抗動物病毒的抗病毒劑的制作方法

文檔序號：1223488閱讀：447來源：國知局

專利名稱：抗動物病毒的抗病毒劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及抗動物病毒的抗病毒劑。更具體而言，本發明涉及含有作為活性成分的蛋白或編碼所述蛋白的核酸序列的抗動物病毒的抗病毒劑，以及含有所述蛋白或編碼所述蛋白的核酸序列的抗病毒動物細胞，所述蛋白具有對侵入動物細胞的外來核酸鏈的結合能力和降解能力，并且對所述動物細胞本身沒有細胞毒性。
背景技術：
至今所開發的抗病毒劑大多為根據被感染的病毒類型表現出優良抗病毒活性且具有相對較低毒性的非蛋白藥物，所述抗病毒活性例如為病毒吸附抑制、病毒穿透抑制、病毒脫殼抑制、病毒核酸轉錄(或翻譯) 抑制(例如，病毒胸苷激酶抑制、病毒反轉錄酶抑制、病毒聚合酶抑制
和病毒mRNA加帽抑制)和病毒蛋白合成抑制。
有數件專利與抗病毒藥物有關。例如，針對病毒轉錄抑制的韓國專利申請第10-2001-0021449號公開了抑制在細胞核內前病毒長末端重復序列(LTR)上的RNA表達的融合蛋白。
美國專利第5,849,800號公開了與病毒脫殼有關的金剛胺。
美國專利第4,957,924號公開了作為抑制病毒核酸的生物合成的抗病毒藥物的無環鳥苷。所述無環鳥苷是通過修飾核酸內的糖來制備的藥物且用于治療皰疹病毒感染。所述無環鳥苷與三磷酸脫氧鳥苷(dGTP)競爭并加入病毒DNA中，由此終止DNA復制。
美國專利第5,108,993號和第5,026,687號分別公開了齊多夫定和雙脫氧肌苷，它們是用于治療人類免疫缺陷病毒(HIV)感染的逆轉錄酶抑制劑。
美國專利第5,962,725號公開了抑制HIV蛋白酶活性以防止HIV產生所需蛋白的奈非那韋(nelfmavir)。
此外，已知阿立酮和普來可那立是介導病毒與宿主細胞結合然后穿透并脫殼的抗病毒藥物。據報道，這些藥物抑制衣殼蛋白從RNA基因組
中脫殼。
已知三氟胸苷是引入到DNA中并由此導致在DNA復制過程中的突變體生長的嘧啶類似物。已知膦甲酸與皰疹DNA聚合酶結合而抑制DNA 復審ij。己知利巴韋林和尼普蘭諾辛A(neoplanocin A)是抑制mRNA帽結構的形成而抑制RNA合成的鳥苷和腺苷類似物。
其它抗病毒藥物如沙奎那韋、利托那韋和茚地那韋抑制HIV蛋白酶活性而防止HIV產生所需蛋白。
然而，這些抗病毒藥物具有副作用，如潛在感染率的增加和在短期內耐藥病毒株的連續出現(Magden等，Appl Microbiol Biotechnol 66:612-621, 2005)。
稱作免疫蛋白的抗體廣泛用于治療病毒疾病。但是，抗體的臨床使用局限于涉及抗體對抗特定病毒的中和機制的被動免疫。例如，已知的巾白利珠單抗(palivizumab)(Cardenas等，Expert Rev Anti Infect Ther 3:719-726, 2005)針對存在于呼吸道合胞病毒(RSV)包膜內的F-糖蛋白的 A抗原位點內的表位。
美國專利第6，818，216號公開了一種新型抗RSV抗體，由于所述抗體與傳統抗RSV抗體相比具有更優異的親和力，因而可以以低劑量施用。
然而，這些抗體的根本性問題在于，由突變體在基因抗原結構上的改變抑制了抗體繼續識別所述抗原，因此無法實現對抗原具有特異性的所述抗體的抗病毒活性。
造成這一問題的原因在于，抗病毒抗體的開發針對的是病毒基因產物。作為解決該問題的一個替代方案是開發出病毒核酸靶向抗體。然而，目前還未有與所述替代方案的抗體有關的報道。核酸酶據報道是降解核酸的酶。核酸酶轉移到宿主細胞中對于該細胞而言是非常具有細胞毒性的，因而引起細胞死亡這一根本性問題。這種問題不可避免地限制了病毒核酸靶向抗體的開發。同時，僅有少數稱作催化抗體的抗體蛋白在與抗原結合的同時對該
抗原表現出酶促活性。某些抗DNA抗體、抗RNA抗體和抗DNA/RNA 抗體稱作天然產生的催化抗體(Buneva等，Appl Biochem Biotechnol 75: 63-76， 1998; Jang等，cell Mol Life Sci 60:309-320， 2003)。
另夕卜，本領域內已知的唯一抗DNA催化抗體是BV04-01， BV04-01 具有基于重組單鏈可變片段(scFv)的結構，并且表現出作為降解單鏈和雙鏈DNA的抗DNA催化抗體的催化活性(Gololobov等，Mol Immunol 34:1083-1093， 1997)。
然而，對BV04-01的RNA酶活性、在動物細胞上的抗病毒活性和對自衍生的核酸的保護可能性根本沒有報導
發明內容
技術問題
本發明的一個方面是提供一種新型抗病毒劑，所述抗病毒劑具有對侵入動物細胞的外來核酸鏈的選擇性降解能力，并且對所述動物細胞本身沒有細胞毒性，因此不造成所述動物細胞的死亡。
本發明的另一個方面是提供一種抗病毒動物細胞，所述抗病毒動物細胞具有對侵入動物細胞的外來核酸鏈的選擇性降解能力，并且對所述動物細胞本身沒有細胞毒性，因此不造成所述動物細胞的死亡。
技術方案
根據為實現上述方面的本發明的一個方面，提供了抗動物病毒的抗病毒劑，所述抗病毒劑含有作為活性成分的蛋白，所述蛋白具有對侵入動物細胞的外來核酸鏈的選擇性結合和降解能力，并且對所述動物細胞本身沒有細胞毒性。
根據本發明的另一個方面，提供了一種抗動物病毒的抗病毒劑，所述抗病毒劑含有作為活性成分的編碼蛋白的核酸序列，所述蛋白具有對侵入動物細胞的外來核酸鏈的選擇性結合和降解能力，并且對所述動物細胞本身沒有細胞毒性。
根據本發明的又一個方面，提供了一種含有作為活性成分的蛋白的抗病毒動物細胞，所述蛋白具有對引入動物細胞的外來核酸鏈的選擇性結合和降解能力，并且對所述動物細胞本身沒有細胞毒性。
根據本發明的另一方面，提供了一種含有作為活性成分的編碼蛋白的核酸序列的抗病毒動物細胞，所述蛋白具有對侵入動物細胞的外來核酸鏈的選擇性結合和降解能力，并且對所述動物細胞本身沒有細胞毒性。
有利作用
從上文可以明顯看出的是，本發明的抗病毒劑能選擇性地降解侵入動物細胞的外來核酸鏈，并且對所述動物細胞沒有細胞毒性，因此表現出所述宿主細胞能夠受到保護且能夠只除去所述外來核酸鏈的有利作用。

從如下詳細說明并結合附圖將可以更清晰地理解本發明的上述和其它方面、特性和其它優點，其中
圖1顯示了本發明的3D8 scFv蛋白的VH、VL和接頭的堿基和核酸序列(由"方框"表示的部分對應于所述接頭的序列)；
圖2顯示了在細菌中表達的本發明的3D8 scFv、 3D8 VH和3D8 VL 蛋白的表達載體圖3顯示了確定表達在細菌中并純化的本發明的3D8 scFv、 3D8 VH 和3D8 VL蛋白的純度的SDS-PAGE分析結果；
圖4顯示了確定以單體形式存在的本發明的VH和VL蛋白的HPLC 結果；
圖5顯示了確定本發明的VH和VL之間的關聯的表面等離子共振 (SPR)分析結果；
圖6顯示了確定本發明的3D8 scFv、 VH和VL抗體蛋白與具有不同堿基序列的ssDNA和dsDNA的親和力的表面等離子共振(SPR)分析結果；
圖7顯示了在不同濃度的NaCl存在下的酶聯免疫吸附測定(ELISA) 結果，該結果確定了本發明的3D8 scFv、 VH和VL抗體蛋白與DNA的結合主要由靜電力造成；
圖8 10顯示了瓊脂糖凝膠電泳結果，該結果確定了本發明的3D8 scFv、 VH和VL蛋白的雙鏈(ds(N)4o)DNA降解活性取決于Mg"和反應時間(在圖8和圖9中，"B"是用作對照組的BSA蛋白；"Mg"是Mg"處理組；"E"是EDTA處理組，"M"是標記；"rc，'是DNA的"松弛環形形式"的縮寫；"lin"是"線性形式"的縮寫并指線性DNA;而"sc"指"超螺旋形式" 的縮寫并指完全螺旋DNA);
圖11顯示了原位丙烯酰胺凝膠測定結果，該結果確定了本發明的 3D8 scFv、 VH和VL蛋白的dsDNA降解活性基于所述蛋白的固有性質 ("Etbr處理組"是對比數據結果的黑白色的組，其中深色位置是DNA 不與Etbr反應的位置)；
圖12顯示了親和力連接寡核苷酸核酸酶測定(ALONA， affinity-linked oligonucleotide nuclease assay)結果，該結果確定了本發明的 3D8 scFv、 VH和VL蛋白的DNA酶活性對堿基序列不具有特異性；
圖13顯示了由X射線衍射分析的本發明的3D8 scFv蛋白晶體的結
構；
圖14顯示了根據本發明的3D8 scFv蛋白晶體和作為傳統抗DNA催化抗體的BV04-01的重疊結構；
圖15顯示了本發明的3D8 VH蛋白晶體的結構；
圖16顯示了本發明的3D8 VL蛋白晶體的結構；
圖17顯示了酶聯免疫吸附測定(ELISA)結果，該結果確定了 scFv突變體的DNA結合能力和DNA酶活性，在所述突變體中，兩個組氨酸(His) 殘基由丙氨酸取代(黑柱dS-(dN:dN')4o，白柱Ss-(dN)40);
圖18顯示了確定scFv突變體的DNA酶活性的瓊脂糖凝膠電泳結果，在所述突變體中，兩個組氨酸(His)殘基由丙氨酸取代("B"是用作對照組的BSA蛋白；"Mg"是Mg"處理組；"E"是EDTA處理組，"M"是標記；"rc"是DNA的"松弛環形形式"的縮寫；"lin"是"線性形式"的縮寫并指線性DNA;而"sc"指"超螺旋形式"的縮寫并指完全螺旋DNA);
圖19顯示了確定3D8 VH突變體和3D8 VL突變體的DNA結合能力變化的酶聯免疫吸附測定(ELISA)結果，在所述突變體中，兩個組氨酸
(His)殘基由丙氨酸取代(黑柱ds-(dN:dN')恥，白柱SS-(dN)40);
圖20顯示了瓊脂糖凝膠電泳結果，該結果確定了 3D8 VH突變體和 3D8 VL突變體的DNA酶活性變化，在所述突變體中，一個組氨酸(His) 殘基由丙氨酸取代("B"是用作對照組的BSA蛋白；"Mg"是Mg"處理組； "E"是EDTA處理組，"M"是標記；"rc"是DNA的"松弛環形形式"的縮寫； "lin"是"線性形式"的縮寫并指線性DNA;而"sc"指"超螺旋形式"的縮寫并指完全螺旋DNA);
圖21顯示了瓊脂糖凝膠電泳結果，該結果根據反應時間確定了本發明的scFv蛋白的RNA酶活性；
圖22顯示了原位水解測定，其中確定了本發明的3D8 scFv蛋白的 RNA酶活性是歸因于所述蛋白的固有性質("Etbr處理組"是對比數據結果的黑白色的組，其中深色位置是RNA不與Etbr反應的位置)；
圖23顯示了親和力連接寡核苷酸核酸酶測定(ALONA)結果，該結果確定了本發明的3D8 scFv蛋白的RNA酶活性不依賴于Mg2+;
圖24和圖25顯示了熒光顯微鏡圖像，其中確定了轉移進vero細胞的本發明的3D8 scFv蛋白表現出對水泡性口炎病毒(VSV)增殖的抑制活性("3D8-"指"不含3D8 scFv蛋白"，"3D8+"指"注射了 3D8 scFv蛋白"， "VSV-"指"未用VSV處理"，而"VSV+"指"經VSV處理")；
圖26和27顯示了熒光顯微鏡圖像，確定了轉移進vero細胞的本發明的3D8 scFv蛋白表現出對水泡性口炎病毒(VSV)增殖的抑制活性 ("3D8-"指"不含3D8scFv蛋白"，"3D8+"指"注射了 3D8 scFv蛋白"， "VSV-，，指"未用VSV處理"，而"VSV+"指"經VSV處理")；
圖28顯示了 MTT測定結果，該結果確定了通過VSV感染的細胞病變效應(CPE)是否在引入了 3D8scFv、 3D8VH、 3D8VL或其它蛋白的各個vero細胞上被抑制；
圖29顯示了共聚焦顯微鏡的免疫熒光染色結果，該結果確定了在其中轉移有3D8 scFv、VH和VL蛋白的各個HeLa細胞上的VSV增殖抑制活性("3D8-，，指"不含3D8 scFv蛋白"，"3D8+"指"注射了 3D8 scFv蛋白"，"vsv-"指"未用vsv處理"，而"vsv+"指"經vsv處理")；
圖30是其中克隆有3D8 scFv基因的動物細胞表達載體的示意圖31顯示了 RT-PCR結果，該結果確定了 3D8 scFv mRNA在其中穩定轉染有3D8 scFv基因的NIH/3T3細胞中順利表達；
圖32顯示了使用TRITC的免疫熒光染色測定的結果，該結果確定了 3D8 scFv mRNA在其中穩定轉染有3D8 scFv基因的NIH/3T3細胞中的表達("a"是顯示不含3D8 scFv的NIH/3T3細胞的圖像，而"b"是顯示經3D8 scFv轉染的NIH/3T3細胞的圖像)；
圖33是顯示了 RT-PCR結果的瓊脂糖凝膠電泳圖像，所述結果確定 3D8 scFv mRNA在經轉化的HeLa細胞系中的表達；
圖34顯示了流式細胞測定結果，該結果確定3D8 scFv蛋白在代表性轉化HeLa細胞系中的表達；
圖35是顯示RT-PCR結果的瓊脂糖凝膠電泳圖像，所述結果確定3D8 scFvmRNA在經轉化的PK15細胞中的表達；
圖36顯示了 MTT測定結果，該結果確定VSV引起的細胞病變效應 (細胞死亡)是否在表達3D8 scFv蛋白的NIH/3T3細胞中被抑制；
圖37顯示了熒光顯微鏡測定結果，該結果確定VSV引起的細胞病變效應(細胞死亡)是否在表達3D8scFv蛋白的HeLa細胞中被抑制；
圖38顯示了胞內染色結果，該結果確定了CSFV (典型豬瘟病毒) 的增殖在經轉化的PK15細胞內被抑制；
圖39顯示了 MTT測定結果，該結果確定表達3D8 scFv蛋白的HeLa 細胞的定量抗VSV活性；
圖40顯示了熒光顯微鏡測定結果，該結果確定表達3D8 scFv蛋白的HeLa細胞的抗VSV活性(細胞死亡抑制)；
圖41顯示了顯微鏡測定結果，該結果確定表達3D8 scFv蛋白的HeLa 細胞的抗ADV活性(細胞死亡抑制)；和
圖42顯示了顯示RT-PCR結果的瓊脂糖凝膠電泳圖像，所述結果確定經轉化的HeLa細胞系的ADV病毒增殖抑制活性。
具體實施例方式
現在將參考附圖更詳細地對本發明進行說明。
本發明提供了含有作為活性成分的本發明的蛋白或編碼所述蛋白的核酸序列的抗病毒劑，以及含有作為活性成分的本發明的蛋白或編碼所述蛋白的核酸序列的抗病毒動物細胞。
在一方面，本發明涉及含有作為活性成分的蛋白的抗動物病毒的抗
病毒劑，所述蛋白具有對侵入動物細胞的外來核酸鏈的選擇性結合和降解能力，并且對所述動物細胞本身沒有細胞毒性，本發明還涉及含有作為活性成分的編碼蛋白的核酸序列的抗動物病毒的抗病毒劑，所述蛋白具有對侵入動物細胞的外來核酸鏈的結合和降解能力，并且對所述動物細胞本身沒有細胞毒性。
在另一方面，本發明涉及含有作為活性成分的蛋白的抗病毒動物細胞，所述蛋白具有對侵入動物細胞的外來核酸鏈的結合和降解能力，并且對所述動物細胞本身沒有細胞毒性，本發明還涉及含有作為活性成分的編碼蛋白的核酸序列的抗病毒動物細胞，所述蛋白具有對侵入動物細胞的外來核酸鏈的結合和降解能力，并且對所述動物細胞本身沒有細胞毒性。
根據本發明，用于所述抗病毒劑和抗病毒動物細胞的蛋白必須能與外來核酸鏈結合并降解所述核酸鏈，同時對所述動物細胞沒有細胞毒性。
作為符合這些要求的蛋白的一個實例，評估了經分離并純化的3D8 蛋白的抗動物病毒的抗病毒活性。如從下列實施例1中戶萬能見到的，評
估結果表明所述3D8蛋白展示了抗動物病毒的抗病毒活性且沒有細胞毒性。
本文所用術語"對外來核酸鏈的結合能力"指蛋白能識別核酸(如
DNA禾nRNA)鏈并與所述核酸鏈結合的能力。蛋白與核酸鏈的結合基于在構成蛋白的氨基酸中的正電荷與DNA或RNA的磷酸主鏈中的負電荷之間的偶聯。
抗核酸抗體和核酸酶通常通過識別DNA或RNA的特定序列來結合所述DNA或RNA。如從實驗例2和5中可以明顯看出，本發明的蛋白與核酸鏈結合而沒有任何序列特異性，因此廣泛用在與核酸降解活性相關的研究領域。
本文所用術語"對外來核酸鏈的降解能力"指蛋白能夠通過水解切
割諸如DNA和RNA等核酸鏈的能力。該術語也叫做"催化能力"。
同時，本文所用術語"細胞毒性"指細胞被侵入性外來材料殺死的
現象。DNA酶(DNA降解酶)和RNA酶(RNA降解酶)通常具有細胞毒性。
另一方面，本發明的蛋白的特征在于對自身衍生的細胞沒有細胞毒性。
編碼具有對引入動物細胞的外來核酸鏈的結合和降解能力且對^f述動物細胞沒有細胞毒性的蛋白的核酸序列可為RNA或DNA序列。從穩定性角度考慮，優選的是DNA序列。
所述DNA序列可為被引入能在動物細胞內表達基因的載體中的核酸序列。如實施例4所能確定的，在動物細胞內具有這樣的DNA序列的基因的引入導致蛋白的有效表達和有效抗病毒活性的展現。
優選的是，用于本發明的抗病毒劑和抗病毒動物細胞的蛋白獲自誘發了自身免疫疾病的動物，所述蛋白能結合侵入性核酸鏈并降解所述核酸鏈且對動物細胞自身沒有細胞毒性。這就是與核酸結合或反應的蛋白己知與自身免疫疾病密切相關的原因。在本發明中，對于所述動物沒有特別限制。可以使用任何動物而沒有特別限制，只要所述動物自然地誘發自身免疫疾病即可。優選的是使用小鼠。
在對所述動物誘發出自身免疫疾病的基因中，優選的是功能異常的 // r基因。
具有功能異常//^基因的動物易患上自身免疫疾病。因此，具有對外來核酸鏈的結合和降解能力同時對動物細胞沒有細胞毒性的蛋白可以容易地從所述/;^基因功能異常的動物中獲取。
爾r基因介導了造成凋亡的主要因素之一的Fas蛋白的產生。Fas蛋白在細胞表面介導細胞凋亡。當Fas蛋白被激活時，細胞開始執行凋亡機制。另一方面，當//^基因受損時，Fas蛋白的形成被抑制，并且由此使正常細胞凋亡不會發生。該機制抑制了能攻擊自身細胞的淋巴細胞的去除，因此導致自身免疫疾病。
作為能結合侵入動物細胞的外來核酸鏈并降解所述核酸鏈且對所述動物細胞沒有細胞毒性的蛋白，可以使用具有對外來核酸鏈的特異性結合和降解能力的免疫球蛋白或其片段。所述免疫球蛋白可以優選為免疫
球蛋白G(IgG)。更具體而言，所述IgG可為3D8蛋白。
本文所用"免疫球蛋白"是在免疫中起重要作用且發揮抗體的作用的血清成分的蛋白總稱。這些免疫球蛋白由通過二硫鍵相連的一對分子
量約為23,000的輕鏈(CL)和一對分子量約為50,000 70,000的重鏈(CH) 構成。由y、 (x、 p、 S和e表示的重鏈類型確定了抗體類別，例如分別為 IgG、 IgA、 IgM、 IgD禾口IgE。
IgG由一對分子量約為25,000的輕鏈和一對分子量約為50,000的重鏈構成，且總分子量為150,000。
IgG是在高等動物(兩棲動物或更高等)中很重要的免疫球蛋白，占整個人類免疫球蛋白的約70%，通過胎盤并表現出各種抗體活性。
同時，任何免疫球蛋白片段可以單獨使用或作為它們的組合使用，只要它能結合核酸鏈并降解所述核酸鏈。優選的是選自scFv、 VH、 VL 以及與VH和VL結合的Fv的片段。
scFv (單鏈可變片段)是通過接頭連接的可變重鏈(VH)和可變輕鏈 (VL)的融合體。已知這種scFv與單獨使用的VH或VL相比具有強的抗原結合力。介導VH和VL之間的結合的接頭可為本領域內常用的任何類型。
如上所述，已知VH或VL的抗原結合力通常弱于scFv的抗原結合力。然而，在打算改善進入組織的滲透性的某些情形中，仍優選VH或 VL。
優選的是，所述scFv可具有如SEQIDN0 6所示的序列，所述VH 可具有如SEQ ID NO 2所示的序列，而所述VL可具有如SEQ ID NO 4 所示的序列。
在本發明的蛋白所需的核酸鏈結合能力和核酸鏈降解能力方面，任何蛋白只要具有對RNA的特異性結合/降解能力或對DNA的特異性結合 /降解能力，都可用來獲得本發明所想要的效果。因此具有僅對RNA鏈的特異性結合和降解能力的蛋白只能應用于RNA病毒，而具有僅對DNA 鏈的特異性結合和降解能力的蛋白只能應用于DNA病毒。
更優選的是使用對DNA和RNA鏈都具有結合和降解能力的蛋白，因為它們對RNA病毒和DNA病毒均可以使用。
在本發明中，對侵入動物細胞的病毒沒有特別限制。具體而言，所述病毒可為基于RNA的病毒，更具體而言，所述病毒可為HIV病毒(人類免疫缺陷)或SARS(嚴重急性呼吸道綜合征)病毒。
在對確定具有對侵入動物細胞的外來核酸鏈的結合能力和降解能力且對所述動物細胞自身沒有細胞毒性的蛋白是否表現出如上所述的抗動物病毒的抗病毒活性的嘗試中，使用根據制備例1的方法獲得的3D8抗體(IgG)的VH、 VL和scFv域作為一個實例。根據制備例2的方法從3D8 雜交瘤細胞中獲得了所述VH、 VL和scFv域抗體。將這些抗體在大腸桿菌內過表達并純化后使用。
在實驗例1中，研究了 VH和VL蛋白的存在形式和它們之間的結合。研究結果確定，VH和VL蛋白均以單體而不是以多聚體形式存在，且VH和VL彼此自然結合形成Fv。
在實驗例2中，研究了所述VH、 VL和scFv蛋白的DNA結合能力和特性。從評估結果中可確定的是，所有這三種抗體蛋白(scFv、 VH和 VL蛋臺)具有相當高的與ssDNA和dsDNA的結合力。scFv的DNA結合親和力比VH和VL的DNA結合親和力高出100倍 1,000倍。該結果顯示，VH和VL域共存的蛋白的DNA親和力要優于單獨存在VH和 VL域的蛋白的DNA親和力。
在實驗例3中，評估了所述VH、 VL和scFv抗體蛋白的DNA降解活性和底物特異性。在鎂離子(MgS+)的存在下，所述抗體蛋白的DNA酶活性的順序為scFv〉VL》VH。另一方面，在EDTA存在下，所有蛋白的DNA酶活性都被抑制。具體而言，從瓊脂糖凝膠電泳測定中確定了隨著時間的推移，所述蛋白降解了 ss M13mpl8 DNA以及ds M13mpl8DNA。
使用親和力連接寡核苷酸核酸酶測定(ALONA)來探查DNA酶活性的底物特異性。所述scFv、 VH和VL蛋白基本沒有表現出在DNA酶活性方面的DNA底物特異性。
從實驗例4中確定了 scFv、 VH和VL蛋白通過不同機理降解DNA。
作為具有對侵入動物細胞的外來核酸鏈的結合能力和降解能力且對所述動物細胞自身沒有細胞毒性的蛋白的一個實例，使用3D8scFv蛋白來評估RNA酶活性。作為實驗例5的結果，可以確定的是，所述scFv 蛋白表現出對dsRNA和ssRNA的RNA酶活性，并取決于反應時間。所述底物特異性測定結果表明，scFv抗體蛋白在RNA酶活性方面能夠降解 RNA/DNA雜交體以及ssRNA和dsRNA。
在實施例1中，在用水泡性口炎病毒對注射了 3D8scFv蛋白的動物細胞進行轉染后，證實了 3D8scFv蛋白抗所述病毒的抗病毒活性。結果，可以證實的是，其中沒有引入3D8 scFv蛋白的動物細胞發生了細胞死亡 (細胞死亡是由VSV導致的細胞病變效應(CPE)之一)(圖24)，然而其中引入了 3D8 scFv蛋白的動物細胞不管進行VSV感染與否都仍然存活。此外，在HeLa細胞(人類宮頸癌細胞系)上觀察到了所述3D8 scFv蛋白的細胞死亡抑制活性。
其中沒有感染VSV的轉移有3D8 scFv蛋白的Hela細胞沒有所述 3D8scFv蛋白所固有的細胞毒性。另一方面，作為對照組的轉移有RNA 酶A的Hela細胞(未轉染有VSV)由于所述RNA酶A所固有的細胞毒性而全部死亡。
這些結果表明，所述3D8 scFv蛋白的抗病毒活性顯著大于傳統核酸酶的抗病毒活性，而具有對引入動物細胞的外來核酸鏈的結合能力和降解能力同時對所述動物細胞自身沒有細胞毒性的蛋白展現了抗動物病毒的抗病毒活性。
從實施例2所獲得的結果確定，3D8 VH和VL蛋白以及3D8 scFv
蛋白展現出抗動物病毒的抗病毒活性。
即使在編碼具有對侵入動物細胞的外來核酸鏈的結合能力和降解能力且對所述動物細胞沒有細胞毒性的蛋白的核酸序列侵入動物細胞的情形中，也證明了所述核酸序列展示出抗病毒感染的動物細胞的抗病毒活
性。具體而言，從實施例4可以證實，3D8 scFv基因轉染的動物細胞也產生scFv蛋白，而且還表現出抗多種病毒的抗性。
下文中將給出本發明的抗動物病毒的抗病毒劑的配制和使用方法。 <配制和施用含有作為活性成分的蛋白的抗動物病毒的抗病毒劑，
所述蛋白具有對侵入動物細胞的外來核酸鏈的結合和降解能力，并且對
所述動物細胞自身沒有細胞毒性>
含有本發明的蛋白作為活性成分的抗動物病毒的抗病毒劑能夠選擇
性地降解侵入的外來核酸鏈，并且對所述動物細胞本身沒有細胞毒性。
具體而言，本發明的抗病毒劑能夠只除去侵入性外來病毒而不殺死自身
細胞，因此可用于病毒介導的疾病，如獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)。更具體而言，所述疾病的治療影響了受病毒感染的細胞，并因此防止了所述細胞的死亡。
本發明的抗病毒劑含有作為活性成分的蛋白，所述蛋白具有對侵入動物細胞的外來核酸鏈的結合能力和降解能力，并且對所述動物細胞本身沒有細胞毒性。
"含有作為活性成分的蛋白的抗病毒劑"這一表述是指，以使所述蛋白能發揮所需抗病毒活性的量將所述蛋白添加到所述抗病毒劑中，并且在光一上是指，所述蛋白與各種用于遞送和穩定藥物的佐劑一起配制為多種劑型。
優選的是，所述蛋白可包括具有對外來核酸鏈的結合/降解能力的免疫球蛋白或其片段。更優選的是，所述免疫球蛋白可為免疫球蛋白G (IgG)。最優選的是，所述IgG可為3D8蛋白。優選的是，所述免疫球蛋白片段可為選自scFv、 VH、 VL以及與VH和VL結合的Fv中的片段。
本發明的抗病毒劑還可包含藥用載體或添加劑(一般而言，緩沖劑溶液、等滲溶液或水性懸浮液等，并且可選的是穩定劑或防腐劑等)。制劑通常包含鹽水和可選的經保護或穩定處理的分子，如高分子量蛋白(例如，人類血清白蛋白)。將具有對侵入動物細胞的外來核酸鏈的結合和降解能力且對所述動物細胞自身沒有細胞毒性的蛋白(優選為IgG或其片段)，以使得所述蛋白"有效"或"對治療有效"的劑量施用于受體。
施用于受體的蛋白的有效劑量可在約O.l mg/kg 約20 mg/kg范圍內。一般而言，蛋白的有效劑量根據各種因素如蛋白類型(例如，整個 IgG或其片段)、親和力和具體治療蛋白的個體特性來確定，并且取決于藥代動力學參數。因此，本發明的蛋白的有效劑量可取決于這些不同的因素。
根據本發明的主要實施方式，含有蛋白的抗病毒劑的使用能使所述治療蛋白即使以低劑量施用也能實現所需的療效。
此外，本發明的治療蛋白的使用(例如，劑量和處方設計)可能受到不希望的副作用(例如，發熱、頭疼、氣喘和血壓降低等)的限制。
于是，對患者施用的治療蛋白的標準劑量可以根據患者的個體特性而改變。在實踐中，熟練臨床醫師可以考慮例如具體必要性和患者的總體狀況等因素來為患者設計出最優選的治療策略(例如，最佳劑量和用藥方案)。治療蛋白的合適劑量可根據各種基準來確定。
根據本發明的一個實施方式，醫師可在逐漸減少治療蛋白的給定量的同時，對患者施用本發明的含所述蛋白的抗病毒劑。在監測了治療蛋白的效能、病毒缺陷細胞的活性和各種治療癥狀，同時考慮劑量和施用頻率后，可以控制治療蛋白的相對濃度和劑型以優化療效并使副作用最小化。
同時，本發明的治療蛋白通常可在體外或通過動物模型確定。例如，可以通過以下方法來確定最佳劑量，即，在體外將不同濃度的本發明的治療蛋白引入目標細胞(病毒感染細胞)中，然后評估所述目標細胞的死亡比例。
可通過靜脈內、腹膜內、動脈內、肌內或皮內注射直接對受試對象施用本發明的含有所述治療蛋白的抗病毒劑。
諸如利妥昔單抗(rituxan)(以RituximabTM的名稱銷售)和奧馬珠單抗(omalizumab)(以XolairTM的名稱銷售)等單克隆抗體在臨床治療中有效且等價處方方案(即，制劑和/或劑量和/或用藥程序)可用于本發明的含有所述治療蛋白的抗病毒劑。
本發明的抗病毒劑可與化學療法或治療病毒疾病的治療程序或其組合聯合來同時使用或相繼使用。
<配制和施用含有作為活性成分的編碼蛋白的核酸序列的抗動物病毒的抗病毒劑，所述蛋白具有對侵入動物細胞的外來核酸鏈的結合和降解能力，并且對所述動物細胞自身沒有細胞毒性>
可以使用數個單獨的表達載體或單個表達載體來進行DNA序列的表達，如編碼蛋白的核酸序列的表達。
優選的是，根據本發明的核酸序列編碼的蛋白包括具有對外來核酸鏈的結合/降解能力的免疫球蛋白或其片段。更優選的是，所述免疫球蛋
白可為免疫球蛋白G(IgG)。最優選的是，所述IgG可為3D8蛋白。此外，所述免疫球蛋白片段可為選自scFv、 VH、 VL以及與VH和VL結合的 Fv中的核酸編碼的免疫球蛋白片段。
如果分別對各個序列采用單一載體，可在注射和電穿孔前將所述載體混合以便允許個體肌肉細胞攜帶上和表達各所述載體。
本文所用術語"表達載體"指通過編碼多肽的核酸的插入或合并來操作且能在所述載體處于適當環境中時指導所述多肽的表達的質粒或媒介物。
合適的表達載體通常包含啟動子、復制起點、聚A識別序列和核糖體識別位點或內部核糖體進入位點，且可包含諸如增強子等其它調控元件(組織特異性)。
幫助所插入的編碼核酸序列在肌肉內有效轉錄的啟動子可以為組成型，或如果需要時可為誘導型、組織特異型或發育階段特異型。可用于本發明的啟動子的實例包括通常在肌肉內發揮功能的啟動子，如骨骼肌動蛋白基因啟動子(Muscat等，Mol. Cell. Biol. 7, 4089 (1989))、肌肉肌酸激酶啟動子(Sternberg等，Mol. Cell. Biol., 8, 2896 (1988))和肌球蛋白輕鏈增強子/啟動子(Donoghue等，Proc. Natl. Acad. Sci, USA 88, 5847 (1991》。
優選的表達載體包含具有多個核酸內切酶限制位點的表達盒，所述核酸內切酶限制位點允許編碼不同多肽的DNA以將所述編碼DNA與啟
動子或載體的其它轉錄調控元件操作性地連接的方式容易地克隆到所述表達盒內。優選的表達載體還可具有用于原核細胞的復制起點和至少一個選擇性標記以幫助克隆到這類細胞中。本領域內的技術人員了解如何通過選擇用于在肌肉中表達的多肽的正確配置有啟動子、增強子和其他轉錄或翻譯調控元件的適當組合的載體來優化表達。
本發明的方法學允許分別來自骨骼肌、平滑肌和心肌的多鏈蛋白表達。優選的是骨骼肌注射后的表達，因為該肌肉來源豐富且易于獲得。對于骨骼肌，所述表達載體可以通過傳統方式(如注射器和針)或通過無針注射裝置經皮膚注射進入所述骨骼肌。后一類裝置在本領域內是熟知的，并且通常涉及通過緊貼皮膚保持的微孔的壓力輔助輸送。
可參考授予Morrow等的美國專利第4,596,556號、授予Parsons的美國專利第4,913,699號和授予Castellano等的美國專利第5,730,723號適當地選擇注射裝置。另一種可商購獲得的注射裝置是BIOJECT (來自 Bioject Medical Technologies, Inc., Portland Oregon U.S.A.)。另——禾中無針注射裝置是使用加壓氣體來作為氣壓功能而將小顆粒(例如，金顆粒)輸送到目標皮膚位點的基因槍輸送系統。生物導彈輸送裝置的實例是 PDS-1000 "基因槍"(由美國Dupont， Inc., Wilmington, Delaware銷售)。
表達載體可以在0.9%的氯化鈉中施用，然而，可以加入各種溶劑和賦形劑而不影響表達水平。例如，本領域內眾所周知的是，蔗糖能增加在骨骼肌中的DNA吸收。
可以根據熟知方法，將本發明的表現出抗動物病毒的抗病毒效能的動物細胞用于實驗用途和細胞藥物。
本發明的方式
參考下列實例(制備例、實驗例和實施例)來對本發明進行更詳細的說明。本發明的范圍不必限于這些實例且旨在包括利用等效技術思想的修改。
實施例
制備例l: 3D8雜交瘤細胞系的建立利用聚乙二醇(PEG) 4000融合MRL-/;^//;^小鼠的脾細胞(來自美國 Jackson Laboratory)和V653細胞(來自韓國細胞系庫)并在37。C于5% C02培養箱中的次黃嘌呤-氨基喋呤-胸苷(HAT)培養基(來自 Sigma-Aldrich,Inc.)中培養15天。在培養期間，通過酶聯免疫吸附測定 (ELISA)選擇具有DNA結合能力的抗體。
通過有限稀釋法將所述細胞系培養兩次，以獲得約十種分泌抗DNA 抗體的雜交瘤細胞系。通過ELISA從所述雜交瘤細胞系中選出顯示出最大DNA結合能力的分泌抗DNA抗體的細胞系。將所選的細胞系在2006 年9月13日存到韓國細胞系研究基金會(KCLRF， Korean Cell Line Research Foundation)(登錄號KCLRF畫BP-00146)。
使用同種型檢測定劑盒(Pierce,Inc.)檢測出所選的雜交瘤細胞系分泌的抗體的同種型。結果，確定從所述細胞系衍生的抗體是IgG2a/K并稱為 "3D8"。
制備例2:克隆來自3D8雜交瘤細胞系的重鏈(VH)和輕鏈(VL)可變
域基因
將約1 X 106的獲自制備例1的雜交瘤細胞溶解于0.2 mL的RNA提取試劑中(RNAzol BTM; TEL-TEST, Inc.)并均化。在所述溶液中加入0.02 mL 氯仿，徹底攪拌15秒，然后讓其在冰浴中靜置5分鐘。離心所得溶液，然后分離所得上清液。向殘留物中加入0.25 mL乙醇，讓其在4t:靜置 15分鐘，然后離心(12000 g， 4°C)15分鐘。所得RNA沉淀用70%乙醇洗滌、干燥并溶解于重蒸水中。測量所述RNA在260 nm和280 nm處的吸光度，并確定所述RNA的純度和產量。
使用RT-PreMix試劑盒(Bioneer Inc.)由如此獲得的RNA合成cDNA。此時，使用寡聚(dT)寡核苷酸作為引物。使用所述cDNA作為模板，用聚合酶鏈式反應(PCR)方法擴增VH和VL基因。
用于VH基因擴增的引物組如下
正向5'畫ATGGGATGGAGCTRTATCATSYTCTT-3' (SEQ ID NO 7) 反向5'-TGGATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC匿3' (SEQ ID NO 8)使用Taq DNA聚合酶通過降落PCR對所述VH基因進行30個循環的擴增。(每個循環中的)降落PCR條件如下94。CX1分鐘-> 每個循環(從初始退火溫度(65。C))降低0.5。CX1分鐘)72'CX1分鐘。
用于VL基因擴增的引物組如下
正向5'-ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGTGTCTC畫3' (SEQ ID NO 9)
反向5'-GGATGGTGGGAAGATGGATAC-3' (SEQ ID NO 10)
使用Taq DNA聚合酶通過降落PCR對所述VL基因進行30個循環的擴增。(每個循環中的)降落PCR條件如下94"CX1分鐘-> 每個循環(從初始退火溫度(63。C))降低0.3'CX1分鐘)72。CX1分鐘。
用"/。瓊脂糖凝膠對各自的PCR反應溶液進行電泳，并從所述凝膠中提取了VH和VL基因，然后將它們克隆到pGEM-T Easy載體(來自 PromegaCorp.)中。克隆基因的堿基序列由Perkin Elmer 373A自動DNA 測序儀(Applied Biosystems， Inc.)分析。
用于堿基序列分析的引物組如下
正向5'-CAAGCTGGGATTTAGGTG-3'(SEQ ID NO 11) 反向5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'(SEQ ID NO 12)
從堿基序列分析結果中可以確定，所述VH基因的堿基序列與SEQ ID NO 1所示的序列相同，所述VH基因的氨基酸序列與SEQ ID NO 2 所示的相同，所述VL基因的堿基序列與SEQ IDNO 3所示的相同，而所述VL基因的氨基酸序列與SEQ ID NO 4所示的相同。Blast搜索結果確定至今尚未有這種堿基序列的報道。
制備例3: VH、 VL和scFv (單鏈片段可變)域基因在細菌表達載體中的亞克隆
為在細菌中表達VH或VL蛋白，將在制備例2中所獲的VH和VL 基因克隆到plg20H和plg20L載體(來自美國Stollar BD教授，Tufts University)中。制備了含有作為限制酶識別位點的X顧I/Xk I片段的引物并將其用于VH克隆。同時，制備了含有作為限制酶識別位點的 Bg/II/NcoI片段的引物并將其用于VL克隆。為構造scFv構建體，將分別克隆在pGEM-T Easy載體(Promega Corp.) 上的VH和VL基因相繼亞克隆在含有接頭DNA (解碼為"GGGGS3")的 plg20表達載體中(來自美國StollarBD教授，Tufts University)。此處所
用的引物的堿基序列如下
〈用于VH亞克隆的引物〉
正向5'-TCCCCCCGGGAGGTCCAGCTG-3' (SEQ ID NO 13) 反向5'-GCTCTAGAGGAGACGGT國3' (SEQ ID NO 14)
〈用于VL亞克隆的引物〉
正向5'-GAAGATCTTGTGATGTCA-3' (SEQ ID NO 15) 反向5'畫CATGCCATGGTGATGATGATGTTTTATTTCCAG-3' (SEQ ID NO 16)
作為所述亞克隆的結果，獲得了 plg20H-3D8 VH、 plg20L-3D8 VL 和pIg20-3D8 scFv載體(克隆在所述plg20載體中的scFv基因的堿基序列如圖1所示，而所述plg20H-3D8 VH、pIg20L-3D8 VL和plg20-3D8 scFv 載體的圖如圖2所示)。所述scFv基因分別具有如SEQ ID NO 5所示的堿基序列和如SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列。
制備例4: 3D8重組scFv、 VH和VL抗體蛋白的表達和純化
為了純化VH、 VL和scFv蛋白，將plg20H-3D8 VH、 plg20L-3D8 VL 和plg20-3D8 scFv載體轉化到大腸桿菌BL21 (DE3) pLysE細胞中(來自 Novagen Inc.)，并在含100嗎/mL的氨芐青霉素和20 pg/mL的氯霉素的 LB培養基中培養直到吸光度(A600)達到0.8。在所述培養基中加入0.5 mM 異丙基-卩-D-硫代吡喃型半乳糖苷(IPTG)并在常溫下再培養4小時。將所培養的細胞離心(10,000Xg， 4"C)10分鐘，然后將所得上清液經0.45 pm 過濾膜過濾。使濾液以1 mL/分鐘的流動速率通過IgG-瓊脂糖柱 (Amersham pharmacia Biotech Ltd.)，用磷酸鹽緩沖液(PBS， pH 7.4)和乙酸銨(pH 5.0)洗滌，然后用O.l M乙酸(pH 3.4)洗脫。將洗脫的蛋白用PBS 透析并在還原條件下進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)，以確定所述蛋白的純度。
圖3顯示了 VH、VL和scFv蛋白的SDS-PAGE分析結果。在對20嗎的各種蛋白進行SDS-PAGE并用考馬斯藍染色后，確認三種重組抗體已被純化，純凈度為95%以上。
實驗例1: VH和VL蛋白的存在形式和它們之間的結合
使用HPLC系統對經純化的VH、 VL、 scFv和Fv (定義為具有VH 和VL之間的非共價鍵的可變片段)蛋白執行尺寸排阻色譜(SEC)。將 0.02 mL蛋白(濃度為5 |iM 20 pM)注射到TSK G3000SWXL柱中 (TosoHaas，日本)，并使磷酸鹽緩沖溶液(50 mM磷酸鈉/150 mMNaCl， pH7.4)以0.7mL/分鐘的流動速率在其中流過，根據280nm處的吸光度獲得所述蛋白的色譜圖。
在磷酸鹽緩沖溶液條件下，VH和VL蛋白都以單體的形式存在，并沒有觀察到多聚體形式的VH或VL (圖4)。
此外，從圖4中看到了 VH-VL結合的Fv。用表面等離子共振(SPR) 生物傳感器(Biacore 2000 , Pharmacia,瑞典)分析了 VH和VL蛋白之間的定量結合。將0.5 mg/mL 1.0 mg/mL的VL蛋白固定在羧甲基化葡聚糖涂覆的CM5傳感器芯片(Amersham pharmacia Biotech制造)表面并讓VH蛋白(12.5nM、 25 nM、 50nM、 100 nM、 200 nM)在磷酸鹽緩沖溶液條件下在所述芯片表面上流過。感應譜分析顯示，VH與VL以14nM 的結合親和力Ko偶聯(圖5)。
實驗例2: VH、 VL和scFv蛋白的DNA結合能力分析和表征
通過表面等離子共振(SPR)分析評估了經純化的VH、 VL和scFv蛋白與帶不同堿基序列的DNA的定量結合能力。
將具有含生物素標記3'端的40聚體合成DNA片段固定在鏈霉親和素涂覆的傳感器芯片上，此前用HES緩沖液(10mMHEPES， pH7.4， 150 mM NaCl， 3 mM EDTA， 0.005%表面活性劑P20)稀釋的scFv (5 nM 200 nM)、 VH (0.2 pM 50 itiM)和VL (1.6 |^M 200 )iM)蛋白以50 (xl/分鐘的流動速率在所述芯片上流動3分鐘，并讓HES緩沖液再以50 pl/分鐘的流動速率流到所述芯片上，以誘導與所述DNA連接的所述蛋白的解離。
感應譜分析確定了所有三種抗體蛋白(scFv、 VH和VL抗體蛋白)具有相當高的與ssDNA和dsDNA的結合能力。所述高結合能力表明，scFv、 VH和VL抗體蛋白很難具有對DNA的堿基序列特異性(圖6)。此外，scFv的DNA親和力比VH和VL的DNA親和力高出100倍 1 ，000倍。該結果顯示，其中VH和VL域共存的蛋白的DNA親和力要優于其中單獨存在VH和VL域的蛋白的DNA親和力。
為確定所述scFv、 VH和VL蛋白的非特異性DNA結合主要由靜電力造成的事實，在不同濃度(O M 0.8 M)的NaCl存在下，使用具有40
聚體的堿基序列經預先確定的單鏈(SS(N)4o)或雙鏈(ds(N)4o)核酸作為底物
進行了 ELISA。
從ELISA結果中可以看出，隨著NaCl濃度的增加，所有三種蛋白都經歷了 DNA結合親和力從50%到90%的減少。該行為表明抗體蛋白與DNA的結合主要由靜電力造成(在圖7中，符號'、"表示結合ss(N)4o底物的scFv，符號"o"表示結合ds(N)4。底物的scFv，符號"T，，表示結合ss(N)4o底物的VH，符號"V"表示結合ds(N)恥底物的VH，符號、"表示結合ss(N)恥底物的VL，而符號"口"表示結合ds(N)4。底物的VL)。
實驗例3: VH、 VL和scFv蛋白的DNA降解能力和底物特異性
經純化的scFv(0.8 pM)、 VH(5 )iM)和VL (5 iiM)蛋白與300 ng的質粒M13mpl8(來自New England Biolabs， Ltd)在TBS溶液(20 mM Tris-HCl，pH 8.0, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl。的存在下反應1小時 12小時。反應混合物用胰蛋白酶處理并進行瓊脂糖凝膠電泳。
將含50 mM EDTA(而非MgCl2)的TBS溶液加入所得物，以確定DNA酶活性的鎂離子(Mg")依輸性。圖8顯示了在反應一小時后的瓊脂糖凝膠電泳結果。圖9顯示了反應12小時后的瓊脂糖凝膠電泳結果。在圖8 10中，術語"rc"是DNA的"松弛環形形式"的縮寫；術語"lin"是"線性形式"的縮寫并指線性DNA;術語"sc"指"超螺旋形式"的縮寫并指完全螺旋DNA。 sc類型的DNA依次被降解為rc類型和lin類型的DNA。其后，lin類型DNA被完全降解為更小的DNA片段。
在鎂離子(Mg"存在下，各個蛋白的DNA酶活性的順序為scFv>VL VH。另一方面，在EDTA存在時，所有蛋白的DNA酶活性都被抑制。具體而言，如可從瓊脂糖凝膠電泳結果所看到的，ssM13mp18DNA以及dsM13mpl8DNA隨著時間的推移而被降解(圖10)。
圖11顯示了獲自原位丙烯酰胺凝膠測定的結果。所述丙烯酰胺凝膠測定根據如下步驟進行。首先，讓2嗎 10嗎的scFv蛋白在含dsM13mpl8 DNA(20昭/mL)或ss M13mpl8 DNA (20 (xg/mL)的12%丙烯酰胺凝膠中進行SDS-PAGE。為了從凝膠中除去十二垸基硫酸鈉(SDS)并誘導蛋白折疊，用7M脲溶液洗漆凝膠一小時并讓其在Tris溶液中(10mMTris,pH8.0, 10mMMgCl2, 50mMNaCl)在37。C靜置過夜。然后用溴化乙錠和考馬斯藍相繼染色凝膠。觀察到僅在有蛋白且未被溴化乙錠染色的區域內發生DNA降解。(在圖11中，"Etbr處理組"是對比數據結果的黑白色的組，而深色位置是DNA沒有與Etbr反應的位置)。該行為表明，scFv蛋白的DNA酶活性歸因于scFv的固有性質，而不是歸因于在蛋白純化期間污染的副產品。總之，這些結果表明本發明的重組scFv蛋白表現出強力的抗單鏈(ss) DNA和雙鏈(ds)DNA的DNA酶活性。
使用親和力連接寡核苷酸核酸酶測定(ALONA)來探查DNA酶活性的底物特異性。將具有地高辛標記的5'端和生物素標記的3'端的寡核苷酸，艮卩ss-(dT)40、 ds-(dT:dA)40、 ss-(dN)40、 ds-(dN:dN')40、 ss-(dG-dC)20和ds-(dG-dC:dC-dG)2o通過生物素-鏈霉親和素結合來固定在內涂覆鏈霉親和素的96孔培養板上，然后讓其與3D8 scFv (0.8 (iM)、 Fv (5 pM)、 VH(5 jxM)和VL(5 ^iM)在37。C于含MgCl2的TBS溶液(2mM)中反應10小時。本文所用ss-(dT^指由胸腺嘧啶組成的單鏈核酸。本文所用dS-(dT:dA)4o指由胸腺嘧啶40聚體和腺嘌呤40聚體組成的雙鏈核酸。本文所用ss-(dN)4。指由特定堿基40聚體組成的單鏈核酸。本文所用ds-(dN:dN')4()指一條堿基40聚體與另一條堿基40聚體互補結合的雙鏈核酸。本文所用ss-(dG-dC)4o指其中鳥嘌呤與胞嘧啶交替連接的20聚體單鏈核酸。本文所用ds-(dG-dC:dC-dG)指其中鳥嘌呤-胞嘧啶鏈20聚體與胞嘧啶-鳥嘌呤鏈20聚體連接的雙鏈核酸。
剩余DNA與堿性磷酸酶聯抗地高辛抗體反應，并向其中加入p-NPP溶液(在0.1 M甘氨酸、1 mM ZnCl2、 1 mM MgCl2中的1 mg/mL p-NPP，pH 10.3)作為堿性磷酸酶的底物。測量了在405 nm處的吸光度(圖42)。如圖12所示的結果可以明顯看出，scFv、 VH和VL的DNA酶活性對DNA底物基本上是非特異性的。
實驗例4:敲除組氨酸的scFv蛋白的DNA酶活性的變化比較本發明的3D8 scFv抗體蛋白與作為傳統已知的抗DNA催化抗體的BV04-01/ss-(dT)3的三維結構(圖13和圖14)，可以推斷，VH和VL蛋白各自存在的一個組氨酸(His)殘基介導了 DNA酶活性(圖15和圖16)。
基于此推斷，使用定位突變試劑盒和引物將VH的His35和VL的His94 (S口，圖1中由數字"35"和"94"代表的殘基)用丙氨酸取代。在細菌中表達所得蛋白并提純。評價所述蛋白的DNA結合能力和DNA降解能力的變化。通過ELSIA評價所述蛋白的DNA結合能力。更具體而言，用溶解于TBS溶液(20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl， 5 mM MgCl2)中的40聚體寡核苷酸(10pg/mL， 100pl)在37。C包被聚苯乙烯96孔培養板1小時。培養板用TBST (含0.1% Tween 20的TBS)洗滌三次，向其中加入3。/。BSA-TBS，在37。C靜置1小時，然后用TBST洗滌三次。在每個孔中引入經純化的scFv、 VH和VL野生型蛋白(20 |ag/mL， 100 pl)和組氨酸突變體蛋白，并在37。C反應1小時，然后用TBST洗滌三次。所得蛋白和兔IgG (10 D/mL， 100 D)在37。C反應1小時，用TBST洗滌三次，然后與堿性磷酸酶聯抗兔IgG (I:IO，OOO稀釋，100 pi)在37。C反應1小時，并用TBST洗滌三次。最后，在所得蛋白中加入作為堿性磷酸酶底物的； -NPP溶液(在0.1 M甘氨酸、1 mM ZnCl2、ImM MgCl2中的1 mg/mL的p-NPP， pH10.3)。測量所述蛋白在405nm處的吸光度。
以與實驗例3相同的方法評估了所述蛋白的DNA酶活性。
結果，scFv蛋白中His殘基取代對DNA結合沒有大的影響(圖17)，但導致了對DNA酶活性的抑制。這些行為表明，所述兩個His殘基介導了 scFv蛋白的DNA酶活性。
另一方面，VH和VL蛋白中的His殘基取代幾乎不影響DNA結合能力和DNA酶活性。這些行為意味著VH和VL蛋白的DNA降解機理與scFv蛋白的DNA降解機理不同(圖19和圖20)。
在圖18和圖20中，術語"rc"是DNA的"松弛環形形式"的縮寫；術語"lin"是"線性形式"的縮寫并指線性DNA;而"sc"指"超螺旋形式"的縮寫并指完全螺旋DNA。
在圖17 20中，符號"*"表示其中組氨酸被丙氨酸取代的突變體。
實驗例5: 3D8scFv蛋白的RNA酶活性
為評估3D8 scFv蛋白的RNA酶活性，首先制備了 ssRNA和dsRNA底物。
使用煙草花葉病毒殼蛋白(TMV-CP)基因克隆pLITMUS載體(來自New England BioLabs， Inc.)的T7啟動子，通過體外轉錄然后純化合成ssRNA，從而制備了所述ssRNA。
所述dsRNA通過使用pLITMUS載體的T7和SP6啟動子進行體外轉錄來合成dsRNA然后提純并雜交而獲得。
將300 ng如此制備的ssRNA (或dsRNA)與0.8 的scFv蛋白在TBS溶液中反應1小時 5小時，然后進行瓊脂糖凝膠電泳。從瓊脂糖凝膠電泳結果可以確認，所述scFv蛋白對dsRNA和ssRNA都表現出RNA酶活性，并取決于反應時間(圖21)。
為確定3D8 scFv蛋白的RNA酶活性是歸因于scFv的固有性質而不是蛋白純化期間被污染的副產物這一假定，進行了所述3D8 scFv蛋白的原位水解測定。即，讓3D8 scFv蛋白在含20 (ig/mL的dsRNA或20 |ag/mL的ssRNA的丙烯酰胺凝膠上進行SDS-PAGE。用7M脲溶液洗滌凝膠1小時并讓其在Tris溶液(IO mM Tris， pH 8.0， 10 mM MgCl2， 50 mM NaCl)中在37'C靜置過夜。用溴化乙錠和考馬斯藍依次染色凝膠。觀察到只有在存在蛋白因此沒有被溴化乙錠染色的區域發生RNA降解。(在圖22中，"Etbr處理組"是對比數據結果的黑白色的組，而深色位置是RNA不與Etbr反應的位置)。這些結果表明，所述scFv蛋白對ssRNA和dsRNA都表現出強力的RNA酶活性(圖22)。
以與實驗例3中相同的方式通過親和力連接寡核苷酸核酸酶測定(ALONA)探査了 RNA酶活性的底物特異性，不同的是使用了具有地高辛標記的5'端和生物素標記的3'端的寡核苷酸，即sS-(rU)4()、 dS-(rU:rA)40和ds-(rU:dA)4Q (RNA/DNA雜交體)。
將這些底物通過生物素-鏈霉親和素結合來固定在鏈霉親和素涂覆的96孔培養板上，并讓其在含MgCl2的TBS溶液(2 mM)中與0.8 的3D8 scFv蛋白在37。C反應10小時。
同時，在所得物中加入含50mMEDTA (而不是MgCl2)的TBS溶液，以確定RNA酶活性的二價鎂離子(Mg^)依賴性。
本文所用的ss-(rU)4o指由核糖尿嘧啶(ribouraci1)40聚體構成的單鏈核酸。本文所用的ds-(rU:rA)卯指由核糖尿嘧啶40聚體和核糖腺嘌呤40聚體構成的雙鏈核酸。本文所用的ds-(rU:dA)4o指由核糖尿嘧啶40聚體和脫氧核糖腺嘌呤40聚體構成的RNA/DNA雜交體形式的雙鏈核酸，在所述核酸中將核糖尿嘧啶與脫氧腺嘌呤交替相連排布。
用堿性磷酸酶聯抗地高辛抗體與剩余RNA和RNA/DNA雜交體反應，并向其中加入p-NPP溶液(在0.1 M甘氨酸，1 mM ZnCl2, ImM MgCl2中的lmg/mL的,NPP， pH 10.3)作為堿性磷酸酶的底物。測量所得混合物在405nm處的吸光度。結果如圖23所示。
結果表明，scFv抗體蛋白能降解RNA/DNA雜交體以及ssRNA和dsRNA，并且scFv抗體蛋白的RNA酶活性不依賴于Mg2+，這與所述scFv抗體蛋白的DNA酶活性不同。
已知在傳統RNA酶上觀察到了不依賴于Mg^的RNA酶活性。
實施例1:通過熒光顯微鏡對轉移有3D8 scFv蛋白的動物細胞的抗病毒活性的確定
用Alexa488標記試劑盒(Molecular probes， Inc.，綠色熒光)對如此在細菌中表達并純化的3D8 scFv抗體進行熒光標記。
然后，用微孔穿孔器(microporator)(來自韓國Digital Bio TechnologyCo., Ltd.)在伏特數為100、脈寬為35和脈沖數為2的電穿孔條件下將所述3D8 scFv抗體注射到vero細胞內(非洲綠猴腎細胞)。在2X 105個vero細胞中導入20嗎scFv蛋白，將導入蛋白的細胞接種到含0.5 mL的DMEM-10。/。胎牛血清的48孔培養板上，然后將接種后的板在5% 002培養箱中培養10小時。
重要的是，利用具有單RNA鏈作為基因組的水泡性口炎病毒(VSV)，在5% C02培養箱中以MOI 5對所述細胞進行1小時的轉染，然后在新的DMEM-10。/。胎牛血清培養基中溫育。
24小時后，用熒光顯微鏡觀察所述細胞。從熒光顯微鏡測定中可以確認，其中未導入3D8 scFv蛋白的vero細胞發生了細胞死亡(一種由VSV引起的細胞病變效應(CPE》(圖24)，而其中導入有3D8 scFv蛋白的vero細胞不管VSV感染與否都仍然存活(圖25)。
在圖24和圖25中，"3D8-"指"不含3D8 scFv蛋白"，"3D8+，，指"注射了 3D8 scFv蛋白"，而"VSV+"指"經VSV處理"。
通過電穿孔(伏特數為1000，脈寬為35，脈沖數為2)將所述3D8 scFv蛋白轉染到HeLa細胞(人類宮頸癌細胞系)內并用VSV轉染(感染)。觀察到HeLa細胞表現出與所述vero細胞相似的抗病毒活性，即細胞死亡受到抑制(參見圖27，并且從圖26中可以看出，其中轉染了VSV的轉移有3D8 scFv蛋白的HeLa細胞沒有表現出所述3D8 scFv蛋白的固有細胞毒性(參見圖27中"3D8+ZVSV-"部分))。
在圖26和27中，"3D8-"指"不含3D8 scFv蛋白"，"3D8+"指"注射了 3D8 scFv蛋白"，"VSV-"指"未用VSV處理"，而"VSV+"指"經VSV處理"。
另一方面，所有轉移有RNA酶A的HeLa細胞(未用VSV轉染)由于RNA酶A的固有細胞毒性而在5小時內死亡。
該結果顯示，所述3D8 scFv蛋白的抗病毒活性顯著高于傳統核酸酶的抗病毒活性。
實施例2:轉移有3D8scFv、 VH或VL蛋白的動物細胞的抗病毒活性的定量測定
通過MTT (溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑)測定定量確定了 3D8 scFv、 VH或VL蛋白的抗病毒活性。
將這些蛋白、作為對照組的牛血清白蛋白(BSA)和溶菌酶以20 pg/2X 105細胞電穿孔到HeLa細胞中，以1 X 105細胞/孔分到96孔培養板上，并在5% C02培養箱中培養24小時。
僅進行電穿孔而不含蛋白的HeLa細胞用作另一個對照組。24小時后，將所述不含蛋白的HeLa細胞組用VSV (MOI-l)轉染1小時并在新的培養基中培養24小時。
當用熒光顯微鏡觀察所述不含蛋白的HeLa細胞時，向其中加入MTT溶液(l mg/mLPBS, 100 iil)并在5% (302培養箱中培養4小時 5小時。
將所得甲暨(fomazan)溶解在200 pl 二甲亞砜(DMSO)中。用吸收分光光度計在595 nm處測量所述甲暨的吸光度，以確定所述HeLa細胞的存活率。
結果，轉移有所述scFv、 VH或VL蛋白的HeLa細胞的存活率顯著高于對照組的HeLa細胞存活率。該結果確定了所有scFv、 VH和VL蛋白都具有抗VSV的抗病毒活性(參見圖28:"對照"為未處理組而"BSA"和"溶菌酶"為對照組)。
實施例3:通過共聚焦顯微鏡對轉移3D8 scFv、 VH和VL蛋白的動物細胞的抗病毒活性的確定
將所述scFv、 VH和VL蛋白以20 jig/2 X 105細胞/孔電穿孔到24孔培養板上的HeLa細胞內，并在帶滅菌蓋玻片的孔內培養24小時。
在24小時培養完成，將所述細胞用VSV轉染1小時并在新的培養基中培養12小時。為通過共聚焦顯微鏡監測HeLa細胞內的VSV片段的增殖，進行了免疫熒光染色。具體而言，將所述培養基從各孔中分離，用含2% FBS的PBS緩沖溶液洗滌所述細胞一次，然后向其中加入400 pl固定/增透溶液(Becton Dickinson, Inc,)，并讓其在4。C靜置20分鐘。所得細胞用含2% FBS的PBS緩沖溶液洗滌兩次，然后與500 (il的抗VSV-FITC抗體(1:1000稀釋)(Abeam， Inc.)在4"C反應40分鐘，并用含2% FBS的PBS緩沖溶液洗滌三次。
將含有作為使細胞核染為藍色的試劑的3 (il的DAPI(4'-6-二脒基-2-苯基吲哚)的固定溶液(Invitrogen，Corp,)加到預先準備的載玻片上，用附著有所述細胞的蓋玻片覆蓋所述載玻片，用所述固定溶液密封剩余相鄰區域，然后用共聚焦顯微鏡觀察VSV顆粒。
31從共聚焦顯微鏡監測中可以確認，存在于轉移有scFv、 VH或VL蛋白的細胞中的VSV片段的量低于未轉移有scFv、 VH或VL蛋白的細胞中的VSV片段的量。低量的所述VSV片段表明，scFv、 VH和VL蛋白抑制了VSV的增殖。(參見圖29， "3D8-"指"不含3D8scFv蛋白"，"3D8+"指"轉移有3D8 scFv蛋白"，"VSV-"指"未用VSV處理"，而"VSV+"指"經VSV處理")。
制備例5: NIH/3T3、 HeLa、 PK15動物細胞的轉化為了建立其中穩定表達3D8 scFv蛋白的細胞系，用plg20-3D8質粒進行了 PCR以獲得3D8 scFv基因，并將所述3D8 scFv基因克隆到動物細胞表達載體中(圖30)。使用包括pcDNA3.1載體(invitrogen,Inc.)、逆轉錄病毒載體pLXIN (invitrogen, Inc.)和逆轉錄病毒載體pQCXIN(invitrogen， Inc.)在內的三種載體進行所述3D8 scFv基因克隆(在圖30中，這些載體分別由"a"、 "b"和"c"表示)。此處所用的各PCR引物組如下
a) 3D8 scFv基因在pc DNA3.1載體中的克隆
正向 ' 5'-GGATCCTGCTATGGCAAAAGCCCGGGAG陽3' (SEQ ID NO
17)
反向5'畫CTCGAGGTCCATGGTGATGATGATG畫3' (SEQ ID NO 18)
b) 3D8 scFv基因在pLXIN載體中的克隆
正向5'畫TCTCGAGATGGAGGTCCAGCTGCAG-3' (SEQ ID NO 19)反向5'隱TGGATCCTTATTAAAGATCTTCTTCGCTAATAAGTTTTTGTTCTTTTATTTCCAGCTTGGTCCC-3'(SEQ ID NO 20)
c) 3D8 scFv基因在pQCXIN載體中的克隆
正向5'-GTTCTAGAGCGGCCGCATGGAGGTCCAGCTGCAGC-3'(SEQ ID NO 21)
反向5'畫TGGATCCTTATTAAAGATCTTCTTCGCTAATAAGTTTTTGTTCTTTTATTTCCAGCTTGGTCCC-3' (SEQ ID NO 22)
(1)通過簡單轉染來建立表達3D8 scFv的HeLa和NIH/3T3細胞系將HeLa細胞系和NIH/3T3細胞系(小鼠胚胎成纖維細胞)以105細胞/孔在60 mm培養板上培養，12小時后，用pc DNA3.1-3D8 scFv載體轉染這些細胞。在剛要轉染前，用新鮮培養基(DMEM-10M FBS)替代所述培養基。將6 (il JetPEI轉染溶液(Qbiogen， Inc.)和3 pg pcDNA3.1-3D8 scFv載體與NaCl (100 150 mM)均勻混合，并將其于室溫靜置30分鐘。將所得混合物加入在60 mm培養板上培養的HeLa細胞系或NIH/3T3細胞系。24小時后，用含G418抗生素(lmg/mL)的選擇培養基替換所用培養基，并且重要的是，連續重復替換所述選擇培養基(以2天 3天間隔進行2周)以獲得群落。
通過逆轉錄酶聚合酶鏈式反應(RT-PCR)確定了形成群落的細胞表達 3D8 scFv mRNA。使用Trizol溶液(Invitrogen Life Technologies, Inc.)從所述細胞中提取總細胞RNA，然后由3嗎所提取的RNA合成cDNA并使用RT-PCRPreMix試劑盒(來自Bioneer， Ltd.)對所述cDNA進行聚合酶鏈式反應(PCR)。
圖31是顯示所述NIH/3T3細胞的RT-PCR分析結果的瓊脂糖凝膠電泳圖像。在圖31中，泳道1為尺寸標記(來自Bioneer, Inc.的100 bp序列梯)，泳道2是其中使用蒸餾水(D.W)作為PCR模板的陰性對照組的 PCR圖案，泳道3是其中使用未轉染NIH/3T3的細胞合成的cDNA作為 PCR模板的陰性對照組的PCR圖案，而泳道4顯示了其中使用從轉染有 pcDNA3.1-3D8 scFv的NIH/3T3細胞合成的cDNA作為PCR模板的PCR 圖案。
如從圖31中可以明顯看出，在泳道4的圖案中觀察到對應于3D8 scFv基因尺寸的750bp條帶。所述條帶的存在表明所述經轉染的NIH/3T3 細胞穩定表達3D8 scFv mRNA。
然后，通過免疫熒光染色確定所述經轉染的NIH/3T3細胞是否表達 3D8scFv蛋白。艮P，將所述細胞通過4%多聚甲醛固定，并相繼使用0.1% Triton X-100進行膜增透和使用5M脫脂奶(DIFCO， Inc.)封閉膜。將所得 NIH/3T3細胞與兔衍生抗3D8 scFv —抗(在3。/。脫脂奶-TBST中以1:50 稀釋)在室溫下反應30分鐘，用3。/。脫脂奶-TBST洗滌兩次，與TRITC 聯抗兔IgG (1:2,000稀釋)在室溫下反應30分鐘，并用3n/。脫脂奶-TBST 洗滌兩次。熒光顯微鏡測定結果表明，3D8 scFv蛋白在所述經轉染的NIH/3T3 細胞中均勻表達(圖32)。
在圖32中，"a"是顯示不含3D8 scFv的NIH/3T3細胞的圖，而"b" 是顯示轉染了 3D8 scFv的NIH/3T3細胞的圖。
從轉染了 3D8 scFv的Hela細胞系中選出G418并在96孔板上進行有限稀釋，以使在每個孔中引入0.5個細胞以建立單克隆細胞系。
圖33是顯示RT-PCR結果的瓊脂糖凝膠電泳圖像，所述結果確定了 scFv mRNA在經轉染的HeLa細胞系中的表達。在圖33中，泳道M是 100 bp序列梯(來自Bioneer， Inc.),"正常HeLa"泳道是陰性對照組的 PCR圖案，其中使用由未轉染HeLa細胞合成的cDNA作為模板，而按從左至右的順序，第三至第七泳道分別為其中使用從經轉化的轉染有 pcDNA3.1-3D8 scFv的HeLa細胞系合成的cDNA作為模板的組的 RT-PCR圖案。
如圖33所示，在所有轉染細胞系中都觀察到了對應于3D8 scFv基因尺寸的750bpDNA條帶(Hl-1、 H 1-2、 H2-l、 H2-2、 H3-2和H3-3)。該行為表明，所述轉染HeLa細胞穩定表達了 3D8 scFv mRNA。
然后，通過流式細胞儀確定了在兩個代表性轉染HeLa細胞系(Hl-1 和Hl-2)中的3D8 scFv蛋白的表達(圖34)。艮卩，將所述細胞通過4% 多聚甲醛固定，并相繼使用0.1% TritonX-100進行膜增透和使用2%胎牛血清(Invitrogen, Corp.)進行膜封閉。將所得HeLa細胞與兔衍生抗3D8 scFv —抗(在2。/。胎牛血清-TBST中以1:50稀釋)在室溫下反應30分鐘，用2。/。胎牛血清-TBST洗漆兩次，與FITC偶聯抗兔IgG (1:2,000稀釋) 在室溫下反應30分鐘，并用2。/。胎牛血清-TBST洗滌兩次。
流式細胞儀分析結果顯示，3D8 scFv蛋白在所述經轉染的HeLa細胞中表達(圖34)。
(2)使用逆轉錄病毒載體對表達3D8 scFv的HeLa和PK15細胞系進行的確定
將其中克隆有3D8 scFv基因的兩個逆轉錄病毒載體，即pLXIN-3D8 scFv禾B pQCXIN-3D8 scFv轉染到作為包裝細胞系的PT67細胞內。將2X 105個PT67細胞在6孔板的一個孔上生長約24小時，并用不含血清的 TOMTM (Welgene, Inc.)洗滌。將2嗎的DNA、 5 jxl的lipofectamine (Invitrogen， Corp.)和200 |il的TOIV[Tm互相混合，使其在室溫下反應15分鐘，再向其中加入800^1 TOM 培養基，然后將倒進含細胞的孔內，并在37"C于5% C02培養箱中溫育8小時。8小時后，將所述細胞在含10% 胎牛血清的DMEM培養基中培養約24小時，然后用含800 pg/mL G418 的DMEM-10。/。胎牛血清培養基替換所用培養基。約兩周后，當細胞開始在孔內成簇并生長時，將它們培養2天 3天并離心以獲得病毒上清液。剩余溶液經0.45 (im過濾器過濾以除去細胞殘余物。
為將由PT67包裝細胞系獲得的含3D8 scFv基因的逆轉錄病毒顆粒轉導到HeLa和PK15細胞內，將1 X 105個HeLa細胞和PK15細胞(豬腎成纖維細胞)在60 mm培養板上培養約24小時，并使用添加有溴化己二甲胺(polyblene) (10昭/mL)的含10。/。血清的DMEM培養基在37。C于5。/。 C02培養箱中溫育兩周。將所述細胞在添加了 5 mL通過培養所述PT67 包裝細胞獲得的病毒上清液的培養基中在37X:溫育24小時，然后使用 1 mg/mL的含G418培養基進行G418選擇。
在用逆轉錄病毒轉染所述HeLa和PK15細胞后約三周，當通過所述 g418選擇形成了所述轉導細胞的細胞簇時，進行有限稀釋而在96孔板的一個孔中引入0.5個細胞，以建立單克隆細胞系。H4-2、 H5-14、 H5-18 和H5-26建立為轉染有所述逆轉錄病毒的代表性HeLa細胞系，而Pl-l、 P 1-2和P 1-3建立為轉染有所述逆轉錄病毒的代表性PK細胞系。
圖35是顯示RT-PCR結果的瓊脂糖凝膠電泳圖像，所述RT-PCR結果確定了 3D8 scFv mRNA在經轉化的PK15細胞系中的表達。在圖35 中，泳道M為100bp序列梯(來自Bioneer,Inc.)，"正常PK15"泳道是陰性對照組的PCR圖案，其中使用由未轉染PK15細胞合成的cDNA作為模板，并且按從左至右的順序，第三至第七泳道分別為其中使用從經轉化的轉染有pcDNA3.1-3D8 scFv的HeLa細胞系合成的cDNA作為模板的組的RT-PCR圖案，而泳道P1-1、 P 1-2和P l-3分別是其中使用由經轉化的PK15細胞系合成的cDNA作為模板的組的RT-PCR圖案。如圖35所示，在所有經轉化的PK15細胞系(Pl-1、 Pl-2禾BPl-3) 中都觀察到了對應于3D8 scFv VH和VL基因的尺寸的400 bp DNA條帶。這表明所述經轉化的PK15細胞穩定表達了 3D8 scFvmRNA。
實施例4:表達3D8 scFv蛋白的動物細胞的抗病毒活性測定對其中已證明表達了 3D8 scFv基因的NIH/3T3和HeLa細胞系的抗病毒活性進行確定。具體而言，評估了所述NIH/3T3細胞系抗水泡性口炎病毒(VSV)的抗病毒活性，評估了所述HeLa細胞系抗VSV、單純皰疹病毒(HSV)和偽狂犬病(Aujesky's disease)病毒(ADV)的抗病毒活性，并評估了所述PK15細胞系抗典型豬瘟病毒(CSFV)的抗病毒活性。
感染到所述經轉化的細胞系中的病毒量在0.1 1.0的感染復數(MOI) 范圍內。為確定各細胞系的抗病毒活性，用病毒感染所述細胞系，在約 20小時 72小時后，進行細胞死亡監測、RT-PCR或胞內病毒染色。根據如下方式確定各細胞系的病毒活性
確定抗VSV的抗病毒活性(負鏈RNA基因組) :在病毒感染后20小時 40小時用顯微鏡觀察細胞死亡 -確定抗HSV的抗病毒活性(雙鏈DNA基因組) :在病毒感染后20小時 40小時用顯微鏡觀察細胞死亡 :在用HSV-GFP (綠色熒光蛋白)病毒感染細胞后24小時用顯微鏡觀察細胞死亡，所述HSV-GFP病毒當在細胞內表達GFP時發綠色熒光。
確定抗ADV的抗病毒活性(雙鏈DNA基因組) :在感染后40小時進行靶向ADV gp50基因的RT-PCR。
評估抗CSFV的抗病毒活性(正鏈RNA基因組) :在感染后72小時時對胞內病毒進行染色。
圖36顯示了以與實施例2中的相同方式確定表達所述3D8 scFv蛋白的NIH/3T3細胞的抗VSV活性的定量MTT測定結果。
在用VSV以MOI 1感染所述細胞后24小時，互相比較細胞系的細胞存活率。具體而言，未轉化的NIH/3T3細胞系的存活率約為47%，而經3D8 scFv基因轉化的NIH/3T3細胞系的存活率約為76%。相似地，未轉化的HeLa細胞的存活率約為32%，而經3D8 scFv轉化的HeLa細胞的存活率約為85%(圖36)。這些結果表明，3D8 scFv蛋白能抑制NIH/3T3 細胞中的VSV (RNA病毒)活性。
圖37顯示了熒光顯微鏡測定結果，該結果確定表達所述3D8 scFv 蛋白的HeLa細胞的抗VSV活性。在用VSV以MOI 1感染所述細胞后 24小時，觀察了細胞行為。從所述細胞觀察發現，經轉化的HeLa細胞的死亡率低于未轉化的HeLa細胞的死亡率(圖37中，"正常HeLa"是不表達3D8 scFv蛋白的正常細胞，而H4-2、 H5-14、 H5-18和H5-26是表達3D8scFv蛋白的細胞)。這些結果表明，3D8scFv蛋白能抑制HeLa 細胞中的VSV (RNA病毒)活性。
圖38顯示了胞內染色結果，該結果確定經轉化的PK15細胞的CSFV 增殖抑制活性。在用CSFV (MOI = 0.5)感染所述細胞1小時后，將所述細胞從病毒接種培養基中分離。在添加有1 ml含10% FPS的完全 DMEM的每個孔中培養所述細胞72小時。培養72小時后，將所述細胞從所述培養基分離并用PBS洗滌。用80。/。丙酮在-2(TC將所述細胞固定 IO分鐘。在除去丙酮并干燥后，將所述細胞與識別CSFVE2抗原的3B6 單克隆抗體(來自韓國National Veterinary Research & Quarantine Service 的抗E2抗體)在37。C反應40分鐘。所得細胞用PBS洗滌三次，并與生物素偶聯抗小鼠抗體在37。C反應40分鐘。所得細胞用PBS洗滌三次，在AB溶液中培養40分鐘，用PBS洗滌三次，然后與二氨基聯苯胺四鹽酸鹽(DAB)底物溶液在室溫下反應約IO分鐘。反應后，從孔中除去DAB 溶液，用自來水洗滌培養箱，用自來水將孔裝到l/4并用顯微鏡觀察。
如從圖38中可以看出，正常PK15細胞(在圖38中由"正常PK15" 表示)表面和與其相鄰區域全部被染為深色，而在細胞系內表達3D8 scFv 蛋白的經轉化的PK15細胞系(P1-1、 Pl-2、 Pl-3)幾乎沒有染色。這些結果表明，3D8 scFv蛋白能抑制PK15細胞中的CSFV增殖。
同時，圖39顯示了以與實施例2中的相同方式進行的定量MTT測定的結果，該結果確定表達3D8 scFv蛋白的HeLa細胞的抗VSV活性。
在用VSV (MOI:0.1或1)感染所述細胞后24小時和36小時，互相比較了所述細胞系的存活率。結果證實，經3D8 scFv基因轉化的H4-2 細胞的存活率高于未轉化HeLa細胞的存活率，具體而言，所述經3D8 scFv基因轉化的H4-2細胞的存活率在MOI 1時為約75%，而在MOI 0.1 時為約88%(圖39)。這些結果表明，3D8scFv蛋白能抑制HeLa細胞中的VSV活性。
圖40顯示了以與實施例4中的相同方式進行熒光顯微鏡測定的結果，該結果確定表達3D8 scFv蛋白的HeLa細胞的抗VSV活性。
在用HSV-GSP以MOI 1和MOI 0.5感染所述細胞后24小時，觀察了所述細胞的熒光活性。經觀察發現，經轉化的HeLa細胞的熒光細胞比例(fluorescent cell ratio)低于未轉化HeLa細胞的熒光細胞比例。這些結果表明，3D8 scFv蛋白能抑制HeLa細胞中的VSV增殖。
圖41顯示了顯微鏡測定結果，該結果確定表達3D8 scFv蛋白的HeLa 細胞的抗ADV活性。在用ADV以MOI 0.1和MOI 1感染細胞后24小時和40小時，觀察了所述細胞行為。在所有情形中，觀察到經轉化HeLa 細胞的死亡率低于未轉化HeLa細胞的死亡率。這些結果表明，3D8 scFv 蛋白能抑制HeLa細胞中的ADV (DNA病毒)增殖。
圖42是顯示RT-PCR結果的瓊脂糖凝膠電泳圖像，該結果確定經轉化的HeLa細胞系的ADV病毒增殖抑制活性。在圖42中，泳道M為100 bp序列梯(來自Bioneer, Inc.),"正常HeLa"泳道是其中使用由未轉化的HeLa細胞合成的cDNA作為模板的陰性對照組的RT-PCR圖案，而按從左至右的順序，第三至第七泳道分別為其中使用由經轉化的HeLa細胞系(H1-2、H2-2、H3-1 、H3-2和H3-3)合成的cDNA作為模板的組的RT-PCR 圖案。
用于所述PCR的引物的堿基序列如下。所述引物靶向ADV病毒的 gp50基因。
ADV正向引物5 '-CGTACCGCGCCCACGTGGCC-3 (SEQ ID NO
23)
ADV反向引物5'國GTCGGTGAGGATGTTCACGC-3' (SEQ ID NO
24)從圖42中明顯可以看出，在未轉化HeLa細胞中觀察到了 263 bp的 ADV gp50 DNA強帶，而在經轉化的HeLa細胞中觀察到了弱帶。與圖 41相似，這些結果表明3D8 scFv蛋白能抑制HeLa細胞中的ADV病毒增殖。
總之，上述結果證明，DNA病毒(例如，ADV和HSV)和RNA病毒(例如，VSV和CSFV)在表達3D8scFv蛋白的細胞中的增殖受到抑制。
配制例1: 3D8 scFv蛋白的配制 ScFv (SEQ ID NO: 6) 40昭 Tween 802 mg
甘氨酸2g
通過將所述成分溶解在注射用生理鹽水中，進行無菌過濾，分裝到 2 mL小瓶中，凍干并密封來制備組合物(20 mL)。配制例2: 3D8 scFv蛋白的配制 ScFv (SEQ ID NO: 6) 40嗎 Tween 801 mg 山梨糖醇2g 甘氨酸1 g
通過將所述成分溶解在注射用生理鹽水中，進行無菌過濾，分裝到 2 mL小瓶中，凍千然后密封來制備組合物(20 mL)。配制實施例3: 3D8 scFv蛋白的配制 ScFv (SEQ ID NO: 6) 20嗎血清白蛋白501 mg 山梨糖醇4g
通過將所述成分溶解于0.01 M磷酸鹽緩沖溶液(PBS, pH 7.0)中，進行無菌過濾，分裝到2mL小瓶中，凍干然后密封來制備組合物(20mL)。施用例1: 3D8 scFv DNA的肌內注射
將100嗎表達scFv蛋白的載體DNA(SEQIDNO: 6)肌內注射到小鼠的股四頭肌中。將稀釋在0.9% NaCl中的50嗎載體DNA各自注射到小鼠的兩個股四頭肌中。
注射后，通過將電極置于與注射位點相鄰的肌肉上并對所述位點施加具有10串1,000次脈沖的電勢來進行電穿孔。此時，施加的脈沖長度
為200微秒(兩次)，兩個連續脈沖之間的間隔為600微秒，而電流限制為50 mA。對皮膚使用導電凝膠。在較大型動物的情形中，可將所述電極插入動物的肌肉中。工業應用
從上文可以明顯看出，本發明能夠應用于動物細胞，特別是能應用于人類細胞，因此可廣泛用于與由包括HIV病毒和SARS病毒在內的多種病毒引起的疾病的治療相關的藥物行業中。
權利要求
1. 一種抗動物病毒的抗病毒劑，所述抗病毒劑含有作為活性成分的蛋白，所述蛋白具有對侵入動物細胞的外來核酸鏈的結合和降解能力，并且對所述動物細胞本身沒有細胞毒性。
2. —種抗動物病毒的抗病毒劑，所述抗病毒劑含有作為活性成分的編碼蛋白的核酸序列，所述蛋白具有對侵入動物細胞的外來核酸鏈的結合和降解能力，并且對所述動物細胞本身沒有細胞毒性。
3. 如權利要求2所述的抗動物病毒的抗病毒劑，其中所述核酸序列為DNA序列。
4. 如權利要求3所述的抗動物病毒的抗病毒劑，其中所述DNA序列是被引入到能在動物細胞內表達基因的載體中的核酸序列。
5. 如權利要求1或2所述的抗動物病毒的抗病毒劑，其中所述蛋白獲自誘發有自身免疫疾病的動物。
6. 如權利要求5所述的抗動物病毒的抗病毒劑，其中所述自身免疫疾病由/pr基因的功能異常所誘發。
7. 如權利要求5所述的抗動物病毒的抗病毒劑，其中所述誘發有自身免疫疾病的動物是小鼠。
8. 如權利要求1或2所述的抗動物病毒的抗病毒劑，其中對外來核酸鏈的所述結合和降解能力是對RNA鏈的結合和降解能力，或對DNA 鏈的結合和降解能力。
9. 如權利要求1或2所述的抗動物病毒的抗病毒劑，其中對外來核酸鏈的所述結合和降解能力是對RNA和DNA鏈都具有的結合和降解能力。
10. 如權利要求1或2所述的抗動物病毒的抗病毒劑，其中所述蛋白是具有對外來核酸鏈的結合和降解能力的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段。
11. 如權利要求10所述的抗動物病毒的抗病毒劑，其中所述免疫球蛋白是免疫球蛋白G。
12. 如權利要求10所述的抗動物病毒的抗病毒劑，其中所述免疫球蛋白片段選自scFv、 VH、 VL以及與VH和VL結合的Fv。
13. 如權利要求ll所述的抗動物病毒的抗病毒劑，其中所述免疫球蛋白G是3D8。
14. 如權利要求12所述的抗動物病毒的抗病毒劑，其中所述scFv 具有如SEQ ID NO 6所示的序列。
15. 如權利要求12所述的抗動物病毒的抗病毒劑，其中所述VH具有如SEQ ID NO 2所示的序列。
16. 如權利要求12所述的抗動物病毒的抗病毒劑，其中所述VL具有如SEQ ID NO 4所示的序列。
17. 如權利要求1所述的抗動物病毒的抗病毒劑，其中侵入動物細胞的病毒是RNA病毒。
18. 如權利要求17所述的抗動物病毒的抗病毒劑，其中所述RNA 病毒是獲得性免疫缺陷綜合征病毒或嚴重急性呼吸道綜合征病毒。
19. 含有作為活性成分的蛋白的抗病毒動物細胞，所述蛋白具有對侵入動物細胞的外來核酸鏈的結合和降解能力，并且對所述動物細胞本身沒有細胞毒性。
20. 含有作為活性成分的編碼蛋白的核酸序列的抗病毒動物細胞，所述蛋白具有對侵入動物細胞的外來核酸鏈的結合和降解能力，并且對所述動物細胞本身沒有細胞毒性。
21. 如權利要求20所述的抗病毒動物細胞，其中所述核酸序列是 DNA序列。
22. 如權利要求21所述的抗病毒動物細胞，其中所述DNA序列是被引入到能在動物細胞內表達基因的載體中的核酸序列。
23. 如權利要求19或20所述的抗病毒動物細胞，其中所述蛋白獲自誘發有自身免疫疾病的動物。
24. 如權利要求23所述的抗病毒動物細胞，其中所述自身免疫疾病由/pr基因的功能異常所誘發。
25. 如權利要求23所述的抗病毒動物細胞，其中所述誘發有自身免疫疾病的動物是小鼠。
26. 如權利要求19或20所述的抗病毒動物細胞，其中對外來核酸鏈的所述結合和降解能力是對RNA鏈的結合和降解能力，或對DNA鏈的結合和降解能力。
27. 如權利要求19或20所述的抗病毒動物細胞，其中對外來核酸鏈的所述結合和降解能力是對RNA和DNA鏈都具有的結合和降解能力。
28. 如權利要求19或20所述的抗病毒動物細胞，其中所述蛋白是具有對外來核酸鏈的結合和降解能力的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段。
29. 如權利要求28所述的抗病毒動物細胞，其中所述免疫球蛋白是免疫球蛋白G。
30. 如權利要求28所述的抗病毒動物細胞，其中所述免疫球蛋白片段選自scFv、 VH、 VL以及與VH和VL結合的Fv。
31. 如權利要求29所述的抗病毒動物細胞，其中所述免疫球蛋白G 是3D8。
32. 如權利要求30所述的抗病毒動物細胞，其中所述scFv具有如 SEQIDN0 6所示的序列。
33. 如權利要求30所述的抗病毒動物細胞，其中所述VH具有如SEQ IDN0 2所示的序列。
34. 如權利要求30所述的抗病毒動物細胞，其中所述VL具有如SEQ IDN0 4所示的序列。
全文摘要
本發明公開了一種抗動物病毒的抗病毒劑。所述抗病毒劑含有作為活性成分的蛋白或編碼所述蛋白的核酸序列，所述蛋白具有對侵入動物細胞的外來核酸鏈的結合能力和降解能力，并且對所述動物細胞本身沒有細胞毒性。本發明還公開了含有本發明的蛋白或編碼所述蛋白的核酸序列的抗病毒動物細胞。所述抗病毒劑和抗病毒動物細胞由于能夠選擇性地降解侵入動物細胞的外來核酸鏈，并且對所述動物細胞沒有細胞毒性，因此不造成所述動物細胞的死亡，從而表現出有利的作用。
文檔編號A61K38/16GK101534848SQ200780042871
公開日2009年9月16日申請日期2007年9月18日優先權日2006年9月19日
發明者孫鐘南, 樸乙鏞, 權明姬, 李又覽, 李建燮, 李承炫, 李錫瓚, 沈惠京, 鄭義靜, 鄭有哲, 金基潤, 金容星, 金映林, 金正宣, 金泰賢申請人:亞洲大學校產學協力團

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