皮膚電極和期望組織之間電子連接建立的阻抗沖企測器。阻抗沖企測器可用于測定皮膚EP裝置的回路是否與組織之間建立了適當的電子連接。這一檢測驗證所插入的皮膚電極已與手柄建立了良好的連接以及皮膚電極與組織之間具有良好連接。EP治療之前可進行阻抗檢測。如果任何阻抗測量落在電阻程序化范圍之外(以歐姆測量，Q),阻抗沖企測失敗并且不啟動電穿孔序列。參見圖27A的電穿孔功能流程圖，尤其是決策箱27A.10,如果阻抗被啟用(即電極和期望組織之間的電子接觸未建立)其可導致點火延遲。阻抗檢測具有操作器程序控制特點，由在操作中可禁用的軟件或固件控制。阻抗檢測器由功能受控制器指導的一般運算放大器類比回路組成。阻抗檢測器可在皮膚EP裝置中作為安全裝置發揮功能。它可以指示，例如，是否所有的電極都已插入相同的組織并且可建立一個回路。與空氣接觸尤其是干燥空氣接觸的電極具有極高的電阻。如果開始電穿孔并且一個或多個電極未刺入皮膚(使用皮膚電極和進行皮膚EP操作時真正存在的可能性)，所得電極電壓可為上萬伏特，其對受試者可能具有致死或損傷后果并且也損傷皮膚EP裝置。由于這一原因，可實施過載電壓保護以防止電極上的過量電壓。在一些實施方案中，電穿孔裝置包括安全特征(safetyfeature),當調整能量脈沖將得到高于電壓限(voltagecap)的電壓時該安全特征為防止裝置向組織遞送能量脈沖的電壓限。不考慮電負荷(例如，空氣、皮膚或肌肉組織)，如果Vij在多于lms的時間內超過200V可使用過電壓保護(或觸發安全限(safetycap))。Vi』為電極i和j之間的電壓，其中i,j-l至5。如果使用過電壓保護(或觸發安全限)，V^接近OV直至點火下一個電穿孔脈沖。當皮膚EP裝置為關閉狀態時任何電極對之間的電壓優選不超過IOV。在一些實施方案中，皮膚電穿孔裝置也包括與電穿孔組件連接的波形記錄器。優選地，該波形記錄器可在能量脈沖過程中持續記錄電穿孔電壓和電流波形。更優選地，該波形記錄器可以2000個樣品每秒的速度記錄電穿孔電壓和電流波形。通過取樣和監控電穿孔操作的參數，波形記錄器使得使用者能夠接受并處理可能的問題并調節電穿孔操作失敗或不能達到預期結果這些事件中的設置。示例性取樣速度為2000個樣品每秒，52毫秒(ms)的2-3個電脈沖約104個樣品。示例性總取樣時間為2208ms,取樣起始于點火笫一次脈沖前約50ms并以2-脈沖^t式在最后一次脈沖后50ms結束。電壓和電流波形以具有±1個最低有效位("LSB")線性的12位數字表示法定量。電流波形分辨率優選至少10毫安(mA)并且電壓波形分辨率應當優選至少1.0V。波形記錄器可由一般的運算放放大器類比回路和適用于控制器的模擬-數字("A/D")轉換器組成。皮膚轉輸DNA制劑特性的波形記錄器的實例列于表2C(請參考"2.5")。在一些實施方案中，皮膚電穿孔裝置也包括與使用者和電穿孔組分直接通信的輸入裝置該輸入裝置可接受輸入指令并將該輸入指令傳遞至電穿孔組件。優選地，該輸入裝置為數字鍵盤或觸屏。在一個實例中，可由操作者通過數字4建盤(例如Grayhill88AB2)輸入EP裝置操作參數。在優選的實施方案中，輸入鍵盤的數字顯示在液晶顯示器("LCD")上。可程序控制的典型參數為電穿孔脈沖電流、阻抗檢測啟用/禁用和電穿孔點火延遲。與鍵盤相關的裝置也可由控制器指導。可用于使用所述皮膚EP裝置之一進行電穿孔的信息實例包括受試者識別號碼、順序中的脈沖數量、預等待時間(秒，s,sec)、脈沖寬度(ms)、脈沖電流(Amp)以及皮膚電極陣列針狀電極的轉換類型(受試者識別號碼以及所有電穿孔條件為自動記錄并可用于分析)。可用于使用所述皮膚EP裝置之一進行電穿孔的信息實例見圖2C(注意受試者識別號碼以及所有電穿孔條件為自動記錄并可用于分析)。在一些實施方案中，皮膚EP裝置可進一步包括用于顯示或提醒操作者系統狀態的狀態報告元件。在一些實施方案中，皮膚電穿孔裝置也包括與電穿孔組件通信的狀態報告元件。優選地，狀態報告元件為信息顯示板、語音提示、發光二極管或其組合。該狀態報告元件可報告能量脈沖生成的確認和恒定電流的遞送。這些狀態報告元件可包括信息顯示板，例如液晶顯示器("LCD")(例如，LumexLCM-S02004DSF)。LCD優選為特征顯示類型并優選可以顯示4行20個字。LCD也優選安裝有可由肘節開關打開和關閉的背景光。狀態信息也由語音提示器提供，例如以各種音調發聲的蜂鳴器(例如，CUICEP-2202AS)。各音調優選具有不同的含義，由軟件或固件控制。例如，蜂鳴器的音量可具有3個程序可控的設置并且距蜂鳴器1米處的范圍大略為60-80dB。提供聲壓水平范圍僅作為參考。如果設定至其最高水平在嘈雜環境中(例如農場或軍事圍地(militarycompound))可以聽見并且當設定至其最低水平在安靜環境中(例如辦公室)聲音不是很高那么該聲音水平是可接受的。此外，皮膚EP裝置可安裝發光二極管("LED")(例如，LumexSSI-LXR1612ID或任何安裝于面板的紅色LED)以指示元件是打開還是關閉。優選地，狀態報告元件包括在完成電脈沖序列后在LCD上對成功生成電場的可^L化確認。在一個實施方案中，在每次電穿孔過程(或電穿孔序列)后，LCD將顯示一列三至五個數字，或"1"或"0"，各用于電穿孔序列的各脈沖。"0"表示脈沖正常，"1"表示脈沖不正常。更具體而言，各脈沖必須達到所述設定電流的至少90%才是正常的或者LCD上顯示"0"。如果某一脈沖小于設定電流的90%,該脈沖不正常并且顯示"1"。此外，顯示不正常脈沖的最低和平均電流。舉例而言，對于設定于0.5Amp電流的五次脈沖電穿孔序列而言，如果脈沖3和5僅分別達到0.4Amp和0.3Amp,將顯示"00101"以及"低:60%平均80%"。在一些實施方案中，皮膚電穿孔裝置也包括與電穿孔組件通信的通信端口。在一些實施方案中該通信端口可用于上傳電穿孔波形數據至外部電子裝置，例如便攜個人電腦(例如，"PocketPC")、個人數據助手("PDA")或個人電腦("PC")用于復查。優選地，該通信端口為串行通信端口，例如紅外("IR")端口(例如，收發器(Transceiver):ACTiSYSACT畫IR220LN115,或ZilogZH1201;編碼器(Encoder):MicrochipMCP2120或TITIR1000)。在一些實施方案中，皮膚電穿孔裝置也包括與電穿孔組件通信的存儲器組件。存儲器組件可儲存電穿孔波形數據和操作參數。優選地，該存儲器組件(例如，AtmelAT45DB321B或AT45DB321C-TU)為非易失的，意味著即使關閉皮膚EP裝置仍然保留這些數據。為了保存存儲器，僅可在電穿孔脈沖序列的活化階段將電穿孔波形數據保存至存儲器。在非活化階段，只有任一波形超過特定閾值時才可將取樣數據存儲在存儲器中。舉例而言，這些閾值可為2V的電壓閾值和1OmA的電流閾值。在電脈沖序列的非活化階段存儲至存儲器的數據可能具有時戳(timestamped)這樣一旦重構波形即可知數據的時間指數。存儲量可存儲脈沖序列的非活化階段發生的多至40個樣品(20ms)的數據。存儲可限制于20ms因為軟件可設定如果超過任一閾值的累積時間多于20ms將停止之后的電穿孔序列。當實施上述壓縮技術時電穿孔波形數據設置需要約2kB的內存。皮膚EP裝置的存儲器組件優選包含足夠的內存保存至少8000個脈沖(各脈沖單獨存儲)。在一些實施方案中，皮膚電穿孔裝置也包括與電穿孔組件相連的能量源。優選地，該能量源為電池，更優選為例如鋰離子、鎳金屬氫化物、鉛酸或鎳鎘電池這樣的電池。在一些實施方案中，該能量源優選為電池(例如，兩個6VPanasonicLC-R064R5P4.5Ah,兩個6VgenesisNP7-66V7.0Ah)并用于向皮膚裝置的各回路提供電源。這些回路包括用于控制器及其外圍的低電壓/低功率容量電源，阻抗檢測器的低電壓和低功率容量電源以及電流波形發生器的高功率容量電源。電源開關(例如，E-SwitchR5CBLKBLKEF0,或任何DPDT10A安裝于面板的翹板開關)控制皮膚EP裝置的電源并可打開或關閉。在關閉位置，與電極組件的所有電連接在關閉電源5秒內為電中性。在本發明的一方面提供了電穿孔手柄組件(或"手柄組件")，其經配置向哺乳動物的期望組織遞送能量脈沖以在期望組織中產生與使用者輸入的預設定電流相似的恒定電流。手柄組件包含具有在空間排列中的多個皮膚電極的皮膚電極，其中至少一個皮膚電極在傳送輸能量脈沖過程中為中性并測量期望組織中的阻抗；與皮膚電極陣列通信的控制器，該控制器控制經皮膚電極的能量脈沖的傳送；執行反饋機制的工具，其中該反饋機制由軟件或硬件執行，其接受從中性皮膚電極測定的阻抗并在需要時調節所遞送的能量脈沖以維持恒定的電流。在一些實施方案中，皮膚EP裝置也包括皮膚電極手柄組件。優選地，該手柄組件包括三個元件皮膚電極陣列(優選皮膚針狀電極陣列)、用于報告皮膚EP裝置狀態的狀態指示器和活化器開關。該陣列可包括任何數量的具有一種或更多種不同空間排列的針狀電極并優選包括奇數個電極并且優選較低數量的電極，優選7個電極或更少。在優選的實施方案中，針狀皮膚電極陣列為環形并包含以等腰形式放置的三個針狀皮膚電極，長邊為5mm,底為3mm;這一放置形式^C認為對于脈沖模式和電場生成以及最終皮膚EP的質量是重要的。優選在手柄組件上通過使用狀態指示器指示皮膚EP裝置的狀態，例如一個或多個LED,其可具有多種顏色并經程序化間歇閃爍以指明電極點火序列的多個步驟。手柄組件活化器開關優選用于起始電極點火序列的多個步驟("6丄1")。在一些實施方案中，手柄組件是無線的并可由電穿孔組件(或控制器)遠程操作。該無線手柄組件可接受來自電穿孔組件(或控制器)的信息，包括程序化序列和脈沖參數并向期望組織遞送能量脈沖并在相同組織內維持恒定電流。無線手柄組件可包括維持其操作電荷的內置電池或電容器。優選地，該無線手柄組件將包括反饋機制，優選類比閉環回路。無線手柄組件可與電穿孔組件對接并交換信息以提供本文描述的皮膚EP裝置的一個或多個功能。在一些實施方案中，電極陣列為一次性的并與皮膚電極組件可移除式連接。優選地，該一次性電極陣列為皮膚電極盤并且更優選地，該皮月夫電才及盤為無菌的。在本發明的一個實施方案中，皮膚EP裝置包括可替換皮膚電極盤，其可移除地安裝于手柄組件中。在優選的實施方案中，該可替換的皮膚電極盤安裝在皮膚EP裝置的手柄組件上。圖6.1和6.2描述了電極陣列的側視圖("6.2.3"和"6.2.5")。在圖6.1和6.2中，該電極盤具有以空間排列安裝于支架結構上的針狀皮膚電極用于刺入所選組織尤其是皮膚。在優選的實施方案中，該空間排列為環形皮膚陣列。皮膚電極盤上手柄一側上的針狀陣列中的單個皮膚電極為鈍頭并經去毛刺用于插入手柄中的互補電接觸配件中。手柄優選安裝從針狀皮膚電極至脈沖發生器或皮膚裝置的電連接。在優選的實施方案中，皮膚EP裝置皮膚電極組件以及可替換皮膚電極盤中的針狀皮膚電極為環形陣列。在優選的實施方案中，該多個針狀皮膚電極由三個針狀皮膚電極組成。在另一優選的實施方案中，三個針狀皮膚電極的中心落于由2條5mm的邊和一條3mm的小的底形成的形狀中的環形陣列中。在優選的實施方案中，針狀皮膚電極在特定的包裝系統(圖9)中無菌保存，該系統允許在接受治療的受試者之間快速改變皮膚電極陣列并同時維持各皮膚電極陣列無菌。在一些實施方案中，提供了用于操作皮膚EP裝置的程序化序列，其控制各皮膚針狀電極陣列是否可作為正極、負極或中性電極發揮功能。例如，如圖2C所示，在程序化序列中各電極可以正極、負極或關閉狀態發揮作用。描述了圖2C中的完整序列，其中電極1至3相繼成為正極電極，皮膚陣列對角具有兩個負電荷電極("2.4"-第二列)，或者一個電極關閉，一個正極，一個負極("2.4"-第四列)。在一些實施方案中，電穿孔組件包含控制器；與該控制器電連接的波形發生器；與該控制器電連接的波形記錄器；以及與波形發生器連接的電池。控制器可接受使用者的輸入，根據輸入命令波形發生器遞送能量脈沖至期望組織并根據遞送的能量脈沖將數據傳送至波形記錄器；并且其中該電池向波形發生器傳送電荷，電池為鋰離子、鎳金屬氫化物、鉛酸或鎳鎘電池。優選地，該裝置為便攜式。可通過電池組操作便攜裝置并適用于治療或預防目的的大規模接種。在本發明的一些實施方案中提供了使用本文描述的皮膚電穿孔裝置向期望皮膚組織遞送能量脈沖以產生與使用者輸入的預設定電流相似的恒定電流的方法。這些方法包括將多個針狀皮膚電極插入皮膚組織而基本不刺入肌肉組織；向多個針狀皮膚電極施加能量脈沖以遞送與皮膚組織中的預設定電流相等的電流；用多個針狀皮膚電極中的一個中性電極測量皮膚組織的阻抗并響應所測定的阻抗使用電穿孔裝置中的反饋機制調節所施加的能量脈沖以維持傳送至皮膚組織的電流恒定。在一個優選的實施方案中，使用皮膚EP裝置的方法包括按照例如圖27A和27B提供的流程圖描述的電穿孔功能序列進行。具體而言，圖27B中的27B.10顯示了"產生電脈沖"步驟的放大(blow-up)并描述了反饋機制，其優選由類比閉環回路執行并實時(或即時)操作。在一些實施方案中，這些方法進一步包括在施加能量脈沖之前測定阻抗以確定是否在期望皮膚組織和針狀皮膚電極之間建立了電連接。在一些實施方案中，本發明方法用于將至少一種DNA疫苗與所述皮內或皮下組織接觸。在一些實施方案中，本發明方法包括記錄由電穿孔裝置編輯的向期望皮膚組織遞送能量脈沖的數據。在本發明的一些實施方案中提供了包含以下步驟的方法提供具有多個針狀皮膚電極的皮膚電極組件，與電流波形發生器電子相連的皮膚電極組件；將哺乳動物的皮膚與多個針狀皮膚電極接觸而基本不刺入哺乳動物的肌肉組織；并將來自電流波形發生器的能量電脈沖施加至多個針狀皮膚電極一段時間并在可將皮膚組織有效暴露于基本恒定電流的條件下。在一些實施方案中，施加電能量脈沖包括以下步驟用多個針狀皮膚電極中的一個中性電極測量所接觸皮膚組織的阻抗；將所測阻抗傳遞至與電流波形發生器相連的反饋機制，其中該反饋機制響應所測阻抗并調節傳送自電流波形發生器的能量脈沖以維持基本穩定的電流。在一些實施方案中，由作為電穿孔裝置一部分的類比閉環回路執行反饋抑制并在能量脈沖的整個過程中即時進行測量和通信步驟。本發明的一方面涉及皮膚EP裝置，其可進行生物分子(例如DNA質粒)的體內電穿孔至期望皮膚組織或皮膚細胞。在一些實施方案中該皮膚EP裝置向所關注皮膚組織經皮膚電極針狀陣列提供恒流電場并輔助將生物分子引入所選皮膚組織的細胞中，優選皮下(SQ)和/或皮內(ID)組織。該皮膚EP裝置產生與程序化序列一致的通過皮膚電極針狀陣列的電極的電脈沖串波形并可在操作中監控和記錄。針狀電極可接觸皮膚組織，例如SD或ID組織而基本不刺入肌肉組織。該皮膚EP裝置產生與程序化序列一致的通過皮膚電極針狀陣列的電極的電脈沖串波形并可在操作中監控和記錄(見圖2C)。針狀電極可接觸皮內或皮下組織而基本不刺入月幾肉組織。美國專利7245963號和美國專利出版物2005/0052630公開了根據本發明可使用的某些電穿孔組件的系統圖解，其中它們可適用于皮膚EP裝置中或作為其一部分。本文以該元件的硬件功能描述各元件。這些出版物的完整內容以參考形式并于本文。由硬件啟用的事件序列由軟件或固件或二者的組合控制，如本文所述。在一些實施方案中，皮膚EP裝置的電穿孔組件包括電極-連接繼電器(relay)矩陣，其可輔助程序化序列并可操作皮膚電極組件中電極的點火。繼電器矩陣可控制各電極，優選針狀電極，這樣各電極處于五種狀態之一關閉、正極低電壓、阻抗測量輸入、正極高電壓和負極(調控)高電壓。在一個實施方案中，繼電器矩陣包括ll個雙極、可產生切換矩陣的雙擲(DPDT)繼電器。這些繼電器中的IO個由一組與串行外設接口(SPI)端口連接作為SPI至并行端口的移位寄存器驅動。SPI從入主出(SIMO)與兩個74VHC595(或經認可的等同芯片)的移位寄存器的數據輸入引腳連接。74VHC595具有兩個時鐘輸入。通用串行同步/異步通信接口時鐘(UCLK)信號與用于轉移數據至寄存器的寄存器移位寄存器時鐘輸入(SCK)引腳連接。單獨的通用輸入輸出(GPIO)引腳通向存儲寄存器時鐘(RCK)的時鐘輸入，用于將移位寄存器數據并行時鐘(clock)至輸出寄存器。結果是相同的串行數據移動(shifted)到兩個移位寄存器中，但隨后數據僅被時鐘(clockedinto)到待變的輸出寄存器中。為了驅動實際的繼電器線圈，SPI端口回路的輸出(feed)2個ULN2003A(或經認可的同等物)8信道繼電器線圏驅動器。該芯片主要為集電極開路雙極結晶體管(BJTs)陣列。各信道輸出也具有橫跨的內部回程二極管-不需要外部二極管。繼電器線圏的正極面限制在15伏，線圈的陰極面經ULN2003A部件接地。接觸矩陣中有3組繼電器。繼電器接觸矩陣的實例可見圖26。第一組實際上為lDPDT繼電器。一組接觸將正極電壓從低電壓即阻抗測量電壓轉換200V供給的輸出。相同繼電器中的另一組接觸轉換阻抗測量回路和脈沖電流控制回路之間的負極電壓。因此，該繼電器的位置設定正極和負極電壓二者以形成電脈沖或進行阻抗測量。下一組繼電器為極性繼電器的5繼電器組。這些繼電器(每個電極一個)轉換該電極的極性至正極或負極電壓。最后一組繼電器為線內組接觸以允許各接觸相互分離為正極或負極。為了延長繼電器接觸的壽命，該矩陣僅用于以期望方式將荷載連接至適當的電極上。接著脈沖或阻抗回路通過電壓或電流至荷載。然后在打開接觸之前移除電壓或電流。由于施加電流時接觸事實上不會轉換，因此可大大延長接觸的壽命。由皮膚EP裝置產生的電脈沖的實例顯示于圖3.1和3.2。圖3.1和3.2顯示了各電脈沖的波形。波形參數為廚期(tp):1000ms土250ps.上升時間(tr):最大值20ps置位(settling)時間(ts):最大值20ias脈沖寬度(tw):52ms±100|us衰減(fall)時間(tf):最大值20|us額定電流(In):Ine(0.1A,0.2A,0.3A.1,5A)±10%^過程中的In并且R^100n。Rj為圖3.3和3.4顯示的任一3電極組合之間的負載電阻。圖3.1和3.2中僅限定了電流波形。電壓波形的形狀取決于電脈沖點火時電極的阻抗(th過程中)。th過程中沒有限定電壓波形因為在這一階段阻抗是未知的。th過程中經過任何電極組的電壓為0V。盡管不希望受到理論的束縛，據信電穿孔利用相同的結構并迫使高離子流經過這些結構，打開和擴大導管。金屬或電解質電極與組織接觸并且向它們施加與電極間距離成正比的預設定電壓。用于電穿孔的方案就其所得電場強度定義，根據式E-V/d,其中("E"為電場。("V")為施加電壓，("d")為電極間的距離)。當形成用于遞送藥物或生物分子至受試者細胞的電穿孔方案時電場強度E具有重要價值。因此，可以通過時間與電極間距離成正比的預設定電壓脈沖計算各種方案的電場強度。但是，值得注意的是可在具有絕緣電極的組織中產生電場(即離子流動不一定產生電場)。盡管不希望受到理論的束縛，電流對成功EP是必要的，而不是電場本身。皮膚EP裝置的電流波形發生器的活化將恒定電流電脈沖分布至多個針狀皮膚電極這樣分散EP事件發生在不產生一致EP重疊點的區域。分散EP區域細胞的通透性增加并且生物分子被遞送至受試者細胞中而不會過度加熱和損害細胞或組織。本發明一方面涉及向動物的一個或多個細胞尤其是皮膚中引入生物分子的皮膚EP裝置，用于ID或SQ接種目的。優選地，該皮膚EP裝置向皮膚組織例如ID或SQ組織中？I入生物分子，其方式為在整個電脈沖傳送過程中在相同的組織中遞送和維持恒定電流。在一些實提供向所選組織尤其是皮膚組織植入針狀皮膚電極組件的簡ii方法。使用在手柄上具有搭鎖式固定裝置(snap-onmounts)的一次性針狀皮膚電極盤使得使用者可以快速連接和分離針狀皮膚電極盤并允許在接受治療的受試者之間的快速(并且無菌)轉換。皮膚EP裝置的電源可使用在電源插座和其他電源的獲得和使用是危險的或不方便的情況下(例如在生物恐怖襲擊中的大規模接種)使用的電池組。遞送至皮膚組織細胞例如SQ和ID組織中的生物分子包括DNA質粒、DNA疫苗(DNA質粒和DNA疫苗不互相排斥)、基因、治療藥物或其他試劑，不論是補充劑或增強劑。優選地，該生物分子為可在目標皮膚組織細胞中表達的DNA質粒，用于皮膚EP遞送的生物分子可包括多于一種生物分子。在一些實施方案中，該生物分子為DNA質粒。與本發明一起使用的DNA質粒可用于基因療法中，即將所選基因遞送至宿主用以預防、緩解或治療損傷或疾病狀態。使用皮膚EP裝置DNA質粒可在哺乳動物中表達相關基因以緩解疾病癥狀，降低疾病的致病性、消除疾病的根本誘因或預防疾病的發生。DNA質粒中的編碼基因可為獲自外源性來源的外源基因。基因療法可用于基因相關疾病，例如嚢性纖維化或肌肉萎縮癥。基因療法也可用于腫瘤的治療。優選地，DNA質粒的基因編碼釋放生長激素的激素或胰島素生長因子I,無論是合成或天然形式或其全長或功能片段。在一些實施方案中，與本發明一起使用的DNA質粒可引入哺乳動物細胞用于接種目的或接種抵抗感染性疾病，例如肝炎、流感、登革熱、日本腦炎和HIV。在一些實例中DNA質粒可表達病毒蛋白免疫原性片段的多肽。可作為生物分子通過皮膚EP遞送至皮月夫組織的藥物的實例包括具有抗腫瘤或細胞毒性作用的化療藥物，包括博來霉素、新制癌菌素、蘇拉滅、多柔比星、卡鉑、紫杉醇、絲裂霉素C和順鉑。其它化療藥物為本領域技術人員已知并可在包括默克索引的參考文獻中找到。此外，有助于跨膜遞送的試劑("遞送劑")也可作為生物分子考慮進行遞送并包括N-烷基醇酰胺和對氯苯曱酸汞。在生物分子為DNA質粒或DNA疫苗的實施方案中，與DNA質粒或DNA疫苗同時遞送，在其之前或之后遞送的另一生物分子可為附加的一個或多個DNA質粒或DNA疫苗。在其中的生物分子為預期表達誘導免疫應答的靶蛋白的DNA質粒或DNA疫苗的實施方案中，與DNA質粒或DNA疫苗同時、在其之前或之后遞送的另一生物分子可為進一步增強對該靶蛋白的免疫應答的一個或多個蛋白的基因。該類基因的實例為編碼其它細胞因子和淋巴因子者，例如oc干擾素、y干擾素、血小板衍生的生長因子(PDGF)、TNFa、TNFP、GM-CSF、內皮生長因子(EGF)、IL國1、IL國2、IL-4、IL國5、IL-6、IL-IO、IL-12、IL-18、MHC、CD80、CD86和I1^15,包括信號序列缺失的IL-5并任選包括來自IgE的信號肽。可使用的其他基因包括編碼以下者MCP-1、MIP-1、MIP-lp、IL-8、RANTES、L-選擇蛋白、P-選擇蛋白、E-選擇蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA隱1、Mac-l、p150.95、PECAM、ICAM隱1、ICAM-2、ICAM國3、CD2、LFA畫3、M-CSF、G畫CSF、IL國4、IL畫18的突變形式、CD40、CD40L、血管生長因子、IL-7、神經生長因子、血管內皮生長因子、Fas、TNF受體、Flt、Apo-l、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、CaspaseICE、Fos、c-jun、Sp-l、Ap畫l、Ap國2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、InactiveNIK、SAPK、SAP-1、JNK、干擾素應答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANKLIGAND、0x40、0x40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2及其功能片段。普通技術人員理解可對皮膚EP裝置進行很多改變和修改而不偏離本發明精神和范疇。皮膚EP裝置可包括任何數量的電極例如不同形式的三電極陣列，其可參見圖11.選擇距離L這樣點B的能量強度是點A的三分之一。三次脈沖之后(1至2,2至3,3至1),點B接受了與點A相等的累積劑量。由于陣列中電極數量增加，產生均一能量分布所必須的距離L也成比例增長。L=kxn，其中n為電極數量，k為比例常數。因此，通過選擇更大數量的電極可包圍更大體積的組織。皮膚電極最佳數量的選擇取決于被轉染材料的體積和其在注射和電穿孔之間分散的遠近。實施例進一步在以下實施例中例證本發明。應理解的是雖然實施例指明了本發明的優選實施方案但是僅用于說明目的。從上述討論和這些實施例，本領域技術人員可確定本發明的基本特點并對本發明進行各種改變和4務改以適應各種應用和條件而不偏離其并奇神和范疇。因此，除本文所顯示和描述者之外的本發明各種修改對于本領域技術人員是顯而易見的。這些修改也應屬于附屬權利要求的范疇。優選地，與本文所述皮膚EP裝置一起使用的DNA制劑應具有高DNA濃度，優選最佳用于遞送至皮膚的小體積內包括毫克量DNA的濃度，優選小注射體積，理想為25-200微升()LiL)。在一些實施方案中，該DNA制劑具有高DNA濃度。例如lmg/mL或更高(mgDNA/制劑體積)。更優選地，DNA制劑具有可在200^iL制劑中提供克量DNA的濃度并且更優選在100nL制劑中提供克量DNA。與本發明皮膚EP裝置一起使用的DNA質粒可使用已知裝置和技術的組合配制或生產，但是優選使用描述于共同擁有的未決美國臨時申請美國序列60/939792號(2007年5月23日申請)的經優化的質粒生產技術生產。在一些實施例中，可以大于或等于10mg/mL的濃度配制用于這些研究中的DNA質粒。這些生產技術也包括或并入本領域技術人員熟知的各種裝置和方案，除美國序列60/939792號所描述之外還包括共同擁有的美國專利7238522號(2007年7月3日頒布)所描述者。與本發明皮膚EP裝置和遞送技術一起使用的高濃度質粒可以適當的低容量給予質粒至ID/SC空間并輔助增強表達和免疫作用。共同擁有申請和專利即美國序列60/939792號和美國專利7238522號均以其完整內容并于本文。實施例l皮膚電穿孔電動裝置("皮膚EP裝置")的操作首先將皮膚EP裝置的電源打開。固件維持空閑狀態直至接收到使用者的輸入。為了起始電穿孔順序，輸入密碼在LCD上獲得介紹性提示以起始電穿孔序列。這時，按壓手柄組件活化器開關。接著使用者輸入數字，優選受試者識別號碼，其與各次脈沖一起被記錄并保存用于之后的下載。優選使用數字鍵盤輸入號碼。然后以適當的小注射體積以ID或SQ注射給予生物分子制劑，理想為25-200皮膚升(skinliters)并且將皮膚電極陣列插入皮膚以完全包圍輕易可見的注射面積。接著使用者在蜂鳴器"蜂鳴聲(beep)"的提示下按壓活化器開關以繼續電穿孔序列。當按壓活化器開關之后，固件確立阻抗檢測器是否被啟用。如果阻抗檢測器被啟用，軟件立即執行一系列的阻抗測定。固件檢測低DC電壓電極之間的阻抗。將電極插入目標組織后并且在阻抗檢查階段，處理器在電極水平檢查組織的傳導性。這樣做以確保電極與患者的目標組織發生數，通常小于2秒。在阻抗檢測過程中，手柄組件上的紅色LED發光。如果任何阻抗測定失敗，表示錯誤的長蜂鳴聲響起，手柄LED仍為紅色，LCD將顯示錯誤并且固件返回至空閑狀態。如果所有的測量均通過，發出短蜂鳴聲，手柄上綠色LED發光并且該顯示提示使用者按壓活化器開關以繼續。固件等待再次按壓手柄活化器開關以繼續順序。如果這時按壓了鍵盤上的任何鍵，將響起錯誤長蜂鳴并且該單元將返回空閑狀態。固件按照所選脈沖程序設定執行點火序列。在各電脈沖或能量脈沖的遞送過程中，EP裝置根據目標組織(例如皮膚)中的所測電阻持續調節其輸出以維持預期電流。實質上，處理器通過將預期輸出電流水平設置至使用者輸入的預設定電流值以起始脈沖。由于目標組織電阻變化硬件反饋環(例如類比閉環回路)通過調節在電極間施加的電壓持續維持預期輸入電流。在能量脈沖的遞送過程中，處理器記錄脈沖波形。當通過此時設定預期輸入電流至零滿足脈沖時間長度時處理器終止脈沖。當脈沖序列結束，處理器復查波形數據并當電穿孔序列過程中電流不在設定參數之內時提醒操作者；藉此告知使用者電穿孔序列或處理是否錯誤。當成功完成EP序列時，皮膚EP裝置回復至空閑狀態。在完成電脈沖序列之后LCD上會進一步可視確認成功生成電場。每次序列之后，LCD將顯示一列三或五個數字，其為"0"或'T，，各數字表述電穿孔序列的各次脈沖。"0"指示脈沖正常而"1"指示脈沖不正常。更具體而言，各次脈沖必須達到設定電流的至少90。/。才稱之為正常或在LCD上顯示"0"。如果某一脈沖達到小于設定電流的90%,該脈沖為不正常并且顯示"1"。而且，顯示不正常脈沖的最低和平均電流。例如，對于設定于0.5安培電流的五次脈沖電穿孔序列，如果脈沖3和5分別僅達到0.4安培和0.3安培，將顯示"00101"以及"低60%平均80%"。當遞送治療或預防應用的疫苗時這一控制機制是必須的。如果疫苗遞送不足，很有可能達不到治療或保護需要的抗體或細胞應答并且受試者可能生病(Roth等，2005)。實施例2數據采集和存儲皮膚EP裝置軟件或硬件可實現實時數據采集并存儲至非易失性存儲器中。圖2C顯示了在電穿孔過程中釆集的第一部分數據。文件標題的第一部分包含文件名稱("2.1")和動物編號("2.2")。分欄(columnar)數據("2.3")描述了脈沖序列，脈沖前的等待時間，脈沖寬度和三個電極各自的脈沖電流。圖2.4顯示了數據的第二部分，其鑒定在給定脈沖序列中各電極的結構。圖2.5顯示了相同電穿孔的原始數據第三部分的格式化版本。該文件以MicrosoftExcelCSV文件下載自皮膚EP裝置。拷貝數據并粘貼至模板MicrosoftExcelSpreadsheet文件。Spreassheet的列顯示電脈沖過程中測定的電壓(V)和電流(Amps)以及計算的組織電阻(Ohms)。將較小電極用于豬皮膚之后下載的數據比使用較大電極(700Q至2200Q)之后得到的皮膚電阻幾乎增力口一倍。實施例3質粒設計、遞送方法以及在豬中的實驗性研究質粒構建。用于本文所述實^r中的pEGFP-Nl編碼野生型GFP的紅移變異體，其經優化具有更亮的熒光和在哺乳動物細胞中更高的表達(最大激發光二488nm;最大發射光二507nm)。EGFP-N1編碼包含Phe-64至Leu和Ser-65至Thr兩個氨基酸替換的GFPmutl。EGFP基因的編碼序列包含多于190個沉默堿基變化，其與人密碼子使用偏好一致。側接EGFP的序列^皮轉化成Kozak—致序列翻i奪起始位點以進一步增加在真核生物細胞中的翻譯效率。EGFP基因下游的SV40多腺苷酸化信號指導EGFPmRNA3'端的適當加工。載體骨架也包含用于在哺乳動物細胞中復制的SV40復制起點并表達SV40T抗原。新霉素耐藥盒(neor,由SV40早期啟動子、Tn5的新霉素/卡那霉素抗性基因和皰滲單純胸苷激酶基因的多腺苷酸化信號組成)使得可使用G418篩選穩定轉化的真核生物細胞。這一盒上游的細菌啟動子在大腸桿菌中表達卡那霉素抗性。pEGFP-N1骨架也提供在大腸桿菌中增殖的pUC19復制起點和用于單鏈DNA生產的fl起點。電穿孔條件。在所有實驗中使用方波脈沖。單獨說明各實驗的電穿孔條件。在所有情況下，恒定電流為0.1-0.4Amps,具有2或3個脈沖并持續20或52毫秒/脈沖，脈沖之間相隔一秒。控制皮膚EP裝置電穿孔裝置(之前用于向骨骼肌遞送生物分子)包含5個等空間分布的規格21固體不銹鋼針狀電極的環形陣列(直徑lcm),安裝于非傳導性材料上。皮膚電穿孔皮膚電極由以等腰三角形排列的三個規格26固體不銹鋼針狀電極組成(兩個長邊長5mm,短邊長3mm),安裝于非傳導性材料上。將質粒DNA肌肉內注射至豬。在GFP實驗中使用三至六周大，重量在15-40公斤的混合性別的幼雜種豬。在可隨意獲取食物和水分的單獨圍欄中飼養動物。在無菌水中稀釋不含外毒素的質粒制劑并用經HPLC純化的低分子量多聚L谷氨酸(平均MW10900)配制成1%重量/重量。在實驗的第O天，手工控制動物并如所述直接ID/或SQ注射GFP質粒溶液。在一個方4各的距左上角中心2cm處劃下標記，其中注射位點在該方;f各的中間，這樣可容易地識別和剖割各注射位點。當發現適當的注射位點時應避免所有主要的表面血管。皮膚收集。將豬放血并識別注射位點。立即在各注射位點剖割2.5cm方形面積的皮膚、皮下組織和少量下層的肌肉。使用紫外光于365nm波長在暗室中觀察剖割區域。表達區域的照相分析。使用數碼相機給顯示足夠熒光的樣品照相。對沒有或熒光量很少的樣品不進行照相。由三名不了解該處理的觀察者對熒光在0-5范圍內評分。O分評給無熒光者，l分評給經觀察具有少量熒光并沒有被照相者，3-5分評價自被照相的熒光。保存樣品用于組織學檢查。實施例4對照研究將所有檢測條件的數據制表。圖10僅表示平均分高于或等于2的條件，而最大可能評分為5(對評分的解釋可參見段落)。如數據所示，使用皮膚特異性皮膚陣列(圖IO,第一行)達到了最好的整體結果。雖然下一組(圖IO,第二行)具有相同的分數，但是應注意皮膚陣列("MA")僅使用配置于50viL中的50pg質粒，而大陣列("LA")使用兩倍的量即配置于100^iL中的100pg質粒。此外，對皮膚電極陣列使用經優化的條件顯著降低了操作時間當使用MA時所觀察到的注射和EP之間的操作時間為4秒(見圖IO,第四列)，使用LA為80秒。分析質粒劑量、制劑體積、延遲時間、電流振幅和脈沖長度的許多其他條件并列于圖IO。如一般規律，具有足夠質粒劑量的較小體積(更濃縮的溶液)具有更好的結果。實施例5豬的皮內遞送與肌肉內遞送的對比對比在豬中皮內(ID)或M^肉內(IM)遞送濃縮劑量的CMV-GHRH和CMV-SEAP質粒理的遞送和表達。使用兩種分泌蛋白(SEAP,GHRH)以及檢測第一次在豬中的SEAP免疫原性結果顯示了哪一種遞送方法可獲得豬中的最高表達。單獨銅養動物并使其適應7天。在實-驗一開始將動物稱重、采血，然后麻醉。以各種濃度和電流強度給豬(11=4/組)注射lmgCMV-SEAP和CMV-GHRH+O.P/。多聚L谷氨酸鹽(表l)。4秒鐘后使用CELLECTRATM電穿孔裝置(VGXPharmaceuticals,Inc.,BlueBell,PAl9422)((5個針，52毫秒脈沖，脈沖之間間隔l秒，總共3次脈沖)以不同電流(0.1至0.5Amp)對動物進行電穿孔。使豬從麻醉中恢復并監控24小時以確保完全恢復。記錄任何沒有在2或3個小時內恢復的動物。第2、4、7、9和11天將豬稱重和采血。在整個實驗過程中可隨意獲得食物和水。采集血液用于SEAP、SEAP抗體ELISAs、GFRF和IGF-I。表l實^r組摘要<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>使用化學發光試劑盒Phospha-LightChemilurninescentReporterAssayKit(AppliedBiosystems,Bedford,MA)才艮據操作i兌明在血清樣品中測定SEAP表達，見圖12。該測定法的檢測下限為3pg/mL。給予稀釋質粒組的SEAP水平高于以0.5Amp電穿孔的IM注射濃縮質粒的動物(高出43%,*P=0.024)。在ID注射的動物血清中發現極低水平的可斥企測SEAP蛋白。用于本實驗的SEAP為人蛋白質并且因此其在豬中誘導免疫應答。使用ELISA進行抗體應答的檢測，結果見圖13所示的圖中。第11天血清樣品中的抗體應答與11天的血清SEAP結果一起作圖。濃縮質粒樣品得到最高的平均抗體滴度。在GHRH軸中使用下游激素測量GHRH表達，即胰島素樣生長因子I或IGF-I。結果可見圖14顯示的圖中。IGF-I是血清中較穩定的蛋白質并可4吏用IGFI-RIA方便地沖全測。與IM給予濃縮質粒組相比IM給予非濃縮質粒(C-IM-0.5A)組注射后第11天的血清IGF-I(D國IM畫0.5A)水平更高。結果表明注射體積和途徑對已表達和分泌的蛋白質的表達和對這些蛋白的免疫原性具有重要影響。就表達相對于免疫原性而言，濃縮和非濃縮DNA具有顯著差異。IM注射并以0.5Amps電流強度電穿孔的動物中IGF-I表達更高。更低的電流強度得到更低的表達水平，但是小數量的動物使得該差異為非統計學差異。實施例6在豬中的皮膚EP研究材料和方法動物在前期實驗中使用三至六周大，重量在25-40kg的混合性別的幼雜交豬(11=5/纟且)。才艮4居AmericanAssociationforAccreditationofLaboratoryAnimalCare的標準在Stillmeadow,Inc.,Sugarland,TX飼養動物。在可隨意獲取食物和水的圍欄中按組飼養動物。在開始實驗之前寸吏動物適應5天。質粒pEGFP-Nl或pSEAP畫2基礎載體(ClontechLaboratories,Inc.,PaloAlto，CA)分別用于實驗1和2。用于實驗l(Exp.l)的pEGFP-Nl編碼野生型綠色焚光蛋白(GFP)的紅移變異體，其經優化在哺乳動物細胞中具有更亮的熒光和更高的表達(最大激發光-488nm;最大發射光二507nm)。普遍存在的細胞巨化病毒啟動子(CMV)驅動pSEAP-2基本載體中分泌型胚胎堿性磷酸酶(SEAP)的表達；該質粒用于豬實驗2(Exp.2)。使用可商業購買的試劑盒(QiagenInc.,Chatsworth,CA,USA)獲取質粒。內毒素水平經KineticChromagenicLAL(Endosafe,Charleston,SC)測定小于0.01EU/iug。在無菌水中稀釋質粒制劑并用多聚L谷氨酸鈉鹽(MW-10.5kDa平均)配制成1。/。重量/重量(Sigma,St.Louis,MO),在VGXPharmaceuticals,ImmuneTherapeuticsDivision(TheWoodlands,TX)進一步HPLV純化。皮內/皮下(ID/SQ)給予質粒和電穿孔(EP)在實驗1的第0天，將動物稱重并用異氟烷(5%誘導，2-3%維持)麻醉。將兩側肋上的兩個3"x3"位點剃毛并仔細清理。用紋身墨水標記一英寸的區域用于之后識別。在該區域的中央進行各質粒注射。動物接受ID/SQ注射；在不同EP條件下(見下文)、注射體積和劑量質粒劑量、注射體積(50|ug/50|uL、50|ug/100|uL、100|iig/100|uL和200jug/100iliL)、電流振幅和脈沖長度均變化并且由不了解處理組身份的獨立觀察者對經處理區域的活組織檢查評分。對剖離的皮膚區域照相并在注射后5天測量熒光。基于分布面積和熒光強度計算數字分數，與具有最高表達的樣品相比(0=無熒光，無分布；5=最亮熒光，最大分布)。在所有實驗中使用方波脈沖并使用皮膚EP裝置CELLECTRATM裝置(VGXPharmaceuticals,ImmuneTherapeuticsDivision,TheWoodlands,TX)給予。其可遞送適當的恒定電流(如下層組織經受的恒定電流)。在所有情況下，適當的恒定電流參數為0.1-0.4Amps之間，具有2或3次脈沖，持續20毫秒/脈沖或52毫秒/脈沖，并且脈沖間相隔一秒。在實驗1中使用兩種陣列類型之前用于肌肉內(IM)EP的電極陣列，其為5個等空間排列的規格21固體不銹鋼針狀電極的環形陣列(直徑lcm),安裝于非傳導性材料上；ID/SC皮膚針狀電極由三個長3mm以等腰三角形(兩個長邊長5mm，短邊長3mm)排列的安裝于非傳導性材料上的規格26固體不銹鋼針狀電極組成(見圖17B)。在實,險2中，ID/SQ注射動物并用lmgpSEAP(或者為2mg/mL的標準質粒制劑(500|uL，與IM注射相似)或者為10mg/mL的濃縮質粒制劑)進行皮膚EP,測量SEAP表達直至給予質粒后11天。血液收集和SEAP測定法在實驗2的第0、4、7和11天，于8:30AM稱重動物并通過頸靜脈穿刺收集血液至MICROTAINER血清分離管中。使血液在室溫下凝結10或15分鐘，接著3000xg離心10分鐘并將血清-8(TC保存用于進一步分析。將血清樣品凍融并使用Phospha-LightChemiluminescentReporterAssayKit(AppliedBiosystems，Bedford,MA)才艮才居才喿4乍i兌明只于50juL進行分析。該測定法的檢測下限為3pg/mL。測定SEAP活性之前7t,1、窟A;杏T±M.1fl"^r搭承(由4點AAAt、:杏；):主旦/f擊田TTTlV/fT"orno1ov、,^.計(BMGLabtechnologies,Offenburg,Germany)讀數所有樣品。結果實驗l使用皮膚針狀電極和IM電極均得到最高GFP評分。但是，使用IM電極的最佳結果需要以相同的濃度將質粒劑量加倍，即與用于皮膚針狀電極陣列的配置于50jliL的50iug質粒相比為配置于100iliL的100)ug質粒(圖15)。此外，使用0.2Amps、2次脈沖、52ms/脈沖、脈沖間相隔l秒(其為我們經過測定用于皮膚EP的最佳條件)，可大大減少操作時間當使用皮膚電極時操作時間僅為4-5秒，當使用IM陣列時為80秒。如一般規律，具有足夠質粒劑量的較小體積(更濃縮的溶液)具有更好的結果。實驗2使用在之前實驗中確定的最適于與皮膚EP聯用的ID/SQ質粒遞送的條件處理豬，即0.2Amps、2次脈沖、52ms/脈沖、脈沖間相隔1秒。給予動物相同的質粒量，lmgpSEAP，使用小體積制劑或IM+EP注射常用的體積。使用濃縮質粒制劑和較低注射體積得到更高的SEAP數值(圖16),P〈0.05.在非人類靈長類動物中進一步驗證這些條件。實施例7靈長類實驗用低劑量DNA(0.2mg/抗原)免疫兩次獼猴，然后用高劑量DNA(O.lmg/抗原)通過ID/SQ注射免疫三次，之后進行皮膚EP。經IFNyELISpot測定在單獨ID/SQ組和ID/SQ注射接著進行皮膚EP(ID/SQ+EP)的組中兩次低劑量免疫得到弱細胞免疫應答。但是，三次免疫后在ID/SQ組中DNA劑量的增加將應答提高至1000SFU/106PBMCs。ID+EP組比ID/SQ組的IFNY產生細胞多50%。ID/SQ+EP組免疫原性的增強也表現于記憶T細月包應答，其中ID/SQ+EP組比ID/SQ組的抗原特異性IFNY產生細胞多50%。單獨ID/SQ免疫未得到gag或env抗體滴度的顯著產生(<終點滴度)。但是用EP進行質粒遞送得到8800的峰gag終點滴度和1600的env終點滴度。最后，同時給予質粒編碼的rhlL-12也可得到經IL-4ELISpot測定法測定的THl特異性免疫應答。4n'丄ju—、、t,i卩《i,c"々動物才艮據AmericanAssociationforAccreditationofLaboratoryAnimalCare的標準在可隨意獲取食物和水的條件下在BIOQUAL,Inc.(Rockville,MD)單獨祠養獼猴(Macacamw/a"a)。在任何實驗之前允許動物在隔離區適應30天。質粒本實-瞼中使用pGag4Y、pEY2El-B和WLV104質粒。pGag4Y包含編碼HIVgag蛋白的表達盒。將Gag4Y基因亞克隆至表達載體pVax(Invitrogen,Carlsbad,CA)用于進一步研究。pEY-2El-B包含編碼HIVcladB包膜的表達盒。WLV104M為編碼獼猴IL-12基因的質粒。使用可商業購買的試劑盒(QiagenInc.,Chatsworth,CA,USA)獲得質粒。經KineticChromagenicLAL(Endosafe,Charleston,SC)測定內毒素水平小于0.01EU/)Lig。在無菌水中稀釋質粒制劑并用多聚L谷氨酸鈉鹽配制成l。/。重量/重量(MW40.5kDa平均)(Sigma,StLouis，MO),在VGXPharmaceuticals,ImmuneTherapeuticsDivision(TheWoodlands,TX)進一步HPLC純化。免疫在非人靈長類中使用(n-3/組)和不使用(11=3/組)EPID/SQ遞送HIVDMA疫苗，其中使用CELLECTRATM適應性恒定電流EP裝置(如上文中實施例3)和皮膚針狀電極陣列。在四周內分別進行免疫并且每兩周采集動物血液以測量抗體和T細胞應答。前兩次免疫遞送0.2mg的兩種HIV抗原(gag和evn)并且將IL-12表達質粒作為佐劑，體積為200iuL,分開用于每只動物的兩個ID/SQ注射位點。使用lmg各HIV疫苗和更高質粒濃度(10mg/mL)的IL-12質粒(總共3mg)進行接下來的兩次免疫以在與之前兩次免疫相同的體積中達到更高的質粒劑量。電穿孔條件為0.2Amps恒定電流、2次脈沖、52ms脈沖長度，脈沖間隔1秒。血液收集在實馬全過程中每兩周采集動物血液。將10mL血液收集至EDTA試管中。通過標準Ficoll-hyp叫ue離心分離PBMCs并接著重懸于入+立關苴,A古，…"N/I7TT《各貼乂,'長"T1no,Anj*、'水AAn厶土丄、、春乂U工,口"7|-^t>V&厶ii丄丄vi/LL^r—^sc、rj^乂|_j、、—/v—lv/u/'",'";乂、/口w'j/ju|juj^/fj、100IU/mL青霉素、100lug/mL鏈霉素和55|liM/Lp巰基乙醇的RPMI1640)中。用ACK裂解緩沖液(CambrexBioScience,EastRutherford,NJ)裂解RBC。酶聯免疫測定法(ELISA)用100ng/孑L的重組HIV-1IIIBp24或gbl20(IrnrnunoDiagnostics,Woburn,MA)包凈皮96孔板過夜以分別測定HIVgag和env應答。包被了100ng/孔胎牛血清白蛋白的板作為陰性對照。用3%BSA-PBST于37。C封閉板1小時。接著將板子與四倍系列血清稀釋液于37。C溫育1小時。然后以1:10000稀釋度向板中加入羊抗猴IgG辣根過氧化物酶結合抗體(MPBiomedicals,Aurora,OH)并于37'C溫育1小時。使用四甲基聯苯胺(R&Dsystems,Minneapolis,MN)顯色并用2NH2S04終止反應。然后測定光密度(OD)。IgG終點滴度定義為可以得到比BSA孔的平均OD值大兩4咅的ODj直的交互血清稀釋(reciprocalserumdilution)。酶聯免疫斑點測定法(ELISpot)使用IFNY或IL-4捕獲和檢測抗體(MabTech,Sweden)進行ELISpot。通過用包含肽的孔數減去陰性對照的空數測定抗原特異應答。結果以三個孔的平均值(點/百萬脾細胞)表示。統計學分析使用PrismGraphpad軟件分析數據并表示為平均值±SEM。非人靈長類實驗設計根據圖17A說明的設計用經優化的HIV-1gag和env構建體和質粒編碼的獼猴IL-12免疫獼猴；用于豬實驗的裝置也用于非人靈長類(圖17B)。ID/SQ注射免疫三只動物，ID/SQ注射結合皮膚電穿孔(ID/SQ+EP)免疫三只動物。在第0、4、8、12、16周免疫動物5次。每兩周采集血液，每次免疫后兩周進4亍ELISpot測定，而每次免疫后四周進行ELISA測定。ELISpot分析通過IFNyELISpot測定每次免疫之后細胞免疫應答的誘f閱1e、An，mrr直^"店AA—、》/W"糸l善各6TrwoimTrvQrvu"RT3\J、1U/OU.V",N、HVV、K、N/1一7",u乂'l「U乂'J_Vi組均具有弱應答(分別為72土11SFU/106PBMCs和85土34SFU/106PBMCs)。第二次低劑量免疫使ID/SQ組中IFNy產生細胞的數量加倍(173±77SFU/106PBMCs)并且使ID/SQ+EP組的應答增加至三倍(287±34SFU/106PBMCs)。已在兩次低劑量免疫后觀察到較弱的細胞應答，我們使用高劑量DNA進行接下來的三次免疫。ID/SQ組第三次免疫的免疫應答并未顯著增加(176±72SFU/106PBMCs)。但是ID/SQ+EP組確實在較高劑量將IFNY產生細胞的數量提高至兩倍(383±162SFU/106PBMCs)。用lmg劑量的DNA第四次免疫動物。與之前免疫相比在ID/SQ組中觀察到IFNY應答的三倍增長(376±210SFU/106PBMCs)。在第三次接種時，使用皮膚EP遞送高劑量DNA得到雙倍的IFNy應答(1466±762SFU/106PBMCs)。在最后的免疫中維持了這些高水平的抗原特異應答(1453±873SFU/106PBMCs)。最后一次免疫進一步加倍了ID/SQ組中IFNY產生細胞的數量(927±191SFU/106PBMCs)。記憶T細胞應答誘導強效的T細胞應答是成功免疫的一個重要方面。為了評價ID/SQDNA免疫謙導的記憶T細胞群，在最后一次DNA接種后IO周進行ELISpot分析(圖19)。ID/SQ+EP組的記憶IFNy應答是ID/SQ組強度的兩倍(分別為998±290和449±108SFU/106PBMCs)。TH2T細胞應答使用基因槍用于皮膚免疫的研究已例證對TH2偏倚(biased)T細胞應答的誘導。但是已顯示如果也遞送IL-12可將這一偏倚逆轉至THl應答。在IDDNA免疫中一起遞送給獼猴IL-12以確定其共遞送是否可引起對THl偏倚應答的誘導(圖20)。在最后一次免疫后10周通過IL-4ELISpot測定法測定對抗原特異TH2應答的誘導。僅進行ID/SQ的組中所有動物具有陰性IL-4應答(>50SFU/106PBMCs)并且ID/SQ+EP組中僅有一只動物具有陽性IL-4應答(136SFU/106PBMCs),表明顯著的THl應答。體液應答DNA免疫的一個弱點在于其不能在非人靈長類和人類臨床實驗中誘導抗體應答。通過ELISA測定法測定各組誘導對重組p24和gbl60抗原的HIV-gag和evn特異抗體滴度的能力(圖21)。對兩種抗原而言，ID/SQ組未顯示顯著的抗體滴度(<50終點滴度)。ID/SQ+EP組在第二次低劑量免疫后具有低水平的抗體(終點滴度100±50)。但是在使用高劑量DNA的笫三次免疫中增加所遞送DNA的劑量之后觀察到更大的抗體誘導(2220±1000)。第四次免疫中提高了抗體滴度(8800±4000)。env抗體應答也反映了我們在有低滴度(<50終點滴度)的ID/SQ組觀察到的gag抗原的結果并且ID/SQ組達到最大終點滴度1600土800。IM相對ID/SQ電穿孑L用相同的HIVgag、env和rhlL-12構建體(如上所述)以1.0mg/mL通過IM免疫將獼猴免疫三次。與細胞免疫應答誘導相比，前兩次免疫之后IM和ID/SQ途徑二者具有相似水平的IFNy產生細胞。相反的，與IM+EP相比在第一次高劑量免疫之后ID/SQ+EP免疫得到高水平的HIVgag抗體滴度。在兩次免疫之后，ID/SQ+EP組的HIVgag終點滴度是IM+EP組的兩倍。在這些實驗中，我們使用皮膚針狀電極遞送至ID/SD區室,并比較所得免疫應答與IM+EP之后得到者(見表l)。表l.經IM或ID/SQ途徑通過電穿孔誘導的免疫應答的比較。顯示了3次高劑量(l.Omg/抗原)免疫后IFNYELISpot和HIVgagELISA結<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>實施例8使用皮膚EP在小鼠中進行DNA接種A.質粒構建體在實驗1和3中(Exp.l和Exp.3)使用普遍存在的細胞巨化病毒(啟動子)或肌肉特異性合成啟動子(SPc5-12)驅動人分泌型胚胎堿性磷酸酶(SEAP)在pSEAP-2基本載體中的表達。野生型綠色熒光蛋白(GFP)表達質粒pEGFP-Nl的紅移變異體(其經優化在哺乳動物細胞中具有更亮的熒光和更高的表達(最大激發光-488nm;最大發射光二507nm))用于報告基因實驗中(Exp.2)。使用可商業購買的試劑盒(QiagenInc.,Chatsworth,CA)獲得質粒。經KineticChromagenicLAL(Endosafe,Charleston,SC)測定外毒素水平低于0.01EU/)iig。通過分析在近幾年內被證明對人具有致死性的16H5病毒的原始病毒序列和多于40種人NI病毒生成一致序列HA和NA。從LosAlamosNationalLaboratory's流感序列數據庫下載這些序列。在生成一致序列之后，將構建體優化用于哺乳動物表達，包括添加Kozak序列、密碼子優化和RNA優化。然后將這些構建體亞克隆至pVAX載體(Invitrogen,CarlsbadCA)。除非另外指明，在無菌水中稀釋質粒制劑并用多聚L谷氨酸鈉鹽配制成l。/。重量/重量(MW-10.5kDa平均)(Sigma,StLouis,MO)，在VGXPharmaceuticals,ImmuneTherapeuticsDivision(TheWoodlands,TX)進一步HPLV純化。B.小鼠中的報告基因表達這一實馬全檢測SEAP或EGFP表達質粒的遞送和表達以確定哪些電穿孔參數(最低有效電流)、延遲時間(注射和開始電穿孔之間的時間)、制劑和目標肌肉影響表達和抗體水平。使用CELLECTRATM皮膚EP裝置(包括使用3x規格26電極)用各種電流和用于IM或ID注射的延遲時間電穿孔動物。在第一個實驗(Exp.l)中，將10pg在肌肉特異性合成啟動子(pSPc5-12-SEAP)控制下表達SEAP的質粒注射至C57/B16小鼠組的脛骨前肌(TA)或腓腸肌(G)肌肉中，延遲時間為4或80秒，恒定電流為0.1A。對照組TA注射質粒而不進4亍EP(無EP)。其它組的動物TA或G肌肉接受等摩爾的無質粒骨架(NB)但是具有相同的啟動子、轉基因和3'多腺普酸化信號的表達盒，不進行EP。在第二個實驗(Exp.2)中，給小鼠組(n=4)IM或ID注射總體積分別為5或25iuL的50pgpCMV-EGFP,終質粒濃度為10mg/mL或2mg/mL。對剖離組織和肌肉部分照相并在注射后5天測量熒光。對經處理組的身份不了解的獨立觀察著對經處理區域評分。與具有最高表達的樣品相比基于分布面積和熒光強度計算數字評分(0=無熒光，無分布；5=最亮熒光、最大分布)。在笫三個小鼠實驗(Exp.3)中,總共使用80只小鼠，分為16組，每組5只(表2)。以不同制劑(鹽水、鹽水+P/oLGS、水、水+1%LGS)和電流強度給小鼠(11=5/組)注射50|ugCMV-SEAP(10mg/mL)。以4秒延遲時間和不同電流(0.1A至0.2A)對TA或G肌肉IM注射的動物進行電穿孔。表2小鼠中CMV-SEAP制劑實驗的分組組制劑濃度(mg/mL)總劑量(ILlg/動物)EPn1鹽水10500.22鹽水10500.13鹽水10500.254鹽水10500.15鹽水+LGS10500.26鹽水+LGS10500.1了鹽水+LGS10500.258鹽水+LGS10500.159水10500.210水10500.111水10500.25<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>在所有情況下，使動物適應三天，稱重并在耳朵進行標記。在整個實驗過程中可隨意獲取食物和水。在研究一開始稱重動物、采血并使用嚙齒類組合麻醉劑麻醉，即甲苯噻溱(37.5mg/mL;0.05mL/30克體重)、氯胺酮(1.9mg/mL;0.016mL/10克體重)、乙酰丙嗪(0.37mg/mL;0.025mL/15克體重)，根據設計給予質粒并進行電穿孔。對于實驗1和實驗3，眼眶后釆血并使其凝結。離心所有收集的血液以分離血清和血漿，接著分裝至置于水上的試管中用于SEAP測定法和抗-SEAPELISA,如之前所進行并存在較小的修改。笫14天后，在手術麻醉計劃下將動物放血。C.分析血液收集在第0、4、7和ll天稱重小鼠并分別眼眶后釆血至樣t量離心管中。4吏血液在室溫下凝結10至15分鐘并接著于3000xg離心10分鐘，將血清儲存于-80。C用于進一步分析。SEAP測定法將血清樣品凍融并使用Phospha-LightChemiluminescentReporterAssayKit(AppliedBiosystems,Bedford,MA)才艮才居才喿4乍i兌明只于50faL進行分析。該測定法的檢測下限為3pg/mL。測定SEAP活性之前在小鼠血清中1:10稀釋更濃縮的血清樣品。使用LUMIstarGalaxy光度計(BMGLabtechnologies,Offenburg,Germany)讀數所有樣品。SEAP間接ELISA在小鼠中使用以下經修改的操作測定對人SEAP蛋白的免疫原性。用經純化的PBS中的人胎盤堿性磷酸酶(每IOOjuL包含100納克/孔的人胎盤堿性磷酸酶(Sigma))在4。C包被NuncMaxisorb(Rochester.NY)板過夜。傾倒板子并洗滌三遍。用含有P/oBSA(Sigma)和0.05。/o吐溫20的PBS封閉板子并于室溫下溫育2小時。將樣品1:100稀釋并接著在單獨的稀釋板中用含有1。/。BSA(Sigma)和0.05%吐溫20的PBS以1:4序列稀釋。將封閉液從板中傾倒出。向各孔中加入100luL經稀釋的待測血清并于室溫下溫育2小時。傾去血清稀釋液并洗滌三次。在含有1Q/。BSA(Sigma)和0.05。/o吐溫20的PBS中以1:1000稀釋第二抗體(與辣根過氧化酶結合的兔抗小鼠抗體)并于試問下溫育l小時。傾倒板子并洗滌。將每孔IOOiuL的鄰苯二胺(OPD)底物加入(0.67mg/mL)O.IM檸檬酸緩沖液中并溫育8分鐘；加入IOO|uL1MH2S04終止反應。在SpectramaxPlus384讀板儀(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)上于490nm測量吸光度。D.小鼠中的結果SEAP表達依賴于目標肌肉與G肌肉相比如果將SEAP表達質粒注射劑給予TA(圖22),注射和使用皮膚EP裝置進行EP之間的時間為80s和4s,則表達增加。當將SPc5-12-SEAP質粒注射至TA肌肉時，血清SEAP水平比在不進行EP條件下接受質粒的對照動物高285倍(P<1.3E-21);未發現80s和4s延遲時間對于TA月幾肉的差異(357±6vs.357±6.2pg/mL/g);在相同條件下注射至G肌肉得到比對照高90至182倍的SEAP水平(G80svs.無EP對照，P<0.003;G4svs.無EP對照，P<7.7E-0.6)。當以等摩爾制劑將僅包含表達盒的質粒片段注射至TA和G(無骨架(NB),但是具有相同的啟動子、轉基因和3'多腺苷酸化信號)，表達水平比未接受IM+EP的對照組高210-250倍((80svs.無EP,P<1.8E國08;4svs.無EP,P<3.8E畫05)。TA80s中的SEAP表達比NB80s組高24%(PO.004)。給予C5-12-SEAP和NB而不進行EP(無EP)的兩組均顯示可忽略不計的SEAP表達。GFP表達仔細剖離注射部位后觀察GFP表達并由不了解處理組的觀察者評分。ID(4.63±0.24vs.3.25±0.14,P=0.01)和IM注射動物中給予濃縮質粒的組與非濃縮質粒組相比GFP評分更高(圖23)。在這些研究中濃縮制劑(高至10mg/mL)與更高的總體表達相關。基于這一實驗的結果，實驗3中以1Omg/mL的濃度使用質粒。SEAP表達依賴于制劑和電流強度當SEAP轉基因由普遍存在的啟動子(相對于實驗1中使用的肌肉特異性啟動子)控制時評價SEAP水平的差異。與之前的實驗一致，與G肌肉(P-0.05)相比如果質粒注射-EP操作在TA中進行(圖24)則表達增加。在這一具體實驗中，與鹽水制劑相比鹽水+LGS制劑得到更高的血清SEAP水平(分別為41.1±7.9pg/mL/gvs.31.0±5.9pg/mL/g),盡管由于組內差異性并未達到統計學顯著性。總體而言，與接收相同LGS質粒制劑并以0.2A恒定電流遞送的動物相比以0.1A電流設置進行電穿孔的動物得到更高的SEAP表達。此外，接受0.2A以水配制的質粒的動物與相同肌肉接受0.1A的動物相比得到顯著較低的SEAP水平(對TA，PO.05;對G，PO.001)。當將LGS加入水制劑時對TA肌肉的差異并不顯著但是對G肌肉仍然保持(PO.04)。抗SEAP抗體的誘導SEAP質粒與鹽水+LGS的制劑得到更高的蛋白表達，但是與注射用水+LGS配制的SEAP質粒的動物相比抗SEAP抗體的滴度更低(圖25),盡管由于組內差異性并未達到統計學顯著性。實施例9靈長類中皮內遞送和肌肉內遞送的比較靈長類血清lQ/o馬血清中A/vietnam/2003/04HI滴度組靈長類ID試驗組第6周的HI滴度H5+M2MCELLECTRAlmg每質粒4497C804498C804499c404500c804501c<20H5+M2IDCELLECTRA麗lmg每質粒4520D1604521D804522D1604523D404534D160<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>DNA構建體1.HIVEvnCladeA2.HIVEvnCladeC3.HIVEvnCladeD4.HIVGag5.HIVPol6.FluH57.FluNA8.FluM2NP9.HPV16E6/E710.HPV18E6/E711.IL2<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>在這些實驗中免疫獼猴。在起始實驗之前使動物適應2個月。按以下進行實驗第O周進行第一次免疫(質粒劑量給予)和基線采血；第2周進行采血；第三周進行第2次免疫(質粒劑量給予)；第5周進行釆血；第6周進行第三次免疫(質粒劑量給予)和采血；笫8周進行采血。所有質粒均以水配制為10mg/mL,用于注射+1Q/qLGS,如之前實施例所描述，并與各實驗組的單溶液混合物(A-H組，上表中)。計算命名為IMCELLECTRAIDCELLECTRATM和IM注射器的各組的準確注射體積。對于ID給藥，如果所要求注射劑量超過每個位點IOO)liL,將制劑分至數個注射位點(2、3或6,取決于總共給予多少毫克的疫苗)。接受IM注射的動物將在一個注射位點給予全部制劑。在上述實施例中用于豬實馬全和非人類實-驗的CELLECTRATM適應性恒流裝置也用于這些非人靈長類實驗中。電穿孔條件如下對于IM注射和電穿孔組，條件為0.5Amps,52毫秒/脈沖，三次脈沖，質粒注射和電穿孔之間4秒延遲。對于ID注射和電穿孔組，條件為0.2Amps，52毫秒/脈沖，三次脈沖，質粒注射和電穿孔之間4秒延遲。紅細胞凝集抑制反應測定法-通過用三份血清稀釋一份酶并于37。C水浴中溫育過夜用受體破壞酶(RDE)處理猴血清。在56。C溫育30分鐘使酶失活，然后加入6份PBS最終達到1/10稀釋。在V底96孔微量滴定板中進行HA測定法，使用病毒的HA單位和1%馬血紅細胞。本文顯示的數據為第二次免疫后的結果(在笫三次免疫之前采血)。權利要求1.一種電穿孔裝置，其經裝配以向哺乳動物期望組織遞送能量脈沖，所述能量脈沖產生與使用者輸入的預設定電流相似的恒定電流，該電穿孔裝置包括可遞送在期望組織中產生恒定電流的能量脈沖的電穿孔組件，該電穿孔組件具有反饋機制；包括具有空間排列的多個皮膚電極的電極陣列的皮膚電極組件，其中所述皮膚電極組件接受來自電穿孔組件的能量脈沖并將其經皮膚電極遞送至期望組織；其中多個皮膚電極的至少一個在遞送能量脈沖過程中是中性的并測定期望組織中的阻抗并將所述阻抗傳遞至電穿孔組件；以及其中所述反饋機制可接受已測定阻抗并調節電穿孔組件遞送的能量脈沖以維持恒定電流。2.權利要求l的裝置，3.權利要求l的裝置，織。4.權利要求3的裝置，電薄膜區域。5.權利要求3的裝置，6.權利要求5的裝置，而基本不刺入月幾肉組織。7.權利要求5的裝置，活化器開關，以及其中所述針狀電極可接觸真皮內或皮下組織其中所述皮膚電極組件進一步包括報告皮膚電極組件活化的狀態指示器。8.權利要求5的裝置，其中所述電極陣列包括至少三個皮膚電極。9.權利要求8的裝置，其中所述三個皮膚電極具有三角形的空間排列。10.權利要求9的裝置，其中所述三角形為等腰三角形。11.權利要求10的裝置，其中所述等腰三角形具有5mm長的邊和3mm長的底。12.權利要求5的裝置，其中多個皮膚電極可以分散模式遞送能量脈沖。量脈沖以維持恒定電流。13.權利要求12的裝置，其中多個皮膚電極可在程序化序列下通過對皮膚電極的控制以分散模式遞送能量脈沖，所述程序化序列由使用者輸入至電穿孔組件。14.權利要求13的裝置，其中所述程序化序列包括按序列遞送的多個脈沖，其中由至少兩個活性皮膚電極遞送多個脈沖的各脈沖，所述活性皮膚電極中的一個為測量阻抗的中性皮膚電極；并且其中多個脈沖的后續脈沖由至少兩個活性皮膚電極的另一個遞送，所述活性皮膚電極中的一個為測量阻抗的中性電極。15.權利要求5的裝置，其中反饋機制由硬件或軟件執行。16.權利要求5的裝置，其中反饋機制由類比閉環電路執行。17.權利要求16的裝置，其中中性電極測量期望組織中的阻抗并將該阻抗傳遞至反饋機制，反饋機制響應該阻抗并調節能量脈沖以將恒定電流維持在與預設定電流相似的值。18.權利要求17的裝置，其中電穿孔裝置包括安全特征，所述安全特征為當對能量脈沖的調節會得到高于電壓限的電壓時防止裝置向組織遞送能量脈沖的電壓限。19.權利要求17的裝置，其中反饋機制在能量脈沖的遞送過程中持續并即時地維持恒定電流o20.權利要求19的裝置，其進一步包括接受使用者的輸入并控制電穿孔組件以根據輸入遞送能量脈沖的控制器。21.權利要求3的裝置，其進一步包括接受使用者的輸入并控制電穿孔組件以根據輸入遞送能量脈沖的控制器。22.權利要求21的裝置，其中所述控制器為單芯片微控制器。23.權利要求3的裝置，其進一步包括與電穿孔組件相連并與皮膚電極組件電子相連的電流波形發生器；所述電流波形發生器產生經皮膚電極組件遞送的電流脈沖串波形。24.權利要求23的裝置，其中使用者輸入程序化序列至電穿孔組件，其將程序化序列傳遞至電流波形發生器；其中所述電流波形發生器可根據所提供的程序化序列生成電流脈沖串波形。25.權利要求23的裝置，其中所述電流波形發生器為功率晶體管類比電路。26.權利要求3的裝置，其進一步包括可檢測皮膚電極與期望組織之間是否建立電子連接的阻抗檢測器。27.權利要求3的裝置，其進一步包括與電穿孔組件連接的波形記錄器。28.權利要求27的裝置，其中所述波形記錄器可在能量脈沖遞送過程中持續記錄電穿孔電壓和電流波形。29.權利要求27的裝置，其中所述波形記錄器可以每秒2000個樣品的速度記錄電穿孔電壓和電流波形。30.權利要求3的裝置，其進一步包括與使用者和電穿孔組件直接通信的輸入裝置，所述輸入裝置可接受輸入指令并將該輸入指令傳送至電穿孔組件。31.權利要求30的裝置，其中所述輸入裝置為數字式鍵盤或觸屏。32.權利要求3的裝置，其進一步包括與電穿孔組件連接的狀態報告元件。33.權利要求32的裝置，其中所述狀態報告元件為信息顯示面板、語音提示、發光二極管或它們的組合。34.權利要求33的裝置，其中所述狀態報告元件報告能量脈沖產生和恒定電流遞送的確^人。35.權利要求3的裝置，其進一步包括與電穿孔組件相連的通信端。36.權利要求3的裝置，其進一步包括與電穿孔組件相連的存儲器組件。37.權利要求3的裝置，其進一步包括與電穿孔組件相連的能量源。38.權利要求37的裝置，其中所述能量源為電池。39.權利要求3的裝置，其中所述電極陣列為一次性的并與皮膚電極組件可移除地連接。40.權利要求39的裝置，其中所述一次性電極陣列為皮膚電極盤。41.權利要求40的裝置，其中所述電極陣列盤為可滅菌的。42.權利要求6的裝置，其中所述電穿孔組件包括控制器；與該控制器電子連接的波形發生器；與該控制器電子連接的波形記錄器；以及與波形發生器電子相連的電池；其中所述控制器接受來自使用者的輸入，指示波形發生器根據輸入向期望組織遞送能量脈沖并根據所遞送的能量脈沖將數據傳送至波形記錄器并且其中所述電池向波形發生器發送電荷，所述電池為鋰離子、鎳金屬氫化物、鉛酸或鎳鎘電池。43.權利要求42的裝置，其中所述裝置為便攜式的。44.一種電穿孔手柄組件，其經裝配以向哺乳動物期望組織遞送能量脈沖以在期望組織中產生與使用者輸入的預設定電流相似的恒定電流，其包括具有在空間排列的多個皮膚電極的皮膚電極陣列，其中所述皮膚電極的至少一個在能量脈沖遞送過程中為中性并測量期望組織中的阻抗；與皮膚電極陣列相連的控制器，所述控制器控制經皮膚電極的能量脈沖的遞送；以及進行反饋機制的裝置，其中所述反饋機制由軟件或硬件執行，其接受來自中性皮膚電極的所測量阻抗并在需要時調節遞送的能量脈沖以維持恒定電流。45.權利要求44的手柄組件，其中所述皮膚電極陣列為一次性的并與手柄組件可移除地連接。46.權利要求44的手柄組件，其中所述皮膚電極陣列包括以三角形空間排列的三個皮膚電極。47.權利要求44的手柄組件，其中所述皮膚電極長5mm并且規格為26。48.權利要求44的手柄組件，其中在能量脈沖遞送過程中多個皮膚電極中的至少兩個是活性的并且多個皮膚電極之一為中性。49.向哺乳動物期望皮膚組織遞送能量脈沖以在所述期望組織細胞中引起電穿孔發生的方法，該方法使用經裝配以遞送能量脈沖的電穿孔裝置，產生與使用者輸入的預設定電流相似的恒定電流，其包括將多個針狀皮膚電才及插入皮膚組織而基本不刺入肌肉組織；向多個針狀皮膚電極施加能量脈沖以向皮膚組織遞送與預設定電流相等的電流；使用多個針狀皮膚電極中的一個中性電極測量皮膚組織中的阻抗并響應所測量阻抗使用電穿孔裝置中的反饋機制調節施加的能量脈沖以維持遞送至皮膚組織的電流恒定。50.權利要求49的方法，其中所述期望皮膚組織為皮下或真皮內組織。51.權利要求50的方法，其進一步包括在施加能量脈沖之前測量阻抗以確定是否在期望皮膚組織和針狀皮膚電極之間建立了電子連接。52.權利要求50的方法，其中至少一種DNA疫苗與所述真皮內或皮下組織接觸。53.權利要求49的方法，其進一步包括記錄由電穿孔裝置編輯的來自向期望皮膚組織遞送能量脈沖的數據。54.包括以下步驟的方法提供具有多個針狀皮膚電極的皮膚電極組件，所述皮膚電極組件與電流波形發生器電子連接；將哺乳動物皮膚組織與多個針狀皮膚電極接觸而基本不刺入哺乳動物的月幾肉組織；以及在可將所接觸皮膚組織有效暴露于基本恒定電流的條件下，將來自電流波形發生器的電子能量脈沖施加至多個針狀皮膚電極一段時間。55.權利要求54的方法，其中施加電子能量脈沖的步驟包括用多個針狀皮膚電極的一個中性電極測量所接觸皮膚組織中的阻抗；所述反饋機制響應已測阻抗并調節從電流波形發生器遞送的能量脈沖以維持基本恒定的電流。56.權利要求55的方法，其中所述反饋機制由作為電穿孔裝置一部分的類比閉環電路執行并且其中在能量脈沖持續過程中即時進行測量和通信步驟。57.權利要求44的方法，其進一步包括設定安全特征，所述安全特征為當對能量脈沖的調節會得到高于電壓限的電壓時防止裝置向組織遞送能量脈沖的電壓限。58.權利要求54的方法，其進一步包括設定安全特征，所述安全特征為當對能量脈沖的調節會得到高于電壓限的電壓時防止裝置向組織遞送能量脈沖的電壓限。全文摘要本發明涉及電穿孔裝置和用該裝置有效促進將生物分子導入身體特定組織(特別是皮膚例如真皮內或皮下組織)的細胞的方法。在某些方面，本發明是皮膚EP裝置，其產生能量脈沖，用皮膚電極陣列將能量脈沖遞送至皮膚組織，并基于使用者的輸入在該皮膚組織維持恒定電流，包括預設定電流，并能夠存儲和獲取電流波形數據。文檔編號A61N1/32GK101563132SQ200780046652公開日2009年10月21日申請日期2007年10月17日優先權日2006年10月17日發明者A·S·韓,M·A·波普,P·A·布朗,R·德雷希亞-阿克利申請人:Vgx藥品公司