長效藥物制劑的制作方法

專利名稱：：長效藥物制劑的制作方法長效藥物制劑發明領域本發明涉及長效治療制劑及其使用方法，所述制劑包含含有載體的經遺傳修飾的微器官，所述載體包含與一個或多個調節序列可操作地連接的編碼治療性多肽如紅細胞生成素或干擾素a的核酸序列。
背景技術：
：治療劑可以口服、經皮、通過吸入、通過注射或通過緩釋貯庫遞送。然而，遞送方法受限于藥劑在接受者中經歷的過程、頻繁給藥的需要和對可用分子尺寸的限制。對于一些方法，治療劑的量在給藥間變化。涉及將期望的核酸序列/片段亞克隆到載體中(所述載體隨后用于修飾特定宿主細胞，所述宿主細胞應產生所需的蛋白質以用于進一步純化步驟)的蛋白質生成技術在表達的蛋白質的量、蛋白質分泌、翻譯后修飾(例如糖基化和蛋白質的精確折疊)等方面受到限制。而且，即使能夠獲得高水平的蛋白質生成，之后也必須產生大量的重組蛋白并純化至不含污染物。純化路線的開發是非常漫長的過程。而且一旦獲得純化的重組蛋白，就必須進行進一步配制以使其穩定和可接受地引入動物或人類中。此外，即使經配制，純化的重組蛋白仍然由于保持和儲存限制而具有有限的貯存期限；因此經常需要反復純化和配制更多的蛋白質。開發適當制劑的過程也是耗時、困難和昂貴的。因此，廣泛認識到需要長效的基于蛋白質的治療分子，其具有必需的翻譯后修飾以保留它們的生物活性，其可被便宜且快速地制備，而不需要通常與獲得高水平重組蛋白相關的辛苦且昂貴的方法。一些研究者已試圖通過基因治療獲得重組基因產物的體內表達。通常將病毒載體用于體內轉導細胞以表達重組基因產物。這些基于病毒的載體具有有益的特性，例如感染靶組織的天然能力。然而，基于逆轉錄病毒的載體需要在耙組織的基因組內整合以允許重組產物表達(具有激活固有癌基因的潛能)并且只能用于轉導活躍分裂的組織。病毒載體通常也不能經受長期轉基因表達，這可能至少部分是由于它們因再次宿主免疫應答而被消除。因此，本領域仍然需要具有持續幾周或更長時間的一貫高表達水平的重組基因產物制劑和使用那些制劑來治療疾病的方法。發明概述在一個實施方案中，本發明提供包含經遺傳修飾的微器官的長效治療制劑，所述微器官包含含有與一個或多個調節序列可操作地連接的核酸序列的載體，其中所述核酸序列編碼治療性多肽，從而所述制劑將所述治療性多肽的表達水平比基礎水平提高超過5%，且所述提高維持超過一個月。在一個實施方案中，所述載體是輔助病毒依賴型腺病毒載體(helper-dependentadenovirusvector)。在一個實施方案中，所述治療性多肽是紅細胞生成素，而在另一實施方案中，所述治療性多肽是干擾素a，在一個實施方案中所述干擾素a為干擾素a2b。在另一實施方案中，本發明提供在持續的時間內向有需要的個體提供治療性多肽的方法，所述方法包括提供一個或多個遺傳修飾的微器官，所述微器官包含含有與一個或多個調節序列可操作地連接的核酸序列的載體；并將所述經遺傳修飾的微器官植入所述個體中，其中所述核酸序列編碼治療性多肽，從而所述制劑將所述治療性多肽的表達水平比基礎水平提高超過5%，并將所述提高維持超過一個月。在一個實施方案中，所述載體是輔助病毒依賴型腺病毒載體。在一個實施方案中，所述治療性多肽是紅細胞生成素，而在另一實施方案中，所述治療性多肽是干擾素(X，在一個實施方案中所述干擾素a為干擾素a2b。在另一實施方案中，有需要的個體患有貧血。在另一實施方案中，有需要的個體患有感染。在另一實施方案中，有需要的個體患有癌癥。在另一實施方案中，本發明提供與SEQIDNo:1的同源性超過85%的核酸序列、包含這樣的核酸序列的載體、以及包含這樣的載體的細胞。在另一實施方案中，本發明提供與SEQIDNo:2的同源性超過85%的核酸序列、包含這樣的核酸序列的載體、以及包含這樣的載體的細胞。圖l顯示由本發明的制劑體外產生的重組優化的人干擾素a(IFNoc)的水平。圖2顯示由本發明的制劑體外產生的重組人紅細胞生成素(hEPO)的水平。HD-Ad-CAG-wt-hEPOGMMO滴定法(A)。以HD-Ad-CAG-wt-hEPO病毒1:25;1:100和1:1000稀釋度的漸增稀釋度轉導微器官。將Ad5/CMV/wt-hEPO稀釋成1:10和1:50的工作濃度。由兩種不同皮膚H-l和H-2產生的GMMO之間的比較(B)。以HD-Ad-CAG-wt-hEPO1:25轉導微器官。條形指示通過ELISA測量的在每3-4天收集和替換的培養基中的hEPO濃度。圖3顯示得自包含表達EPO的無腸腺病毒的優化制劑和包含表達EPO的腺病毒-5的微器官的峰值體外紅細胞生成素(EPO)表達水平的百分數。用HD-Ad-CAG-hEPO以1:25或用Ad5/CMV/hEPO以1:10轉導微器官。圖4顯示得自包含優化的和非優化的表達EPO的無腸腺病毒的制劑的體外紅細胞生成素(EPO)表達水平。以1:100病毒顆粒的工作稀釋度轉導微器官。條形指示通過ELISA測量的在每3-4天收集和替換的培養基中的hEPO濃度。圖5顯示得自包含CAG或CMV啟動子下游的表達EPO的無腸腺病毒的制劑的體外紅細胞生成素(EPO)表達水平。圖6顯示由本發明的制劑在SCID小鼠體內(A)和體外(B)產生的重組人紅細胞生成素的水平和血細胞比容的相關變化(A)。用GMMO對十只小鼠/組進行皮下植入。顯示在用腺病毒-hEPO、輔助病毒依賴型腺病毒-hEPO和輔助病毒依賴型腺病毒-優化hEPO轉導的GMMO和用非轉導的GMMO植入的小鼠血清中測量的hEPO水平(mU/ml)和相應的血細胞比容。/。。每10天進行抽血(A)。通過離心法測量血細胞比容并通過hEPOELISA試劑盒測量血液中的血清hEPO水平。將未植入的GMMO保留在培養基中并測量EPO的水平(B)。發明詳述在一些實施方案中，本發明涉及長效治療制劑及其使用方法，所述制劑包含含有載體的經遺傳修飾、基于組織的微器官，所述載體包含與一個或多個調節序列可操作地連接的編碼治療性多肽如紅細胞生成素或干擾素a的核酸序列。在一個實施方案中，本發明提供包含經遺傳修飾的微器官的長效治療制劑，所述微器官包含含有與一個或多個調節序列可操作地連接的核酸序列的載體，其中所述核酸序列編碼治療性多肽，從而所述治療性多肽的表達水平比基礎水平提高超過5%，且所述提高維持超過一個月。在另一實施方案中，所述治療性多肽的表達水平比基礎水平提高超過5%，且所述提高維持超過六個月。在另一實施方案中，本發明提供包含經遺傳修飾的微器官的長效治療制劑，所述微器官包含含有與一個或多個調節序列可操作地連接的核酸序列的載體，其中所述核酸序列編碼治療性多肽，從而所述治療性多肽的表達水平比基礎水平提高超過5%，所述提高維持超過一個月，且其中所述載體是輔助病毒依賴型腺病毒載體。在另一實施方案中，本發明提供包含經遺傳修飾的微器官的長效治療制劑，所述微器官包含含有與一個或多個調節序列可操作地連接的核酸序列的載體，其中所述核酸序列編碼治療性多肽，從而所述治療性多肽的表達水平比基礎水平提高超過5%，且所述提高在免疫活性宿主中維持超過一個月。在另一實施方案中，本發明提供包含經遺傳修飾的微器官的長效治療制抓所述微器官包含含有與一個或多個調節序列可操作地連接的核酸序列的載體，從而所述治療性核酸的表達水平比基礎水平提高超過5%。在一個實施方案中，所述治療性核酸在免疫活性宿主中的表達水平比基礎水平提高超過5%，而在另一實施方案中，所述載體是輔助病毒依賴型腺病毒載體。在一個實施方案中，本發明提供長效治療制劑及其使用方法，其中所述制劑包含經遺傳修飾的微器官。在一個實施方案中，用于本文的術語"微器官"在一個實施方案中指源自外植塊或與外植塊相同的分離的組織或器官結構，所述外植塊通過有益于細胞生存和功能的方式制得。在一個實施方案中，微器官保持至少一些與獲得它的組織或器官相似的體內結構，或者在另一實施方案中保持至少一些與獲得它的組織或器官相似的體內相互作用。在另一實施方案中，微器官保留它們的來源組織或器官的微結構和三維結構并具有選定的維度，以允許充足的養分和氣體被動擴散到微器官的細胞內，使細胞廢物擴散到微器官的細胞外，從而使由不足的營養和/或廢物的蓄積所致的細胞毒性和伴隨的細胞死亡最小化。在一個實施方案中，微器官是一條真皮組織。在一個實施方案中，微器官的直徑為1-2mm，長度為30-40mm。在另一實施方案中，微器官的直徑可為例如1-3mm、l-4mm、2-4mm、0.5-3.5mm或1.5-10mm。在另一實施方案中，微器官的直徑可為例如大約2mm或大約1.5mm。在另一實施方案中，所述微器官的長度可為5-100mm、10-60mm、20-60mm、20-50mm、20-40mm、20-100mm、30-100mm、40-100mm、50-100mm、60-100mm、70-100mm、80-100mm或90-100mm。在另一實施方案中，所述微器官的長度可為大約20mm、大約30mm、大約40mm或大約50mm。在一個實施方案中，微器官小于1.5cm2，且在另一實施方案中小于lcm2。在另一實施方案中，所述直徑小于1.5cm，且在另一實施方案中，所述長度小于1.5cm。在一個實施方案中，微器官是外植塊。在一個實施方案中，微器官源自組織。在另一實施方案中，微器官是組織的切片或部件或部分。在另一實施方案中，微器官是器官的切片或部件或部分。微器官可以不同于皮移植物，在一個實施方案中，不同之處在于微器官被特別設計成在體內和體外長時間存活，在另一實施方案中，不同之處在于微器官的維度是特定選擇的，以允許充足的養分和氣體被動擴散到微器官的細胞內并使細胞廢物擴散到所述微器官的細胞外，在一個實施方案中使由不足的營養和減廢物的蓄積所致的細胞毒性和伴隨的細胞死亡最小化。因此，在一個實施方案中，微器官不是皮移植物。在另一實施方案中，微器官可以不同于離體細胞的集合，在一個實施方案中，所述離體細胞的集合生長在天然或人造支架上，不同之處在于微器官保持著它們的來源組織或器官的微結構和三維結構。因此，在一個實施方案中，微器官不是支架上生長的一種或多種細胞類型。微器官的詳細描述可以在US-2003-0152562中找到，該文獻全文納入本文作為參考。較早的專利(WO03/006669、WO03/03585、WO04/0993631，它們被納入本文作為參考)描述了微器官，它們可以被修飾以表達相關的基因產物，所述微器官可按自主功能態在機體外維持延長的時間段，然后可以被植入皮下或所述機體內的其他位置以治療疾病或病癥。然而，本發明的微器官意外地顯示出相關基因產物在體外和體內的長得多的表達特征。用于本文時，術語"外植塊"在一個實施方案中指從其在生物中的天然生長位點中取出并在培養基中放置一段時間的組織或器官或其部件。在一個實施方案中，所述組織或器官是有活力的，在另一實施方案中是代謝活性的或它們的組合。用于本文時，術語"微結構"在一個實施方案中指外植塊的特性，其中組織外植塊的一些或所有細胞和它們在體內處于物理和/或功能性接觸的至少一種細胞或非細胞物質保持物理和/或功能性體外接觸。在另一實施方案中，微器官外植塊保持它們的來源組織或器官的三維結構。在一個實施方案中，微器官外植塊保留它們的來源組織的空間相互作用如細胞-細胞、細胞-基質和細胞-間質相互作用，并保留所述組織的取向。在一個實施方案中，如上所述的空間相互作用的保持允許外植塊生物學功能的維持，例如自分泌和旁分泌因子和其他胞外刺激物的分泌，它們在一個實施方案中為外植塊提供長期存活力。在一個實施方案中，所述微器官外植塊的至少一些細胞與它們在體內與之處于物理和/或功能性接觸的至少一種細胞或非細胞物質在體外保持它們的物理和/或功能性接觸。在一個實施方案中，一些細胞指細胞總體的至少約50%，在另一實施方案中指至少約60%,在另一實施方案中指至少約70%,在另一實施方案中指至少約80%,在另一實施方案中指至少約90%或更多。在另一實施方案中，所述外植塊的細胞保持著它們從中分離的器官或組織的至少一種生物學活性。在一些實施方案中，本發明的任何制劑會包含本文所述的任何形式或實施方案的經遺傳修飾的微器官。在一些實施方案中，本發明的任何制劑會由本文所述的任何形式或實施方案的經遺傳修飾的微器官組成。在一些實施方案中，本發明的任何組合物會主要由本文所述的任何形式或實施方案的經遺傳修飾的微器官組成。在一些實施方案中，術語"包含"指包括提到的活性劑如經遺傳修飾的微器官，以及包括制藥工業已知的其他活性劑和藥學可接受的運載體(cairier)、賦形劑、潤濕劑、穩定劑等。在一些實施方案中，術語"主要由……組成"指組合物的僅有活性成分是提到的活性成分，然而，可以包括其他化合物來使所述制劑穩定、防腐等，但其他化合物不直接涉及提到的活性成分的治療效果。在一些實施方案中，術語"主要由……組成"可指促進活性成分釋放的組分。在一些實施方案中，術語"由……組成"指包含活性成分和藥學可接受的運載體或賦形劑的組合物。類似地，在一些實施方案中，本發明和用于本發明方法中的載體包括與一個或多個調節序列可操作地連接的核酸序列，其中所述核酸序列編碼治療性多肽。在另一實施方案中，所述載體主要由這樣的核酸序列組成，且在另一實施方案中，所述載體由這樣的核酸序列組成。可以從中分離微器官的哺乳動物的實例包括人類和其他靈長類、豬如完全或部分近親繁殖的豬(例如雛型豬和轉基因豬)、嚙齒動物等。微器官可以由許多器官的組織加工而得，在一個實施方案中所述器官為皮膚、真皮、淋巴系統、胰腺、肝、膽囊、腎、消化道、呼吸道、生殖系統、尿道、血液、膀胱、角膜、前列腺、骨髓、胸腺、脾或它們的組合。來自這些器官的外植塊可以包括朗氏細胞島、毛囊、腺體、上皮和結締組織細胞或者其微結構排列與從中獲得外植塊的器官的微結構排列相似的組合。在一個實施方案中，可以使用本領域已知的材料、儀器和/或方法在微器官中辨別或識別從中獲得外植塊的器官的微結構。在一個實施方案中，本發明提供包含經遺傳修飾的微器官的制劑及其使用方法。在一個實施方案中，術語"經遺傳修飾的微器官"或"GMMO"指表達至少一種重組基因產物的微器官。在其他實施方案中，提到微器官不一定指未經遺傳修飾的微器官，但在一些情況下也可以指經遺傳修飾的微器官，正如本領域技術人員會由上下文清楚這一點。在一個實施方案中，短語"基因產物"指蛋白質、多肽、肽和功能性RNA分子。在一個實施方案中，由所述核酸分子編碼的基因產物是要應用于個體的所需基因產物。這樣的基因產物的實例包括通常由接收個體的細胞產生的蛋白質、肽、糖蛋白和脂蛋白。在一個實施方案中，所述基因產物并非天然存在于從中收集微器官的生物中和/或存在于植入GMMO的生物中，而在另一實施方案中，所述基因產物是天然存在的。在一個實施方案中，所述GMMO的基因產物與由微器官的一個或多個細胞內源性表達的基因產物相似或相同。在一個實施方案中，遺傳修飾提高非遺傳修飾的微器官會產生的基因產物的水平。在另一實施方案中，由GMMO表達的基因產物與由微器官的一個或多個細胞內源性表達的基因18產物不相似或相同。在另一實施方案中，由所述核酸分子編碼的基因產物編碼直接或間接地控制相關基因表達的分子。在另一實施方案中，由所述核酸分子編碼的基因產物上調或下調要應用于個體的所需基因產物的表達水平。在另一實施方案中，微器官的遺傳修飾可以修改內源基因的表達。這可以通過例如引入增強子、或用于控制內源基因表達的可抑制或可誘導的調控元件來實現。本領域已知的任何方法學均可用于遺傳改變所述微器官外植塊。可以使用本領域己知的許多不同載體中的任何一種，例如病毒載體、質粒載體、線狀DNA等，來將編碼治療劑的外源性核酸片段引入靶細胞和/或組織內。可以使用例如感染、轉導、轉染、磷酸鈣介導的轉染、DEAE-右旋糖介導的轉染、電穿孔、脂質體介導的轉染、遺傳轉化(biolistic)基因遞送、使用成融和陰離子型脂質體的脂質體基因遞送(這是使用陽離子型脂質體的替代方法)、直接注射、受體介導的攝取、磁穿孔(magnetoporation)、超聲或它們的任何組合，以及本領域已知的其他技術插入這些載體(關于進一步的細節，參見例如"MethodsinEnzymology，，Vol.1-317，AcademicPress,CurrentProtocolsinMolecularBiology,AusubelF.M.等人(eds.)GreenePublishingAssociates,(1989)禾口MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版,Sambrook等人ColdSpringHarborLaboratoryPress,(1989)，或其他標準實驗室手冊)。有關的多核苷酸片段編碼序列可以被捆綁到適合轉導哺乳動物細胞和適合指導重組產物在轉導細胞內表達的表達載體系統中。通過將載體引入微器官附近來實現外源性核酸片段的引入。一旦已經使用上文所述或本領域己知的任何技術將外源性核酸片段引入細胞內，將可以定量由核酸片段編碼的治療劑的產量和域分泌速率。在一個實施方案中，術語"外源性"指源自外部的物質，例如源自細胞或組織外部的核酸。在一個實施方案中，本發明制劑和方法中的微器官包含載體，在一個實施方案中所述載體促進重組基因表達。在一個實施方案中，所述載體是非免疫原性基因轉移劑如非病毒載體(例如DNA質粒或小環DNA)、"無腸"病毒載體，即沒有內源基因(其在一個實施方案中是由于缺失，而在另一實施方案中是由于在阻止基因表達的基因中的插入、取代或缺失)、輔助病毒依賴型腺病毒(HDAd)載體或腺伴隨病毒AAV(在一個實施方案中為單鏈，在另一實施方案中為雙鏈)。在另一實施方案中，選擇所述制劑，使得重組基因表達導致缺少由微器官的基因產物引起的毒性或免疫介導的排斥。在一個實施方案中，所述載體是源自病毒的，在另一實施方案中，所述載體是質粒。在一個實施方案中，所述源自病毒的載體源自腺病毒，在一個實施方案中所述腺病毒是輔助病毒依賴型腺病毒，而在另一實施方案中，所述源自病毒的載體源自腺病毒相關的載體，如下文所述。在一個實施方案中，術語"載體"或"表達載體"指運載體分子，核酸序列可以插入其中以被引入能夠進行復制的細胞內。在一個實施方案中，所述核酸分子被轉錄成RNA，然后RNA在一些情況下被翻譯成蛋白質、多肽或肽。在其他情況下，RNA序列不被翻譯，例如在反義分子或核酶的產生中。在一個實施方案中，表達載體可以包含各種"控制序列"，所述控制序列指特定宿主細胞內可操作地連接的編碼序列的轉錄和可能翻譯所必需的核酸序列。在另一實施方案中，載體還包括復制源。在一個實施方案中，所述載體可以是穿梭載體，在一個實施方案中穿梭載體可以在原核細胞和真核細胞兩者內繁殖，或者在另一實施方案中，所述載體可以被構建成推動它整合到所選生物的基因組內。在其他實施方案中，所述載體可以是例如質粒、桿粒、噬粒、粘粒、噬菌體、病毒或人工染色體。在一個實施方案中，所述載體是病毒載體，在一個實施方案中可以是噬菌體、哺乳動物病毒或植物病毒。在一個實施方案中，所述病毒載體是腺病毒載體。在另一實施方案中，所述腺病毒載體可以是任何已知的血清型或亞型。在一個實施方案中，使用腺病毒作為基因轉移載體的一些優點是它的中等大小的基因組、易于操作、高滴定度、靶細胞范圍廣和高感染性。腺病毒基因組的兩端包含100-200個堿基對反向重復序列(ITRs)，它們是病毒DNA復制和包裝所必需的順式元件。基因組的早期(E)區和晚期(L)區包含通過病毒DNA復制的發生而分開的不同轉錄單位。E1區(E1A和E1B)編碼負責調節病毒基因組和少數細胞基因的轉錄的蛋白質。E2區(E2A和E2B)的表達導致用于病毒DNA復制的蛋白質的合成。這些蛋白質涉及DNA復制、晚期基因表達和宿主細胞關閉。晚期基因的產物，包括大多數病毒殼體蛋白，只在顯著處理過由主要晚期啟動子(MLP)造成的單次前轉錄之后表達。MLP(位于16.8m.u.)在感染的晚期過程中特別有效，且由該啟動子引發的所有mRNA均具有5'-三聯前導序歹i」(TPL)，這使它們成為翻譯的優選mRNA。在另一實施方案中，所述腺病毒載體是輔助病毒依賴型腺病毒載體，在另一實施方案中這與無腸、腸化(gutted)、最小、完全缺失、高容量、A或假腺病毒同義，在另一實施方案中缺失所有病毒編碼序列，除了支持DNA復制的序列，所述支持DNA復制的序列在一個實施方案中包括腺病毒末端反向重復序列和包裝序列(M/)。在另一實施方案中，輔助病毒依賴型腺病毒載體不表達病毒蛋白質。在一個實施方案中，輔助病毒依賴型腺病毒載體只包括復制和包裝載體DNA所需的腺病毒的順式作用元件。在一個實施方案中，輔助病毒依賴型腺病毒載體包括大約500bp野生型腺病毒序列。在另一實施方案中，所述腺病毒載體還包括填充DNA以符合基因組尺寸為27.7kb的最小要求，在一個實施方案中需要填充DNA以有效地包裝到腺病毒殼體內。在一個實施方案中，使用具有最小重復序列的非編碼哺乳動物DNA作為填充DNA。在另一實施方案中，填充DNA包括非哺乳動物DNA，在一個實施方案中為非哺乳動物DNA為HPRT和/或C346粘粒序列。在一個實施方案中，輔助病毒依賴型腺病毒顯示高效的體內轉導、高水平的轉基因表達，能夠保持長期轉基因表達，在一個實施方案中是通過避免由病毒蛋白質的殘余表達引起的慢性毒性實現的，或其組合。在另一實施方案中，輔助病毒依賴型腺病毒具有高滴定度生成、有效感染的細胞類型廣、具有感染分裂中和非分裂中的細胞的能力或它們的組合。在另一實施方案中，用于本發明方法的輔助病毒依賴型腺病毒不誘導對植入微器官的強烈適應性免疫應答，在一個實施方案中其特征在于產生腺特異性MHCI型來限制免疫活性宿主中的CD8細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，在一個實施方案中這將限制轉基因表達的持續時間，在另一實施方案中這會導致腺病毒載體在幾周內清除。在另一實施方案中，用于本發明方法的輔助病毒依賴型腺病毒不誘導高細胞毒性T細胞水平(在一個實施方案中可以通過本領域已知的正CD8染色測量)，在另一實施方案中不誘導高輔助性T細胞水平(在一個實施方案中可以通過本領域已知的正CD4染色測量)。在另一實施方案中，輔助病毒依賴型腺病毒具有較低的種系傳播和插入誘變的危險，這可能引起致癌性轉化，因為所述載體基因組不整合到宿主細胞染色中。在一個實施方案中，輔助病毒依賴型腺病毒的克隆容量特別大(在一個實施方案中為大約37kb，在另一實施方案中為大約36kb)，這允許遞送整個基因座、多個轉基因和大的順式作用元件以提高、延長和調整轉基因表達。在一個實施方案中，用于本發明組合物和方法中的輔助病毒依賴型腺病毒系統與Palmer和Ng，2003(MolTher8:846)以及Palmer和Ng，2004(MolTher10:792)中所述類似，這些文獻據此全文納入本文作為參考。在一個實施方案中，在輔助病毒依賴型腺病毒系統的輔助病毒組分的E3區內插入填充序列，以使所述輔助腺病毒和所述輔助病毒依賴型腺病毒之間的重組最小化，以產生增殖型腺病毒。在一個實施方案中，本發明的包含輔助病毒依賴型腺病毒載體的制劑顯示出EPO和IFN-a的長期、高體外(圖1、2和6B)和體內(圖6A)表達水平。在另一實施方案中，本發明的包含輔助病毒依賴型腺病毒載體的制劑與包含腺病毒-5的微器官相比在轉導后至少100天內顯示峰值表達EPO水平的升高百分比(圖3)。不受限于理論，可能促成本發明微器官的長效、高水平基因表達產物的一個因素是使用了輔助病毒依賴型腺病毒，它在本發明的制劑中對組織無毒和無免疫原性。在另一實施方案中，所述腺病毒載體是El缺失的，而在另一實施方案中，所述腺病毒載體還包括E2、E3、E4或它們的組合的缺失。在另一實施方案中，所述病毒載體是腺伴隨病毒載體(AAV)。在一個實施方案中，AAV是細小病毒，作為腺病毒原種的污染物被發現。它是普遍存在的病毒(在85%的美國人口中存在抗體)，其不關聯任何疾病。它還被歸類為依賴病毒，因為其復制依賴于輔助病毒如腺病毒的存在。已經分離了至少九種血清型，其中AAV-2被最好地表征。AAV具有直線單鏈DNA，所述DNA被用殼體包裹到殼體蛋白VP1、VP2和VP3內，以形成直徑為20-24nm的二十面體病毒粒子。在一個實施方案中，所述AAVDNA的長度為大約4.7kb。在一個實施方案中，它包含兩個可讀框并且側面與兩個ITR相連。AAV基因組內存在兩個主要基因rep和cap。rep基因編碼負責病毒復制的蛋白質，而cap基因編碼殼體蛋白VPl-3。每個ITP形成T形發夾結構。這些末端重復序列是AAV用于染色體整合的唯一必需順式組分。因此，在一個實施方案中，所述AAV能被用作載體，其中所有的病毒編碼序列被除去且被用于遞送的基因盒代替。在一個實施方案中，當使用重組AAV(rAAV)作為表達載體時，所述載體包括145-bpITR，它僅占所述AAV基因組的6n/。，在另一實施方案中，其在載體中留下空間以組裝4.5-kbDNA插入。在一個實施方案中，AAV是安全的，因為認為它是不致病的，也不涉及任何疾病。除去病毒編碼序列使得對病毒基因表達的免疫反應最小化，因此,即使有，rAAV也只引發最小的炎癥應答。在另一實施方案中，AAV載體是雙鏈的，而在另一實施方案中，AAV載體是自身互補的，在一個實施方案中這繞過對病毒第二鏈DNA合成的需要，在一個實施方案中這導致早期轉基因表達。在另一實施方案中，所述病毒載體是逆轉錄病毒載體。所述逆轉錄病毒是一組單鏈RNA病毒，特征是能夠在受感染細胞中通過逆轉錄過程將它們的RNA轉變成雙鏈DNA。然后所得DNA穩定地整合到細胞染色體中作為前病毒并直接合成病毒蛋白質。整合導致病毒基因序列保留在受體細胞及其后代中。所述逆轉錄病毒基因組包含三個基因，即gag、pol和env，它們分別編碼殼體蛋白、聚合酶和包裝元件。在所述gag基因上游發現的序列包含用于將基因組包裝到病毒中的信號。在病毒基因組的5'和3'端存在兩個長末端重復(LTR)序列。它們包含強大的啟動子和增強子序列，也是所述宿主細胞基因組的整合所需的。在一個實施方案中，為了構建逆轉錄病毒載體，將編碼一個或多個相關寡核苷酸或多核苷酸序列的核酸插7V病毒基因組內代替某些病毒序列，以產生復制缺陷的病毒。為了產生病毒體，構建包含gag、pol和env基因但不含LTR和包裝元件的包裝細胞系。當將包含cDNA的重組質粒、連同逆轉錄病毒LTR和包裝序列一起引入該細胞系時(通過例如磷酸鈣沉淀)，所述包裝序列允許重組質粒的RNA轉錄以被包裝至病毒顆粒內，然后將其分泌到培養基中。然后收集包含重組逆轉錄病毒的培養基，任選濃縮，并用于基因轉移。逆轉錄病毒載體能夠感染多種細胞類型。然而，整合和穩定表達需要宿主細胞的分裂。在其他實施方案中，所述病毒載體源自病毒如痘苗病毒、慢病毒、骨髓灰質炎病毒、肝炎病毒、乳頭瘤病毒、巨細胞病毒、猿猴病毒或單純皰疹病毒。在本發明的某些實施方案中，包含核酸序列的載體可以包含裸重組DNA(nakedrecombinantDNA)或質粒。可以通過物理或化學使細胞膜通透的任何方法進行構建體的轉移。在一個實施方案中，所述載體是小環DNA，在一個實施方案中為用于非病毒基因轉移的超螺旋DNA分子，它既沒有細菌復制源，也沒有抗生素耐藥標記。在另一實施方案中，小環DNA不包括在質粒生成過程中來自基因遞送載體的細菌控制區。它們因此比基因治療中使用的其他質粒更小和潛在地更安全。在一個實施方案中，小環DNA產生高收率，易于純化，并提供了穩健和持久的轉基因表達。使用標準重組技術構建載體是本領域公知的(參見例如Maniatis等人，MolecularCloning,ALaboratoryManual(ColdSpringHarbor,1990)禾口Ausubel等人，1994,CurrentProtocolsinMolecularBiology(JohnWiley&Sons,1996)，兩者均納入本文作為參考)。在另一實施方案中，載體還包含插入編碼標記多肽的異源核酸序列。所述標記多肽可以包括例如yECitrine、綠色熒光蛋白(GFP)、DS-Red(紅色熒光蛋白)、分泌型堿性磷酸酶(SEAP)、p-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉移酶、螢光素酶、GFP/EGFP、人生長激素或者本領域技術人員已知的任何數目的其他報告蛋白。在另一實施方案中，所述載體可以包含一個或多個相關基因。因此，在一個實施方案中，本發明的載體可以包含相關基因，所述相關基因在一個實施方案中為紅細胞生成素或干擾素(i2b，在一個實施方案中表達標記，在另一實施方案中在框架內與標記連接，在一個實施方案中允許識別相關基因產物，在另一實施方案中允許區別由微器官產生的相關基因產物和由所述微器官外部的宿主細胞內源性產生的相似基因產物。在一個實施方案中，本發明的包含編碼治療性多肽的核酸的載體被引入微器官中。本領域有許多已知技術可將盒(cassette)和/^或載體引入細胞內以實現本發明的方法，所述技術為例如但不限于直接DNA攝取技術，以及病毒、質粒、線狀DNA或脂質體介導的轉導、受體介導的攝取和引入應用磷酸鈣介導和DEAE-右旋糖介導方法的磁穿孔法、電穿孔或脂質體介導的轉染(關于進一步的細節，參見例如"MethodsinEnzymology"1-317巻，AcademicPress,CurrentProtocolsinMolecularBiology,AusubelF.M.等人(eds.)GreenePublishingAssociates,(1989)禾口MolecularCloning:ALaboratoiyManual,第2版，Sambrook等人ColdSpringHarborLaboratoryPress,(1989)，或其他標準實驗室手冊)。在一個實施方案中，用核酸被膜的粒子轟擊可以是將裸DNA表達構建體轉移到細胞中的方法。該方法依賴于將DNA被膜的微射彈(micro-projectile)加速到高速率以允許它們刺穿細胞膜并進入細胞而不殺滅它們的能力。已經開發了用于加速小粒子的幾種裝置。一種這樣的裝置依靠高電壓放電以產生電流，然后電流提供驅動力。所用的微射彈已包含生物惰性或生物相容的物質如鎢珠或金珠。要理解可以使用任何這些方法將所需的物質引入細胞內，由此產生的細胞被認為是本發明的部分，它們用于實現本發明方法的用途也被認為是本發明的部分。在一個實施方案中，本發明的制劑和方法中的載體包括核酸序列。用于本文時，術語"核酸"指多核苷酸或寡核苷酸如脫氧核糖核酸(DNA)，并且，在適當時指核糖核酸(RNA)或其模擬物。所述術語還應被理解為包括由核苷酸類似物制成的RNA或DNA的等價物、類似物，并且在可用于所述實施方案時，被理解為包括單鏈(有義或反義)和雙鏈多核苷酸。該術語包括由天然存在的核苷酸堿基(nucleobase)、糖和共價核苷間(主鏈)連接組成的寡核苷酸以及具有相似功能的包括非天然存在部分的寡核苷酸。因為期望的性質例如增強的細胞攝取、對核酸耙的增強的親和力和在核酸酶存在時增強的穩定性，這樣的修飾或取代的寡核苷酸通常相對于天然形式是優選的。在一個實施方案中，術語"核酸"或"寡核苷酸"指這樣的分子，其可以包括但不限于原核序列、真核mRNA、來自真核mRNA的cDNA、來自真核(例如哺乳動物)DNA的基因DNA序列和甚至合成的DNA序列。所述術語還指包括DNA和RNA的任何已知堿類似物的序列。所述核酸可以通過本領域熟知的任何合成或重組方法制備。核酸可以通過本領域已知的技術進行進一步修飾以改變生物物理或生物學性質。例如，可以修飾所述核酸以提高其對抗核酸酶的穩定性(例如"封端")、或用于修改其溶解度或對互補序列的親和力。這些核酸可以包括載體、表達盒、啟動子序列、相關基因或它們的任何組合。在另一實施方案中，可以修改其親脂性，其進而會反映用于遞送它的系統的變化，在一個實施方案中，所述系統還會受到是否期望這樣的序列保留在皮膚內、或滲透過皮膚、或其任何層的影響。這樣的考慮可以影響本發明、所述方法和系統中使用的任何化合物。在一個實施方案中，可以通過本領域已知的方法由四個完整或部分的核苷酸化學合成DNA。這樣的方法包括那些描述于Caruthers(1985;Science230:281-285)中的。通過制備重疊的雙鏈寡核苷酸、填充到空隙內、并將末端捆綁到一起，也可以合成DNA(通常參見Sambrook等人(1989;MolecularCloning-ALaboratoryManual,第2版。ColdSpringHabourLaboratoiyPress,紐約))。在另一實施方案中，可以通過定向誘變由野生型DNA制備滅活的突變(參見例如Zoller等人(1982;DNA.1984Dec;3(6):479-88);Zoller(1983);和Zoller(1984;DNA.1984Dec;3(6):479-88);McPherson(1991;DirectedMutagenesis:APracticalApproach.OxfordUniversityPress,纟丑纟勺》。可以通過本領域已知的方法放大獲得的DNA。一種合適的方法是Saiki等人(1988;Science.1988Jan29;239(4839):487491)、Mullis等人，美國專利4,683,195和Sambrook等人(1989)所述的聚合酶鏈反應(PCR)方法。本領域公開了用于修飾核酸以實現特定目的的方法，例如Sambrook等人(19S9)。而且，本發明的核酸序列可以包括不編碼相關蛋白質的核苷酸序列的一個或多個部分。由點突變或由誘導修飾(包括插入、缺失和替代)引起DNA序列改變以提高由其編碼的多核苷酸的活性、半衰期或制備，這也包括在本發明內。在一個實施方案中，本發明的制劑可以包括核酸，或者在另一實施方案中，本發明的方法可以包括核酸的遞送，其中在另一實施方案中，所述核酸是載體的一部分。通過下文所述的本領域常規標準方法，可以評價特定表達載體系統和將核酸引入細胞內的方法的效能。正如本領域技術人員會理解，核酸序列的片段或衍生物或編碼蛋白質或月太的基因還可以按照與完全野生型基因或序列相同的方式起作用。同樣，核酸序列的形式與野生型序列相比可以有變化，不過在編碼相關的蛋白質或肽、或它們的片段時，盡管存在這些變化，但保留的野生型功能仍顯示相同的生物學效應。這些各自表示本發明的獨立實施方案。26在一個實施方案中，本發明的制劑和方法可以用于基因沉默應用。在一個實施方案中，通過使用反義寡核苷酸抑制或消除特定基因的活性或功能，所述反義寡核苷酸為嵌合分子，包含兩個或更多個化學上不同的區，分別構成至少一個核苷酸。在一個實施方案中，嵌合寡核苷酸包含至少一個區，其中所述寡核苷酸經修飾以使寡核苷酸耐受核酸酶降解的抗性增加、細胞攝取增加和/或對靶多核苷酸的結合親和力增加。寡核苷酸的額外區可以作為能夠裂解RNA:DNA或RNA:RNA雜合體的酶的底物，根據本發明的這方面，其作為通過降解特別序列來沉默基因的方式。可以通過凝膠電泳法常規檢測RNA靶的裂解，如果必要，可以聯合本領域己知的核酸雜交技術。在一個實施方案中，嵌合反義寡核苷酸可以作為包含兩個或更多個寡核苷酸和域修飾的寡核苷酸的復合結構形成，如本領域中所述(參見例如美國專利5,013,830;5，149，797;5,220,007;5,256,775;5,366,878;5,403,711;5,491,133;5,565,350;5,623,065;5,652,355;5,652,356和5,700,922)，在另一實施方案中可以包含核酶序列。在另一實施方案中，通過使用小干擾RNA來實現基因表達的抑制、活性或功能，這提供了對基因表達的序列特異性抑制。控制對應于生物中的單個基因的雙鏈/雙螺旋RNA(dsRNA)可以通過快速降解受影響的細胞內的mRNA來沉默特定基因的表達。這個過程被稱為基因沉默，其中dsRNA作為特定RNA抑制劑(RNAi)起作用。RNAi可以源自天然來源，例如內源性病毒和轉座子活性，或者它可以通過微注射(Fire等人(1998)被人工引入細胞內(ElbashirSM等人(2001).Nature411:494-498)，或者通過用產生互補RNA或折回RNA的基因結構轉換，或者通過其他載體(Waterhouse，P.M.等人(1998).Proc.Natl.Acad.Sci.USA95，13959-13964和Wang，Z.等人(2000).J.Biol.01601.275,40174-40179)被人工引入細胞內。在一個實施方案中，RNAi介導mRNA降解包括雙螺旋或雙鏈RNA，或者在其他實施方案中，包括單鏈RNA、離體RNA(部分純化的RNA、基本上純的RNA、合成的RNA、重組制備的RNA)、以及通過添加、缺失和/或改變一個或多個核苷酸而與天然存在的RNA不同的改變的RNA。在一個實施方案中，本發明的制劑和方法中的核酸編碼治療性多肽。在一個實施方案中，術語"多肽"指由通過肽(即酰胺)鍵結合的氨基酸殘基組成的分子，包括肽、多肽和蛋白質。因此，在一個實施方案中，本發明的多肽可以具有單個或多個共價連接的氨基酸鏈，還可以包含由二硫鍵組成的鏈內或鏈間連接。在一個實施方案中，一些多肽還可以形成多單位大分子復合物的多單位。在一個實施方案中，所述多肽可以預期具有構象優先性并顯示三維結構。構象優先性和三維結構兩者通常都均通過多肽的原始(即氨基酸)序列和/或存在(或缺少)二硫鍵或其他共價或非共價鏈內或鏈間相互作用來定義。在一個實施方案中，術語"肽"指天然肽(降解產物、合成的合成肽或重組月太)和/或肽擬似物(通常為合成的合成肽)，例如作為肽類似物的肽樣物質和半肽樣物質，它們可以具有例如修飾以使肽在體內更穩定或更能滲透進細胞內。這種修飾包括但不限于N端修飾、C端修飾、肽鍵修飾，包括但不限于CH2-NH、CH2-S、CH2-S=0、OC-NH、CHrO、CHrCH2、S=C-NH、CH=CH或cfk:h、主鏈修飾和殘基修飾。用于制備肽擬似化合物的方法是本領域公知的，具體描述于例如QuantitativeDrugDesign,C.A.RamsdenGd.,Chapter17.2，F.ChoplinPergamonPress(1992)，該文獻納入本文作為參考，如同本文完全闡述。所述肽內的肽鍵(-CO-NH-)可以被例如N-甲基化鍵(-N(CH3)-CO-)、酯鍵(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)、酮亞甲基鍵(-CO-CH2-)、氮雜鍵(-NH-N(R)-CO-)(其中R為任何烷基如甲基)、carba鍵(-CH2-NH-)、羥乙烯鍵(-CH(OH)-CH2-)、硫代酰胺鍵(-CS-NH-)、烯屬雙鍵(-CHK:H-)、反酰胺鍵(-NH-CO-)、肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)(其中R是本來存在于碳原子上的"正"側鏈)取代。這些修飾可以發生在肽鏈內的任何鍵上，甚至可以同時發生在幾個(2-3)鍵上。天然芳族氨基酸Trp、Tyr和Phe可以被取代，用于合成非天然氨基酸如TIC、萘基丙胺酸(Nol)、Phe的環甲基化衍生物、Phe的鹵代衍生物或鄰甲基-Tyr。除了以上所述，本發明的肽還可以包括一個或多個修飾的氨基酸或者一個或多個非氨基酸單體(例如脂肪酸、復合糖等)。在一個實施方案中，術語"氨基酸"或"多個氨基酸"被理解為包括20種天然存在的氨基酸；這些氨基酸通常在體內翻譯后被修飾，包括例如羥脯氨酸、磷酸絲氨酸和磷酸蘇氨酸；以及其他獨特的氨基酸，包括但不限于2-氨基己二酸、羥賴氨酸、異鎖鏈素、正纈氨酸、正亮氨酸和鳥氨酸。此外，術語"氨基酸"可以包括D-和L-氨基酸兩者。用于本文時，除非另有特殊說明，術語"氨基酸"指氨基酸的D或L立體異構體形式。本發明的范圍內還包括等價蛋白質或等價肽，例如具有純化野生型腫瘤抑制蛋白質的生物活性。"等價蛋白質"和"等價多肽"指背離天然存在的蛋白質或多肽的線性序列，但其氨基酸取代不改變其生物學活性的化合物。這些等價物可以通過用相關氨基酸如同樣帶電的氨基酸代替一個或多個氨基酸、或通過取代或修飾側鏈或官能團而與天然序列不同。所述肽或多肽或者編碼它們的DNA序列可以獲自各種天然或非天然來源，例如原核或真核細胞。在一個實施方案中，所述來源細胞可以是野生型、重組的或突變的。在另一實施方案中，大多數肽或多肽對于微生物如細菌、酵母或真菌、對于病毒、對于動物(包括哺乳動物、無脊椎動物、爬行動物、鳥類和昆蟲)或對于植物細胞可以是內源性的。在另一實施方案中，所述肽或多肽可以獲自更特殊的來源，例如病毒體粒子的表層膜、特定的細胞溶解產物、組織提取物，或者它們可以限于在細胞膜表面上表達的那些多肽。在另一實施方案中，所述肽或多肽源自特定的細胞或組織類型、發育階段或疾病狀況或階段。在一個實施方案中，所述疾病狀況或階段是癌癥，在另一實施方案中，所述疾病狀況為感染，在另一實施方案中為fflV感染。在另一實施方案中，所述疾病狀況是發育疾患，而在另一實施方案中，所述疾病狀況是代謝疾患。本發明的多肽可以是任何的尺寸。可以預期，所述多肽可以表現廣泛不同的分子量，一些超過150-200千道爾頓(kD)。通常，所述多肽的分子量可為約5,000至約100，000道爾頓。其他可以落入更窄的范圍內，例如約10,000至約75,000道爾頓，或約20,000至約50,000道爾頓。在可選的實施方案中，本發明的多肽的長度可以1-250個氨基酸殘基。在另一實施方案中，本發明的多^:的長度可以10-200個氨基酸殘基。在可選的實施方案中，本發明的多肽的長度可以50-100個氨基酸殘基。在可選的實施方案中，本發明的多肽的長度可以1-250個氨基酸殘基。在可選的實施方案中，本發明的多肽的長度可以1-250個氨基酸殘基。在一個實施方案中，所述肽或多肽的最大尺寸由它所表達的載體確定，在一個實施方案中為大約20-37kD、20-25kD、25-30kD、30-37kD或35-37kD。在另一實施方案中，所述多肽為34kD糖蛋白。在另一實施方案中，所述肽或多肽是激動劑。在另一實施方案中，所述^:或多肽是拮抗劑。在另一實施方案中，所述肽或多肽是抗原。在另一實施方案中，所述肽或多肽是酶。在另一實施方案中，所述肽或多肽是酶或其他底物的激活劑。在另一實施方案中，所述肽或多肽是酶或其他底物的抑制劑。在另一實施方案中，所述肽或多肽是激素。在另一實施方案中，所述肽或多月太是調節蛋白。調節蛋白支配著許多相互作用，這些相互作用管理著基因的表達和復制、酶的行為、細胞及其環境之間的相互影響，以及許多其他現象。在另一實施方案中，所述肽或多肽是細胞骨架蛋白。細胞骨架蛋白為細胞形成柔性框架，為細胞器官和形成的機體提供附著點，并使細胞部分之間能夠連通。在另一實施方案中，所述肽或多肽是毒素。在另一實施方案中，本發明的治療性核酸編碼一種或多種自殺基因。在另一實施方案中，所述肽或多肽是激動劑、拮抗劑、抗原、酶、酶激活劑、酶抑制劑、酶底物、激素、調節蛋白、細胞骨架蛋白或毒素的功能片段。"功能片段"意在指示肽或多肽的一部分，它們即使在缺乏肽或多肽的剩余部分的情況下也能履行肽或多肽的一種或多種功能。在一個實施方案中，所述功能片段足以介導與相關靶的分子間相互作用。在可選的實施方案中，所述肽結合DNA或RNA或其片段。在一個實施方案中，所述DNA或RNA結合肽可以是本領域許多已知的中的任一種，包括但不限于鋅指蛋白如P-p-a鋅指蛋白、核受體蛋白、環-片-螺旋型蛋白和GAL4型蛋白；螺旋-翻轉-螺旋蛋白如Cro和阻抑蛋白、Lacl嘌呤阻抑蛋白(PurR)、Fokl限制性內切核酸酶(DNA識別區)、"重組酶蛋白(C-端結構域)、Hin重組酶蛋白、Trp阻抑蛋白、Diptheriatox阻抑物、分解代謝基因活化蛋白(CAP)、同源結構域蛋白、RAP1蛋白、Prd配對蛋白、Tc3轉座酶蛋白、TFIIB家族、干擾素調節因子、轉錄因子家族和ETS結構域家族噬菌體；和亮氨酸拉鏈蛋白如堿性拉鏈蛋白和拉鏈型蛋白(螺旋-環-螺旋)。在另一實施方案中，所述DNA或RNA結合肽可以是其他a-螺旋蛋白如Cre重組酶家族、乳頭瘤病毒-1E2蛋白、組蛋白家族、Ebnal核蛋白家族、Skn-l轉錄因子、高遷移率組家族和MADS盒家族；P-片狀蛋白如TATA盒結合蛋白；p-發夾/帶狀蛋白如Met阻抑蛋白、Tus復制終止子蛋白、整合宿主因子蛋白、超嗜熱DNA結合蛋白、Arc阻抑物、轉錄因子T結構域；以及其他蛋白家族如Rel同源區蛋白和Stat家族。在另一實施方案中，所述DNA或RNA結合肽可以是酶如甲基轉移酶蛋白、PvuII核酸內切酶蛋白、核酸內切酶V蛋白、EcoRV核酸內切酶家族、BamHI核酸內切酶家族、EcoRI核酸內切酶家族、DNA錯配核酸內切酶、DNA聚合酶I蛋白、DNA聚合酶T7、Dnasel蛋白、DNA聚合酶p蛋白、Uraci-DNA糖基化酶、甲基腺嘌呤-DNA糖基化酶、Homing核酸內切酶和拓撲異構酶I或病毒蛋白如HIV逆轉錄酶。在另一實施方案中，所述肽或多肽是轉錄或翻譯激活劑或它們的片段。在另一實施方案中，所述肽或多肽是轉錄或翻譯阻抑物或其片段。在另一實施方案中，所述肽或多肽是受體或其片段。在一個實施方案中，所述肽或多肽可以是上文所述的任何肽或多肽的關聯肽。"關聯"肽是與另一分子相互作用和/或結合的任何肽。根據本發明的其他實施方案，重組基因產物可以由與相應的天然多核苷酸相比具有修飾核苷酸序列的多核苷酸編碼。除了蛋白質，重組基因產物還可以包括功能RNA分子。根據本發明的另一實施方案，本發明的制劑和方法可以提供產生功能RNA分子的微器官。功能RNA分子可以包括反義寡核苷酸序列、包括本文述反義寡核苷酸的核酶和與本文所述反義寡核苷酸融合的核酶序列。這樣的核酶可使用固相寡核苷酸合成法方便地合成。核酶正越來越多地被用于通過裂解編碼相關蛋白質的mRNA來序列特異性地抑制基因表達[Welch等人，"ExpressionofribozymesingenetransfersystemstomodulatetargetRNAlevels."CurrOpinBiotechnol.1998October;9(5):486-96]。設計核酶來裂解任何特定靶RNA的可能性已經使它們在基礎^f究和治療應用兩者中成為有價值的工具。在治療領域，核酶已經被開發用于針對感染性疾病中的病毒RNA、癌癥中的顯性致癌基因和遺傳性疾患中的特定體細胞突變[Welch等人，"RibozymegenetherapyforhepatitisCvirusinfection."ClinDiagnVirol.Jul.15,1998;10(2-3):163-71]。最值得注意的是，幾種用于HIV患者的核酶基因治療方案已經處于l期試驗中。最近，核酶已經被用于轉基因動物研究、基因靶確認和途徑闡明。幾種核酶處于各種臨床試驗階段。ANGIOZYME是用于人體臨床試驗研究的第一種化學合成的核酶。ANGIOZYME特異性地抑制VEGF-r(血管內皮生長因子受體)的形成，VEGF-r是血管發生途徑的關鍵組分。RibozymePharmaceuticals,Inc.以及其他廠商已經在動物模型中證實了抗血管發生治療的重要性。HEPTAZYME被設計成選擇性破壞丙型肝炎病毒(HCV)RNA的核酶，發現它在細胞培養測定中能有效地減少丙型肝炎病毒RNA。如上文所述，在一個實施方案中，本發明的制劑和方法提供治療制劑，所述治療制劑包含編碼治療性多肽的核酸序列。在一個實施方案中，術語"治療劑"指在提供給有需要的個體時可提供有益效果的分子。在一些情況下，所述分子是治療劑的原因在于它可以代替個體中缺少或減少的這樣的分子。在一個實施方案中，所述治療性蛋白質是個體中缺少的蛋白質，例如在個體具有所需蛋白質的內源性無效或錯義突變的情況下。在其他實施方案中，所述內源性蛋白質是突變的，并會產生無功能的蛋白質，需要提供功能性蛋白質來補償。在其他實施方案中，異源性蛋白質的表達加上低內源性水平，導致給定蛋白質的累積表達增強。在其他實施方案中，所述分子剌激信號級聯，其提供細胞或宿主功能的關鍵元件的表達或分泌或其他作用。在一個實施方案中，術語"治療制劑"描述了可用于診斷，或者在另一實施方案中可用于治愈，或者在另一實施方案中可用于緩解，或者在另一實施方案中可用于治療，或者在另一實施方案中可用于預防疾病、疾患、病癥或感染的物質。在一個實施方案中，本發明的"治療制劑"指影響其應用耙的結構或功能的任何物質。在另一實施方案中，本發明的"治療制劑"是在向疾病或疾患所折磨的個體給藥時能減輕其癥狀的分子。在一個實施方案中，本發明的"治療制劑"是合成分子，或者在另一實施方案中是從在自然界中發現的來源中分離的天然存在的化合物。在一個實施方案中，所述治療性多肽是紅細胞生成素，而在另一實施方案中，所述治療性多肽是干擾素cx，在一個實施方案中所述干擾素a為干擾素a2b。在一個實施方案中，所述治療性多肽是任何其他治療性多肽。在一個實施方案中，"治療"指治療性治療和預防性或防止性治療措施兩者，其中目的是防止或減輕上文所述的目標病理病癥或疾患。因此，在一32個實施方案中，進行治療可以包括直接影響或治愈、壓制、抑制、防止疾病、疾患或病癥、減少其嚴重性、延遲其發生、減少其相關癥狀、或它們的組合。因此，在一個實施方案中，"進行治療"特別指延遲進程、加速緩和、誘導緩和、擴大緩和、加速恢復、提高可選的治療的效能或降低對替換治療的耐受性、或它們的組合。在一個實施方案中，"進行防止"特別指延遲癥狀的發作、防止疾病復發、減少復發發作的次數或頻率、增加癥狀性發作之間的潛伏期、或它們的組合。在一個實施方案中，"進行壓抑"或"進行抑制"特別指減少癥狀的嚴重性、減少急性發作的嚴重性、減少癥狀的數目、減少疾病相關的癥狀的發生率、減少癥狀的潛伏期、改善癥狀、減少繼發性癥狀、減少繼發性感染、延長患者存活期、或它們的組合。在一個實施方案中，癥狀是原發性的，而在另一實施方案中癥狀是繼發性的。在一個實施方案中，"原發性"指作為特定疾病的直接結果的癥狀，而在一個實施方案中，"繼發性"指源自原發性病因或作為原發性病因的結果的癥狀。在一個實施方案中，用于本發明的化合物治療原發性或繼發性癥狀或涉及所述疾病的繼發性并發癥。在另一實施方案中，"癥狀"可以是疾病或病理狀況的任何表現。在一個實施方案中，治療性核酸可以編碼治療性多肽，在一個實施方案中，戶萬述治療性多肽包括酶、酶輔因子、細胞毒性蛋白、抗體、通道蛋白、轉運蛋白、生長因子、激素、細胞因子、受體、粘蛋白、表面活性劑、適體或激素。在另一實施方案中，所述治療性多肽可以是上面所述的一種或多種種類。在另一實施方案中，治療性核酸可以編碼下文所述的功能性RNA。在一個實施方案中，術語"抗體或抗體片段"指完整的抗體分子以及能夠與表位結合的其功能片段，如Fab、F(ab')2和Fv。在一個實施方案中，Fab片段指包含抗體分子的單價抗原結合片段的片段，其可以通過用酶木瓜蛋白酶消化整個抗體以獲得完整輕鏈和一部分單重鏈。在一個實施方案中，Fab'片段指抗體分子的一部分，所述片段可以通過用胃蛋白酶處理整個抗體，然后還原，以獲得完整輕鏈和一部分重鏈來得到。每個抗體分子可以獲得兩個Fab'片段。在一個實施方案中，(Fab')2指抗體的片段，所述片段可以通過用酶胃蛋白酶處理整個抗體，之后不進行還原而獲得。在另一實施方案中，F(ab')2是通過兩個二硫鍵連接到一起的兩個Fab'片段的二聚物。在一個實施方案中，Fv可以指遺傳工程片段，它包含輕鏈的可變區和重鏈的可變區，表現為兩個鏈。在一個實施方案中，所述抗體片段可以是單鏈抗體("SCA")、包含輕鏈的可變區和重鏈的可變區的遺傳工程分子，通過合適的多肽連接基連接成基因融合的單鏈分子。制備這些片段的方法是本領域已知的(參見例如Harlow和Lane，Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,紐約,1988，該文獻納入本文作為參考)。在一個實施方案中，所述抗體會識別表位，在另一實施方案中表位指抗體的互補位所要結合的抗原上的抗原決定簇。在其他實施方案中，表位決定簇可以由分子的化學活性表面活性基因如氨基酸或碳水化合物側鏈組成，在其他實施方案中可以具有特定的三維結構特性，和/或在其他實施方案中具有特定的電荷特性。在一個實施方案中，所識別的表位來自病原，或者在另一實施方案中來自致病細胞，或者在另一實施方案中來自異常表達的蛋白質，在另一實施方案中，異常表達可以指表達的位置、數量或它們的組合。抗體片段的另一種形式是編碼單個互補性決定區(CDR)的肽。CDR肽("最小識別單位")可以通過構建編碼相關抗體的CDR的基因來獲得。通過例如使用聚合酶鏈反應以從抗體產生細胞的RNA中合成可變區來制備這樣的基因。參見例如Larrick和Fry,Methods,2:106-10,1991。在一個實施方案中，所述抗體是殺腫瘤的，因此可治療某些癌癥。具有殺腫瘤活性的抗體也是本領域已知的，它們的任何使用都可以代表本發明的實施方案，包括IMC-C225、EMD72000、OvaRexMabB43.13、抗神經節苷脂G(D2)抗體chl4.18、C017-lA、曲妥珠單抗、rhuMAbVEGF、sc-321、AF349、BAF349、AF743、BAF743、MAB743、AB1875、抗-Flt-4AB3127、FLT41-A、利妥昔單抗、2C3、CAMPATH1H、2G7、alR-3、ABX-EGF、MDX-447、抗-p75IL-2R、抗-p64IL-2R和2A11。在一個實施方案中，本發明的"治療性核酸"可以編碼或者所述"治療性多肽"可以是用作下列藥物的分子抗高血壓藥、抗抑郁藥、抗焦慮藥、抗凝結藥、抗驚厥藥、血液葡萄糖降低藥、解充血藥、抗組胺藥、鎮咳藥、抗炎藥、抗精神病藥、認知增強藥、降膽固醇藥、減肥藥、自身免疫性疾病治療藥、抗陽萎藥、抗菌藥和抗真菌藥、安眠藥、抗帕金森癥藥、抗生素、抗病毒藥、抗腫瘤藥、巴比妥類、鎮靜藥、營養劑、P-阻斷劑、催吐藥、止吐藥、利尿藥、抗凝血藥、強心藥、雄激素類、腎上腺皮質激素類、同化激素類藥、生長激素促分泌劑、抗感染藥、冠狀血管擴張藥、碳酸酐酶抑制劑、抗原生動物藥、胃腸病用藥、5-羥色胺拮抗劑、麻醉藥、降糖藥、多巴胺能藥、抗阿爾茨海默病藥、抗潰瘍藥、血小板抑制劑和糖原磷酸化酶抑制劑。在一個實施方案中，本發明的"治療制劑"是抗菌藥、抗病毒藥、抗真菌藥或抗寄生蟲藥。在另一實施方案中，所述治療制劑具有細胞毒性或抗癌活性。在另一實施方案中，所述治療制劑是免疫刺激劑。在另一實施方案中，所述治療制劑抑制炎癥或免疫應答。在一個實施方案中，所述治療性核酸可以編碼或者所述治療性多肽可以是細胞因子如干擾素或白介素、或它們的受體。缺少細胞因子的表達或缺少正確的細胞因子的表達牽涉易于患病，提高表達可以導致耐受許多感染。可以改變細胞因子的表達模式以產生有益效果，例如使免疫應答在感染或在自身免疫疾病中偏向Thl型表達模式或Th2模式，其中改變的表達模式可以證明對宿主是有益的。在另一實施方案中，所述治療性核酸可以編碼或者所述治療性多肽可以是酶，例如參與糖原貯積或裂解的酶。在另一實施方案中，所述治療性蛋白質包括轉運蛋白，例如離子轉運蛋白如CFTR或葡萄糖轉運蛋白或其缺乏或不適表達會導致各種疾病的其他轉運蛋白。在另一實施方案中，所述治療性核酸編碼或者所述治療性多肽是腫瘤抑制物或促凋亡化合物，它們改變癌癥相關事件的進程。在另一實施方案中，本發明的治療性核酸可以編碼或者所述治療性多肽可以是免疫調節蛋白。在一個實施方案中，所述免疫調節蛋白包括細胞因子、趨化因子、補體或組分如白介素1-15、干擾素oi、P或y、腫瘤壞死因子、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、趨化因子如嗜中性白細胞活化蛋白(NAP)、巨噬細胞趨化和活化因子(MCAF)、RANTES、巨噬細胞炎性肽MIP-la和MIP-lb。在另一實施方案中，本發明的治療性核酸可以編碼或者所述治療性多肽可以是生長因子或組織促進因子。在一個實施方案中，所述治療化合物是骨形態生成蛋白或OP-l、OP-2、BMP-5、BMP-6、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-9、DPP、Vg-l、60A或Vgr-l。在另一實施方案中，所述治療性核酸編碼促進神經再生或修復的RNA或肽，并且可以包括NGF或其他生長因子。在另一實施方案中，所述治療性多肽促進神經再生或修復，并且可以包括NGF或其他生長因子。在另一實施方案中，所述治療性核酸可以編碼或者所述治療性多肽可以是下列物質天然或非天然胰島素、淀粉酶、蛋白酶、脂酶、激酶、磷酸酶、糖基轉移酶、胰蛋白酶原、糜蛋白酶原、羧肽酶、激素、核糖核酸酶、脫氧核糖核酸酶、三酰基甘油脂酶、磷脂酶A2、彈性蛋白酶、淀粉酶、凝血因子、UDP葡糖醛酸基轉移酶、鳥氨酸轉氨甲酰基酶、細胞色素p450酶、腺苷脫氨酶、血清胸腺因子、胸腺體液因子、促胸腺生成素、生長激素、生長調節素、共刺激因子、抗體、集落刺激因子、紅細胞生成素、表皮生長因子、肝紅細胞生成因子(肝細胞生成素)、肝細胞生長因子、白介素、干擾素、負生長因子、成纖維細胞生長因子、a家族轉換生長因子、p家族轉換生長因子、胃泌素、分泌素、縮膽囊素、促生長素抑制素、5-羥色胺、P物質、轉錄因子或它們的組合。在另一實施方案中，所述基因包括報道基因。在一個實施方案中，所述報道基因編碼熒光蛋白。在一個實施方案中，所述熒光蛋白是yECitrine或黃色熒光蛋白。在一個實施方案中，所述熒光蛋白是水母綠熒光蛋白或其突變體或變異體。在另一實施方案中，所述GMMO可以具體包括除報道基因或編碼報道蛋白的基因以外的任何基因。在另一實施方案中，所述報道基因帶來耐藥性。在一個實施方案中，所述報道基因帶來對抗生素如氨芐西林、卡那霉素、四環素等的耐受性，正如本領域技術人員所理解。在另一實施方案中，所述抗生素耐受基因可以包括帶來對新霉素(neo)、殺稻瘟素、大觀霉素、紅霉素、腐草霉素、Tn917、慶大霉素和博來霉素的耐受性的那些基因。新霉素耐受基因的實例是轉座子Tn5的新霉素耐受基因，它編碼新霉素磷酸轉移酶ll，這帶來了對各種抗生素，包括G418和卡那霉素的耐受性。在另一實施方案中，所述報道基因是氯霉素乙酰轉移酶基因(cat)并帶來對氯霉素的耐受性。在一個實施方案中，本發明的制劑和方法用于預防或治干預病毒感染，或者在另一實施方案中用于預防或治療性干預細菌、寄生蟲或真菌感染，或它們的組合。根據本發明的這方面，本發明的制劑和方法用于預防或治療性干預疾病。在一個實施方案中，由此治療的個體的疾病可以包括但不限于肌營養不良癥、癌癥、心血管疾病、高血壓、感染、腎臟病、神經變性疾病如阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓舞蹈病、克-雅病、自身免疫疾病如狼瘡、類風濕性關節炎、心內膜炎、格雷夫斯病或ALD、呼吸疾病如哮喘或囊性纖維化、骨病如骨質疏松、關節病、肝病、皮膚病如銀屑病或濕疹、眼病、耳鼻喉病、其他神經病如Turret綜合征、精神分裂癥、抑郁、孤獨癥或中風、或代謝疾病如糖原貯積病或糖尿病。要理解可以通過本發明的制劑和根據本發明的方法實現的表達特定蛋白質、提供治療性蛋白質、提供藥物、抑制特定蛋白質表達等的任何疾病都被認為是本發明的部分。在一個實施方案中，本發明的制劑和方法包括與一個或多個調節序列可操作地連接的核酸序列。在一個實施方案中，被引入微器官分子內的核酸分子是適合在由所述核酸編碼的基因產物的細胞中表達的形式。因此，在一個實施方案中，所述核酸分子包括轉錄基因(或其部分)所需的編碼和調節序列。當所述基因產物是蛋白質或肽時，所述核酸分子包括翻譯核酸分子所需的編碼和調節序列，包括啟動子、增強子、多聚腺苷酸化信號、轉運已編碼蛋白質或肽所必需的序列，例如在一個實施方案中，用于將蛋白質或肽轉運到細胞或分泌物表面的N-端信號序列。基于基因產物要在其中表達的細胞的類型和基因產物所需的表達水平選擇用于調節基因產物表達的核苷酸序列(例如啟動子和增強子序列)。例如，可以使用已知能帶來與啟動子連接的基因的細胞類型特異性表達的啟動子。可以將對成肌細胞基因表達具有特異性的啟動子連接到相關基因上，以帶來該基因產物的肌肉特異性表達。本領域已知的肌肉特異性調控元件包括肌營養不良蛋白基因(Klamut等人(1989)Mo/.Ce//歷o/.9:2396)、肌酸激酶基因(Buskin和Hauschka，(1989)Mo/.Ce//歷o/.9:2627)和肌l^蛋白(Mar和Ordahl，(1988)iVoc.A/"W/.爿cad5W.C/5"A85:6404)的上游區。角蛋白基因中的負響應元件調節轉錄表達(JhoSh等人(2001).J.BidChem)。對其他細胞類型特異性的調控元件是本領域已知的(例如白蛋白增強子用于肝特異性表達；胰島素調控元件用于胰島細胞特異性表達；各種神經細胞特異性調控元件，包括神經肌營養不良蛋白、神經烯醇酶和A4淀粉樣物質啟動子)。可選地，可以使用能夠指揮各種不同細胞類型中的基因的組成型表達的調控元件，例如病毒調控元件。通常用于驅動基因表達的病毒啟動子的例子包括源自多瘤病毒、腺病毒2、巨細胞病毒(CMV)和猿猴病毒40和逆轉錄病毒LTR的那些。可選地，可以使用能提供與其連接的基因的可誘導表達的調控元件。可誘導調控元件(例如可誘導的啟動子)的使用允許操縱基因產物在細胞中的生成。用于真核細胞的潛在有用的可誘導調節系統的實例包括激素調節的元件(例如參見Mader,S.和White,J.H.(1993)Mz//.^cadt/&490:5603-5607)、合成配體調節的元件(參見例如Spencer,D.M.等人1993)5We"ce262:1019-1024)和電離輻射調節的元件(例如參見Manome，Y.等人(1993)及'oc/^wis燈32:10607-10613;Datta,R.等人(1992)iVoc.Ato/.C/5^89:1014-10153)。可能開發出來的其他組織特異性或可誘導調節系統也可以用于本發明。在一個實施方案中，本發明的調節序列可以包括CMV啟動子，而在另一實施方案中，所述調節序列可以包括CAG啟動子。在一個實施方案中，CAG啟動子是組合了人巨細胞病毒即刻早期增強子和修飾的雞P-肌動蛋白啟動子和第一內含子的復合啟動子。在一個實施方案中，調節序列可以包括猿猴病毒40(SV)-40多聚腺苷酸化序列，在一個實施方案中，所述序列是大多數信使RNA分子在真核細胞內在它們的3'末端終止的機理。在一個實施方案中，所述聚腺苷(poly-A)尾部保護mRNA分子免受核酸外切酶破壞，這對于轉錄終止、從核子中輸出mRNA和翻譯很重要。在一個實施方案中，本發明的制劑可以包含一個或多個調節序列。在一個實施方案中，本發明的包含CMV或CAG啟動子以及SV40的制劑顯示出EPO和IFN-a的長期、高體外(圖1、5和7B)和體內(圖6A)表達水平。不受理論的約束，可能有助于本發明微器官的長效、高水平基因產物的一個因素是使用CMV或者CAG作為啟動子，它們可能在微器官外植塊中對于啟動組成型基因表達特別有效。在一個實施方案中，術語"啟動子"指DNA序列，其在一個實施方案中處于編碼序列的直接上游并且對于基因的基礎和/或調節轉錄很重要。在一個實施方案中，本發明的啟動子與相關基因可操作地連接。在另一實施方案中，所述啟動子是內源性啟動子的突變體，在適當的條件下，所述內源性啟動子通常涉及相關基因的表達。在一個實施方案中，本發明組合物的啟動子和用于本發明方法中的啟動子是可調節的啟動子。在另一實施方案中，可調節的啟動子指使得下游基因的表達作為特定條件的發生或提供的功能而發生的啟動子，所述特定條件刺激特定啟動子的表達。在一些實施方案中，這樣的條件直接導致啟動表達，或者在其他實施方案中導致除去表達的障礙。在一些實施方案中，這樣的條件導致關閉或減少表達。在一個實施方案中，這樣的條件可以包括特定的溫度、養分、缺少養分、存在金屬或本領域技術人員已知的其他刺激物或環境因素。在一個實施方案中，可調節的啟動子可以通過半乳糖(例如UDP-半乳糖差向異構酶(GALIO)、半乳糖激酶(GALl))、葡萄糖(例如醇脫氫酶II(ADH2))或磷酸鹽(例如酸性磷酸酶(PH05))調節。在另一實施方案中，可調節的啟動子可以通過熱激(熱激啟動子)或化學品如IPTG或四環素等本領域技術人員已知的其他條件活化。酸和方法;包^，并:表本發明的實施方^。、、》'、、'在一個實施方案中，本發明的制劑和方法將治療性多肽或核酸的水平比基礎水平提高至少5%。在另一實施方案中，治療性多^:或核酸的水平比基礎水平提髙至少7%，在另一實施方案中提高至少10%，在另一實施方案中提高了至少15%，在另一實施方案中提高至少20%，在另一實施方案中提高至少25%，在另一實施方案中提高至少30°/。，在另一實施方案中提高至少40%，在另一實施方案中提高至少50%，在另一實施方案中提高至少60%，在另一實施方案中提高至少75%，在另一實施方案中提高至少100%，在另一實施方案中提高至少125%，在另一實施方案中提高至少150%，在另一實施方案中比基礎水平提高至少200%。在一個實施方案中，本發明的制劑使得治療性多^t或核酸的表達與"基礎水平"相比得到提高，在一個實施方案中，"基礎水平"是沒有給藥或以其他方式接觸本發明的治療制劑時宿主或細胞培養物中表達的基因水平。在另一實施方案中，本發明的制劑和方法將治療性多肽或核酸的水平提高到大約2000ng/天，或者在另一實施方案中為1500ng/天，或者在另一實施方案中為1000ng/天，或者在另一實施方案中為750ng/天，或者在另一實施方案中為5O0ng/天，或者在另一實施方案中為250ng/天，或者在另一實施方案中為150ng/天，或者在另一實施方案中為100ng/天，或者在另一實施方案中為75ng/天，或者在另一實施方案中為50ng/天，或者在另一實施方案中為25ng/天。在另一實施方案中，本發明的制劑和方法將治療性多肽的水平提高到20-70mU/mL，或者在另一實施方案中為50-100mU/mL，或者在另一實施方案中為5-20mU/mL，或者在另一實施方案中為100-200mU/mL，或者在另一實施方案中為10-70mU/mL，或者在另一實施方案中為5-80mU/mL。在另一實施方案中，本發明的制劑和方法將治療性多肽的水平提高到500-1000mU/mL，或者在另一實施方案中為250-750mU/mL，或者在另一實施方案中為500-5000mU/mL。在一個實施方案中，本發明的制劑和方法將功能標記(在一個實施方案中為血細胞比容水平)比基礎水平提高至少5%。在另一實施方案中，所述功能標記的水平比基礎水平提高至少7%，在另一實施方案中提高至少10%，在另一實施方案中提高至少15%,在另一實施方案中提高至少20%，在另一實施方案中提高至少25%，在另一實施方案中提高至少30%，在另一實施方案中提高至少40%，在另一實施方案中提高至少50%，在另一實施方案中提高至少60°/。，在另一實施方案中提高至少75%,在另一實施方案中提高至少100%，在另一實施方案中提高至少125%，在另一實施方案中提高至少150%，在另一實施方案中比基礎水平提高至少200%。在一個實施方案中，本發明的治療制劑是"長效的"，在一個實施方案中，長效制劑指能夠提高治療性多肽或核酸的分泌、表達、生成、循環或持久性的制劑。在一個實施方案中，治療性多肽或核酸的表達水平比基礎水平提高至少一個月，或者在另一實施方案中提高至少六個月。在另一實施方案中，血細胞比容的水平提高至少2周，在另一實施方案中提高至少3周，在另一實施方案中提高至少4周，在另一實施方案中提高至少5周，在另一實施方案中提高至少6周，在另一實施方案中提高至少8周，在另一實施方案中提高至少2個月，在另一實施方案中提高至少2個月，在另一實施方案中提高至少2個月，在另一實施方案中提高至少3個月，在另一實施方案中提高至少4個月，在另一實施方案中提高至少5個月，在另一實施方案中提高至少7個月，在另一實施方案中提高至少8個月，在另一實施方案中提高至少9個月，在另一實施方案中提高至少10個月，在另一實施方案中提高至少ll個月，或者在另一實施方案中提高至少1年。在另一實施方案中，治療性多肽或核酸的表達水平提高至少4-6個月。在一個實施方案中，將編碼治療性多肽或核酸的核酸序列優化以提高治療性多肽或核酸表達的水平，或者在另一實施方案中用于提高治療性多肽或核酸表達的持續時間，或者在另一實施方案中用于提供它們的組合。在一個實施方案中，術語"優化(的)"指期望的改變，在一個實施方案中，所述期望的改變指基因表達的改變，且在另一實施方案中指蛋白質表達的改變。在一個實施方案中，優化的基因表達指優化的基因表達調節。在另一實施方案中，優化的基因表達指基因表達提高。根據這方面并在一個實施方案中，意欲基因表達與野生型相比提高2倍至1000倍。在另一實施方案中，意欲基因表達提高2倍至500倍，在另一實施方案中，意欲基因表達提高2倍至100倍，在另一實施方案中，意欲基因表達提高2倍至50倍，在另一實施方案中，意欲基因表達提高2倍至20倍，在另一實施方案中，意欲基因表達提高2倍至10倍，在另一實施方案中，意欲基因表達提高3倍至5倍。在另一實施方案中，優化的基因表達可以是在特定環境條件下基因表達的提高。在另一實施方案中，優化的基因表達可以包括基因表達的降低，在另一實施方案中降低基因表達可以僅僅處于特定環境條件下。在另一實施方案中，優化的基因表達指基因表達的持續時間提高。根據這方面并在一個實施方案中，意欲基因表達的持續時間與野生型相比提高2倍至1000倍。在另一實施方案中，意欲基因表達的持續時間提高2倍至500倍，在另一實施方案中，意欲基因表達的持續時間提高2倍至100倍，在另一實施方案中，意欲基因表達的持續時間提高2倍至50倍，在另一實施方案中，意欲基因表達的持續時間提高2倍至20倍，在另一實施方案中，意欲基因表達的持續時間提高2倍至10倍，在另一實施方案中，意欲基因表達的持續時間提高3倍至5倍。在另一實施方案中，基因表達持續時間的增加是與無載體表達對照的表達相比，或者在一個實施方案中，通過轉錄沉默、低mRNA半衰期、交替剪接事件、過早多聚腺苷酸化、不足的核轉位和稀有tRNA池的可用性不足阻礙在哺乳動物細胞中的表達。在信息編碼轉基因時發現哺乳動物表達中的許多問題的來源，還包括許多重要哺乳動物基因的自體表達。哺乳動物RNA的優化可以包括修飾順式作用元件的修飾、其GC含量的適應、修改相對于哺乳動物細胞的非限制性tRNA池的密碼子偏倚、避免內部同源區和排除RNAi's。因此，在一個實施方案中，當依賴仔細設計合成基因時，可以在哺乳動物宿主內期望具有延長半衰期的穩定信息、組成型核輸出和高水平的蛋白質生成。因此，在一個實施方案中，優化基因需要使密碼子使用適應宿主基因的密碼子偏倚，在一個實施方案中，所述宿主基因為智人基因(i/omo^;/emgenes);調整極高(>80%)或極低(<30%)GC含量的區；避免一種或多種下列順式作用序列基元內部TATA-盒、chi-位點和核糖體進入位點；AT富集或GC富集序列伸展；ARE、INS、CRS序列元件；重復序列和RNA二級結構；(隱藏)剪接供位和受位、分支點；或它們的組合。在一個實施方案中，優化基因以在智人細胞中表達。在另一實施方案中，優化基因以在微器官中表達。在另一實施方案中，優化基因以在真皮細胞中表達。在一個實施方案中，如本文所證實的，與由無腸腺病毒載體表達的非優化的EPO或與由腺病毒5載體表達的非優化的EPO相比，優化的基因如EPO將峰值表達水平的上升百分比保持更長的時間(圖3和4)。在一個實施方案中，術語"基因"指能夠被表達為特定蛋白質的核酸片然基因(nativegene)"指在自然界中發現的;有其自身調節序列°的基因。"嵌合基因"指不是天然基因的任何基因，包括沒有在自然界中一起被發現的調節和編碼序列。因此，嵌合基因可以包括源自不同來源的調節序列和編碼序列，或者源自相同的來源、但排列方式與在自然界中發現的排列方式不同的調節序列和編碼序列。"內源基因"指在生物的基因組中處于其天然位置的天然基因。"外源"基因指通常沒有在宿主生物中發現，但通過基因轉移引入宿主生物中的基因。外源基因可以包括被插入非天然生物中的天然基因或嵌合基因。"轉基因"是通過轉換過程引入基因組內的基因。在一個實施方案中，所述治療性核酸可以是編碼RNA分子(有義或反義)、肽、多肽、糖蛋白、脂蛋白或它們的組合或任何其他修飾后多肽的任何基因。在本發明的一個實施方案中，相關基因可以是組織樣本中天然表達的。在本發明的另一實施方案中，所述組織樣本可以是經過遺傳加工的，從而至少一個細胞會表達相關基因，所述相關基因不是由細胞天然表達的或者在細胞內具有改變的表達特征。在一個實施方案中，本發明的治療性核酸可以編碼或者所述治療性多肽可以是美國專利申請序列號10/376,506中所列的任何蛋白質，該文獻全文納入本文作為參考。在一個實施方案中，所述遺傳修飾的微器官是遺傳修飾的真皮微器官。"真皮"微器官可以包括多個真皮組分，在一個實施方案中，真皮是位于表皮下面的皮膚部分。這些組分可以包括皮膚成纖維細胞、表皮細胞、其他細胞類型、毛囊基底、神經末梢、汗腺和皮脂汗、以及血管和淋巴管。在一個實施方案中，真皮微器官可以包括脂肪組織，其中在一個實施方案中，真皮微器官可以不包括脂肪組織。關于真皮微器官的進一步細節，包括收集、在培養基中保存和移植所述真皮微器官的方法描述于PCT專利申請WO2004/099363中，該文獻全文納入本文作為參考。在另一實施方案中，本發明提供在持續的時間內向有需要的個體提供治療性多肽的方法，所述方法包括提供一個或多個經遺傳修飾的微器官，所述微器官包含含有與一個或多個調節序列可操作地連接的核酸序列的載體；并將^f述經遺傳修飾的微器官植入所述個體中，其中所述核酸序列編碼治療性多肽，從而所述治療性核酸或多肽的表達水平比基礎水平提高超過5%，并且所述提高維持超過一個月。在另一實施方案中，本發明提供在持續的時間內向有需要的個體提供治療性多肽的方法，所述方法包括提供一個或多個經遺傳修飾的微器官，所述微器官包含含有與一個或多個調節序列可操作地連接的核酸序列的載體；并將所述經遺傳修飾的微器官植入所述個體中，其中所述核酸序列編碼治療性多肽，并且其中所述載體是輔助病毒依賴型腺病毒載體。在另一實施方案中，本發明提供在持續的時間內向有需要的個體提供治療性多肽的方法，所述方法包括提供一個或多個經遺傳修飾的微器官，所述微器官包含含有與一個或多個調節序列可操作地連接的核酸序列的載體；并將所述經遺傳修飾的微器官植入所述個體中，其中所述核酸序列編碼治療性多肽，并且其中所述載體是輔助病毒依賴型腺病毒載體。在另一實施方案中，上文所述的方法向有需要的個體提供治療性核酸，其中所述治療性核酸或多肽的表達水平比基礎水平提高超過5%，并且所述增加維持超過1小時、3小時、6小時、9小時、12小時、18小時、1天或2天，其中所述載體是輔助病毒依賴型腺病毒載體或其組合。在一個實施方案中，本發明提供上文所述的治療制劑，其中所述治療性多月太是紅細胞生成素，或者其中所述治療性核酸編碼紅細胞生成素。在另一實施方案中，本發明提供長效紅細胞生成素制劑，所述制劑包含經遺傳修飾的微器官，所述微器官包含含有與一個或多個調節序列可操作地連接的核酸序列的載體，其中所述核酸序列編碼紅細胞生成素，從而所述制劑將紅細胞生成素的水平比基礎水平提高超過5%，并且所述提高的紅細胞生成素水平持續超過一個月。在另一實施方案中，本發明提供向有需要的個體提供治療制劑的方法，其中所述治療性多肽是紅細胞生成素，或者其中所述治療性核酸編碼紅細胞生成素。在另一實施方案中，本發明提供向有需要的個體提供紅細胞生成素的方法。在另一實施方案中，本發明提供在持續的時間內向有需要的個體遞送紅細胞生成素的方法，所述方法包括提供一個或多個經遺傳修飾的微器官，所述微器官包含含有與一個或多個調節序列可操作地連接的核酸序列的載體；并將所述經遺傳修飾的微器官植入所述個體中，其中所述核酸序列編碼紅細胞生成素，從而紅細胞生成素的水平比基礎水平提高超過5%，并且所述提高的紅細胞生成素水平持續超過一個月。在另一實施方案中，本發明提供在持續的時間內誘導有需要的個體中形成新血細胞的方法，所述方法包括提供一個或多個經遺傳修飾的微器官，所述微器官包含含有與一個或多個調節序列可操作地連接的核酸序列的載體；并將所述經遺傳修飾的微器官植入所述個體中，其中所述核酸序列編碼紅細胞生成素，從而紅細胞生成素的水平比基礎水平提高超過5%，并且所述提高的紅細胞生成素水平持續超過一個月。在一個實施方案中，紅細胞生成素(EPO)是糖蛋白激素，其涉及將紅細胞系的始祖細胞成熟為紅細胞。在一個實施方案中，紅細胞生成素對于調節循環中的紅細胞水平是重要的。天然存在的紅細胞生成素由腎和肝產生，在血液中循環，并且在一個實施方案中，為響應缺氧而刺激骨髓生成紅細胞。在一個實施方案中，本發明組合物和方法的EPO可以包括與從人類或動物的尿、或者在另一實施方案中從人或動物的血漿中提取的與EPO相似的糖基化模式。編碼紅細胞生成素的基因的識別、克隆和表達描述于美國專利5,756,349;5,955,422;5,618,698;5,547,933;5,621,080;5,441,868和4，703,008，這些文獻納入本文作為參考。關于從支持哺乳動物細胞的生長的包含重組紅細胞生成素質粒的細胞培養基中純化重組紅細胞生成素的描述包含在例如Lai等人的美國專利4,667,016中，該文獻納入本文作為參考。通過遺傳工程技術產生重組紅細胞生成素涉及從用編碼紅細胞生成素的基因轉換的宿主細胞中體外表達蛋白質產物，所述重組紅細胞生成素己經被用于治療由慢性腎臟功能衰竭的貧血。目前，EPO被用于治療腎衰竭的貧血、與用齊多夫定(AZT)治療患者的HIV感染相關的貧血，以及與癌癥化療相關的貧血。給藥rhu-EPO.已經變成腎功能不全繼發性貧血的常規治療，其中使用每周給藥三次的50-75u/kg制劑來逐步恢復血細胞比容并消除輸液依賴性。用一種或多種寡糖基團修飾由真核細胞生成的許多細胞表面和分泌蛋白被稱為糖基化，糖基化能明顯影響蛋白質穩定性、分泌和亞細胞定位以及生物學活性。在一個實施方案中，源自人尿的紅細胞生成素和具有1-165個人紅細胞生成素氨基酸序列的重組紅細胞生成素(在哺乳動物細胞中表達)兩者均包含三個N連接和一個O連接寡糖鏈，它們一起構成糖蛋白總分子量的約40%。在一個實施方案中，與糖基化的但確實保留一些體外活性的形式相比，未糖基化的紅細胞生成素具有大大降低的體內活性。在一個實施方案中，本發明的組合物和用于本發明方法中的EPO是完全糖基化的，而在另一實施方案中，它們包括一些糖基化殘基，而在另一實施方案中，它們是未糖基化的。在一個實施方案中，所述EPO基因可以是野生型EPO基因，而在另一實施方案中，所述EPO基因可以是經過修飾的。在一個實施方案中，所述經過修飾的EPO基因可以是優化的。在一個實施方案中，所述EPO基因具有對應于基因庫登記號X02158;AF202312;AF202311;AF202309;AF202310;細53356;AF202306;AF202307或AF202308中所列的核酸序列，或者編碼對應于基因庫登記號CAA26095;AAF23134;AAF17572;AAF23133;AAC78791或AAF23132中所列的蛋白質序列。在另一實施方案中，所述EPO前體基因具有對應于基因庫登記號-NM—000799;M11319;BC093628或BC111937中所列的核酸序列，或者編碼對應于基因庫登記號NP—000790;AAA52400;AAH93628或AAI11938中所列的蛋白質序列。在另一實施方案中，所述EPO基因具有如SEQIDNo:7中所示的核酸序列，而在另一實施方案中，所述EPO基因具有如SEQIDNo:8中所示的氨基酸序列。在另一實施方案中，所述EPO基因具有與SEQIDNo:7中所示同源的核酸序列，而在另一實施方案中，所述EPO基因具有與SEQIDNo:8中所示同源的氨基酸序列。在一個實施方案中，本發明的制劑可以用于治療患有貧血的個體。在一個實施方案中，貧血定義為"紅細胞中攜氧血紅蛋白的量的病理性不足"。貧血的癥狀包括疲勞、覆行日常功能的能力下降、認知功能受損、頭痛、眩暈、胸痛和呼吸短促、惡心、抑郁、疼痛或它們的組合。在一個實施方案中，貧血涉及預后不良和升高的死亡率。貧血通常是腎衰竭致使由腎產生的紅細胞生成素下降的后果。在另一實施方案中，貧血是由于癌癥浸潤、淋巴瘤或白血病或骨髓移植致使由骨髓生成的紅細胞(類紅細胞)下降引起的。貧血的其他原因包括由于過度流血如出血或異常月經流血導致的血液損失；癌癥治療，如手術、放療、化療、免疫治療或它們的組合；癌性骨髓的浸潤或替換；溶血增加，在一個實施方案中是紅細胞的崩潰或破壞；低水平的紅細胞生成素或它們的組合。在一個實施方案中，貧血指范科尼貧血，在一個實施方案中，所述范科尼貧血是導致骨髓衰竭(再生障礙性貧血)并通常導致急性髓細胞源性白血病(AML)的遺傳性貧血。在另一實施方案中，貧血指戴-布二氏貧血、正常紅細胞性貧血、再生障礙性貧血、缺鐵性貧血、維生素缺乏性貧血、鐵粒幼細胞性貧血、陣發性睡眠性血紅蛋白尿、慢性病性貧血、腎疾病和透析中的貧血、或它們的組合。在另一實施方案中，本發明的長效EPO制劑被用于治療糖尿病個體。根據這方面并在一個實施方案中，本發明的EPO制劑可以與本領域已知的其他糖尿病治療聯合使用，所述治療特別包括給藥胰島素、口服降糖藥，在一個實施方案中所述降糖藥為磺酰脲(sulfonurea)藥物，在一個實施方案中所述磺酰脲藥物特別包括；利糖妥片、格列本脲、格列本脲微粉片劑(glynase)和亞莫利；格華止、噻唑烷二酮類，特別包括曲格列酮片劑、艾可拓和文迪雅；或它們的組合。在另一實施方案中，本發明的長效EPO制劑被用于治療患有慢性腎疾病的個體，而在另一實施方案中，被用于治療患有晚期腎臟病的個體。在另一實施方案中，本發明的制劑被用于易患上述疾病或病癥的個體。要理解本發明的制劑和方法可以用于治療貧血，無論貧血的原因是什么以及是否己知貧血的原因。在一個實施方案中，本發明的制劑和方法可以與有效治療貧血的其他治療一起給藥。在一個實施方案中，其他治療包括補鐵、補充維生素B12、額外來源的紅細胞生成素、雄激素、生長因子如G-CSF或它們的組合。在另一實施方案中，本發明的制劑和方法可以聯合其他治療如血液和骨髓干細胞移植進行給藥。在一個實施方案中，本發明提供如上文所述的治療制劑，其中所述治療性多肽是干擾素或其中所述治療性核酸編碼干擾素，在一個實施方案中，所述干擾素為干擾素a，在一個實施方案中所述干擾素a為干擾素a2a。在另一實施方案中，本發明提供包括經遺傳修飾的微器官的長效干擾素a制劑，所述微器官包含含有與一個或多個調節序列可操作地連接的核酸序列的載體，其中所述核酸序列編碼干擾素a,從而所述制劑將干擾素a的水平比基礎水平提高超過5%，且所述提高的干擾素a水平持續超過一個月。在另一實施方案中，本發明提供向有需要的個體提供治療制劑的方法，其中所述治療性多肽是干擾素，或者其中所述治療性多肽編碼干擾素，在一個實施方案中，所述干擾素為干擾素a，在一個實施方案中所述干擾素a為干擾素a2a。在另一實施方案中，本發明提供向有需要的個體提供治療性多肽即干擾素的方法，在一個實施方案中，所述干擾素為干擾素a，在一個實施方案中所述干擾素a為干擾素a2a。在一個實施方案中，干擾素是能夠在細胞上產生多效性效應如抗病毒、抗增殖和抗炎效應的多功能細胞因子。因為細胞對干擾素、干擾素a和干擾素P的這些響應，它們在臨床上已被發現可用于治療病毒性、增殖性和炎性疾病如多發性硬化、乙型肝炎、丙型肝炎和幾種形式的癌癥。干擾素治療也可以潛在地用于治療有三類主要的干擾素阿爾法(a)、貝塔(p)和伽馬(力。除了它們的抗病毒和抗致癌性質外，干擾素還能活化巨噬細胞和天然殺傷性淋巴細胞，并提高主要組織相容性復合物糖蛋白I類和II類。干擾素a由白細胞(B細胞和T細胞)分泌。干擾素P由成纖維細胞分泌，干擾素Y由T細胞和天然殺傷性淋巴細胞分泌。在一個實施方案中，所述治療性多肽是干擾素a，在另一實施方案中是干擾素P，或者在另一實施方案中是干擾素Y。在另一實施方案中，所述治療性多肽是干擾素a的任何亞型，包括但不限于1、2、4、5、6、7、8、10、13、14、16、17或21。在另一實施方案中，所述治療性多肽是干擾素co、￡、k或它們的同源物。在另一實施方案中，所述治療性多肽是干擾素？i或其同源物。在另一實施方案中，所述治療性多肽是千擾素i的任何亞型，包括但不限于白介素(IL)28A、IL28B或IL29。在另一實施方案中，所述治療性多肽是干擾素S、p、cj、S或它們的同源物。在一個實施方案中，IFN與特定細胞表面受體復合物結合，在一個實施方案中，所述特定細胞表面受體復合物為包含IFNAR1和IFNAR2鏈的干擾素a受體(IFNAR)，在另一實施方案中為包含兩個IFNGR1和兩個IFNGR2亞單位的干擾素Y受體(IFNGR)復合物，在另一實施方案中為包含IL10R2和IFNLRl的受體復合物。在一個實施方案中，干擾素通過JAK-STAT信號途徑傳遞信號。在一個實施方案中，本發明的制劑和方法中的干擾素是干擾素a。在一個實施方案中，本發明的制劑和方法中的干擾素是干擾素a2b。在一個實施方案中，IFN-a-2b是重組、未糖基化的165-氨基酸a干擾素蛋白，包含來自人類白細胞的IFN-a-2b基因。IFN-a-2b是I型、水溶性干擾素,分子量為19，271道爾頓(19.271kDa)。在一個實施方案中，IFN-a-2b的比活按照HPLC測定為約2.6x108(2億6千萬)國際單^/mg。在一個實施方案中，IFN-a-2b是I型干擾素中的一種，它屬于較大螺旋細胞因子超家族，該超家族包括生長激素、白介素、幾種集落刺激因子和幾種其他調節分子。它們都作為細胞活性的調節劑，通過與被稱為IFNAR1和IFNAR2的細胞表面受體復合物相互作用來起作用，并活化各種信號轉導途徑。干擾素在細胞內產生抗病毒和抗增殖響應。在一個實施方案中，本發明的長效IFN-a制劑可以用于預防或治療多毛細胞白血病、性病濕疣、卡波西肉瘤、慢性非甲非乙型肝炎、乙型肝炎或它們的組合。在另一實施方案中，本發明的長效IFN-a制劑可以給藥易患上述疾病或病癥中的一種的個體或者已經或將要暴露于感染劑的個體，如本文所述。在另一實施方案中，本發明的長效IFN-a制劑可以用于預防或治療丙型肝炎。根據這方面并在一個實施方案中，本發明的制劑可以與其他丙型肝炎治療同時或交替給藥，所述其他丙型肝炎治療特別包括利巴韋林、干擾素、聚乙二醇干擾素或它們的組合。在另一實施方案中，長效IFN-a制劑可以單獨或與化療劑聯合使用或評價各種其他細胞增殖性疾患，所述疾患包括慢性髓性白血病、多發性骨髓瘤、表淺膀胱腫瘤、皮膚癌(特別包括基底細胞癌和惡性黑素瘤)、腎細胞癌、卵巢癌、低級淋巴細胞和皮膚T細胞淋巴瘤和膠質瘤。在另一實施方案中，長:癌和乳腺癌產生的實;瘤。、在另二實施方案中，長"ffN-a制劑可以用于預防或治療多發性硬化。在另一實施方案中，長效IFN-a制劑可以用于預防或治療組織細胞疾病，在一個實施方案中，所述組織細胞疾病為埃爾德海姆-切斯特病(ECD)，在一個實施方案中該病是攻擊機體結締組織的潛在致命疾患，在一個實施方案中由組織細胞的過度生成引起，在一個實施方案中，過度生成的組織細胞在松散的結締組織中積累，使結締組織變厚變密。在另一實施方案中，長效IFN-a制劑可以用于預防或治療嚴重的眼貝切特病。在一個實施方案中，所述干擾素a基因具有對應于基因庫登記號K01900;M11003或M71246中所列的核酸序列，或者編碼對應于基因庫登記號AAA52716;AAA52724或AAA52713中所列的蛋白質序列。在一個實施方案中，所述干擾素卩基因具有對應于基因庫登記號:M25460;AL390882或CH236948中所列的核酸序列，或者編碼對應于基因庫登記號:AAC41702;CAH70160或EAL24265中所列的蛋白質序列。在一個實施方案中，所述干擾素Y基因具有對應于基因庫登記號J00219;AF506749;NM—000619或X62468中所列的核酸序列，或者編碼對應于基因庫登記號AAB59534;AAM28885;NP_000610或CAA44325中所列的蛋白質序列。在另一實施方案中，所述干擾素a基因具有如SEQIDNo:9中所示的核酸序列，而在另一實施方案中，所述干擾素a基因具有如SEQIDNo:10中所示的氨基酸序列。在另一實施方案中，所述干擾素a基因具有與SEQIDNo:9中所示同源的核酸，而在另一實施方案中，所述干擾素a基因具有與SEQIDNcK10中所示同源的氨基酸序列。在另一實施方案中，本發明提供在持續的時間內向有需要的個體遞送干擾素a的方法，所述方法包括提供一個或多個經遺傳修飾的微器官，所述微器官包含含有與一個或多個調節序列可操作地連接的核酸序列的載體；并將所述經遺傳修飾的微器官植入所述個體中，其中所述核酸序列編碼干擾素a，從而干擾素01的水平比基礎水平提高超過5%，并且所述提高的干擾素a水平持續超過一個月。在一個實施方案中，本發明的制劑和方法提供被優化用于提高由所述核酸編碼的治療性多肽的表達水平、持續時間或它們的組合的核酸。在另一實施方案中，本發明提供與SEQIDNo:l的同源性超過85%的核酸序列、包含這樣的核酸序列的載體，以及包含這樣的載體的細胞。在另一實施方案中，本發明提供與SEQIDNo:2的同源性超過85%的核酸序列、包含這樣的核酸序列的載體，以及包含這樣的載體的細胞。用于本文時，術語"同源性"在指代任何核酸序列時指候選序列的核苷酸的百分比與相應的天然核酸序列的核苷酸百分比相同。在一個實施方案中，術語"同源性"、"同源物"或"同源的"在任何情況下均指示所提及的序列在一個實施方案中顯示與所指示的序列的至少70%的一致。在另一實施方案中72%的一致。在另一實施方案中75%的一致。在另一實施方案中77%的一致。在另一實施方案中80%的一致。在另一實施方案中82%的一致。在另一實施方案中85%的一致。在另一實施方案中87%的一致。在另一實施方案中90%的一致。在另一實施方案中92%的一致。在另一實施方案中，所述核酸序列顯示與所指示的序列的至少，所述核酸序列顯示與所指示的序列的至少，所述核酸序列顯示與所指示的序列的至少，所述核酸序列顯示與所指示的序列的至少，所述核酸序列顯示與所指示的序列的至少，所述核酸序列顯示與所指示的序列的至少，所述核酸序列顯示與所指示的序列的至少，所述核酸序列顯示與所指示的序列的至少，所述核酸序列顯示與所指示的序列的至少,所述核酸序列顯示與所指示的序列的至少95%的一致。在另一實施方案中，所述核酸序列顯示與所指示的序列的95%-100%的一致。類似地，提及與特定序列的一致包括兩者直接一致，以及與本文定義的序列的同源性。可以通過本領域充分描述的方法，通過用于序列排列的計算機算法測定同源性。例如，核酸序列同源性的計算機算法分析可以包括利用任何數目的可用軟件包，比如例如BLAST、DOMAIN、BEAUTY(BLASTEnhancedAlignmentUtility)、GENPEPT和TREMBL程序包。測定同源性的另外的手段是通過測定核酸序列雜交，本領域充分描述了其方法(參見例如"NucleicAcidHybridization"Hames，B.D.和HigginsS.J.,Eds.(1985);Sambrook等人，1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual,(1-3巻)ColdSpringHarborPress,紐約；以及Ausubel等人1989，CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenPublishingAssociatesandWileyInterscience,紐約)。在一個實施方案中，可以在中等至苛刻條件下運行雜交方法。雜交條件為例如在包含下列成分的溶液中在42°C溫育過夜10-20%甲酰胺、5XSSC(150mMNaCl,15mM擰檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5XDenhardt溶液、10。/。硫酸右旋糖和20iig/ml變性的、剪切鮭精DNA。在一個實施方案中，本發明提供包含微器官的治療制劑及其使用方法。在一個實施方案中，治療微器官的制備包括(a)從供體個體中獲得多個微器官外植塊，所述多個微器官外植塊各自包含細胞群，所述多個微器官外植塊各自保持它們的來源器官的微結構，同時具有選定的維度，以允許充足的養分和氣體擴散到微器官外植塊的細胞內，使細胞廢物擴散到所述微器官外植塊之外，從而使由所述微器官外植塊中不足的營養和/或廢物的積累所致的細胞毒性和伴隨的死亡最小化；(b)遺傳修飾所述多個微器官外植塊，以獲得多個經遺傳修飾的微器官外植塊，所述微器官包含和分泌的蛋白質的至少一個氨基酸是不同的；并(c)將所述多個經遺傳修飾的微器官外植塊植入多個接受者個體中。在一個實施方案中，治療性微器官的制備按照PCT專利WO03/006669、WO03/03585和WO04/0993631中所述進行，這些文獻被全文納入本文作為參考。用于制備微器官并將其加工成經遺傳修飾的微器官的方法公開于WO2004/099363,該文獻全文納入本文作為參考。微器官包括限定的組織維度，從而確保養分和氣體擴散進入三維微器官的每個細胞，并確保細胞廢物充分擴散離開得到外植塊。在一個實施方案中，將微器官離體保存在基本培養基中，能夠保持延長的時間段，從而當使用病毒或非病毒載體將所需候選基因以受控的離體轉導方式結合到微器官的細胞中時，從而產生經遺傳修飾的微器官。在一個實施方案中，使用鉆子和鉆取針(coreingneedle)收集微器官，如下文所述。在另一實施方案中，使用收集系統收集微器官，所述收集系統在插入鉆取器的過程中利用真空保持皮膚緊繃和打開裂縫。在另一實施方案中，可以使用可用于收集真皮組織的任何工具收集適當尺寸的微器官，包括但不限于PCT申請WO04/099363中所述的那些工具和方法。可以通過本領域公知的許多方法將重組核酸引入到所述微器官中以產生經遺傳修飾的微器官或生物泵。可以利用核酸構建體以穩定或瞬時轉導微器官細胞。在穩定轉導中，將核酸分子整合到微器官細胞基因組中，這樣它就表現穩定和遺傳性狀。在瞬時轉導中，將所述核酸分子保留在轉導分子中作為附加體并被細胞表達，但它沒有被整合到基因組中。當所述轉導細胞由于附加體的損失成為迅速分裂細胞時，這樣的附加體可以導致瞬時表達，或者當其中所述轉導細胞是未分裂細胞時，這種附加體可以導致長期表達。通常，根據將所述序列引入所述微器官中的優選方法，將核酸序列亞克隆到特定載體內，如上文所述。一旦將所需的核酸片段亞克隆到特定載體內，它就變成重組載體。在一個實施方案中，微器官在遺傳修飾之前和之后在32°C溫育，而在另一實施方案中，它們在37°C溫育。在另一實施方案中，微器官在33°C、34°C、35。C、36。C、38°C、39。C、40。C、28。C、30。C、31。C、25。C、42。C或45。C溫育。在一個實施方案中，微器官在遺傳修飾之前和之后在10%(:02中溫育，而在另一實施方案中，它們在5%<:02中溫育。在另一實施方案中，微器官在12%0)2、15%C02、17%(:02或20%(:02中溫育。在另一實施方案中，微器官在2%<:02、6%C02、7%C02、8。/。C02或9。/。C02中溫育。在另一實施方案中，溫育溫度、co2濃度或它們的組合可以在遺傳修飾52之前、過程中或之后保持在單一溫度或濃度，而在另一實施方案中，溫育溫度、C02濃度或它們的組合可以在微器官的遺傳修飾之前、過程中或之后在不同的點進行調整。在另一實施方案中，微器官在85-100%濕度下溫育，在另一實施方案中為95%濕度，在另一實施方案中為90%濕度，在另一實施方案中為98%濕度。在一個實施方案中，可以使用本領域已知的任何方法檢測治療性核酸或多肽的水平。可以通過本領域常規使用的標準方法評價特定的表達載體系統和將核酸引入細胞內的方法的效能。例如，可以通過濾膜雜交技術(例如DNA印跡法)檢測引入細胞的DNA，可以通過例如RNA印跡法、RNA酶保護或逆轉錄酶-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測由誘導的DNA的轉錄產生的RNA。可以通過適當的測定法檢測基因產物，例如通過免疫學檢測產生的蛋白質，例如使用特異性抗體，或者通過功能測定法來檢測基因產物的功能活性，例如酶測定法。在一個實施方案中，可以使用ELISA、蛋白質印跡或放射性免疫測定來檢測蛋白質。如果要由細胞表達的相關基因產物不能容易地測定，可以首先使用與待用調控元件和載體連接的報道基西來優化表達系統。所述報道基因編碼能夠容易檢測的基因產物，因此能夠被用于評價系統的效能。本領域使用的標準報道基因包括編碼(3-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉移酶、螢光素酶和人生長激素的基因。因此，在一個實施方案中，在體外測量治療性多肽或核酸表達水平，而在另一實施方案中，在體內測量治療性多肽或核酸表達水平。在一個實施方案中，體外測定多肽或核酸的表達水平，在一個實施方案中為EPO水平，在另一實施方案中為IFN-a水平，允許通過測定微器官體外分泌的治療劑水平;評估所述治療劑的體外生成水平和分泌水平與體內血清水平之間的關系；并基于測定的分泌水平和估計的關系，確定要植入的治療制劑的量，來確定要植入患者體內的微器官的數目。在本發明的另一個優選實施方案中，多核苷酸也可以包括反式或順式作用增強子或阻抑物元件，它們調節所述微器官的細胞內、或被引入所述微器官內的另外的重組基因表達的內源基因的轉錄或翻譯。可以用于哺乳動物細胞的合適的翻譯或轉錄調控元件的許多實例是本領域已知的。例如，轉錄調控元件包括順式或反式作用元件，它們是激活特定啟動子的轉錄所必需的[(Carey等人，(1989),J.Mol.Biol.209:423-432;Cress等人,(1991),Science251:87-90;和Sadowski等人，(1988),Nature335:5631-564)]。翻譯激活劑的實例是花椰菜花葉病毒翻譯激活劑(TAV)[參見例如Futterer和Hohn，(1991)，EMBOJ.10:3887-3896]。在該系統中，產生雙順反子mRNA。也就是說，在同一mRNA內，由同一啟動子轉錄兩個編碼區。在缺少TAV吋，核糖體只翻譯第一順反子，然而在表達TAV的細胞中，兩個順反子都被翻譯。可以通過常規實踐的基因敲入技術將順式作用調控元件的多核苷酸序列引入微器官的細胞中。關于基因敲入/敲除方法學的綜述，參見例如美國專利5,487,992、5,464,764、5,387,742、5,360,735、5,347,075、5,298,422、5,288,846、5,221,778、5,175,385、5，175，384、5,175,383、4,736,866，且Burke和Olson,MethodsinEnzymology,194:251-270，1991;Capecchi,Science244:1288-1292，1989;Davies等人，NucleicAcidsResearch,20(11)2693-2698,1992;Dickinson等人，HumanMolecularGenetics,2(8):1299-1302，1993;Duff和Lincoln,"InsertionofapathogenicmutationintoayeastartificialchromosomecontainingthehumanAPPgeneandexpressioninEScells",ResearchAdvancesinAlzheimer'sDiseaseandRelatedDisorders,1995;Huxley等人,Genomics,9:742-7501991;Jakobovits等人，Nature,362:255-2611993;Lamb等人，NatureGenetics,5:22-29,1993;Pearson和Choi，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1993，90:10578-82;Rothstein,MethodsinEnzymology,194:281-301，1991;Schedl等人，Nature,362:258-261，1993;Strauss等人，Science,259:1904-1907，1993，WO94/23049、WO93/14200、WO94/06908和WO94/28123也提供了信息。為了專門評價重組產物的生成，也可能需要下調內源性序列。為此，可以使用反義RNA作為內源性序列滅活的手段。將與內源性mRNA序列互補的外源性多核苷酸編碼序列轉錄到所述微器官的細胞內。也可以通過本領域熟知的基因敲除技術完成向下調節("MolecularCloning:AlaboratoryManual"Sambrook等人，(1989);"CurrentProtocolsinMolecularBiology"VolumesI-IIIAusubel,R.M.，ed.(1994);Ausubel等人，"CurrentProtocolsinMolecularBiology",JohnWiley和Sons,Baltimore,Md.(1989);Perbal，"APracticalGuidetoMolecularCloning",JohnWiley&Sons,紐約(1988))。也可能需要過度表達重組產物。可以通過在各個載體中提供一個或多個編碼序列的高拷貝數來實現過度表達。這些外源性多核苷酸序列可以被置于哺乳動物表達載體的合適啟動子的轉錄控制下以調節它們的表達。在另一實施方案中，可以使用相同基因或幾種相關基因的多個副本作為提高多肽或核酸表達的手段。在一個實施方案中，通過DNA元件穩定表達，在另一實施方案中，所述DNA元件為基體相關區(MARs)或支架相關區(SARs)。在一個實施方案中，腺病毒載體是本發明組合物和用于本發明方法的載體。在使用腺病毒載體作為載體的實施方案中，輔助病毒依賴型腺病毒系統可以被用于一個實施方案，以制備表達治療性多肽或核酸的輔助病毒依賴型腺病毒載體來轉化微器官。在一個實施方案中，這樣的輔助病毒依賴型腺病毒系統包括輔助病毒依賴型腺病毒、輔助病毒，用于制備本發明制劑的生產細胞系如Palmer和Ng，2003MolTher8:846以及PalmerandNg，2004MolTher10:792中所述，這些文獻據此全文納入本文作為參考。在一個實施方案中，輔助細胞系被指定為293，其通過Ad5DNA片段由人胚腎細胞轉化并組成性地表達El蛋白質，所述輔助細胞系被用于產生和繁殖復制缺陷的腺病毒載體。在另一實施方案中，輔助細胞系可以源自人肌肉細胞、造血細胞或其他人胚胎間質細胞或上皮細胞。可選地，所述輔助細胞系可以源自許可人腺病毒的其他哺乳動物物種的細胞。這樣的細胞包括例如Vero細胞或其他猴胚胎間質細胞或上皮細胞。在一個實施方案中，將微器官離體保存一段時間，該時間可為幾小時到幾個月。在一個實施方案中，它們在植入前被保存了幾天，在另一實施方案中在植入前被保存了幾周。不受理論的約束，在一個實施方案中，所述溫育允許細胞處理和裂解病毒蛋白質，在一個實施方案中所述病毒蛋白質是作為病毒載體轉導的結果的病毒殼體。在一個實施方案中，殼體蛋白的這樣的翻轉發生在2-3天內，從而在一個實施方案中，在離體第10天時，即使有也剩下很少病毒殼體蛋白。在一個實施方案中，病毒殼體的裂解進一步減少了本發明制劑的免疫原性并提高了相關基因的表達水平和表達持續時間。在另一實施方案中，所述溫育允許早期HD-Ad載體誘導的先天免疫應答在體外發生，在一個實施方案中，在缺少腺基因轉錄時該響應不會持續超過24小時。在另一實施方案中，HD-Ad載體沒有引發由淋巴細胞浸潤和在另一實施方案中由Ad-特異性CTL誘導的后期適應性響應，所述響應通常在給藥轉錄活性第一代Ad載體之后，在一個實施方案中主要描繪了其特征。在一個實施方案中，將離體微器官以1.6-3xl(^感染微粒(ip)/ml、3-4xl012病毒顆粒/ml或2xl0"病毒顆粒/ml的劑量暴露于病毒載體。在另一實施方案中，將離體微器官以lxl03-lxl012病毒顆粒/ml，在另一實施方案中以lxl0Mxl09，在另一實施方案中以lxlO、lx109，在另一實施方案中以lxl0Mxl()U病毒顆粒/ml的劑量暴露于病毒載體。在一個實施方案中，在微器官內給藥個體的病毒顆粒/g機體體重的劑量小于lxl03，在另一實施方案中小于lxl02，在另一實施方案中小于lxl(^病毒顆粒/g個體體重。在一個實施方案中，使用生長因子提高微器官中細胞的數目。在一個實施方案中，可以在植入之前評價體外表達，從而能夠進行表達重組蛋白的體外與體內相關性研究。在本發明的一些實施方案中，由下列一種或多種因素確定包含待植入的遺傳修飾細胞的組織樣本的量基于調整原則常規向這些個體給藥的相關治療劑的相應量、用于類似個體的特定臨床方案或人口統計、在他/她以前已經通過注射或其他途徑接受治療劑如相關蛋白質的情況下，具體用于同一個體的相應量、個體的數據例如體重、年齡、身體狀況、臨床狀態、以前將遺傳修飾的細胞向其他類似個體給藥時組織樣本的藥代動力學數據、以前將遺傳修飾的細胞向該個體給藥時組織樣本的響應或它們的組合。因此，在一個實施方案中，體外測定一個或多個微器官的基因產物的表達水平，測定或估計治療性多肽或核酸的體外和體內表達水平之間的關系，基于計算或估計關系來確定要植入特定患者體內的微器官的數目。可以如前所述調整治療劑的劑量(WO200德9363)。在一個實施方案中，微器官或遺傳修飾的微器官可以在體外保持預定的(proscribed)時間段，直到需要將它們植入宿主中為止。在一個實施方案中，微器官或遺傳修飾的微器官可以在培養基中保持或貯存1-7天、1-8周或1-4個月。在另一實施方案中，包圍組織樣本的上清液培養基中剩余的治療劑可以被分離并注射或應用到相同或不同的個體中。作為可替換的或附加的，經遺傳修飾的微器官可以通過本領域已知的方法低溫保存，非限制性的實例為在由組織樣本形成后或在遺傳改變后，即刻在包含10%DMSO的DMEM中逐級冷凍(0。C、-20°C、-80°C、-196°C)。在一個實施方案中，本發明的制劑可以植入受疾病或疾患影響的器官或系統內，所述疾病或疾患可以通過使所述微器官定位于期望位點的方法或途徑來治療或預防。在另一實施方案中，植入制劑的位置遠離受疾病或疾患影響的器官或系統。因此，盡管在一個實施方案中，重組蛋白是局部釋放的，在另一實施方案中，所述重組蛋白擴散到淋巴系統內，在另一實施方案中，這會最終導致重組蛋白的全身分布。因此，本發明提供不同濃度的治療制劑用于治療在有需要的個體的任何部位中表現出的疾病或疾患的用途。根據這方面并且在一個實施方案中，本發明的制劑可被植入瘤內。在另一實施方案中，制劑可以植入遠離腫瘤的位置，在一個實施方案中這涉及腫瘤的特定類型的轉移。在另一實施方案中，本發明的制劑可以植入個體的腎內，在一個實施方案中是囊下植入。在另一實施方案中，本發明的制劑經腹腔鏡(laparascopically)植入。在一個實施方案中，本發明的制劑可以被單次植入用于急性治療短暫的病癥，或者可以被多次植入，尤其是在進行性、復發性或退行性疾病的情況中。在一個實施方案中，可以同時給藥本發明的一個或多個制劑，或者在另一實施方案中，它們可以以錯開的方式給藥。在一個實施方案中，所述錯開的方式可以依照疾病的階段或時期的指示。在一個實施方案中，將所述微器官植入個體中的期望位置，使得所述微器官的至少一部分細胞仍然有活力。在本發明的一個實施方案中至少約5%，在本發明的另一實施方案中至少約10%，在本發明的另一實施方案中至少約20%，在本發明的另一實施方案中至少約30%，在本發明的另一實施方案中至少約40%，在本發明的另一實施方案中至少約50%或更多的細胞在向個體給藥后仍然有活力。細胞在向個體給藥后的存活期可以短至幾小時，例如二十四小時，到幾天，到長至幾周或幾個月或幾年。在接受者個體中植入微器官提供了所述重組產物的持續劑量。可以在植入之前準備所述微器官以有效結合到宿主中，從而促進例如在植入組織內形成血管。重組產物因此可以在生產后立即遞送至拼周接受者循環中。可選地，可以在植入之前準備微器官以防止細胞粘附和有效結合到宿主中。防止血管形成的方法的實例包括將微器官包裝到用絲線或尼龍等制成的可商購的細胞密封限定直徑的生物學網袋如GORE-TEX袋(TerrillPJ,KedwardsSM，和LawrenceJC,(1991)TheuseofGORE-TEXbagsforhandbums.Bums17(2):161-5)中，或者用防止細胞粘附的材料如Teflon涂布的其他多孔膜中。然后可以通過例如設計用于受控遞送化合物如藥物、包括蛋白質型生物藥劑的聚合裝置遞送由微器官產生的基因產物。在本發明的語境中，各種生物學相容的聚合物(包括水凝膠)，包括可生物降解的和不可生物降解的聚合物兩者都可以用于形成將微器官的基因產物持續釋放到特定目標位置的植入物。這樣的植入物的產生是本領域公知的(參見例如ConciseEncyclopediaofMedical&DentalMaterials,ed.ByDavidWilliams(MITPress:Cambridge,Mass.,1990);Sabel等人的美國專利4，883，666;Aebischer等人的美國專利4,892,538;Aebischer等人的美國專利5，106，627;Lim美國專利4，391,909和Sefton美國專利4,353,888)。可以通過標準的外科技術，或者通過利用特殊改制的注射器，使用適合給藥微器官的注射器將微器官制劑注射到哺乳動物的預期組織區域內，來植入本發明的經遺傳修飾的微器官。在另一實施方案中，使用導管植入微器官。在一個實施方案中，PCT公布W0204/099363中所述的任何植入方法都可以使用并被認為是本發明的實施方案。在一個實施方案中，微器官被植入皮下、皮內、肌內、腹膜內或胃內。在一個實施方案中，術語"植入"排除作為裂縫厚度或完全厚度的皮膚移植物被移植。在本發明的一個實施方案中，用于植入的供體微器官優選由接受者哺乳動物(即自體)，或者由同源的哺乳動物的器官組織來制備，但異源和異種組織也可以用于制備所述微器官，條件是在植入之前、或者在植入過程中采取供應措施，以避免移植物排斥和/或移植物抗宿主病(GVHD)。用于本文時，GVHD指移植物抗宿主病，這是由對抗接受者宿主的移植免疫應答引起的組織移植(移植物)后果。更具體地，移植物抗宿主病是由供體T淋巴細胞(T細胞)引起的，它將接受者識別為外來物并攻擊接受者的細胞。用于防止或緩解移植物排斥或GVHD的許多方法是本領域己知的，并可用于本發明的方法。在一個實施方案中，為了便于將細胞群移植到可能經受宿主免疫攻擊的組織內，例如在使用異種移植如豬-人移植時，可以將微器官插入或包封到生物相容的免疫保護材料如可反復使用、不可生物降解或可生物降解的裝置內，然后移植到接受者個體中。在另一實施方案中，用于植入的供體微器官優選由供體制備，所述供體與接受者是人白細胞抗原(HLA)匹配的，在一個實施方案中，HLA是人體內的主要組織相容性復合物。在一個實施方案中，供體和接受者的I類主要組織相容性復合物(MHC)基因、II類MHC基因或它們的組合匹配。在一個實施方案中，I類MHC基因包括HLA-A、HLA-B和HLA-C，其中在一個實施方案中，I類MHC基因的不匹配增加了移植物排斥的危險，在一個實施方案中，II類MHC基因包括HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA、HLA-DRB1，其中在一個實施方案中，II類MHC基因的不匹配增加了GVHD的危險。在另一實施方案中，供體和接受者的HLA-DM和HLA-DO基因匹配。在一個實施方案中，通過本領域已知的技術增強病毒從離體細胞的周轉或消除，這樣的技術如物理方法(在一個實施方案中是加熱)、使用抗病毒劑、刺激細胞的病毒翻轉的藥劑等。在一個實施方案中，盡管本發明的長效制劑提高核酸或多肽表達的水平和持續時間，但核酸或多肽表達的水平沒有無限地升高。不受理論的約束，在一個實施方案中，作為表達重組核酸或多肽的分化真皮成纖維細胞的死亡的結果，由本發明的長效制劑表達的核酸或多肽的水平可以作為時間的函數而下降。實施例實驗材料和方法材料和設備清單制備培養基用于生長微器官并包含DMEM-HEPES培養基(高葡萄糖4,500mg/L和25mMHEPES;Hi-CloneCat#SH3A1448.02)，所述DMEM-HEPES培養基包含1%谷氨酰胺并添加有50ng/ml慶大霉素(RAFA實驗室，用于注射)和0.1。/。兩性霉素B(BMS,Fungizonel.V.)(在培養基中的最終濃度為2.5c:g/ml兩性霉素B)。在一些實驗中，將10%血清代替品添加物(SSS，IrvineScientific,Cat#99193)、10%自體人血清或10。/。胎牛血清(FBS或FCS)添加到制備培養基中。59真皮微器官的收集——同心針法從供體的下腹部區域的皮膚區域收集人皮膚微器官。為防止收集表皮，沿著直線，從要收集微器官的皮膚區域的一側切出經過角質層進入真皮的淺裂縫(l-2mm深)，在離第一個裂縫30mm處，平行地切出相似的裂縫。裂縫之間的距離決定了微器官長度并在整個實驗中保持恒定。將細口(通常為22GA)皮下注射用針連接到充滿無菌鹽水的1ml注射器上，將其插入第一個裂縫處的暴露真皮內并沿著收集位置的真皮向著對面的裂縫滑動，在必要時將針構成角度以使它在對面的裂縫處穿出真皮。接下來，用手術鉗沿著引導針的長度夾緊外部皮膚。稍微提起陷入真皮的針以抬高包圍它的皮膚區域，有時在夾緊皮膚之前，在插入皮下注射用針的點之下使用鉤形裝置來幫助提起皮膚。引導針的頂端從其出口點突出來，將其插入鉆取針(l-3mm直徑，PointTechnologies,COUSA)的尖銳前端內，鉆取針用可商購的鉆子(例如AesculapMicroSpeedGD650,GD657)支撐。將少量無菌鹽水從注射器中注射到鉆取針內。啟動鉆子，以高速(通常為3000-7000RPM)旋轉鉆取針，在旋轉的同時，將鉆子和鉆取針沿著引導針的軸手工向前推進，以切出30-40mm長度的圓柱形皮膚核心(真皮微器官)，其外徑大約為鉆取針的內徑。所述真皮微器官通常仍然附著在引導針上，將其從鉆取針內退出并放入制備培養基(如上所述)中，并將鉆取針從皮膚上取下。使用鑷子，將每個微器官轉移到24孔板的標記單個孔內，孔中包含1000口1制備培養基。為除去碎屑，用1000口1制備培養基將每個微器官的培養基再更換兩次。然后將包含1000口1制備培養基內的微器官的板轉移到在32。C、10%(:02和~95%濕度下保持平衡的溫育器中，經過24小時恢復期。病毒轉導將每個微器官轉移到48孔板的孔內進行轉導，該48孔板具有較小的孔，需要較小的總液體體積，來保存病毒。將培養基小心地從每個孔中移出，而不擾亂里面的微器官。在臨床前實驗過程中，測試了三種不同的載體1.6-3xio9感染粒子(ip)/ml第一代腺病毒(MolecularMedicine)、大約3-4xl012病毒顆粒/ml輔助病毒依賴型腺病毒(Baylor)、或大約2xl011病毒顆粒/ml腺伴隨病毒(UniversityofPennsylvania),它們分別包含重組人EPO基因、優化的重組人EPO基因或優化的IFN-a基因，將它們在包含或不含FCS的DMEM-HEPES(GibcoCat弁42430-025)中分別稀釋1:10、1:25、1:50、1:100、1:500或1:1000。向48孔板的每個孔中充入100|aL稀釋滴定度的病毒中的一種。將板放入C02溫育器內，通過在數字式微滴定振蕩器上以300rpm攪動2小時并在不振蕩的情況下再溫育16-22小時來幫助轉導。在轉導后，將轉導的微器官轉移到24孔板上，然后用制備培養基(不含FCS)洗滌三次，以除去非轉導的病毒顆粒。在洗滌后，將生物泵保持在lmL制備培養基中，處于濕度95%、10%C02和32。C的標準高濕度C02溫育器內。在除去病毒載體七十二小時后，用新鮮培養基代替制備培養基，并測定已消耗的培養基的等分部分的分泌重組蛋白水平。離體微器官保持每3-4天，收集用過的制備培養基，評價分泌的重組蛋白水平和葡萄糖水平以及生物泵的存活力。將新鮮制備培養基添加到24孔板內。分泌的蛋白質測量根據制造商的說明書，使用酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(Quantikine人紅細胞生成素；R&DSystems;人干擾素aELISA試劑盒，PBLBiomedicalLaboratories)來測定人EPO(hEPO)和IFNa濃度以及分泌水平。根據制造商的說明書，使用Sigma-AldrichCorporationGAGO20Glucose(GO)測定試劑盒評價組織葡萄糖消耗。血細胞比容測量根據制造商的說明書，使用Sigma-AldrichCorporationGAGO20Glucose(GO)測定試劑盒評價組織葡萄糖消耗。如本領域中已知，使用由國家臨床實驗標準委員會(NCCLS灘薦的參照法，使用離心測定血細胞比容水平。為測定血細胞比容，將試管中的全血在10-15，000xg離心5分鐘，以使紅細胞成丸(稱為濃縮紅細胞)，使用讀圖儀，在離心后10分鐘內測量濃縮紅細胞柱與毛細管中樣本總長的比率。微器官植入在一些實驗中，在測定組織葡萄糖消耗后，將經遺傳修飾的微器官或對照微器官皮下植入重癥聯合免疫缺陷(SCID)小鼠中，以確定微器官是有活力的。體重為約25克的雄性和雌性SCID小鼠被140|_U稀釋的Ketaset(鹽酸氯胺酮)(400plKetaset和600pl鹽水)麻醉或在微器官轉導10天后，將對照微器官或表達EPO的微器官皮下植入。實施例l由GMMO體外產生的EPO和IFNa水平如上所描述制備微器官并用與CAG啟動子連接的表達優化的IFNoc基因的輔助病毒依賴型腺病毒載體轉導，如上所述。然后將GMMO保持在培養基中，通過ELISA評價產生的IFNa的水平。在收集后至少40天中，表達優化的IFNa的微器官體外產生超過1000ng/天的IFNa(圖1)，在收集后至少142天中，表達重組hEPO的微器官體外產生超過1000ng/天的hEPO(圖2A-B)。與包含編碼hEPO的腺病毒-5載體的微器官相比，包含編碼優化的hEPO的無腸腺病毒載體的GMMO將更高的峰值表達百分比保持超過200天(圖3)。與包含編碼非優化的hEPO的無腸腺病毒載體的微器官相比，包含編碼優化的hEPO的無腸腺病毒載體的微器官也將更高的峰值表達百分比保持更長的時間(圖4)。最后，與包含CMV增強子下游的編碼hEPO的無腸腺病毒載體的微器官相比，包含CAG增強子下游的編碼hEPO的無腸腺病毒載體的微器官顯示出更高水平的hEPO表達，hEPO作為轉導后天數的函數生長得更顯著(圖5)。實施例2由保存在體外和HASCID小鼠血清中的表達人EPO的GMMO產生的EPO水平如上所描述制備表達EPO的微器官。在培養總共九天后，測量每個微器官產生的EPO的量，使用該值確定給每只小鼠植入表達相等水平的EPO的微器官。在第十天，將兩個微器官皮下植入每只SCID小鼠體內，在十天后進行的第一次測量時，在SCID小鼠血清中測量的hEPO水平明顯高于基線水平。在植入后至少216天內水平仍然高，SCID小鼠體內的血細胞比容在至少157天中明顯上升(圖6A)。在與植入的表達EPO的微器官相同的時間，從同一供體制備未植入的表達EPO的微器官，但將其保存在體外，所述微器官連續保持高水平的EPO生成(圖6B)。與用重組hEPO基因轉導的微器官相比，用包含優化的hEPO基因的載體轉導的微器官在體內(圖6A)和體外(圖6B購產生更高水平的EPO。在植入微器官后，與植入前相比，植入了不產生EPO的微器官的對照SCID小鼠沒有顯示出血清EPO水平上升和血細胞比容水平的明顯變化(圖6A)。包括表達EPO的腺病毒-5的微器官被用作陽性對照，相對于包括表達EPO的優化或非優化無腸腺病毒的微器官的1:100滴定度，陽性對照以1:10的滴定度使用。實施例3植入遺傳修飾微器官的人在臨床試驗中產生的EPO水平按照以前的描述(Lippin等人，2005，說ood106(7):2280-6，全文納入本文作為參考)進行臨床試驗，除了會如上文所描述收集和基因修飾微器官。I期臨床試驗在以色列進行，在患有慢性腎病的透析前貧血患者中植入本發明的持續型自體hEPO-GMMO。期望用GMMO-hEPO單次植入治療來提供4-6個月的有效EPO治療。I/II期GMMOhEPO試驗經以色列衛生部批準并在Hadassah醫療部門進行。關于所需規定和臨床標準的所有步驟均符合FDA要求，以便于基于美國的臨床試驗。在準備計劃的臨床試驗時，在SCID小鼠中進行所需的臨床前毒理學研究。這些研究按照前面所述(Brill-Almon等人M/ecw/wT7^ra;;;12(2),274-282)進行，具有超過20天的附加的時間點。在符合FDAGMP的工廠中制備用于臨床試驗的HD-Ad-hEPO載體以符合用于患者時所要求的FDA原則(GMP)。將GMMO植入四到六個月，然后在試驗結束時除去或切除，或者如果PI要求并經倫理委員會批準，可延長時間。如表1所示，毒理學研究包括三組SCID小鼠，具有相等數目的雄性和雌性個體。由于SCDI小鼠的高死亡率，每組包括了大量動物。表1.實驗設計<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>第一組中，每只動物最多接受單個真皮30mmhEPOGMMO或者更可能是一部分GMMO，它們分泌100-150IUEPO/天。由于每只小鼠重量為大約25克，因此該劑量等于4,000-6000IU/天/kg小鼠(為建議植入人類患者的最高預期劑量的25倍或更多)。由于GMMO的小尺寸以及這種小尺寸對其處理的影響，植入組織的尺寸通常相當于整個GMMO的至少1/4。第二組中，每只動物最多接受單個真皮30mmhEPOGMMO或者更可能是一部分GMMO，它們會分泌300-450IUEPO/天。由于小鼠重量為大約25克，因此該劑量等于12，000-18，000IU/天/kg小鼠(為建議植入人類患者的最高預期劑量的80-120倍或更多)。在第三組，即對照組，每只動物接受三分之一(10mm)30mm真皮非轉導的G固O。在測量由GMMO體外產生的實際每日蛋白質的量后，通過調整GMMO的數目或尺寸，控制植入前的GMMO-hEPO給藥。在上面所列的實驗方案中，用與我們在臨床試驗中所用相tl的病毒滴定度轉導微器官，從而將GMMO中的細胞暴露至相似的多重感染。這些GMMO產生的分泌hEPO的一般水平在300-1000IU/生物泵/天的范圍內。因此，預期由1/3BP(相當于1.0cm)和2/3BP(相當于2.0cm)分泌的最低EPO的量分別為大約100IU和200IU。通過植入短于0.5cm的片段，可以降低小鼠中的劑量。基于我們前面臨床試驗的結果，預期大約1500-3500IU/70kg患者(或1-3個G謹O)足以引起網狀細胞的持續生成并導致血細胞比容上升。因此，從植入25克小鼠中的單個GMMO或GMMO片段分泌的IOOIUEPO，是我們建議植入人類患者的最高預期劑量的至少25倍或更高。因此，在該研究中使用至少1/4GMMO即可提供充分的安全裕度(safetymargin)以測試GMMO-EPO在小鼠中的毒理學效應并支持臨床劑量。正如我們已經證明的，來自多例人類腹部皮膚樣本GMMO的hEPO分泌水平為大約300->1000IU/天。盡管來自相同的皮膚樣本的GMMO的分泌水平相似，但不同皮膚樣本之間的變異性較高。正如我們己經證明，通過在植入前測量體外分泌水平，在GMMO植入小鼠中之前解決劑量變異性。除了組織學，整個研究都會在GLP下完成。組織學玻片會由一組經認證的病理學家盲態審核。要進行的試驗包括64臨床體征每天體重隔天器官重量心、肝、腎、脾、腦、胸腺(如果能夠找到)會在最后處死時測定臨床化學在最后處死時完整的血液學特征在最后處死時。要包括血清hEPO水平和血細胞比容。臨床病理學在最后處死時組織學包括植入位點、肝、腎、淋巴結、心、脾、骨髓及在尸檢和骨髓中發現的任何損傷都會在最后處死時進行檢査。所有其他器官都會被保存用于未來分析。與涉及細胞的瞬時轉導的其他方法或迅速翻轉的細胞相比，本發明的長效EPO制劑包含不再復制的細胞。因此，所述EPO制劑從穩定的構建體產生穩定的蛋白質并被預期會繼續產生已經表征過的蛋白質。權利要求1.長效治療制劑，其包含經遺傳修飾的微器官，所述微器官包含含有與一個或多個調節序列可操作地連接的核酸序列的載體，其中所述核酸序列編碼治療性多肽，從而所述制劑將所述治療性多肽的表達水平比基礎水平提高超過5％，且所述提高的水平持續超過一個月。2.權利要求l的制劑，其中所述調節序列包含CAG啟動子。3.權利要求l的制劑，其中所述調節序列包含CMV啟動子。4.權利要求l的制劑，其中所述調節序列包含SV40多聚腺苷酸化序列。5.權利要求l的制劑，其中所述載體是源自病毒的。6.權利要求5的制劑，其中所述源自病毒的載體源自腺病毒。7.權利要求6的制劑，其中所述腺病毒是輔助病毒依賴型腺病毒。8.權利要求5的制劑，其中所述源自病毒的載體源自腺伴隨病毒(AAV)載體。9.權利要求l的制劑，其中所述載體是質粒。10.權利要求l的制劑，其中所述載體是小環DNA質粒。11.權利要求l的制劑，其中編碼所述治療性多肽的所述核酸序列被優化以提髙所述治療性多肽的表達水平、持續時間或它們的組合。12.權利要求l的制劑，其中所述經遺傳修飾的微器官是經遺傳修飾的真皮微器官。13.權利要求l的制劑，其中所述治療性多肽是紅細胞生成素。14.權利要求l的制劑，其中所述治療性多肽是干擾素a。15.權利要求14的制劑，其中所述干擾素a是干擾素a2b。16.在持續的時間內向有需要的個體提供治療性多肽的方法，所述方法包括a.提供包含一個或多個經遺傳修飾的微器官的制劑，所述微器官包含含有與一個或多個調節序列可操作地連接的核酸序列的載體；并b.將所述經遺傳修飾的微器官植入所述個體中，其中所述核酸序列編碼所述治療性多肽，從而所述治療性多肽水平比基礎水平提高超過5%，且所述提高的治療性多肽表達水平維持超過一個月。17.權利要求16的方法，其還包括在步驟(b)之前測定所述治療性多肽的體外表達水平的步驟。18.權利要求16的方法，其還包括測定所述治療性多肽的體內表達水平的步驟。19.權利要求16的方法，其中所述調節序列包含CAG啟動子。20.權利要求16的方法，其中所述調節序列包含CMV啟動子。21.權利要求16的方法，其中所述調節序列包含SV40多聚腺苷酸化序列。22.權利要求16的方法，其中所述載體是源自病毒的。23.權利要求22的方法，其中所述源自病毒的載體源自腺病毒。24.權利要求23的方法，其中所述腺病毒是輔助病毒依賴型腺病毒。25.權利要求22的方法，其中所述源自病毒的載體源自腺伴隨病毒(AAV)載體。26.權利要求16的方法，其中所述載體是質粒。27.權利要求16的方法，其中所述載體是小環DNA質粒。28.權利要求16的方法，其中編碼所述治療性多肽的所述核酸序列被優化以提高所述治療性多肽的表達水平、持續時間或它們的組合。29.權利要求16的方法，其中所述經遺傳修飾的微器官是經遺傳修飾的真皮微器官。30.權利要求16的方法，其中所述治療性多肽是紅細胞生成素。31.權利要求16的方法，其中所述治療性多肽是干擾素a。32.權利要求31的方法，其中所述干擾素a是干擾素a2b。33.長效紅細胞生成素制劑，所述制劑包含經遺傳修飾的微器官，所述微器官包含含有與一個或多個調節序列可操作地連接的核酸序列的載體，其中所述核酸序列編碼紅細胞生成素，從而所述制劑將紅細胞生成素水平比基礎水平提高超過5%，所述提高的紅細胞生成素水平維持超過一個月，且其中所述載體是輔助病毒依賴型腺病毒載體。34.權利要求33的制劑，其中所述調節序列包含CAG啟動子。35.權利要求33的制劑，其中所述調節序列包含CMV啟動子。36.權利要求33的制劑，其中所述調節序列包含SV40多聚腺苷酸化序列。37.權利要求33的制劑，其中所述載體是源自病毒的。38.權利要求37的制劑，其中所述源自病毒的載體源自腺病毒。39.權利要求38的制劑，其中所述腺病毒是輔助病毒依賴型腺病毒。40.權利要求37的制劑，其中所述源自病毒的載體源自腺伴隨病毒(AAV)載體。41.權利要求33的制劑，其中所述載體是質粒。42.權利要求33的制劑，其中所述載體是小環DNA質粒。43.權利要求33的制劑，其中編碼紅細胞生成素的所述核酸序列被優化以提高紅細胞生成素的表達水平、持續時間或它們的組合。44.權利要求43的制劑，其中所述優化的核酸序列與SEQIDNo:l的同源性超過85%。45.權利要求33的制劑，其中所述經遺傳修飾的微器官是經遺傳修飾的真皮微器官。46.在持續的時間內治療有需要的個體中的貧血的方法，所述方法包括a.提供一個或多個經遺傳修飾的微器官，所述微器官包含含有與一個或多個調節序列可操作地連接的核酸序列的載體；并b.將所述經遺傳修飾的微器官植入所述個體中，其中所述核酸序列編碼紅細胞生成素；其中所述載體是輔助病毒依賴型腺病毒載體；且從而紅細胞生成素的水平比基礎水平提高超過5%，且所述提高的紅細胞生成素水平維持超過一個月。47.權利要求46的方法，其還包括在步驟(b)之前測定所述紅細胞生成素的體外水平的步驟。48.權利要求46的方法，其還包括測定所述紅細胞生成素的體內水平的步驟。49.權利要求46的方法，其中所述調節序列包含CAG啟動子。50.權利要求46的方法，其中所述調節序列包含CMV啟動子。51.權利要求46的方法，其中所述調節序列包含SV40多聚腺苷酸化序列。52.權利要求46的方法，其中所述載體是源自病毒的。53.權利要求52的方法，其中所述源自病毒的載體源自腺病毒。54.權利要求53的方法，其中所述腺病毒是輔助病毒依賴型腺病毒。55.權利要求52的方法，其中所述源自病毒的載體源自腺伴隨病毒(AAV)載體。56.權利要求46的方法，其中所述載體是質粒。57.權利要求46的方法，其中所述載體是小環DNA質粒。58.權利要求46的方法，其中編碼紅細胞生成素的所述核酸序列被優化以提高紅細胞生成素的表達水平、持續時間或它們的組合。59.權利要求58的方法，其中所述優化的核酸序列與SEQIDNo:l的同源性超過85%。60.權利要求46的方法，其中所述經遺傳修飾的微器官是經遺傳修飾的真皮微器官。61.權利要求46的方法，其中所述個體是糖尿病患者。62.權利要求46的方法，其中所述個體患有晚期腎病。63.長效干擾素(x制劑，其包含經遺傳修飾的微器官，所述微器官包含含有與一個或多個調節序列可操作地連接的核酸序列的載體，其中所述核酸序列編碼干擾素01，從而所述制劑將干擾素01水平比基礎水平提高超過5%，所述提高的干擾素(x水平維持超過一個月，且其中所述載體是輔助病毒依賴型腺病毒載體。64.權利要求63的制劑，其中所述調節序列包含CAG啟動子。65.權利要求63的制劑，其中所述調節序列包含CMV啟動子。66.權利要求63的制劑，其中所述調節序列包含SV40多聚腺苷酸化序列。67.權利要求63的制劑，其中所述載體是源自病毒的。68.權利要求67的制劑，其中所述源自病毒的載體源自腺病毒。69.權利要求68的制劑，其中所述腺病毒是輔助病毒依賴型腺病毒。70.權利要求67的制劑，其中所述源自病毒的載體源自腺伴隨病毒(AAV)載體。71.權利要求63的制劑，其中所述載體是質粒。72.權利要求63的制劑，其中所述載體是小環DNA質粒。73.權利要求63的制劑，其中編碼干擾素a的所述核酸序列被優化以提高干擾素a的表達水平、持續時間或它們的組合。74.權利要求73的制劑，其中所述優化的核酸序列與SEQIDNo:2的同源性超過85%。75.權利要求63的制劑，其中所述經遺傳修飾的微器官是經遺傳修飾的真皮微器官。76.權利要求63的制劑，其中所述干擾素a是干擾素a-2b。77.在持續的時間內將干擾素a遞送到有需要的個體中的方法，所述方法包括a.提供經遺傳修飾的微器官，所述微器官包含含有與一個或多個調節序列可操作地連接的核酸序列的載體；并b.將所述經遺傳修飾的微器官植入所述個體中，其中所述核酸序列編碼干擾素a;其中所述載體是輔助病毒依賴型腺病毒載體；且從而干擾素01水平比基礎水平提高超過5%,且所述提高的干擾素a水平維持超過一個月。78.權利要求77的方法，其還包括在步驟(b)之前測定所述干擾素a的體外水平的步驟。79.權利要求77的方法，其還包括測定所述干擾素a的體內水平的步驟。80.權利要求77的方法，其中所述調節序列包含CAG啟動子。81.權利要求77的方法，其中所述調節序列包含CMV啟動子。82.權利要求77的方法，其中所述調節序列包含SV40多聚腺苷酸化序列。83.權利要求77的方法，其中所述載體是源自病毒的。84.權利要求83的方法，其中所述源自病毒的載體源自腺病毒。85.權利要求84的方法，其中所述腺病毒是輔助病毒依賴型腺病毒。86.權利要求83的方法，其中所述源自病毒的載體源自腺伴隨病毒(AAV)載體。87.權利要求77的方法，其中所述載體是質粒。88.權利要求77的方法，其中所述載體是小環DNA質粒。89.權利要求77的方法，其中編碼干擾素(x的所述核酸序列被優化以提高干擾素a的表達水平、持續時間或它們的組合。90.權利要求89的方法，其中所述優化的核酸序列與SEQIDNo:2的同源性超過85%。91.權利要求77的方法，其中所述經遺傳修飾的微器官是經遺傳修飾的真皮微器官。92.權利要求77的方法，其中所述個體患有感染。93.權利要求92的方法，其中所述感染是肝炎。94.權利要求77的方法，其中所述個體患有或易患有癌癥。95.權利要求94的方法，其中所述癌癥是多毛細胞白血病。96.權利要求94的方法，其中所述癌癥是惡性黑素瘤。97.權利要求94的方法，其中所述癌癥是多發性骨髓瘤。98.權利要求94的方法，其中所述癌癥是腎細胞癌。99.權利要求94的方法，其中所述癌癥是卡波西肉瘤。100.核酸序列，其與SEQIDNo:1的同源性超過85%。101.載體，其包含權利要求100的核酸序列。102.細胞，其包含權利要求101的載體。103.核酸序列，其與SEQIDNo:2的同源性超過850/0。104.載體，其包含權利要求103的核酸序列。105.細胞，其包含權利要求104的載體。全文摘要本發明涉及長效治療制劑及其使用方法，其中所述制劑包含含有載體的經遺傳修飾的微器官，所述載體包含與一個或多個調節序列可操作地連接的核酸序列，其中所述核酸序列編碼治療性多肽如紅細胞生成素或干擾素α。文檔編號A61K48/00GK101610793SQ200780042395公開日2009年12月23日申請日期2007年9月12日優先權日2006年9月14日發明者A·L·珀爾曼申請人:邁德詹尼克斯醫療以色列有限公司