β-內酰胺酶的用途的制作方法

專利名稱：β-內酰胺酶的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及減少抗生素對腸道內正常菌群的副作用。更確切的說，
它涉及A類P-內酰胺酶在制備用于減少腸內副作用的藥劑中的用途。 本發明還公開了減少腸內未被吸收的P -內酰胺類抗生素之副作用的方 法。
背景技術：
P-內酰胺類抗生素是最廣泛使用的抗細菌感染的抗生素中的一類。 P -內酰胺類抗生素都具有共同的結構特征，即它們均^^有P -內酰胺核。 P-內酰胺類抗生素抑制細菌細胞壁的生物合成，而對宿主的毒性非常 低。但是，與P-內酰胺治療相關的一個問題是許多細菌產生一種名為 P -內酰胺酶的酶，其能夠通過水解P -內酰胺環的酰胺鍵使得P -內酰胺 類抗生素失活。
革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的產P-內酰胺酶菌林流行程度的增 加限制了 P-內醜胺類抗生素的使用。因此，已經開發了含有P-內酰胺 類抗生素和P-內酰胺酶抑制劑組合的藥物組合物，以提供不受產P-內 酰胺酶菌林影響的有效治療。已知的組合有例如阿莫西林和克拉維酸， 氨芐青霉素和舒巴坦，哌拉西林和他唑巴坦，以及替卡西林和克拉維酸 (Higgins等2004 )。
與抗生素治療相關的另一個問題是當抗生素到達腸道時它們通過 對腸道菌群產生選擇壓力促進了抗生素抗性。不僅僅經口施用的P-內 酰胺，就連胃腸外施用的P-內酰胺也可能具有對腸內菌群組成的副作 用，推測這是因為它們以可檢出的濃度分泌進膽汁。其從膽汁分泌到腸 中，在那里它們可造成正常腸內菌群的破壞。宿主和腸內菌群之間生態 平衡的紊亂可造成與抗生素有關的腹瀉，病原微生物例如萬古霉素抗性 腸球菌、持久產P-內酰胺酶革蘭氏陰性桿菌的過度生長或者正常腸內 菌群或病原中出現抗生素抗性并傳播(Sullivan等，2001, Donskey, 2006 )o
4一種減少腸內菌群紊亂的策略是在胃腸外抗生素治療中選擇具有
最少膽汁分泌的抗微生物劑(Rice等，2004)。另一個策略包括使用益 生菌。在預防和減少成人和兒童的抗生素相關腹瀉中已經評價了許多不 同的益生菌，其包括非病原性布拉酵母(Sflcc/iflrow^"s 6<wi/"/y/i7)和 多種乳酸發酵細菌例如GG菌(Zflc似6flc,7/ws W^附wmws GG, LGG)。 布拉酵母治療似乎在成人中預防抗生素相關腹瀉反復發作的艱難梭菌 (C.力jQ7"7e)感染，而LGG可用于治療兒童中的抗生素相關腹瀉(Katz， 2006)。另一個策略包括基于牛初乳的免疫乳產品，其已被證明在預防 多種抗生素相關腸感染中是有效的(Korhonen等，2000)。
另 一種避免P -內酰胺類抗生素在腸內副作用的策略是共施用抗生 素和P-內酰胺酶。經口施用p-內酰胺酶使得有可能讓胃腸道中未被吸 收的P-內酰胺失活，由此包括腸正常菌群的改變以及p-內酰胺抗性細 菌過度生長在內的它們的副作用得以減少。方便地配制P-內酰胺酶使 得其在所期望的胃腸道部分釋放(WO 93/13795 )。
在狗中經口施用P-內酰胺酶與胃腸外氨千青霉素治療聯用已經顯 示以劑量依賴形式降解膽分泌的氨千青霉素，而不影響血清中的氨千青 霉素水平(Harmoninen等，2003)。另外，還已經闡明P-內酰胺酶治 療在狗模型中與胃腸外氨芐青霉素一起治療的數天中阻止抗生素誘導 的糞便菌群的改變(Harmoninen等，2004)。通過使用結腸乾向劑型的 P -內酰胺酶也獲得了類似的結果(US 2005/249716 )。
Harmoinen等2003和2004所進行的研究中使用的P -內酰胺酶是重 組地衣芽孢桿菌(5"c,7/"s "c/^w(/brw/s) P -內酰胺酶(PenP )，其屬于 Ambler分類法中的A類酶(Ambler， 1980)。其具有針對青霉素、氨 基青霉素(例如氨芐青霉素和阿莫西林)和脲基青霉素(例如艱拉西林) 的高水解活性。但是，它容易被常見的P-內酰胺酶抑制劑例如舒巴坦、 克拉維酸和他唑巴坦失活。
P-內酰胺酶抑制劑在預防P-內酰胺被產P-內酰胺酶細菌失活中 是有效的。因此，P-內酰胺酶抑制劑可與P-內酰胺組合。 一般地，這 種組合的兩種組分對于機體的多種液體和組織來說具有相當類似的藥 代動力學參數，并且具有相當類似的清除半衰期，其被認為是組合制備 物具有治療效力的必要先決條件。但是，對于膽汁清除來說，發現P-內酰胺和P-內酰胺酶抑制劑的藥代動力學特征有所不同。例如，發現
在血清中舒巴坦與氨節青霉素的比值接近恒定(約1:2 )，而在膽汁中舒 巴坦/氨節青霉素比值在1:3至1:13之間(Wildfeuer等1988 )。盡管膽 汁中它們的比例具有高度變異性，但是P -內酰胺和P -內酰胺酶抑制劑 的組合已被認為是抗膽管中感染的安全且有效的療法(Morris等1986， Brogard等，1989， Westphal等，1997)。
從上述內^ff到結論通過將P -內酰胺類抗生素與P -內耽胺酶抑制 劑聯用來降低P-內醜胺酶的作用(否則會使所述抗生素失活)，從而增 強了 P-內酰胺類抗生素的作用。另外，提^C了多種方式降低抗生素治 療的有害副作用(例如擾亂腸內菌群)。仍需要更有效的沒有副作用的 抗生素治療。本發明滿足了這些需要。它降低了與使用P-內酰胺類抗 生素相關的超感染(superinfection)和增加抗生素抗性的風險。

發明內容
本發明涉及P-內酰胺類抗生素療法，其對產P-內酰胺酶細胞導致 的失活不敏感，并且其不破壞腸內正常微生物菌群的平衡。目前發現了 P -內醜胺酶在使與P -內酰胺類抗生素和P -內酰胺酶抑制劑聯用的抗 生素治療相關的腸內殘余P -內酰胺失活中是有效的。因為已知P -內酰 胺及其抑制劑部分地通過膽汁進入小腸從身體清除出去，并且所述抑制
劑在體外使P-內酰胺酶失活，所以上述事實是出人意料的。
本發明提供了 A類P-內酰胺酶在制備用于減少與P-內酰胺類抗生 素和P -內酰胺酶抑制劑聯用的治療相關的腸內副作用之藥劑中的用 途。
本發明還描述了減少與P-內酰胺類抗生素和P-內酰胺酶抑制劑聯 用的治療相關的腸內副作用的方法，其中向有需要的對象施用有效量的 A類P-內酰胺酶。
權利要求書中給出了本發明的一些具體實施方案。本發明的其它目 的、細節和優點通過下述附圖、詳細描述和實施例來展現。


6圖1顯示了克隆在分泌載體pKTH141中的地衣芽孢桿菌(5flci7/ws //c/^",yiw7w/s) P -內酰胺酶基因的核普酸序列和推出的氨基酸序列。
圖2顯示了在存在和不存在經口施用p-內酰胺酶的情況下，胃腸外 施用氨節青霉素/舒巴坦組合后比格犬的空腸食糜中的氨芐青霉素濃 度。
圖3顯示了在存在和不存在經口施用P-內酰胺酶的情況下，胃腸外 施用阿莫西林/克拉維酸組合后比格犬的空腸食糜中的阿莫西林濃度。
圖4和圖5顯示了在存在和不存在不同劑量的經口施用P-內酰胺酶 的情況下，胃腸外施用哌拉西林/他唑巴坦組合后比格犬的空腸食糜中 的派拉西林濃度。
具體實施例方式
本發明涉及經口施用的P-內酰胺酶在制備用于減少來源于P-內酰 胺類抗生素和P -內酰胺酶抑制劑聯用治療的殘余未吸收P -內酰胺類抗 生素對腸內菌群之副作用的藥劑上的用途。經口施用的P-內酰胺酶藥 物組合物旨在減少P -內酰胺/ P -內酰胺酶抑制劑組合對回腸遠段和結 腸中主要腸內菌群的影響，以及維持腸內菌群的生態平衡。因此，通過 利用p-內酰胺酶治療，防止了與小腸和結腸內殘余未吸收P-內酰胺/ P-內酰胺酶抑制劑相關的副作用。
P-內酰胺酶
P-內酰胺酶是分類為EC 3.5.2.6的p-內酰胺水解酶。根據其氨基 酸序列，P-內酰胺酶被進一步分為四類A、 B、 C和D(Ambler， 1980)。 A、 C和D類也被稱為絲氨酸P-內酰胺酶，因為它們在活性部位具有絲 氨酸殘基。通過比較3D結構，已經鑒定出在其一級結構上對于底物識 別或催化來說重要的三個保守肽序列(Colombo等，2004):P-內酰胺酶元件
123
A類SXXKSD(N/S/G)(麗H〉(T/S) G
c類SXXKYANKTG
D類SXXKK(T/S)G
在所有絲氨酸p -內酰胺酶中第一個元件是相同的。它含有活性部位絲
氨酸(S)和賴氨酸(K)，其側鏈指向活性部位。第二個元件構成催化腔 的一側。在A類P-內酰胺酶中其被稱為SDN環。所述SDN環在A類酶 中幾乎是不變的，僅有少數例外。第三個元件是位于P-片層的最內部鏈， 其構成催化腔的對側壁。它一般是KTG.在少數例外情況下，賴氨酸 (K)可以被組氨酸(H)或精氨酸(R)所代替，在一些A類P-內跣 胺酶中蘇氨酸(T)可以被絲氨酸(S)所代替(Matagne等，1998)。
根據本發明的一個實施方案，A類P-內酰胺酶來源于芽孢桿菌屬 (5fl"7/"s)物種。才艮據本發明的一個具體實施方案，A類P-內酰胺酶 是地衣芽孢桿菌(5""7/"5/&/^"(/^附&) 61^。此酶已由Izui等，1980 進行過描述，它可來源于例如地衣芽孢桿菌749/C (ATCC 25972)。來 自菌林749/C的PenP的氨基酸序列在蛋白質序列數據庫Swiss-Prot中 以序列號P00808表示。這里也作為SEQ ID NO:l給出。對應于/^w尸 基因的核苷酸序列在DDBJ/EMBL GenBank數據庫中以序列V00093 表示。地衣芽孢桿菌P-內酰胺酶是脂蛋白，其通過脂肪酸尾以蛋白質 部分在膜外折疊的方式錨定于芽孢桿菌的細胞質膜。SEQ ID NO:l表示 所述蛋白質的全長氨基酸序列，包括26個氨基酸長的信號序列。此形 式是前體脂蛋白。甘油二酯共價連接于NH2端的27位半胱氨酸(C )， 得到所述脂蛋白形式。
除此之外，還有分泌到細胞外的較短形式的所述蛋白質。這些也被 稱為胞外型(exoform)。所述胞外型是細胞壁或培養基中蛋白酶水解活 性導致的結果。
本文使用的"PenP"涵蓋明確給出的氨基酸序列(SEQIDNO:l) 的任何P-內酰胺酶活性片段和/或變體。尤其N端截短形式的序列，其 意為在氨基端截短。除了 N端截短之外，它可包含一個或多個其它的氨
8基酸缺失、取代和/或插入，只要它具有P-內酰胺酶活性即可。所述修 飾可以是天然變體或突變體，或通過例如基因技術引入的人工修飾。不 同的氨基端截短胞外型已經在地衣芽孢桿菌的培養基中發現。本文中，
這些胞外型也被包括在術語PenP中。Matagne等，1991描述了天然宿 主地衣芽孢桿菌749/C產生的細胞外形式的不同程度的微觀不均一性 (microheterogeneity )。鑒定了下述5種具有不同N端氨基酸殘基的不 同的分泌的胞外型
SQPAEKNEKTEMKDD.....KALNMNGK:(35-49 , . 300-307位#^酸)
EKTEMKDDKALIS!MNGKU2-49 , . . 300-307位~^^酸) KTKMKDD….KALNMNGK(43-49 , . , 300-3 07位#^酸) EMKDD…KALMMNGKU5-49, . . 300-307位#^酸) MKDD.....KALNMNGK(46-49 . , . 300—307位^^酸)
起始氨基酸殘基以黑體表示。c端氨基酸殘基在右側顯示。氨基酸
位置引用SEQIDNO: 1。起始自35位絲氨酸(S )的胞外型被稱為"大 分泌型"地衣芽孢桿菌P-內酰胺酶，起始自43位賴氨酸(K)的被稱 為"小分泌型"。第一個a螺旋(ar螺旋)起始自48位天冬氨酸(D ), 最后一個a螺旋(au-螺旋)終止于303位天冬酰胺(N )。根據本發明 的一個實施方案，PenP包含至少48至303位氨基酸，其參與所述蛋白 質的二級結構(Knox等，1991)。根據本發明的另一個實施方案，所述 48至303位氨基酸中的一個或多個缺失或被取代。
根據本發明的另 一個實施方案，PenP的氨基端起始自 NH2-KTEMKDD ( SEQ ID NO:l的43-49位氨基酸)。如Gebhard等， 2006所述，此所謂的ES-PL胞外型可另外缺少多至21個連續殘基。 根據本發明的另一個實施方案，氨基端起始自SEQ ID NO:l的谷氨酸 (E )，尤其是它起始自NH2-EMKDD(SEQ ID NO:l的45-49位氨基酸) 或者它起始自NH2-MKDD(SEQ ID NO:l的46-49位氨基酸)。
PenP蛋白質羧基端最后四個氨基酸MNGK-COOH不是二級結構 的一部分，因此可被缺失而不喪失活性。在另一個實施方案中，可缺失 多至9個C端氨基酸。C端截短形式的所述蛋白質已由Santos等，2004 進行了描述。上文所述P -內酰胺酶的所有不同形式以及具有P -內酰胺酶活性的
所述其它形式蛋白質都被包括在本文所使用的術語PenP中。根據本發 明的一個具體實施方案，P-內酰胺酶具有與SEQIDNO:l有至少40、 50、 60、 70、 80、卯、95、 97、 98或99%序列同一性的氨基酸序列或 其P-內酰胺酶活性片段，尤其是起始自27位的所述蛋白質的成熟片段， 以及優選起始自對應于SEQ ID NO:l的45或46位之位置的所述蛋白 質的N端截短片段。如Altschul等，1997所述，使用BLAST( Basic Local Alignment Search Tools )確定序列同 一性。
如O，Callaghan等，1972所述，可通過頭孢硝噻吩(nitrocefin )測 定來確定P -內酰胺酶活性。
A類P-內酰胺酶方便地作為重組蛋白質產生。優選地，在適于產生 藥物產品的芽孢桿菌宿主菌林(例如解淀粉芽孢桿菌(及 fl附盧/iX"c/efis)、短小芽抱軒菌(A戸附"/Zs)或枯草芽孢軒菌(A s"6說/s))中產生。 一種在非產孢枯草芽孢桿菌菌林中產生P-內酰胺酶 的方法描述于WO 03/040352。所述蛋白質還可類似地通過過量產生在 地衣芽孢桿菌中生產。
制劑
P-內酰胺酶被方便地配制成經口施用的腸衣藥物組合物，例如胃抗 性P-內酰胺酶丸劑，以獲得靶向p-內酰胺酶制劑。才艮據本發明的一個 實施方案，P-內酰胺酶被方便地以填充于例如硬明膠膠嚢中的腸衣丸 劑的形式施用。腸衣劑型是制藥工業中公知的口服產品。具有腸衣的藥 物產品被設計成以完整形式通過胃并且在小腸(即十二指腸、空腸和/ 或回腸)中釋放所述劑型的成分。應用腸衣制劑的原因是保護所述藥物 物質免受胃酶或胃內低pH環境的破壞作用，或者防止藥物物質誘導的 對胃粘膜的刺激、惡心或出血，或者將藥物物質以非稀釋的形式遞送到 小腸中的靶位點。基于這些標準，腸衣藥物產品可被視為延遲作用劑型 中的一種。基于水的包衣形式似乎是用于對親水PenP蛋白質進行包衣 處理的最有利材料。常用于實現腸溶性質的水性聚合物有聚甲基丙烯酸 酯例如Eudragit ,基于纖維素的聚合物例如纖維素醚(例如 Duodcell )或纖維素酯(例如Aquateric )或聚乙烯乙酸酯共聚物(例 如Opadry )。治療方法
A類P -內酰胺酶用于減少P -內酰胺類抗生素與P -內酰胺酶抑制劑 聯用誘導的腸內副作用。腸衣P -內酰胺酶以能夠清除未吸收P -內酰胺 類抗生素的量釋放進腸，由此減少所述抗生素的副作用。P-內酰胺酶 例如減少或防止抗生素相關的宿主和腸內菌群之間生態平衡的紊亂，所 述紊亂可導致腹瀉、病原菌例如萬古霉素抗性腸球菌、持久產P-內酰 胺酶革蘭氏陰性桿菌的過度生長或者正常腸內菌群或病原中出現抗生 素抗性并傳播。因此，P-內酰胺酶使得有可能避免例如對于免疫缺陷 患者特別重要的艱難梭菌(C7^加W/"w.力:伊"7e)和病原性酵母的超感染。 乾向腸衣P -內酰胺酶適于與胃腸外施用的或可能經口施用的抗生素和 P-內酰胺酶抑制劑相聯合經口給藥。用p-內酰胺酶治療的對象是用P-內酰胺類抗生素和P -內酰胺酶抑制劑聯合治療的人或動物例如農場動 物。
抗生素和抑制劑
"P -內酰胺類抗生素"是含有4元P -內酰胺(氮雜環丁烷-2-酮) 環的抗菌化合物。P-內酰胺類抗生素是本領域公知的，它們可以是天 然、半合成或合成來源的。所述P-內酰胺類抗生素一般可以根據它們 的其它結構特征被分為青霉素類、頭孢菌素類、頭霉素類、氧雜-P-內 酰胺類、碳青霉烯類、碳頭孢烯類和單環P-內酰胺類。優選地，所述 抗生素是胃腸外施用的。所述P-內酰胺類抗生素與合適的P-內酰胺酶 抑制劑聯用。用于此目的的合適抗生素有例如青霉素類(如青霉素G)、 氨基青霉素類(例如阿莫西林和氨芐青霉素)、脲基青霉素類(例如哌 拉西林)或者a-羧基青霉素類(例如替卡西林)。
"P-內酰胺酶抑制劑"是能夠抑制P-內酰胺酶的化合物，其因此 能夠水解P-內酰胺類抗生素。所述抑制劑一般但不必然在結構上與P-內酰胺類抗生素相關，其自身可具有弱的抗菌活性，但是其在所述聯合 治療中的功能是保護所存在的抗生素免受細菌P-內酰胺酶的失活。在 本文中，所述抑制劑尤其是針對A類P-內酰胺酶的抑制劑。合適的抑 制劑有例如舒巴坦、克拉維酸和他唑巴坦。克拉維酸是天然類似物，而 舒巴坦和他唑巴坦是半合成的。大多數抑制劑通過胃腸外施用，即靜脈 內或肌內施用。克拉維酸還可經口施用。 一些P-內酰胺類抗生素/P-
ll內酰胺酶抑制劑組合已在本領域有所描述且在臨床上應用。
所述抗生素和所述抑制劑方便地作為混合物施用。市售P -內酰胺酶 抑制劑在臨床上與多種P-內酰胺組合使用。克拉維酸與阿莫西林或替 卡西林組合使用，類似地舒巴坦與氨爺青霉素一起使用，以及他唑巴坦 與哌拉西林一起使用。其它組合也是可能的。P-內酰胺酶可同時經口 施用，或者在用抗生素-抑制劑組合進行治療之前施用。優選地，它與 P ■內酰胺/抑制劑組合同時施用。
劑量
由于施用P -內酰胺和P -內酰胺酶抑制劑的組合所導致的腸內菌群 的紊亂程度和副作用的出現情況取決于多個因素，其包括藥物劑量、施用 途徑和所述P -內酰胺和所述抑制劑的藥代動力學/動力學性質。所述P -內酰胺酶以足以減少與小腸和結腸內殘余未吸收P-內酰胺相關的副作
用的量施用。在所進行的實驗中，約0.1 mgp-內酰胺酶/kg體重的劑量 有效清除氨節青霉素和阿莫西林至空腸食糜中濃度低于檢出限，而清除 哌拉西林需要更高的劑量。合適的劑量可以是0.1-1.0，尤其0.2-0.4 mg P-內酰胺酶/kg體重。
通過下述非限制性實施例進一步闡明本發明。但是應理解說明書上文 中和實施例中給出的實施方案僅用作舉例說明，在本發明的范圍內多種變 型和4奮飾是可能的。測試結果顯示P -內酰胺酶對與P -內酰胺/ P -內酰胺 酶抑制劑治療相關的未吸收P -內酰胺有出人意料的作用。該結果支持 了將地衣芽孢桿菌P-內酰胺酶的用途擴展到P-內酰胺與P-內酰胺酶 抑制劑相組合的抗生素治療。
實施例1
實驗中使用了來源于地衣芽孢桿菌749/C的重組P-內酰胺酶。如 WO 03/040352中所述，所述蛋白質在非產孢枯草芽孢桿菌菌林中產生。
使用分泌型載體pKTH141，其包含帶有解淀粉芽孢桿菌(及 flwy^/^i/e/flc/eifs) E18淀粉酶基因(fl/iy;g)之強生長啟動子(fl附yft;)、 核糖體結合位點(RBS)和信號序列編碼區域(fl y^ss)的表達盒。另 外，帶有單^,> /111位點的合成寡核苷酸直接插入到信號序列編碼區域的3，端。因此，可以將所述編碼外源蛋白質的插入片段以在與a-淀粉酶 信號序列同 一讀碼框中被翻譯的方式克隆進H/"^HI位點。所述HzVirfIII 寡核苷酸編碼三個氨基酸殘基(NHrQAS)，其被認為包含成熟蛋白質 的NH2-端延伸。
使用含H/"rfni限制性位點的合適引物以及地衣芽孢桿菌染色體
DNA作模板，通過PCR擴增編碼SEQ ID NO:l的43-307位連續氨基 酸殘基的地衣芽孢桿菌P-內酰胺酶結構基因(/^w戶)。然后用R!7irfl11 切割所擴增的片段，并連接到pKTH141的相應位點中，得到編碼AmyQ 信號肽和PenP蛋白質序列的融合框。通過使用自動DNA測序儀的雙 脫氧鏈終止法確定P -內酰胺酶基因的核普酸序列。重組地衣芽孢桿菌 749/C P -內酰胺酶基因的完整核苷酸序列和推出的氨基酸序列如SEQ IDNO:2和3所示，并在圖l中給出。
在圖1中，橫行之下括號中顯示的數字指氨基酸殘基。編碼 NH2-QAS延伸的H,VirfIII克隆位點在核苷酸序列之上顯示。預測的信號 肽酶切割位點在-31位丙氨酸后。
所述開放讀碼框編碼299個氨基酸的多肽，其具有flwj^基因的31 個氨基酸殘基長的信號序列。信號肽酶的切割位點預計位于-1位的丙氨 酸后。成熟P-內酰胺酶預期起始自+l位的谷氨酰胺(Q)。因此，成熟 P ■內酰胺酶預期含有268個氨基酸殘基，其中NH2-QAS延伸由好,Vi^111 克隆位點編碼。
使用蛋白質測序儀通過自動Edman降解確定純化的重組P-內酰胺 酶的NHr端序列。分析顯示，重組P-內酰胺酶缺少位于其所推出的氨 基端的NHrQASKT-五肽。結果顯示重組P-內酰胺酶的截短形式是由 蛋白水解酶的翻譯后作用產生的，所述蛋白水解酶在細菌細胞壁中和培 養基中都存在。總之，純化的重組P-內酰胺酶的大部分包含263個氨 基酸殘基，分子量為29.3 kDa。所測定的氨基端序列起始自所推出的氨 基酸序列下游5個氨基酸殘基之后。純化的重組P-內酰胺酶第一個氨 基酸殘基是圖1中+6位的谷氨酸(E)。
純化的酶蛋白質被稱為P1A。它基本由(至少約95。/。重量)SEQID NO:l的45至307位連續氨基酸殘基組成。剩下的基本上由SEQ IDNO:l的46至307位連續氨基酸殘基組成。P-內酰胺酶以腸衣丸劑形 式施用，所述形式基本類似于Harmoinen等，2004進行的研究中4吏用 的丸劑。
在狗模型中研究了地衣芽孢桿菌P -內酰胺酶清除在氨節青霉素-舒 巴坦聯合胃腸外治療期間小腸內膽汁分泌的氨千青霉素的能力。通過手
術將乳頭狀閥(ni卯le valve)插入到實驗比格犬的空腸中距幽門約l70 cm遠的地方，以實現收集樣品用于分析。所述腸手術不改變腸運動。 在研究中使用了 6只比格犬。此研究以依次兩個處理的形式進行在第 一實驗中，在喂食后靜脈施用連續兩劑氨芐青霉素和舒巴坦組合(40 mg 氨芐青霉素和20mg舒巴坦/kg體重)，給藥間隔6小時20分。7天后， 與第一實驗相似地進行第二實驗，不同之處在于在注射氨節青霉素/舒 巴坦之前10分鐘向相同的狗另外經口施用P-內酰胺酶。使用含有約0.1 mg活性p -內酰胺酶/kg體重的單劑腸衣丸劑。
在不同時間點收集空腸食糜樣品。將食糜樣品立即冷凍并保存于-70 x:以待分析。通過固相提取清潔食糜樣品。使用帶UV檢測的反相高效 液相色語(HPLC)方法對氨千青霉素進行定量。
獲得的結果顯示在沒有用P-內酰胺酶治療而進行的第一實驗中的 食糜樣品中檢測到高水平氨千青霉素，而第二實驗顯示經口施用P-內 酰胺酶能夠減少空腸氨千青霉素水平至定量限(10微克氨千青霉素/g 空腸食糜)以下。
圖2顯示經口施用P-內酰胺酶丸劑(約O.l mg活性P-內酰胺酶/kg 體重的劑量)對靜脈內施用氨千青霉素/舒巴坦組合(40 mg氨節青霉素 和20 mg舒巴坦/kg體重)之后比格犬(n=6)的空腸食糜中氨節青霉素 濃度的作用。兩個實驗的值都以不同時間點時平均空腸氨芐青霉素濃度 的形式表示。實驗l中的氨千青霉素值代表以6小時的給藥間隔在沒有 P-內酰胺酶治療的情況下兩次分別施用氨節青霉素/舒巴坦之后達到的 空腸氨芐青霉素濃度。在實驗2中在用氨芐青霉素/舒巴坦組合治療的 同時使用P-內酰胺酶治療比格犬。所使用的P-內酰胺酶劑量能夠清除 第一次氨千青霉素/舒巴坦治療期間比格犬的大部分空腸氨芐青霉素， 并且在同時用P -內酰胺酶治療的第二次氨節青霉素/舒巴坦治療期間空 腸氨節青霉素濃度降低并保持在定量水平以下。結果顯示殘余膽汁分泌P -內酰胺酶抑制劑具有對P -內酰胺酶活性 有限的影響。
實施例2
基本類似于實施例l地，研究了在施用阿莫西林和克拉維酸組合胃腸 外治療過程中地衣芽孢桿菌P-內酰胺酶P1A使得膽汁分泌阿莫西林失 活的有效性，不同之處在于單劑阿莫西林/克拉維酸組合含有25 mg阿 莫西林和5 mg克拉維酸/kg體重，并闡明了 HPLC分析法適于分析阿 莫西林(定量限是2微克/克空腸食糜)。
所得結果在圖3中顯示，其顯示經口施用p-內酰胺酶丸劑對靜脈內 施用阿莫西林/克拉維酸組合(25 mg阿莫西林和5 mg克拉維酸/kg體重) 之后比格犬(n=6)的空腸食糜中阿莫西林濃度的作用。兩個實驗的值 都以不同時間點時平均空腸阿莫西林濃度的形式表示。實驗l中的阿莫 西林值代表以6小時的給藥間隔在沒有P-內酰胺酶治療的情況下兩次 分開施用阿莫西林/克拉維酸之后達到的空腸阿莫西林濃度。在實驗2 中阿莫西林/克拉維酸組合胃腸外治療與經口P-內酰胺酶治療相組合。
發現P-內酰胺酶治療能夠清除用阿莫西林/克拉維酸組合胃腸外治 療過程中的大部分膽汁分泌阿莫西林。通過增加P-內酰胺酶的劑量可 清除不同時間點在一些空腸食糜中發現的痕量阿莫西林。結果提示地衣 芽孢桿菌P -內酰胺酶是用于減少與胃腸外使用阿莫西林/克拉維酸相關 的副作用的有力候選藥物。
實施例3
在同時進行和不進行P ■內酰胺酶治療的情況下，用哌拉西林和他唑 巴坦組合治療比格犬。基本上如實施例1和2中所述進行實驗，不同之處 在于使用單劑哌拉西林/他唑巴坦組合(含有100 mg艱拉西林和12.5 mg 他唑巴坦/kg體重)，以及闡明了 HPLC分析法適于分析哌拉西林(定量限 是10微克/克空腸食糜).
所得結果在圖4中顯示，其顯示經口施用P-內酰胺酶丸劑對靜脈內 施用艱拉西林/他唑巴坦組合(100 mg哌拉西林和12.5 mg他唑巴坦/kg體 重)之后比格犬(n=6)的空腸食糜中哌拉西林濃度的作用。兩個實驗
15的值都以不同時間點時平均空腸哌拉西林濃度的形式表示。實驗l中的
哌拉西林值代表以6小時的給藥間隔在沒有P-內酰胺酶治療的情況下 兩次分別施用哌拉西林/他唑巴坦之后達到的空腸哌拉西林濃度。在實驗 2中艱拉西林/他唑巴坦組合胃腸外治療與經口 P-內酰胺酶治療相組合。
不使用P -內酰胺酶獲得的結果(實驗1)顯示比格犬中哌拉西林的 膽汁清除比氨千青霉素或阿莫西林高得多。盡管如此，P-內酰胺酶治 療在所有時間點降低了空腸哌拉西林濃度。但是，在p-內跣胺酶治療 中(實驗2)哌拉西林濃度仍然一直可檢出。因此，所得結果顯示P-內酰胺酶治療能夠清除用派拉西林/他唑巴坦組合胃腸外治療過程中的 空腸哌拉西林，但是腸衣丸劑中P-內酰胺酶的量應該升高以使得制劑 能夠將空腸哌拉西林濃度清除至定量限以下。
重復所述實驗，不同之處在于單劑P -內酰胺酶丸劑含有約0.3 mg活 性P -內酰胺酶/kg體重，單劑^Mi西林/他唑巴坦組合含有65.6 mg 9M^ 西林和9.4 mg他唑巴坦/kg體重。結果顯示于圖5，其顯示P -內酰胺酶對 于清除空腸旅拉西林是非常有效的。參考文獻WtschulS.F., ,dGDT.L,Sch甜erA.A.,2hang J,ZhangZ., Milter W., Upman D.丄1997. Gapped BLAST and PS卜BLAST: a new generation of proton database search programs. Nucleic AcWs Res, 25: 3389-3402Ambler RP, 1980. The s歐lure. of beta-tecamases. Phitos,. Trans, R- Soc. London B Biol. Scl 289:321-331Brogard.丄M" Jehl, F., Blickte,丄F.. Adtoff M., Donner, M., and H. Montetl' 1卿.Bi錢ry elimination of feamiJto p餘us rfa她nfc acid《Cfa卿闊: experimental and efintesl study, int.丄Clin. Pharmacol, Ther. ToxicoL 27:135-144、Colombo, M., L,, H3niqu8, S., Bsurin, S,L,, Bauvois, C., De Vrierutt， K., Van Beeumen,丄丄,Frere,丄M,, and B. Jorte.. :2004. The .yfcx/ gene of 8ac//-/"s s"娜s 168 encod的a class D beta-tectamase of low activity. Ant)microb. Agents Ch6mother.48:484-490Donskey, C.丄,2006. Antibiotic regimens and intestina, cofcmization wrth ar她totic鄰slstamt Gram-ragaMw tsaelL Clin. Infect. Dis. .43:62-69.Harmoin。n,丄,Mentula, S., Hei,a， M., van tter Rest, M., Rajala-Schute, P.丄,Donskey. CJ,, Frias, R., Koski, P , Wickstrand N,, Jousimles-Somer. H,， Westormarch, E., anct K. Lindevall. 2004. Orally administered targeted recombinant beta-lactamase prevsnts ampicillir^nduced selective pressure on the gut microbiota: a novel approach .to reducing antimlcroWsl resfe-tance- Antfrnicrofc*. Agents Chemother. 48:75-79H,oinen,丄VaaK, K,， Koski, P., Syrj§nen, K., UW歸n, O., Lfnds~ va", K., and E. Wsstermarck, 2003, Enzymatic degradation of袋p-lactam antibiotic, ampk;畫n, in fte gut: a novei treatment modalSy,丄An畫froterob^ CJiemo-to, 51:287-292、!zui, K,丄B.K. ,elsen, MP. Gau,eW, and丄O. Lamp的.1980. Largs exopenic隨irsase, inrtia條.extrace，lular form detected in growths of 8aci//us feteffl'fofmfe. Bkidiemistry 19:1882-1886丄A. Katz. 2006, Probfotfcs few prevention of antibtotic-sssociated di-.airh的and Cto fntf/c/m rf銜o e diarrhea.丄CRr , Gsstroenteral, 40:249-255.Gebhard LG., Rrtsso V,A. Ssnots丄，Ferreyra R.G.， Noguera M,E and Ermscora 2006. M錢pphg the distribution of conformational .information throughout a protein sequence,丄Mol, Btol. 21:358(1)280-288H能ifw, P,G,豕Wi鄰Knghoff, R, Stefan(k, O., and H, Seffert. 2004. In Vitro activities of th& p-lactamsse inhibitors d暨vularito acid, sulbactam, and ta-zobactam atone or〖rt combination with p-tectams against, epklemiologicaly characterized multWrug"nesistarrt /Ac^ eto6ac〖er h3"rnano,/ strains.. 48: 1586-1592Knox,丄R., and P.C. Moews, 1991. Beta-lac(amase of Sae斑rts ,/c/jen//bmr/s 749/C Refinement a〖2 A resolution and analysis of hydraticm.Korho,, H-, Marnila. P., and H.S, Gill. 2000. Bovine milk an他od-fes for he纖，Br J Nutr. 84:135-146Matagns, A,, Joris, B., van B的umen丄,and J-M. Frere. 1991, Ragged N-termW and other variants of class A beta-laclamases analysed by ctiro幽tofoOJS[no, Btochem.丄.273: 503-510Mat3gn白,A., Lamotte-Brasseur,丄,and丄M. Frera, 1998. Catalytic; properties of class A beta-lactamases: efficiency and diversity. &ochem.丄 330: S8卜鄉Morris D丄,，Ubm, C,S,, Robertson, C,S,, and K,W, Brammer, 1986, 3"iary pharmacokinetics of sulbactam in humans, Rev.lnfect.Dis.. 8:589-592.O'Callaghan, C. H., Morris' A" KMsy, S.M., and A, H. Singter. 1972, Novd method for detection of beta-4aclamases by using a chromogenic cephalosporin substrate. Anlimicrob. Agents Chemother, 1:283-288Rice, LB,, Mutton-Thomas,F ,, Lakticova, V., H經〖ferei, M.S,, and C,丄 。onskey.2卿.B ta~tectam antibiotics and .ga stroimestinal ccton2a1tion of 甽comycin-restetefif舶terocQt:ci丄lnfe汰Dis,湖:"13-1118,Sanios, J, Gebhard LGL, Rteso VA， Fere'拜R,G,, Rossi丄P. and Ermscora M.R. :2004.■ FoWing of an abridged beia-lactamsse. Biochemistry 43(6).1715-123Su川van, A., Edlund, C., and Nord, C.E. 2001, Effect of antimicrobial agenis on the e.cotogfca〗toalarwe of human microflora. Lancs復1:101-114,Westphal,丄F., Brogard, J,M., Caro-Sampara. F., Adloff, M., Blickle, 丄F., Montei， H., and F, Jshl.. 1997. Assessment of biliary excretion of piper-acii"n-tazobactam ;n humans. AMimicrob, Agents Chemother, 41:1636-1640,VWIdf uer, A., Sch^ersch, U., Eng喊K., n CasteW E., Sch湖rig, A., Potempa,丄,and H. Leruiere, 1卿.Pharm日cokinetics of suibaclam and amjste湘n intravenously applied in combination to healthy wiuntesre and pa-itents. Dete濯inatton of the ratio of the two drugs in serum and in various tissues, Arzn咖rttelforechung. 38:164CM643.
權利要求
1.A類β-內酰胺酶在制備用于減少與β-內酰胺類抗生素和β-內酰胺酶抑制劑聯用治療相關的腸內副作用之藥劑中的用途。
2. 根據權利要求l的用途，其中所述A類P-內酰胺酶是地衣芽孢桿菌
3. 根據權利要求l的用途，其中所述P-內酰胺類抗生素選自青霉素 類、氨基青霉素類、脲基青霉素類和羧基青霉素類。
4. 根據權利要求3的用途，其中所述P -內酰胺類抗生素選自青霉素G、 氨芐青霉素、阿莫西林、哌拉西林和替卡西林。
5. 根據權利要求l的用途，其中所述抑制劑是針對A類P-內酰胺酶的 抑制劑。
6. 根據權利要求5的用途，其中所述抑制劑選自舒巴坦、克拉維酸 和他哇巴坦。
7. 根據權利要求l的用途，其中所述P-內酰胺類抗生素和P-內酰胺酶 抑制劑的組合是選自下列的組合氨千青霉素和舒巴坦、阿莫西林和克 拉維酸、哌拉西林和他唑巴坦以及替卡西林和克拉維酸。
8. 根據前述任一項權利要求的用途，其中所述P-內酰胺酶來源于地衣 芽孢桿菌749/C (ATCC 25972 )。
9. 根據前述任一項權利要求的用途，其中所述P-內酰胺酶是重組P-內酰胺酶，其由枯草芽孢桿菌(5. sw&i7/s)、解淀粉芽孢桿菌(5. fl附盧/fX"dews)、短小芽孢桿菌(丑.戸附"http://15)或地衣芽孢桿菌產生。
10. 根據前述任一項權利要求的用途，其中所述P -內酰胺酶被制備成經 口藥物組合物。
11. 根據權利要求10的用途，其中所述藥物組合物是腸衣組合物。
12. 根據前述任一項權利要求的用途，其中所述P -內酰胺類抗生素和所 述P -內酰胺酶抑制劑經胃腸外施用。
13. —種減少與P -內酰胺類抗生素和P -內酏胺酶抑制劑聯用治療相關的腸內副作用的方法，其中向有需要的對象施用有效量的A類P-內酰 胺酶。
14.根據權利要求13的方法，其中所述A類P-內酰胺酶是地衣芽孢桿 菌(丑鎖7/ms //c/rewiyb削/s) PenP。
全文摘要
A類β-內酰胺酶可用于減少與使用β-內酰胺類抗生素和β-內酰胺酶抑制劑聯用的抗生素治療有關的腸內副作用。
文檔編號A61K31/431GK101563099SQ200780044165
公開日2009年10月21日 申請日期2007年11月21日 優先權日2006年11月28日
發明者佩爾蒂·科斯基, 克里斯蒂納·拉泰薩爾米, 塔皮奧·科爾科萊寧 申請人:Ipsat治療公司