專利名稱：：多組分疫苗的制作方法
技術領域：
：本發明總體涉及人類免疫缺陷病毒(HIV)，特別涉及多組分疫苗和使用該疫苗保護不受HIV-1感染的方法。冃京生產有效的HIV-1疫苗是AIDS研究的重要目標。迄今，預防性疫苗的開發由于下述原因而尚未成功Hiv具有多樣性(Gaschen,Science296:2354(2002));免疫細胞在黏膜位點(mucosalsite)凋亡的快速發生(Mattapallil等,Nature434:1093(2005);Veazey等，Science280:427(1998);Guadalupe等，J.Virol77:1-1708(2003);Brenchley等，J.Exp.Med.200:749(2004);Menhandru等，J.Exp.Med.200:761(2004));HIV-1是具有病毒性細胞儲存器(cellularreservoir)的整合病毒(integratingvirus)(Fauci，Science245:305(1989));自體HIV-1先天中和抗體應答的誘導的延遲(在病毒在血漿的增加后的八周到一年內)(Abel等，J.Virol80:6357-67(2006),Wei等，Nature422:307-12(2003);Richman等，Proc.Natl.Acad,Sci.USA100:4144-9(2003))。本發明涉及多組分疫苗，其通過使用共有的和/或嵌合的HIV基因(Gaschen等，Science296:2354(2002);Liao等，Virology353:268(2006),Gao等，J.Virol.79:1154(2005),Weaver等，J.Virol.80:6754(2006),Fischer等，NatureMedicine,13(1):100-106(2007)，Epub2006Dec24)、被設計用來破壞免疫耐受性以使得可在黏膜位點誘導所需的中和抗體的特異性的策略(strategy)(例如，通過使用調節性T細胞抑制和/或TLR-9激動劑佐劑)和被設計用來克服HIV-1誘導的凋亡的策略(例如，誘導抗磷脂酰絲氨酸(PS)抗體、抗CD36抗體和/或抗tat抗體)，來解決由HIV多樣性引起的問題。
發明內容本發明總體涉及HIV。更具體地，本發明涉及可被用來保護人類不受HIV-1感染的多組分HIV疫苗。根據以下描述，將明白本發明的目的和優點。附圖簡述圖1是緊接在急性HIV-1感染之后的抗體應答的概括圖。圖2A-2F:Fas配體相對于病毒量。(圖2A)Fas配體，6246組；(圖2B)Fas配體，6240組；(圖2C)Fas配體，9076組;(圖2D)Fas配體，9021組;(圖2E)Fas配體，9020組；(圖2F)Fas配體，9032組。圖3A-3F:Fas(CD95)相對于病毒量。(圖3A)Fas(CD95)，6246組；(圖3B)Fas(CD95)，6240組；(圖3C)Fas(CD95),9076組；(圖3D)Fas(CD95)，9021組；(圖3E)Fas(CD95),9020組；(圖3F)Fas(CD95)，9032組。圖4A-4E:TNFR2相對于病毒量。(圖4A)TNFR2,6240組；(圖4B)TNFR2,6244組；(圖4C)TNFR2,6246組；(圖4D)TNFR2，9020組；(圖4E)TNFR2,9021組。圖5A和5B:TRAIL(TNF相關的凋亡誘導配體)。(圖5A)TRAIL,9020組；(圖5B)TRAIL,9021組。圖6A和6B:PD-1是在慢性HIV-1感染時在T細胞和B細胞上被上調。(圖6A)CD3+;(圖6B)CD19+。圖7A-7D:(圖7A和7B)在未被感染的細胞上的抗-PS;(圖7C和7D)在MN感染的細胞和病毒體上的抗-PS。圖8A和8B:mAb4E10和2F5結合至肽-脂質體綴合物。約1000RU的合成脂質體(紅色)；月旨質-GTHl-4E10(圖8A，紅色)；或4E10-GTHl-脂質(圖8A，藍色)被錨定至BIAcoreLl傳感芯片。第四組流動細胞(flowcell)未被處理(絳紅色)，其不含脂質。在另一個傳感芯片上，脂質-GTHl-2F5(圖8B，綠色)；或2F5-GTHl-脂質(圖8B，藍色)或單獨的脂質體(圖8B，紅色)被錨定。MAb4E10(圖8A)或mAb2F5(圖8B)被注射在每個傳感芯片上，并將結合應答記錄在BIAcore3000儀器上。利用兩步法構象變化模型和mA評估軟件，由曲線擬合分析獲得Kd值。方法:從AvantiPolarLipids(Alabaster,AL)購買溶解在氯仿中的磷脂POPC(l-棕櫚酰-2-油酰-訓-丙三醇基-3-卵磷脂)、POPE(l-棕櫚酰-2-油酰-s"-丙三醇基-3-磷脂酰乙醇胺)、DOPE((l,2-二油酰，-丙三醇基-3-磷脂酰乙醇胺)、DMPA(1,2-肉豆蔻酰，-3-磷酸脂)和膽固醇。通過將適當摩爾量的磷脂分散在耐氯仿的管中來制備磷脂脂質體。以45:25:20:10(POPC:POPE:DMPA:膽固醇)的摩爾比將脂質的氯仿溶液加至肽溶液中。將HIV-1膜近極肽(proximalpeptide)溶解在70%氯仿、30%甲醇中。每種肽被添加至肽:總磷脂的摩爾比為1:420。通過溫和攪拌混合磷脂，并在溫和的氮氣流中將混合物在通風櫥中干燥。通過將脂質在高真空F儲存(15h)而除去任何殘留的氯仿。通過添加PBS或TBS緩沖液(pH7.4)并在高于Tm的溫度F保持10-30分鐘，同時間歇性劇烈攪拌以重懸磷脂，其后在超聲波儀(MisonixSonicator3000，MisonixInc.,Farmingdale,NY)中超聲處理，從而制備磷脂的水懸浮液。將超聲波儀設定為每個循環運行3個連續循環(共45秒的超聲處理)。每個循環包括5秒的超聲波脈沖(70瓦特功率輸出)，其后為12秒的脈沖停止周期。在超聲處理結束時，將片狀脂質體的懸浮液保藏在4°C，并在錨定至BIAcore傳感芯片之前被解凍并如h所述被再次超聲處理。肽被合成并通過反向HPLC純化，并通過質譜分析確認純度。用于本研究中的肽包括以下肽HIV-1gp412F5表位肽-GTHl-2F5(YKRWIILGLNKIVRMYS-QQEKNEQELLELDKWASLWN);2F5-GTH1(QQEKNEQELLELDKWASL豐-YKR額LGLNKIV腿YS);和HIV-1gp414E10表位肽，GTH1醒4E10(YKRWIILGLNKIVRMYS畫SLWNWFNIT麗LWYIK);4E10-GTH1(SL糊WFNITNWLWYIK-YKRWIILGLNKIVRMYS)圖9:本發明多組分疫苗克服的有害急性感染事件的方案。圖10:非人類靈長類動物(NHP)ONTAK消耗(劑量/動力學)。圖11:用rPA免疫的NHP中的T-Reg。圖12:抗-PA結合的ELISA。圖14A-14C:用于測量血漿凋亡MP的流式細胞技術的開發。為了開發出使用流式細胞術分析血漿的新方案，首先分析了聚苯乙烯珠粒(bead)的混合物(圖14A)。尺寸為0.1jLim至1.0pm的珠粒被與BDLSRII等比例混合，并使用BDLSRII稀釋并分析珠粒。這些尺寸是根據之前的研究(通過尺寸來定義微粒)而被使用的(Werner,Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.26(1):112-6(2006)Epub2005年10月20日，Distler等，Apoptosis10:731-741(2005))。因為光電倍增管具有鑒別比前向散射檢測器的二極管更小的顆粒的增強的能力，所以側向散射被用作尺寸鑒別器。為了測定最佳的稀釋范圍，分析了聚苯乙烯珠粒混合物的一系列的連續稀釋(圖14B)。通過進行這樣的實驗發現，任何未被足夠稀釋的樣品，因為巧合和高中斷率，將產生與實際不符的少的事件計數(eventcount)。當流式細胞儀因為事件太緊密或對于系統單獨(同時)處理來說太快而不能處理事件時，就會出現中斷的事件。通過將樣品稀釋到一次只有-^個顆粒流過檢測器時，由細胞儀處理的事件計數就更加準確。實際..匕，當珠粒混合物以1:1000被稀釋時，4種不同尺寸的珠粒不能被很好地鑒別，而以1:100000稀釋時，每種尺寸的數目可被清楚地檢測到。為了分析血漿微粒(圖14C)，使用相似的連續稀釋以通過實驗確定最佳的稀釋(未顯示數據)。為消除計數存在于血漿中的死細胞(但小于細胞微粒且不具有前向或側向散射)的可能性，發生在確定的微粒門(microparticlegate)范圍內的事件被計數。此門(gate)包括在低側向散射范圍內的O.l，珠粒并包括在較高側向散射范圍內的l.Opm珠粒，而不包括具有非常小的前向和側向散射的顆粒(圖14A和14C中的紅色方框)。對于每個實驗操作，聚苯乙烯涂料(sizing)珠粒都以1:100,000被稀釋，使得所有數據以相同方式被收集(gated)。在血漿樣品中，研究者發現大部分微粒在0.1至0.5pm之間(證明側向散射面積小于104的紅色微粒門內的個體)。也存在較大的微粒(大于0.5pm但小于1.0pm)，但所占比例較小。圖15A-15D:血漿MP的表型匕的凍融循環的效果。因為某些細胞外標記物在血漿供體樣品中的表達水平很低，所以對冷凍和融化血漿對微粒表型的影響作了研究。來自HIV-1慢性感染供體的血槳被分成3份。第一份保持在2(TC(新鮮的)。第二份在-80C冷凍IO分鐘并被融化(冷凍lx)，而第三份被同樣地冷凍、融化，并被再冷凍(冷凍2x)。所有三個樣品隨后被稀釋、過濾和離心。使用CD3(圖15A)、CD45(圖15B)、CD61(血小板MP標記物)(圖15C)和膜聯蛋白V(圖15D)來染色MP重懸液。綠色方框內的百分數表示在被同時分析的同種型對照的背景抽取后，那種特定標記物的MP陽性的百分數。這些百分數在第一個凍融循環時增加，而在另-個凍融循環后減少，表明樣品完整性在血漿MP的表型分型中起重要作用。圖16A-16C:HIV、丙肝病毒(HCV)和乙肝病毒(HBV)受試者的血漿病毒量。研究了30個HIV+陽轉血漿組(panel)(HBV和HCV陰性)、10個HBV陽轉組(HIV陰性)和10個HCV陽轉組(HIV陰性)。各組正式HIV(圖16A)、HCV(圖16B)和HBV(圖16C)的病毒量增加的動力學。第0天被確定為HIV病毒量達到100拷貝數/ml的第一天，HCV病毒量達到600拷貝數/ml的第一天和HBV病毒量達到700拷貝數/ml的第一天。圖17A-17C:凋亡的血漿標記物。圖17A:通過ELISA測量每個血漿樣品的TRAIL、TNFR2和Fas配體，并與病毒量水平比較。圖17B顯示三個有代表性的受試者。為了比較受試者之間的凋亡的血漿標記物的增加量，將第0天前的平均值與第O天之后的平均值比較，并計算增加的百分數。(圖17C)在HCV和HBV感染受試者中測量相同的凋亡的血漿標記物。顯示了.一個HCV受試者和-個HBV受試者的結果。圖18A和18B:凋亡的血漿標記物的總結。圖18A:對每組數據進行Boxplot分析。展示了急性HIV-1、HBV和HCV小組的結果，其中垂直線表示最大值和ii最小值。利用Student'sT測試技術P值。藍色方框表示p<0.01。圖18B:峰值被分析物相對于最大病毒擴張(rO)的出現時間(timing)。結果來自于成對的Wilcoxcm秩檢驗，低p值表示(峰值日期的)兩個平均值顯著不同。這暗示峰值(例如擴張峰值日和TRAIL峰值日)的平均"達到時間"顯著不同。到達時間之間的"延遲"可根據平均值、中值和四分位差來描述。在此組，每個被分析物最大值的"達到時間"都與峰值病毒擴張(紅色方框)比較。來自Wilcoxon檢驗的p值顯示在被分析物上方。還記載了平均延遲時間(括號內中值時間)。圓圈表不弁吊但。圖19A和19B:血漿樣品中的相對微粒計數。圖19A:對于每個被研究的30個受試者，獲得每個連續時間點的相對微粒計數。顯示了三個有代表性的受試者。圖19B:對IO個HBV和IO個HCV感染的受試者進行相同的分析。顯示了一個HCV受試者和一個HBV受試者的結果。圖20:從急性HIV-1感染受試者收集的血漿MP的投射式電子顯微照片。通過超速離心使血漿MP成丸狀，并通過蔗糖墊(pad)純化。MP的尺寸為0.05微米至0.8微米。發明的詳細描述本發明涉及多組分、多功能HIV疫苗，其用來克服i)HIV多樣性，ii)中和抗體誘導的耐受約束(toleranceconstraints)和Hi)凋亡誘導的免疫抑制。本發明提供"種HIV疫苗，其包含集中的(centralized)HIV基因插入物(insert)(共有的、嵌合的)、耐受性破壞成分(例如，TLR-激動劑、調節性T細胞抑制)和可以抑制凋亡的免疫抑制或抑制凋亡本身的成分(例如，抗-PS、抗-CD36抗體誘導和/或抗HIVtat抗體誘導)。導致產生HIV-1包膜免疫通常不會產生的抗體特異性的佐劑和其他免疫體制(immunizationregimen)的使用，已在之前被提議(PCT/US2006/013684;US申請第11/785,007號；US申請第11/812,992號；US臨時申請第60/960,413號)。此成果是由觀察到許多廣譜中和抗HIV-1單克隆抗體是自身抗體且可能受免疫調節控制而得到的(Haynes等，Science308:1906(2005)，Haynes等，HumanAntibodies14:59(2006))。已被用來在小鼠中破壞耐受性的一種佐劑體制(adjuvantregimen)是在油基佐劑中的寡CpG(Tran等，Clin.Immunol.109:278(2003))。對于人類，可使用B型寡CpG，包括2006或10103oCpG(McCluskie和Krieg,Curr.Topic.Microbiol.Immunol.311:155-178(2006))。但是，可能很難完全克服耐受性控制(即使是臨時性的)，并且自身抗體的產生也受調節性T細胞控制(Shevach，Immunity25:195-201(2006))。因此，使用佐劑體制并結合使用使調節性T細胞臨時失活的體制的免疫，可被用來誘導抗-HIV-l抗體(通常通過負免疫調節機制來防止被誘導)。調節性T細胞可通過使用以下方式被失活或消除使用糖皮質激素誘導的TNF家族相關的受體配體(GITRL)DNA免疫(Stone等，J.Virol.80:1762-72(2006));使用CD40配體DNA免疫(Stone等，Clin.VaccineImmunol.13:1223-30(2006));或與疫苗免疫同時使用CD25mab或ONTAK、IL-2-毒素綴合物(參見PCT/US2005/37384、PCT/US06/47591、US申請第11/302,505號和US申請第11/665,251號)(以下實施例2中提供的數據證實了對獼猴使用ONTAK增強了抗體的產生)。破壞對被使用的免疫原的耐受性的另一途徑是設計具有胞質域內質網保留序列(retentionsequence)(例如賴氨酸-賴氨酸)的重組插入基因(insertgene)，并靶定HIV基因(例如包膜)以實現保留在內質網內(Cornall等,JEM198:1415-25(2003))。這樣設計的基因可以為，例如，重組腺病毒免疫原DNA，或重組皰疹性口炎病毒免疫原DNA或它們的組合。任何其他載體也可被用來遞送插入基因(例如，表l中給出的載體)農1C咖-Sgpl60cmMRVRGIQRNCQHLWRWGTLILGMLMICSAAENLWVTVYYGVPVWKEAOTTLFCASDAKAYDTEVHNVWATHACVPTDPUPQEIVLENVT咖FTO4WKNNMVEQMHEDIISL卿SLKPCVKLTPLCVTLNCTNVNVTNTTNNTEEKGEIKNCSFNITTEIRDKKQKVYALFYRLDWPIDDKKNNSSNYRLINCNTSAItqacpkvsfepipihycapagfailkcndkkfngtgpcknvstvqcthgikpwstqlllngslaeEEIIIRSENITroiAKTIIVQLNESVEINCTRPNNNTRKSIRIGPGQAFYATGDIIGDIRQAHQIISgtkwnktlqqvakklrehfnnktiifkpssggdiieitthsfncrgeffycntsglfnstwigngtknnnntndtitlpcrikqiinmwqgvgqamyappiegkitcksnitgllltrdggnnntneteiprpgggdmrdnwrselykykvvkieplgvaptkaerrvveager&vszgftvflgwigaagstosaasitlwoarollsgivooosnllraieaoohlloltvwgikoloarvl&verylkdoolLGIWGCSGKLICTTTVPWNSSWSMKSODEIWDNMTWMEWEREI匿tdiiysli咖q咖ekmeoEUiALDK(msLTOJwFD工T測LWY工iaF工M工VGGLIGLRIVFAVLSIV服VRQGYSPLSFGTLIPNPRGPDRPEGIEEEGGEQDRDRSIRLVNGFLALAWDDUISLCLFSYHRLRDFILIAARWE)IiLGRKGLRJW5WEALKYLWNLliQYWGQELKNSAISI^DTTAIAVAEGTDRVIEVVQRACRAILNIPRRIRQGIiERAIA磁伶錄裕鍵"黑體浙—A，教々^'/ffi-7被力/7>:效統，///-2力黑沐激分，.免發汰.勢^"虛乂'7沐/〃7>，統跨嚴t舒裕凝'"效乂字/4凌示。^r^w化！游^:變#成￡,存'.5M泣ir游尺,異成fi,"嫩餘欲教/';rMRVRGI卿CQHLWRWGTLILG顧ICS織NLWVTVYYGVPVWKEANTTLFCASDAKAYDTEVHNVWATHACVPTDPUPQEIVLENVTENFNMWKNNMVEQMHEDIISLWDQSLKPCVKLTPLCVTLNCTNVNVTNT麗TEEKGEIKNCSFNITTEiRDKKQKVYALFYRLDWPIDr)NNNNSSNYRLINCNTSAItqacpkvsfepipihycapagfailkcndkkfngtgpcknvstvqcthgikpwstqlllngslaeeeiiirsenitnnaktiivq匿sveinctrpnnntrksirigpgqafyatgdiigdirqahcnisGTKWNKTLQQVAKKLHEHFIMKTIIFKPSSGGDLEITTHSFNCRGEFFYCNTSGIiFNSTWIGNGTKnnnntndtitlpcrikqiinmwqgvgqamyappiegkitcksn工tcllltrdggnnntneteifrpgggdmrdhwrselykykwkiepiigvaptkaerrvvekeer&vgigavflqflsaagstiggaasirltvoarollsgivooosnllrmeaoqhllol，gikoloarvlaverylkdoolLGIWGCS孤LALDTOWkSL,FDI麗LWYIKIFIMIVGGLIGLRIVFAVLSIVNRVRQGYSPlsfqtlipnprgpdrpegieeeggeqdrdrsirlvngflalawddlrslclfsyhrlrdfiliaarTVEIitiGRKGLRRGWEALKYLWNlXQYWGQEIiKNSAISIXDTTAIAVAEGTDRVI,QRACRAILNIPRRIRQGLERAL函敲絲稱統"黑體,產;^統菱示，朋-/號勿,纖，朋-2為黑沐虔紛，.免發傻勢區"^t，體辨,纖表示，i^l鄉以顏乂字體歸。在4^體游/:辦成i,在J^錢鄉/c棘成五，M^OT泣點。在c廁餘iCOK-Sgpl60MRVRGIQRNCQHLWRWGTLILGMLMICSAAENLWVTVYYGVPVWKEANTTLFCASDAKAYDTEVHNVWATHACVPTDPNPQE工VLE,ENFIWWKNNMVEQMHEDI工SLWDQSliKPCVKLTPLCVTLNCTNVNVTNTTNNTEEKGE!IKNCSFNTTTE工RD卿KVYALFYRLDVVPIDDKNNNSSlinfRLl:NCNTSAITQACPWSFEPIPIHYCAPAGFAIIiKCNDKKFNGTGPCKNVSTVQCTHGIKPWSTQLLLNGSLAEEEIIIRSENITNNAKTIIVQLNESVEINCTRPNMNTRKSIRIGPGQAFYATGDIIGDIRQMICNISGTKWNKTLQQVAKKLREHFNNKTIIFKPSSGGDLEITTHSFNCRGEFFYCNTSGLFNSTWIGNGTKNNNNTNDTITKPCRIKQIIlWQGVG0JpiyAPPIEGKITCKSNITSLLLTRDG3NNNTNETEIFRPlttoarollsgivo。OSNLLRAIEAOOHLLOLTVWGIKOLemRVLM/ERYLKDOOLLGIWGCSGKL工CTTTyTOMSSWSMKSODEl抑nmtwm臓匿匿TDliTfsti鵬SiLaldkw&sowiwFD工TNWLWY工KIFIMIVGGLIGLRIVFAVLSIVnrvrqgyspLSFQTLIPNPRGPDRPEGIEEEOSEQDRDIlSIRLWGFLMjAWDDLIlSLCLiFSraRLRDFIIiIAARTVELLGRKGlillRGWSALKYLWNLLQYWGQELJCNSAISI^DTTAIAVAEGTDRVIEVVQRACRAILNIPRRIRQGLERALD激合翁賴凝以黑體浙K劍錄表示，//iW被^77淑錄，/恥2為黑伴教分'—免嫂'汰勢區"及乂字沐浙7"，錄:，機^^離犬字沐新。CC9-Sgpl60KKMRVRGIQRNCQHLW柳GTMLGMLMICSAAEKLWTVYYGVPVWKEANTTLFCASDAKAYDTEVHNVWATHACVPTDPNPQErVLENVTEKFKMWK2INMVE,EDIISLWDQSLKPCVKLTOLCVTLNCTNVNVTNTTNNTSEKGEIKNCSFNITTEIRDKKQKVYALFyRLDWPIDDNNNNSSNYRLINCWTSAITQACPKVSF固P工HYCAPAGFA工LKCNDKK鵬TGPCKNVSTVQCTHGIKPWSTQLL國SLAEEE工IIRSENITHNAKTInTQLNESVEINCTRPNMrTRKSlRIGPGQAFYATGDIIGDIRQAHCNISGTKWNKTLQQVAKKLREHFNNKTIIFKPSSGGDLEITTHSFNCRGEFFYCNTSGIiFNSTWIGNGTKKNKNTNDTITLPCRIKQIINMWQGVGQMIYAPPIEGKITCKSNrrGLLLTRDGGKNNTNETEIFRPGGGDMRDNWRSELVKYKWKIEPLGVAPTKAKRRWEKEKH&V^lCAVFLgFLGAJWSSTMQaASirlwoarollsgivooosmllraieaoohlloltvwgikolqarvlaverylkdoolLG工WGCSGKLlCTTTVPWNSSWSNKSODgJlWD鵬TWMEWEREJ:NMYTDirySLIEE幼UQOEKHEO邁LiAiDKWASLWNwFD工TNWLWYIK工F工M工VGGIiIGLiRIVFAVLSIVNRVRQGYSPLSFQTLIPKrPRGPDRPEGIEEEGGEQDRDRSIRLWGFLALAWDDLRSLCLFSYHRLRDFILIAARTVEULGRKGLRRGWEALKYLWNLIiQYW3QEL鵬AISIiliDTTAIAVAEGTDIlVIEVVQRACRAILN工PRRIRQGLSRALIiKKJRFL朋160mr卿irknyqhlwrggtli/lgiivicSAVEKLWTVYYC5VPVWKEATTTLFCASDAKAYDTEVHNvwathacvptdpnpqewlgnvtekfkmwknwmveqmqediislwdqslkpcvkltplcvtlnckdvnatnttktgseg簡rgeikncsfnittsirdevqkeyalfykldvvpidnkntsyrliscdtsvitqacpkisfepipihycapagfailkcndktfngkgpcknvstvqcthgirpwstqlllngslaeEEWIRS匿TNWAKTII卿KESVEI!TCTRPlWKTRKSIHIGPGRAFYTrGE工rcDlRQAHCNISrakwndtl柳vikl卿fenktivfnhssggdpeivmhsfncggeffycnstqlfnstwnnntegsnntegntitlpcrikqiinmwqetckamyappirgqircssnitgllltrdgginengteifrpgGGDMKDMWRSELYKYKWXIEPLGVAPTKAKRRWOREKRAVglGAVgLG夢3^ft6SmiSaA^lTLtvoarlllsgivooowwllraieaoormloltvwg工ko:loarvlaverylgdoollgiwgcsgkliCTTAW鄉ASWS服SIiDRlWNKMTWMEWEREIDNYTSEIYTM腿S諷效EKNE卿LmiDKWASL薩FDITKWLWYIKIFIMIVGGLIGLRIVFTVLSIVnrvrqgysplsfqtllpaprGPDRPEGIEEEGGERDRDRSGRIiVKGFLALIWVDLRSinFSYHRLRDIiLTVTOIVEIXGRRGWEvlkywwnllqwsqelknsavsllhataiavaegtdriiealqrtyrai呵ptrirqglerall激合裙稱凝"黑體浙f:敘續表示，被'勿K劍錄，/恥2為黑體都分，^疫汰勢區被龍7，續.并含#"爿歷r務，^#^^^字體標。mrvkgirkny,wrggtlmigiivicsaveklwtvyygvpvwkeatttlfcaslmkaydtevhnwathacvpt3dpnpqewlgkvtekramwknkmveqmqediislwdqslkpcwltplcvtlmckdvnatnttngsegtmergeikhcsfkrittsirdevqkeyalfykldwpidnnwtsyrliscdtsvitqacpkisfepipihycapagfailkcndktfngkgpcknvstvqcthgirpwstqlllngslaeeewirs,爾證i工vqlkesveinctrpnnntrksih:egpgrafyttceiigdirqahcnisrakwndtlkqiviklreqpenktlvfnhssggdpeivmhsfncggeffycnstqlfnstwnnntegsnntegntitlpcr工恥iinmwqevgkamyappirgqircssnitgllltrdgginengteifrpgttoarlllsgivooo跳lraieaqormlol，gikoloarvlaverylgdqo腦i證sgkliCTTAVPWNASWSNKSLDRIWNNMTWMEWEREIDNYTSElYTLIEESQilQQEIMEQELLELDKWASL卿FDITKWLWYIKIF工MIVGGLIGLRIVFTVLSIVnrvrqgysplspqtllpaprGPDRPEGIEEEGGERDIlDRSGRLVNGFIiAL工WDLRSLCLFSYHRLRDLLI/rVTR還]XGRRGWEVLKYWWNLLQYWSQELKNSAVSLiLNATAIAVAEGTDRIIEALQRTYRAILHIPTRIRQGLERALLKK^合翁餘統以黑體辨7纖表示，朋-/乾勿7^^續，朋-2力黑體激分，.免座'汰勢織勿7纖方，存j歷r序抓鄉激賴凝麗丈，沐麥示。,c末端添力/lJRFLgpl60Cm柳VKGIRKNYQHLWRGGTLLLGIIVICSAVEK^WVTVyYGVPWKEATTTLFCASDAKAYDTEVHNVWATHACVPTDPNPQEWLGNVTBKFNMWKNNMVEQMQED工ISLTOQSLKPCVKLTPLCVTLNCKDVNATOTTNGSEG憶RGEIKHCSPNITTSIRDWQ證ALFYKLDWPIDmiNTSYRLISCDTSVITQACPKISFEPm跳A腦FMI/KC匪TPNGKGPC麗STVQCTfKnRFWS卿固GS認EEVVIRSDNFTNNAKTIIVQLKESVEIMCTRPNNNTRKSIHIGPGRAFyTTGEIIGMRQAHQJISRAKSWTLKQIVTKLREQF,Ti:VFNHSSGGDPElVMHSFICGGEFFOTSTQIiFNSTWNNKTEGSNOTEGNTITLPCRIKQIINMWQEVGKAMYAPP工卿IRCSSNITGLLLTRDGGINENGTEIFRPGGGDMKIMWRSELYKYKVVK]:EPIiGVAPTKAERRVVOREERAVGIGAVyi^夢LGAA6接TMGftASMTLTVQARLLLSG工VOOOKNLLRAIEAOORMLOLTVWGIKOLOARVIAVERYLG加OLLGIW(3CSGKLTCTTAVPWNASWSNKSLDRIWNNMTWMSWEREIDNYTSEITOIEESQBIQC^KNEQELliELDKWASI*WNwFDIT謂LWYIK工FIMIVGGLIGLR工YFTVLSIV麗VRQGYSPLSFQTLLPAPRGPDRPEGIEEEGGERDRDRSGRLVNGFLAL工WVDLRSLCIiFSYHRLRDLLLTVTRIVELLGIRGWEVLKYWWNLLQYWSQEL鵬AVSLLNATAIAVAEGTDRIIEALQRTYRAILHIPTRIRQGLERALL激合，鍵以^體辨朋-/乾勿7:趙續'朋-2為潔體激分，.免疫汰勢/m勿7:纖并含萄一爿,y^^^^潛溝鍵ot犬，條示。在邦3位f游k變^M五，在'5w泣置游k^p成ee，以淤餘效維點。JRF1^gpl60CmKKMRWCGSIRKNYQHLWRGGTLLLGIIVICSAVEKLWTVYYGVPVWKEATTTLFCASDAKAYDTEVHNWATHACVPTDP,EWLGNVTEKF1MWKKNMVE:QM卿IISIiWDQSLKPCWLTPLCVTLNCKDVNATNTrNGSEGTMERGEIKNCSFNITTSIRDEVQKEYALPYKLDWPIDNNNTSYRLISCOTSVITQACPKISFEPIPIHYCA狄GFAILKC節KTFNGK(3PCKlWSTVQCTHG;i:RPWST,LM3SLAEEEWIRSDNFTNNAKTIIVQIJCESVEINCTRPMNWTRKSIHIGPGRAFYTTGEIIGDIRQAHCNISRAKWNOTr/KQIVIKLREQFENKTlWNHSSGGDPEIVMHSFNCGGEFFYCNSTQLFNSTTOINTEGSNNTEGNTITLPCRIKQIINMWQEVGKAMYAPPIRGQIRCSSNITGLM/TRDGGINENGTEIFRPGGGD畫MWRSELYKYKWK工EPIX3VAPT畫HRW0REER&VGIGJlVFLG，LGAAQSgKSAAfiMTLTVO&RLI^SGIVOOOMNLLRAIEAOOmiLOLTVWGlKOLOARVIAVERYLODOOLLGIt^CSGKLICTTAVPWNASWS做SLDRIWWNMTWM鵬REOTYTSEiyTra腿SQNQQEKNEQ孤M!LD咖ASIi17GPDRPEGIEEEGGERDRDRSGRLVNGFLALIWVDIiRSLCIjFSYHRLRDIiLliTVTRIVELLGRRGWEVLKYWWNLLOYWSOELKNSAVSIiLNATAIAVAEGTDRIIEALQRTYRAILHIPTRIRQGLERALL磁^錄粉教以黑沐,A'必續表示，/ffi-/凝》/7A，錄'//iW力黑體敦分，.免姿沐勢區被勿A，鍵方'7t^/4KERy廣銀跨凝裙粉賴'"皮義字沐表示。在'邦3/i^l'/冷K變異成五，在—5W泣盜鄉變異成￡￡,議淑餘坊激位點。在C.末4i^力//級。JRFLgp41碰vrg10rncohlwrwgtlilgmlmicsaaravgigawlctlgaagstmgaasmtltvoarlllsgivooonnllraieaoormloltvwgikoloarvlaverylgdoolLGIWGCSGKUCTTAVP麗ASWSNKSLD隨NNMTWMEWEREID證SEIYTLIVFTVLSIVnRVRQGYSPLSFQTLLP/^RGPDRPEC3腿EGGERDRDRSGRLVNGFLALI群DLRSLCLFSYHRLRDLLLTVTR醒1XGRRGWEVLKYWWNLLQYWSQELKNSAVSLLNATAIAVAEGTDRI正ALQRTYRAlLfflPTRIRQGLERALL在—7V術4f^CCW-S廟-導,對#被菊伊歪'/^#^成起始浙成熟,仏^^券溝鍵"黑沐浙7、，遂表示，凝勿f^H,朋義為潔體教分，.免疫汰夷返'議統丈宇體辨7:i^麥示，^^"及丈字，示。JRFLgp41.KKMRVRGIORNCOHLWRWGTLILGMLMICSAARAVGIGAVFLGFLGAAGSTMGAASMTLTVOARLLLSGIVOOONNIXRAIEAOORMLOLTVWGIKOLOARVLAVERYLGDOOLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSNKSLDriwnnmtwmewereid證seiytliEESQNQ鄰KNEQMXELDlCWASLWNWFDITKWLWYIKIFIMrVGGLVGLRLVFTVLSIVNRVRQGYSPLSFQTLLPAPRGPDRPEGffiEEGGERDRDRSGRLVNGFLALIWVDLRSLCLFSYHRLRDLLLTVTmVELLGRRGWEVLKYWWNLLQYWSQELKNSAVSLLNATAIAVAEGTDRUEALQRTYRAILHIPTRIRQGLERALLKK在W.線游COA^#^^凌敲^^#細熟信考。激^^"以潔絲T^續表示,朋-7tt7纖，朋-2為黑沐教分，.免^^T微犬字錄浙7纖菱示'if^餘鍵以及義字録示。在CHIV的多樣性可通過使用共有的(PCT7US2004/030397和US申請第10/572,638號和第11/896,934號)和/或嵌合的(PCT/US2006/032907)基因T細胞和B細胞疫苗設計策略而解決。這些策略的使用可消除HIV的許多進化枝間(inter-clade)和進化枝內(intra-clade)多樣性，并誘導比野生型HIV基因更優越的對HIV-1的交叉進化枝(crossclade)T和B細胞應答(Gaschen等,Science296:2354(2002);Liao等，Virology353:268(2006),Gao等，J.Virol.79:1154(2005)，Weaver等，J.Virol.80:6754(2006))。嵌合基因途徑(Fischer等，NatureMedicine13(1):100-106(2007),Epub2006Dec24;PCT/US2006/032907)使用在計算機芯片.t的進化來設計基因(當被用作免疫原時集中在一起)，提供最佳的T細胞表位覆蓋率，以誘導抗-HIVT細胞應答。因此，本發明的HIV疫苗構建體(construct)的主要部分是共有的eiw基因、gag基因、pol基因、nef基因和tat基因。優選的基因包括來自LosAlamosNationalLaboratoryHIVSequenceDatabase的2003年M組共有基因序列，或者是選自傳染的HIV隔離群數據庫(transmittedHIVisolatedatabase)的較新的共有基因序列，例如在CenterforHIVAIDSVaccineImmunology進化出的共有基因序列。另外，嵌合HIV基因(例如g紹和nef)的使用可被用來擴大T細胞對多個HIV毒株的應答。為誘導中和抗體，Env構建體可以為M組共有基因2001年、CON-S、2003年CON-T或來自傳染的HIV毒株的較新的共有Env，例如gpl60、gpl40C、gpl40CF或gpl40CFI(Liao等，Virology353:268(2006))(gpl40CFI是指這樣的HIV-1包膜設計，其中處理刪除跨膜結構域和胞質域外，切割位點被刪除(C)、融合位點被刪除(F)且gp41免疫優勢區被刪除(I))。或者，2003年Al共有Env、2003CladeC共有Env(表2、3和4)可被用來誘導廣泛有活性的中和抗體(US申請第:10/572,638號)。使用A亞型、B亞型或C亞型共有Env誘導的豚鼠血清的中和滴定量的比較HIV-1隔離群-**>^，鄉.—^Qi^"NBCTmW、豚鼠數目_一_豚鼠數目豚鼠數目，，麵氣..^雄A^鯽4,50%的中和滴定量是在假型HIV-1病毒中和分析中測定的。如果免疫后(post-immune)血清的滴定量》3倍免疫前(pre-immune)血清，并且中和滴定量的值>30,那么中和被認為是陽性的(黑體表示的數字)。糊^,頓M,JP鰳嫌效璣,,鄉縱鑄繊婦iw,饑微鐮讎s^，嚼縱鄉敏,鄉鶴,鳙糟抑a龍，l敏,必,鋤,n級魂都磡鄉9,iisi,I,糖糊腳鄉li置翻,一l降,e癱縱i節l禱逸逸微，l微3fi鯽魂iiiiggi截鼸^J2一蠘鋤l巇i,l蹦,鯛黼敏8狡l，il纖if魏薩sl,纖i钃微，教1驊轆攀蠏s息麴械llii鼸l斑pi纖s微l鶴嚼斜,坊t翻纖|糊驟鯽忽萄鉍垂認|§|5|使用野生型A、B或CEnv誘導的豚鼠血清的中和滴定量的比較,、，贈班~~3zbwc^(A亞型)jrpl(B亞型)_^72w2(c亞型)h^隔,禽群__豚鼠數目-iSi^50X的中和滴定量是在假型HlVd病毒中和分析中測定的。如果免疫后血清的滴定量》3倍免疫前血清，并且中和滴定量的值>30，那么中和被認為是陽性的(黑體表示的數字)。92US715b.柳is7條qmss1sb.蛇，徹鵬必必幼徹gs必必sg必必ssge必0必必必必必必8必必必必必必必必必必必s敏必必6幼旭e必必ss必必ss吣gwm必必必^必必8效8J必必必必必必幼^必g敏必必s微^的必必sg必必^g鄉ss必必幼必必必必s必s必必必必必必必必必g欲^鄉挪g鄉^iwfl認g^必必n必幼必必^^必,f徹必必,鉞^恥n鄉g必必ii8il必必,必^ff,砝；^,§2必|§s站御鵬gs:s必^敏船敏必必:gs必必gs必必gss糊g必sgl鄉g必必鄉鄉必必鄉鄉^鄉柳TI:必ll^必必敏鄉必g^船必必必必必必必f必微aEg…simiisiss必是碧必w羞Ems:卿<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>用來處理HIV-1基因的載體包括用于初免(priming)的DNA(Letvin等，Science312:1530-33(2006))、用于加強(boosting)的重組腺病毒(Barouch等，Nature441:239-43(2006),Letvin等，Science312:1530-33(2006),Thorner等，J.Virol.Epub.2006年10月11日))、重組皰疹性口炎病毒(Publicover等，J.Virol.79:13231-8(2005))和重組分枝桿菌(例如減毒的TB、rBCG或重組恥垢分枝桿菌)(Hovav等，J.Virol"epub"2006年10月18日，Yu等，Clin.Vacc.Immunol.13:1204-11(2006),Derrick等，Immunology,epub.2006年10月31日)。這些載體的任何一個可以初免/加強組合的形式被使用，且免疫的途徑可為全身免疫(例如IM、SC)或黏膜免疫(po、IN、陰道內黏膜免疫、直腸內黏膜免疫)。如以..匕所指出的，本發明的接種方法包括特定的成分，該成分用來克服HIV-1誘導的凋亡和免疫抑制，以消除在黏膜位點的HIV-1傳染后T和B細胞應答的延遲。最近的研究顯示，雖然多個抗體物種出現在急性HIV感染的極早期，但非中和抗-gp41抗體出現得最早，且自體中和抗體在傳染后的兒個月內都不會出現(圖1)(Wei,Nature422:307-12(2003),RichmanProc.Natl.Acad.Sci.USA100:4144-9(2003))。假設在感染SIV的獼猴中，大量的凋亡與感染和血漿病毒量增加同時發生，那么問題是這樣的免疫細胞的大量凋亡是否發生在人類急性HIV感染的最早期。凋亡最通常是通過腫瘤壞死受體家族的成員來介導的，包括Fas(CD95)和Fas配體(CD178)、TNF受體I和II和TNF相關凋亡誘導配體(TRAIL)。Fas和FasL在慢性HIV-1感染中被異常調節(Cossarizza等，AIDS14:346(2000);Westendorp等，Nature375:497(1995);Sloand等，Blood89:1357(1997))。已經在研究確定在急性HIV感染中血漿Fas或FasL是否會升高。已發現，在許多AHI病人體內，血漿FasL的急劇上升與血漿病毒量的上升同時發生(圖2)。另外，在幾個(并非所有)病人體內，血漿Fas也伴隨上升(圖3)。TNFR2水平在慢性HIV中增力Q，且是疾病發展的前兆(Zangerle等，ImmunolLett.41:229(1994))，并且TNFR2在HIV與單核細胞相互作用的早期階段被觸發(triggered)(Rimaniol等，Cytokine9:9-18(1997))。如圖4所示，在伴隨病毒量增加的感染過程期間，在許多AHI病人體內發現了可溶性TNFR2的升高。最后，TRAIL在HIV感染起見介導未受感染T細胞的凋亡(Kasich等,JEM186:1365(1997);Miura等，J.Exp.Med.193:51(2001))。圖5顯示血漿TRAIL水平在AHI病人體內也升高。因此，HIV病毒體和HIV包膜可直接誘導在AHI中的T細胞死亡，可溶性TRAIL可結合至未受感染細胞并誘導在AHI中的死亡，且伴隨細胞的HIV感染和大量凋亡，含高水平的磷脂酰絲氨酸的細胞和類似顆粒大量存在于AHI中。最近研究顯示，PD-1(程序化死亡分子-l)存在于慢性HIV感染中的人類B細胞的表面上。這表明人類B細胞在HIV感染中準備(primed)凋亡。HIV特異性CD8+T細胞PD-1表達與CD8+T細胞對缺乏控制的慢性HIV感染的應答有關(Petrovas等，JEM203:2281(2006))。已經在HIV感染的細胞和病毒體的表面.h發現了磷脂酰絲氨酸(PS)(圖7)，并且Callahan等已發現PS是單核細胞HIV感染的輔因子(Callahan,J.Immunol170:4840(2003))。凋亡細胞的PS依賴性攝取促進TGF-fil分泌(Huynh等，J.Clin.Invest.109:41(2002))，并且PS和PS受體之間的相互作用抑制了體內的抗體應答(Hoffman等，J.Immunol.174:1393(2005))。INF-a(—種抗病毒細胞因子)使淋巴細胞對凋亡敏感(Carrero等，JEM200:535(2004))。在慢性HIV感染中PS+脫落膜顆粒(shedmembraneparticle)增加(Aupeix等，J.Clin.Invest.99:1546(1997))，且凋亡微粒調節巨噬細胞免疫應答(Distler等,Apoptosis10:731(2005))。凋亡微粒完全是促炎的(Distler等，PNAS102:2892(2005))，且促炎細胞因子的誘導激起HIV感染和病毒體產生過程。被氧化的PS-CD36相互作用在凋亡細胞的巨噬細胞依賴性噬菌作用中起著必不可少的作用，且B細胞也表達CD36(Greenberg等，JEM,2006年11月13日,網上出版物)。因此，伴隨急性HIV感染的大量凋亡，以及所引起的TRAIL的釋放、經由FAS-FASL相互作用的凋亡的介導和含PS病毒和其他顆粒的釋放，所有這些共同對宿主進行最初的免疫抑制，防止保護性B細胞的快速應答。本發明包括防止凋亡的策略，其包括但不限于，使用含PS的HIV免疫原，例如PS脂質體，具有或沒有CON-S或CON-Tgpl40或HIVenv表位與脂質體聯合，例如2FR-GTH1肽脂質綴合物(圖8A和8B)，該綴合物與佐劑一起使用以破壞耐受性并誘導抑制PS-CD36相互作用的抗-PS抗體。或者，重組CD36可被靶定以升高抗-CD36抗體，優選地，抗-PS抗體和抗-CD36抗體在黏膜位點被誘導以防止凋亡介導的免疫抑制。可用來防止凋亡的本發明的其他策略包括在HIV疫苗免疫原中的HIVtat基因或蛋白質，以誘導抗tat蛋白抗體，該抗體將抑制tat在免疫細胞中誘導凋亡的能力(Eusoli等，MicrobesInfect.7:1392-9(2005))。可被使用的tat的形式包括101個氨基酸tat蛋白質或編碼該蛋白質的基因(Watkins等，Retrovirology3:1742(2006))。除以上所述之外，在疫苗中還可包括全胱天蛋白酶(pancaspase)抑制劑(例如zVAD-FMK(參見Dean等，CancerTreat.Rev.33:203-212(2007),Meng等，Current.OpinionCellBiol.18:668-676(2006)))，以同時抑制與凋亡有關的任何疫苗或免疫細胞活化，以讓抗體應答快速出現。任何Env相關的免疫抑制都將被克服。全胱天蛋白酶抑制劑也可被用來治療慢性HIV感染。通過使用具有各種TNF抑制劑(例如Etanercept，-一種二聚體人TNFRp75-FC融合蛋白)或具有抗TNFa抗體(例如Infliximab或Adalimumab)(參見"RheumatoidArthritis(風濕性關節炎)",EWSt.Clair、DSPisetsky和BFHaynes著，LippincottWilliams和Wilkins,2004，特別是第31和32章)和Fas-Fas配體相互作用的抑制劑(像Fas-Fc)和TRAIL-DR5相互作用的抑制劑(例如DR5-Fc)(這些可用在一起或單獨使用)的HIV抗原來免疫，也可實現免疫抑制凋亡損失的彌補。這樣的試劑也可被用來治療慢性HIV感染。本發明的多組分疫苗的成分，可與藥學上可接受的載體一起，通過本領域熟知的技術適當地配制。疫苗成分的合適的使用途徑包括全身性的使用(例如，肌肉內或皮下)、黏膜使用或鼻內使用。最適宜的劑量可由本領域的技術人員來確定，且可根據病人和所使用的特定成分的不同而有所改變。本發明的某些方面可在以下非限制性的實施例中被更加詳細地描述。實施例1疫苗成分多組分疫苗的基本成分為1.破壞免疫耐受性的策略；2.克服多樣性并誘導廣泛有活性的中和抗體的免疫原，3.避免與發生在急性HIV感染時的免疫細胞和其他細胞的大量凋亡相關的免疫抑制的策略，4.提供黏膜免疫應答的載體/制劑。本發明的一個實施例為以卜.的多組分免疫原DNA初免包括具有KK胞質域模體(破壞免疫耐受性并處理多樣性和中和抗體應答)的重組CON-S共有gpl60HIVEnv重組體，使用重組水泡性口炎病毒加強，該病毒包括CON-Sgpl40HIVEnv和嵌合gag-nef基因、共有pol基因、tat基因(處理多樣性和黏膜免疫應答)，重組CON-Sgpl40蛋白在"B"或"C"型oCpG和角鯊烯乳液中初免和加強，該乳液與DNA和rVSV免疫(中和抗體應答、破壞免疫耐受性)并結合在DNA質粒中的CD40配體和GITRL(在每個免疫中使用)一起給藥。實施例2非人類靈長類炭疽PA接種模型(獼猴)獼猴TReg細胞衰竭模型已被開發用于測試在TReg瞬時失活對宿主免疫應答(對炭疽保護性抗原(rPA)的免疫應答)的影響。5天內注入ONTAK(15mcg/Kg)到獼猴，顯著降低(pO.05)了CD4十/CD25+細胞在外周血中的比例(在圖IO中紅線和深黑表示)。重要的是，使用抗人CD25單克隆抗體克隆2A3(BDBiosciences)監測NHP(獼猴)CD25。還要注意的是，ONTAK是人IL-2-白喉毒素，眾所周知它能夠消除動物的CD25+細胞。為了檢驗ONTAK可能增強宿主對生物防御性免疫原的免疫反應的假說，對中國獼猴幼猴進行了單獨的保護性抗原(rPA，25pg)免疫或與ONTAK(15mcg/kgIV)連續5天的聯合注入。動物(11=3/組)在免疫后的第-7、5、10、12、19、33、40天被抽血以檢驗CBC/diff、免疫表型、化學組(chemistrypanel)、血漿和血清。圖11顯示的是在免疫組中CD4+/CD25TReg細胞在PB的頻數。ONTAK輸注的猴子的TReg部分(compartment)有明顯下降。TReg部分在注入鹽水和PA+鋁(Alum)免疫的動物組中未受影響。兩種檢測方法用于評估在NHP模型+AONTAK中對PA的初次體液應答的數量和質量。首先，研究了抗原特異性Ig同種型結合，其次，在TNA測定中測定血清中和炭疽毒素(PA+LF)的能力。所使用的PA(25貼+鋁)的劑量誘導抗PA的體液反應始于第19天，如繪制于對數表(圖12)的幾何平均終點滴度所顯示的。可以觀察到，ONTAK適度地改善了在第19天的單次免疫后PA特異性IgG和IgM的終點結合滴定(endpointbindingtiter),但這種區別并未維持到第40天(圖12)。建立了炭疽毒素中和分析(TNA)，以用于分析小鼠和獼猴的血清。待測血清在分析中被連續稀釋。圖13A顯示隨時間變化的最佳稀釋度(1:512)的中和曲線的百分比。圖13B顯示免疫后19、33和40天的實驗組NTs。。相對于單獨的PA+鋁，在免疫后33天的ONTAK的炭疽毒素中和滴度峰值有提高，這提示ONTAK在NHPs中抗PA應答的功能性增強。實施例3在急性HIV-1感染的在病毒量增加時，血漿FAS配體、TNFR2、TRAIL和凋亡微粒的水平被提高實驗細節微陽轉組(HIV-1+/HCV-/HBV-,n=30,HIV-1-/HCV-/HBV+,n=10,和HIV國1隱,HCV+/HCV-,n-10)從ZeptoMetrix公司(Buffalo,NY)獲得。每組由編號的血漿組成(4-30)，每隔3天從血漿供體收集血漿。1^1-/1^^-/1^￥-人血漿(n=25)從InnovativeResearch(Southfield,MI)獲得。所有研究都獲得杜克大學人類學科機構評審委員會的批準。蘇量淑血漿樣本的病毒量測試由QuestDiagnostics(Lyndhurst,NJ)(HIV-1RNAPCRUltra)完成。HCV和HBV的病毒量由Zeptometrix完成；選擇HCV病毒量由PhilipNorris，BloodSystemsResearchInstitute,SanFrancisco,CA提f共。銜亡顏微記激游虹ZS^Fas、Fas配體、TRAIL(Diaclone,BesanconCedex,France)和TNFR2(HycultBiotechnology,Uden，TheNetherlands)的ELISA根據制造商的說明書進行操作。血漿以不稀釋(TRAIL)、以1:10稀釋(TNFR2)或以1:2稀釋(Fas配體)分析鑒定。銜亡微(MV游量眾每個血漿樣本的MP數量采用流式細胞儀確定。所有的流式細胞術分析在LSRIIFlowCytometer(BDBiosciences,SanJose,CA)上進行，數據分析采用FlowJo(Ashland,OR)軟件進行。在MP實驗使用之前，所有的緩沖液(不含轉和鎂的PBS)(Cellgro,Herndon,VA)和甲醛(Sigma，St.Louis，MO)通過0.22過濾器(Millipore,Billerica,MA)過濾。用以稀釋血漿樣本(1%甲醛在不含鈣和鎂的PBS)的緩沖液被用來確定背景MP計數(在流式細胞儀上，60秒內計數約1500個事件)。為確定MP門(gate),在流式細胞儀上分析了大小從0.1到1|im的FluoSpheres熒光微球(MolecularProbes,Eugene,OR)。MP門圍在珠粒周圍，包括0.1pm、0.2pm、0.5和1.0的珠粒。每個血漿樣本采用1%甲醛/PBS緩沖液以1:100和h1000稀釋，數據在60秒內獲得。最佳的樣本稀釋度通過實驗獲得，可接受的標準為稀釋的血漿中斷計數<5%，噪信比O.l(噪信比-在PBS/實驗血漿MP計數中的背景MP計數)(圖14和15)。微表微析血漿樣本(2ml)稀釋于5ml的已過濾鹽水，然后被過濾通過5pm過濾器(PallCorporation,EastHills,NY)。稀釋后的樣本進行離心(1小時，200000Xg，4°C)(SorvallRCM150GX,ThermoFisherScientific,Waltham，MA)。移去頂部的2.5ml上清液，加入2.5ml的新鮮的鹽水，然后離心1小時(200000Xg)。沉淀物在lml的過濾鹽水中洗2遍，在清洗畢后，移去90(^1的上清液，沉淀物在剩余的200pl的鹽水中重懸。10的MP懸浮液與抗體和/或膜聯蛋白V—起孵育(總體積100nl，20分鐘，20°C，避光)。含1。/。BSA(Sigma)的鹽水作為染色緩沖液與抗體一起孵育，加入2.5mMCaCl2到緩沖液中以進行膜聯蛋白V染色。作為膜聯蛋白V的對照，50mMEDTA被加入到緩沖液中，孵育20分鐘，用鹽水/甲醛將體積調至500nl，用流式細胞儀在24小時內分析。結合的抗體包括鼠抗人CD45-PE、CD3-PE、CD4-PE、CD6a、CD63、CCR5-PE、CD14-PE、CD19-PE和同種型對照(BDBiosciences,SanJose,CA)和膜聯蛋白V結合AlexaFluor647(MolecularProbes,Eugene,OR)。賄微糊德藩8mL的血漿以l:5稀釋于過濾后的鹽水和MP沉淀(l小時，200000Xg，4°C)中。洗沉淀(1小時，200000Xg，4°C)。在lmL鹽水中重懸沉淀，清洗兩遍(100000Xg，30分鐘)。用500pl鹽水重懸MP沉淀，加入lmL4()n/。蔗糖溶液，然后MP離心(100000Xg，90分鐘)。固定沉淀(1%甲醛，《C過夜)，沉淀(100000Xg，60分鐘)，浸泡在1%四氧化鋨中IO分鐘，用鹽水沖洗。沉淀用瓊脂固定，樹脂包埋，6(TC烘烤過夜。超薄切片，染色，用PhilipsCM12透射電鏡檢測。統#藩為了在所有的血清轉換板中建立一個參考點(referencepoint),第"0"天被定義為HIV-1病毒量達到100拷貝數/ml，HCV病毒量達到600拷貝數/ml，HBV病毒量達到700拷貝數/ml的那天。為確定在HIV-1、HBV和HCV感染中細胞凋亡的血漿標志物增加的百分比，將TRAIL、TNFR2或Fas配體在第0天前的均值水平與第0天后的均值水平進行比較，并計算增加的百分比，([(第0天后均值-第0天前均值)/第0天后均值]x脂)。為對比感染中的細胞凋亡的血漿標志物，在陽轉組的第一個樣本中，未感染供體中的TRAIL、TNFR2或Fas配體的均值水平，和病毒量峰值時的均值水平與在HIV-1感染者和HBV、HCV感染者中進行了比較(數據未顯示)。每組數據以方框圖分析顯示。簡言之，對于三組的分析，計算了最大值、最小值、平均值和第一、第三的四分位數(被方框包圍)。異常值(1.5X第三的四分位數與第一的四分位數之差)被剔除。采用Students't檢驗，每組的均值都進行了計算，也計算了P值。為分析在HIV-1感染過程中細胞凋亡的血漿標志物的出現時間，韻律學(metrics)被用來確定病毒擴張速度。韻律學包括最大病毒擴張速度、(rQ)和每個細胞凋亡的血漿標志物峰值的日期。這些分析中，總共30個受試者，其中有6個因為相關病毒量數據太少不能滿足韻律學可信的需要而被排除。病毒擴張速度ro通過病毒增長的兩個最快增殖點確定。為了確定病毒量和分析韻律學的時間關系，每對數據都進行WilcoxonRankSumTest。每個檢測對比最大病毒擴張速度的日期和韻律學峰值的日期。為優化已有的流式細胞術流程以研究微粒，我們進行了各種實驗。首先，采用LSRII分析梯度稀釋的聚苯乙烯微球以確定可以接受的信噪比和中止計數(圖14)。通過實驗還確定了細胞外標志物，例如CD3、CD45、血小板標志物CD61和膜聯蛋白V的表達水平比一個凍融周期明顯下降，顯示樣本完整的重要性。潛菜在倉絲/f/K/感燊^在瘋毒量J:;^y^或J:評好，犬多教瘋乂游77^/丄、7M^2浙E4S忠沐游/7t乎教J:^7。為對比病毒的動力學，也為了確定血漿供體病人之間的細胞凋亡的血漿標志物和微粒水平的時序，針對30例HIV-1病人、10例HCV病人和10例HBV病人中的每一個，確定了一個普遍的時間點(第0天)。第"0"天定義為病人的HIV-1病毒量達到100拷貝/ml，HCV病毒量達到600拷貝/ml，HBV病毒量達到700拷貝/ml水平，這些水平是由每個病毒量測定的檢測極限限制的。接下來，為確定細胞凋亡的血槳標志物的變化是否能夠在急性HIV-1感染過程的早期被檢測，在每個血漿供體成為HIV-1病毒量陽性時所有的血漿樣本進行了可溶性TRAIL、TNFR2和Fas配體的水平檢測，這些水平與HCV、HBV早期感染的水平進行了對比(圖17)。可溶性TRAIL、TNFR2和Fas配體的水平改變的百分比由第0天前的分析物水平均值對比第0天后的分析物水平均值得到。急性HIV-1感染受試者中，27/30顯示了TRAIL超過20%的增量，26/30顯示了TNFR2的增加，23/30提高了Fas配體的水平(圖17B)。比較可知，HCV+和HBV+感染受試者顯示了>20%的增長在TRAIL,TNFR2或Fas配體僅有0/10，3/10,2/10(在HBV),特別在(HCV)僅有1/10,6/10和7/10受試者(圖17C)。方框圖分析用于確定分析物水平在病毒量峰值時與病人進入病毒量增長前抽取的樣本是否具有顯著差異。在病毒量峰值時的TRAIL,TNFR2和Fas配體水平，相對于從每個急性HIV-1感染病人第0天前抽取的最早的血漿樣本，具有顯著的差異(對于TRAILp<0.01,對于TNRF2p<0.001，對于Fas配體p<0.001)(圖18A)。在峰值時的TRAIL,TNFR2和Fas配體水平，也與非感染血漿樣本對照組的TRAIL,TNFR2和Fas配體水平具有顯著差異(分別為pO.001,pO.001和pO.OOl，)(圖18A)。為研究TRAIL,TNFR2和Fas配體的峰值水平與峰值病毒量的時間關系，分析了細胞凋亡分析物峰值的出現與病毒量峰值的關系，受試者的數字顯示在血漿細胞凋亡分析物出現在HIV-1病毒量峰值之前、同步、之后的情況(表5)。大部分急性HIV-1感染受試者(30/30對于TRAIL,27/30對于TNFR2，和26/30對于Fas配體)，顯示峰值分析物水平出現在一個30天的時間框架內(例如，在病毒量峰值出現的15天前，在時間點上，15天后X表5)。大多數受試者的TRAIL水平(21/30)在病毒量峰值之前出現峰值，而TNFR2和Fas配體水平則更經常與病毒量的峰值同步(表5)。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>在30例急性HIV-1感染病人的研究中，大多數顯示了TRAIL,TNFR2和Fas配體的峰值水平接近(在15天內)病毒量峰值。進一步地，大多數病人顯示TRAIL水平峰值在病毒量峰值之前，TNFR2和Fas配體水平峰值與病毒量的峰值同步。在10例HCV和10例HBV的受試者研究中也有相同的結果。為從統計學上分析分析物水平峰值與病毒動力學的時間關系，進行了成對Wilcoxon秩和檢驗。重要的p值顯示分析物水平峰值的平均日期與病毒增殖峰值(r。)的平均日期有顯著差異。病毒擴張速度峰值顯示病毒在最大速率復制的日期(平均5.5天)。需要注意的是，r。是不同于Ro的，Ro是繁殖率。重要的一點是，TRAIL水平峰值在病毒量峰值之前或1.7天后出現，TNFR2水平峰值在病毒量峰值之后7.5天出現，Fas配體水平峰值與ro的9.8天后出現。相同血清轉換板的分析揭示病毒量平均在第0天后的13.9天(中值13天，四分位數間距3天)達到最大水平，說明TRAIL水平峰值在病毒量峰值之前出現，而TNFR2和Fas配體達到峰值水平的時間與最大病毒量的時間非常接近。息微糊定量流式潘應術分析因為血漿板沒有可用的共同外周血單核細胞樣本，血漿板對從10nM到l.OnM大小的血漿微粒的相關水平進行了分析，免疫細胞的出現和外來標志物也在MP中確定。流式細胞術用于確定MP的相關水平，比較每個個體的初期與潛伏期的血漿樣本(圖19)。為使血漿MP可視化，結合了梯度蔗糖的MP進行了透視電鏡分析。采用上述的方法確定出現在血清轉換板的每個樣本的MP相關數字(圖14)。大部分急性HIV-1感染受試者顯示MP數值峰值接近(在0天的15天前或15天后)病毒量的峰值。在30個HIV-1血清轉換板的研究中，18個微粒數值的峰值接近病毒量的峰值，這18個中的11個峰值即刻發生在病毒量峰值之前(表6)。作為對照，HCV和HBV血清轉換板也進行了相同的分析以表示微粒數，未觀察到MP峰值。表6HIV-1HCVHBVMP峰值水平在VL峰值的30天內(+/-15)18/305/105/10MP峰值水平在VL峰值之前11/182/55/5MP峰值水平與VL峰值同步4/182/50/5MP峰值水平在VL峰值之后3/181/50/5在30例急性HIV-1感染病人的研究中，大部分顯示了MP峰值接近(在15天內)病毒量峰值，大部分病人顯示了MP峰值發生在病毒量峰值之前。逾炎微游表娜微藩圖20是血漿MP伴隨結合蔗糖梯度的透視電子顯微圖。通過引用將以上引用的所有文獻和其他信息源以整體形式合并到本文中。3權利要求1、一種在哺乳動物體內誘導產生抗HIV-1的免疫反應的方法，該方法包括向所述哺乳動物施用i)集中的HIV-1基因序列，ii)破壞哺乳動物免疫耐受性的試劑，和iii)抑制HIV-1誘導的凋亡或HIV-1誘導的凋亡的免疫抑制效果的試劑，其中以足夠產生所述免疫反應的量施用i)、ii)和iii)。2、根據權利要求1所述的方法，其中所述集中的HIV-1基因序列為共有的或嵌合的HIV-1基因序列。3、根據權利要求2所述的方法，其中所述集中的HIV-1基因序列存在于載體中。4、根據權利要求3所述的方法，其中所述載體為病毒載體。5、根據權利要求4所述的方法，其中所述病毒載體為重組腺病毒載體或重組水泡性口炎病毒載體。6、根據權利要求3所述的方法，其中所述載體為重組分枝桿菌載體。7、根據權利要求6所述的方法，其中所述重組分枝桿菌載體為減毒的TB、rBCG或重組恥垢分枝桿菌。8、根據權利要求2所述的方法，其中所述集中的HIV-1基因序列為共有HIV-1基因序列。9、根據權利要求8所述的方法，其中所述共有:HIV-1基因序列為共有HIV-1env、gag、pol、nef或tat基因序;歹!j。10、根據權利要求9所述的方法，其中所述的同源的HIV-1基因序列為同源的HIV-1env基因序列。11、根據權利要求10所述的方法，其中所述的同源的HIV-1基因序列為同源的HIV-lgpl60基因序列。12、根據權利要求2所述的方法，其中所述的集中HIV-1基因的序列為嵌合體的HIV-1基因序列。13、根據權利要求12所述的方法，其中所述的嵌合體的HIV-1基因序列為嵌合體的HIV-1gag或nef基因序列。14、根據權利要求1所述的方法，其中所述的集中HIV-1基因的序列包括編碼細胞質結構域內質網滯留信號的序列。15、根據權利要求14所述的方法，其中所述的編碼細胞質結構域內質網滯留信號的序列包括賴氨酸-賴氨酸結構。16、根據權利要求1所述的方法，其中所述的打破哺乳動物免疫耐受的藥劑為調節性T細胞抑制劑或TLR-9激動劑。17、根據權利要求1所述的方法，其中所述的打破哺乳動物免疫耐受的藥劑包括寡聚CpGs。18、根據權利要求17所述的方法，其中所述的寡聚CpGs處于油基佐劑中。19、根據權利要求17所述的方法，其中所述的寡聚CpGs為一種B型的寡聚CpGs。20、根據權利要求16所述的方法，其中所述的打破哺乳動物免疫耐受的藥劑為調節性T細胞抑制劑。21、根據權利要求20所述的方法，其中所述的調節性T細胞抑制劑包括糖皮質激素誘導的TNF家族相關受體的配體(GITRL)編碼序列、抗CD25抗體或ONTAKo22、根據權利要求1所述的方法，其中所述的抑制HIV-1誘導的細胞凋亡的藥劑誘導產生抗磷脂酰絲氨酸(PS)抗體、抗CD36抗體或抗HIVtat抗體。23、根據權利要求22所述的方法，其中所述的抑制HIV-1誘導的細胞凋亡的藥劑誘導產生抗磷脂酰絲氨酸抗體，并包括磷脂酰絲氨酸脂質體。24、根據權利要求23所述的方法，其中所述的磷脂酰絲氨酸脂質體包括一種HIV免疫原。25、根據權利要求24所述的方法，其中所述的磷脂酰絲氨酸脂質體包括HIVenv表位。26、根據權利要求24所述的方法，其中所述的HIV免疫原包括2F5-GTH1肽脂質結合物。27、根據權利要求23所述的方法，其中所述的磷脂酰絲氨酸脂質體包括CON-S。28、根據權利要求22所述的方法，其中所述的抑制HIV-1誘導的細胞凋亡的藥劑誘導產生抗磷脂酰絲氨酸(PS)抗體，所述的抗磷脂酰絲氨酸(PS)抗體抑制磷脂酰絲氨酸-CD36的相互作用。29、根據權利要求22所述的方法，其中所述的抑制HIV-1誘導的細胞凋亡的藥劑誘導產生抗CD36抗體。30、根據權利要求22所述的方法，其中所述的抑制HIV-1誘導的細胞凋亡的藥劑在所述的哺乳動物的粘膜部位上誘導產生抗磷脂酰絲氨酸(PS)抗體、抗CD36抗體。31、根據權利要求22所述的方法，其中所述的抑制HIV-1誘導的細胞凋亡的藥劑誘導產生抗HIVtat抗體。32、根據權利要求1所述的方法，其中所述的4中對HIV-1誘導的細胞凋亡有免疫抑制效果的藥劑被用于給藥。33、根據權利要求32所述的方法，其中所述的一種對H1V-1誘導的細胞凋亡有免疫抑制效果的藥劑包括一種TNF抑制劑。34、根據權利要求33所述的方法，其中所述的TNF抑制劑包括-一種單克隆抗體，所述的單克隆抗體抗TNF受體、Fas-Fas配體相互作用的抑制劑或TRAEL-DR5相互作用的抑制劑。35、根據權利要求1所述的方法，其中所述的方法進一步包括向所述的哺乳動物給予足夠劑量的pancaspase抑制劑以抑制HIV-1誘導細胞凋亡的免疫細胞的活性。36、根據權利要求1所述的方法，其中所述的哺乳動物為人類。37、一種組合物，包括一個集中HIV-1基因的序列，一種打破哺乳動物免疫耐受的藥劑，和一種抑制HIV-1誘導的細胞凋亡或者對HIV-l誘導的細胞凋亡有免疫抑制效果的藥劑。全文摘要本發明總體涉及人類免疫缺陷病毒(HIV)，特別涉及多組分疫苗以及利用該疫苗保護不受HIV-1感染的方法。文檔編號A61K39/00GK101600453SQ200780042673公開日2009年12月9日申請日期2007年11月19日優先權日2006年11月17日發明者華鑫·遼,南希·G·斯密斯,峰·高,巴頓·F·海恩斯,米尼亞·S·阿拉姆申請人:杜克大學