溶瘤彈狀病毒的制作方法

專利名稱：溶瘤彈狀病毒的制作方法
溶瘤彈狀病毒
背景技術：
本發明要求于2006年9月15日提交的美國臨時申請系列60/844,726的優先權， 所述臨時申請系列的全部內容通過引用合并入本文。I.發明領域本發明總地說來涉及病毒學和藥物。在某些方面，本發明涉及溶瘤病毒，特別 是非VSV溶瘤彈狀病毒和包含非VSV糖蛋白的溶瘤彈狀病毒。II.背景許多病毒已顯示在許多種腫瘤細胞中復制并且在體外殺傷它們(辛德比斯病 毒(Unno等人，2005)、仙臺病毒(Kinoh等人，2004)、柯薩奇病毒(Shafren等人， 2004)、單純皰疹病毒(Mineta等人，1995)、細小病毒(Abschuetz等人，2006)、腺病 毒(Heise等人，2000)、脊髓灰質炎病毒(Gromeier等人，2000)、新城疫病毒(Sinkovics and Horvath, 2000)、水泡性口膜炎病毒(Stojdl 等人，2000)、麻疹病毒(Mealesviras) (Grote等人，2001)、呼腸病毒(Coffey等人，1998)、逆轉錄病毒(Logg等人，2001)、 痘苗病毒(Vaccinia) (Timiryasova 等人，1999)、和流感病毒(Influenza) (Bergmann 等人， 2001))。此外，此類病毒已證明在治療癌癥的動物模型中是有功效的。水泡性口膜炎病毒(VSV)為熟知的和詳盡研究的彈狀病毒，已顯示其在細胞培 養實驗中殺傷腫瘤細胞系，并且已經證明其在多種基底細胞癌(rodentcancer)模型中的功 效(Stojdl等人，2000; Stojdl等人，2003)。然而，VSV不殺傷所有癌細胞。發明概述幾種新鑒定的彈狀病毒在殺傷特定的癌癥或癌細胞系方面比VSV更加有效得 多。此外，VSV和減毒的VSV突變體具有神經毒性并且在嚙齒類和靈長類動物中引發 CNS病狀。幾種彈狀病毒不影響CNS (即，Muir Spring s和Bahia Grande Kerschner等 人，1986)，并且顯示更可接受的安全特征。此外，基于新的彈狀病毒的治療可用于治療 CNS的原發性和繼發性癌癥。本發明的彈狀病毒(和/或其他溶瘤劑(oncolytic agent)) 可接連用于規避抗特定治療性病毒的宿主免疫反應。這將允許長期治療和提高功效。本發明的實施方案包括涉及非VSV彈狀病毒的組合物和方法以及它們用作抗癌 治療劑的用途。此類彈狀病毒具有在體外和體內殺傷腫瘤細胞的性質。如本文所使用的，非VSV彈狀病毒將包括一種或多種下列病毒或其變體 Araj as virus、金迪普拉病毒(Chandipura virus)、科卡病毒(Cocal virus)、伊斯法罕病 毒(Isfahiin virus)、Maraba病毒、皮理病毒(Piry virus)、水泡性口炎阿拉戈斯病毒、 BeAn 157575 病毒、博特克病毒(Boteke virus)、Calchaqui 病 毒、美洲鰻病毒(Eel virus American)、格雷洛奇病毒(Gray Lodge virus)、朱羅納病毒(Jurona virus)、克拉馬斯病毒 (Klamath virus) > 克瓦塔病毒(Kwatta virus)、La Joya 病毒、Malpais Spring 病毒、芒特埃 爾崗蝙蝠病毒(MountElgonbatviras)、Perinet 病毒、Tupaia 病毒、Farmington> 大巴伊 亞病毒(Bahia Grande virus)、MuirSprings 病毒、Reed Ranch 病毒、哈特公園病毒(Hart Park virus)、費蘭杜病毒(Flanders virus)、凱米其j 病毒(Kamese virus)、Mosqueiro 病毒、莫蘇里病毒(Mossuril virus)、巴魯病毒(Bararviras)、Fukuoka病毒、克恩峽谷病毒 (Kern Canyon virus)、恩科比遜病毒(Nkolbisson virus)、禾丨J丹特病毒(Le Dantec virus)、 Keuraliba 病毒、Connecticut 病毒、新明托病毒(New Minto virus)、莎草病毒(Sawgrass virus)、查可病毒(Chaco virus)、SenaMadureira 病毒、蒂姆博病毒(Timbo virus)、阿爾 姆皮瓦病毒(Almpiwar virus)、阿魯卡病毒(Aruac virus)，班戈蘭病毒(Bangoranviras)、 卞博病毒(Bimbo virus)、BivensArm病毒、Blue crab病毒、查里維勒河病毒(Charleville virus)、 Coastal Plains 病毒、DakArK 7292 病毒、Entamoeba 病毒、力口巴病毒(Garba virus) > 戈薩其jf病毒(Gossas virus)、Humpty Doo病毒、約英杰卡卡(Joinjakaka)病毒、肯 納曼格拉姆病毒(Kannamangalam viras)、禾斗隆各病毒(Kolongo virus)、Koolpinyah病毒、 Kotonkon 病毒、蘭德幾亞病毒(Landjia virus)、Manitoba 病毒、馬可病毒(Marcoviras)、 Nasoule病毒、納瓦魯病毒(Navarro virus)、Ngaingan病毒、Oak-Vale病毒、奧博第安 病毒(Obodhiang virus)、奧衣塔(Oita)病毒、奧安戈(Ouango)病毒、帕里河病毒(Parry Creekviras)、Rio Grande cichlid 病毒、圣德吉姆巴病毒(Sandjimbaviras)、西格馬病毒 (Sigma virus)、Sripur 病毒、SweetwaterBranch 病毒、Tibrogargan 病毒、Xiburema 病毒、 雅塔病毒(Yatavirus)、羅得島(Rhode Island)病毒、Adelaide River 病毒、Berrimah 病毒、 金伯禾1J病毒(Kimberley viras)或牛失fi暫熱病毒(Bovine ephemeral fever viras)。 在某些方 面，非VSV彈狀病毒可以指Dimarhabdovirus的超級群(定義為能夠感染昆蟲和哺乳動物 細胞的彈狀病毒)。在特定的實施方案中，彈狀病毒不是VSV。在特定的方面所述非 VSV彈狀病毒是Carajas病毒、Maraba病毒、Farmington> Muir Springs病毒和/或大巴 伊亞病毒，包括其變體。
本發明的一個實施方案包括方法和組合物，其包含溶瘤非VSV彈狀病毒或編碼 彈狀病毒N、P、M、G和/或L蛋白，或其變體(包括其嵌合體和融合蛋白)的一種或 多種的重組溶瘤非VSV彈狀病毒，所述變體與下列病毒的N、P、M、G和/或L蛋白具 有至少或至多 20、30、40、50、60、65、70、75、80、85、90、92、94、96、98、99、 100% (包括其間的所有范圍和百分數)的氨基酸同一性，所述病毒是Arajasviras、金迪 普拉病毒、科卡病毒、伊斯法罕病毒、Maraba病毒、皮理病毒、水泡性口炎阿拉戈斯病 毒、BeAn 157575病毒、博特克病毒、Calchaqui病毒、美洲鰻病毒、格雷洛奇病毒、朱 羅納病毒、克拉馬斯病毒、克瓦塔病毒、La Joya病毒、Malpais Spring病毒、芒特埃爾崗 蝙蝠病毒、Perinet病毒、Tupaia病毒、Farmington>大巴伊亞病毒、Muir Springs病毒、 Reed Ranch病毒、哈特公園病毒、費蘭杜病毒、凱米斯病毒、Mosqueiro病毒、莫蘇里病 毒、巴魯病毒、Fukuoka病毒、克恩峽谷病毒、恩科比遜病毒、利丹特病毒、Keuraliba病 毒、Connecticut病毒、新明托病毒、莎草病毒、查可病毒、Sena Madureira病毒、蒂姆博 病毒、阿爾姆皮瓦病毒、阿魯卡病毒、班戈蘭病毒、卞博病毒、Bivens Arm病毒、Blue crab病毒、查里維勒河病毒、Coastal Plains病毒、DakArK 7292病毒、Entamoeba病毒、 加巴病毒、戈薩斯病毒、Humpty Doo病毒、約英杰卡卡病毒、肯納曼格拉姆病毒、科隆 各病毒、Koolpinyah病毒、Kotonkon病毒、蘭德幾亞病毒、Manitoba病毒、馬可病毒、 Nasoule病毒、納瓦魯病毒、Ngaingan病毒、Oak-Vale病毒、奧博第安病毒、奧衣塔病 毒、奧安戈病毒、帕里河病毒、Rio Grande cichlid病毒、圣德吉姆巴病毒、西格馬病毒、 Sripur 病毒、SweetwaterBranch 病毒、Tibrogargan 病毒、Xiburema 病毒、雅塔病毒、羅德島病毒、Adelaide River病毒、Berrimah病毒、金伯利病毒或牛短暫熱病毒。這些病毒 的任何 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、 45、50、55、60、65、70、75、80、85種或更多種(包括其間的所有整數或范圍)可明確
地不包括在所述范圍內。VSV或任何非VSV彈狀病毒可以是可向其中整合入變體G蛋 白或其他病毒蛋白的背景序列。在本發明的另一個方面，非VSV彈狀病毒或其重組體可包含編碼一種或多種非 VSV彈狀病毒的N、P、M、G或L蛋白(包括其嵌合體和融合蛋白)的至少或至多10、 20、30、40、45、50、60、65、70、80、90、100、125、175、250 個或更多連續氨基酸 (包括其間的所有值和范圍)的核酸片段。在某些實施方案中，嵌合G蛋白可包括VSV 或非VSV G蛋白的細胞質部分、跨膜部分或細胞質及跨膜部分。本發明的方法和 組合物可包括第二治療性病毒例如溶瘤或復制缺陷型病毒。溶 瘤劑通常是指能夠殺傷、裂解癌細胞或停止癌細胞的生長的試劑。對于溶瘤病毒，該術 語是指在某種程度上可在癌細胞中復制，引起癌細胞死亡、裂解或癌細胞生長停止并且 通常對非癌細胞具有最小的毒性效應的病毒。第二病毒包括但不限于腺病毒、痘苗病 毒、新城疫病毒、甲病毒、細小病毒、皰疹病毒、彈狀病毒、非VSV彈狀病毒等。在其 他方面，組合物是藥學上可接受的組合物。組合物還可包括第二抗癌劑，例如化學治療 齊U、放射治療劑或免疫治療劑。本發明的另外的實施方案包括殺傷過度增殖(hyperproliferative)的細胞的方法， 該方法包括將細胞與分離的溶瘤彈狀病毒組合物接觸；或另外的方法包括治療癌癥患者，包括施用有效量的溶瘤彈狀病毒組合物。在本發明的某些方面，細胞可包含在患者中，其可以是過度增殖的細胞、贅生 性細胞、癌前細胞、癌細胞、轉移性細胞(metastaticcell)或已轉移的細胞(metastasized cell)。可對具有易于被至少一種非VSV彈狀病毒或包括非VSV彈狀病毒的治療方案或 組合物殺傷的細胞的患者施用非VSV彈狀病毒。可單獨地或以各種組合施用具有1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10或更多種非VSV彈狀病毒或重組非VSV彈狀病毒的治療性組 合物1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。施用的組合物可具有10、100、IO3, 104、105、IO6、107、IO8、109、1010、1011、IO12、1013、IO14 或更多病毒顆粒或空斑形成 單位(pfu)。可通過腹膜內、靜脈內、動脈內、肌內、皮內、皮下或鼻內施用來進行給 藥。在某些方面，可全身性，特別是通過血管內施用(其包括注射、輸注等)施用組合 物。本發明的方法還可包括施用第二抗癌治療，例如第二治療性病毒。在特別的方面， 治療性病毒可以是溶瘤病毒，更特別地非VSV彈狀病毒。在其他方面，第二抗癌劑是化 學治療劑、放射治療劑、免疫治療劑、手術等。本發明的實施方案包括涉及VSV彈狀病毒的組合物和方法，其包括異源G蛋白 和它們作為抗癌治療劑的用途。此類彈狀病毒具有體外和體內殺傷腫瘤細胞的性質。如本文中所使用的，異源G蛋白包括非VSV彈狀病毒。非VSV彈狀病毒將包 括一種或多種下列病毒或其變體Arajas病毒、金迪普拉病毒、科卡病毒、伊斯法罕病 毒、Maraba病毒、皮理病毒、水泡性口炎阿拉戈斯病毒、BeAn 157575病毒、博特克病 毒、Calchaqui病毒、美洲鰻病毒、格雷洛奇病毒、朱羅納病毒、克拉馬斯病毒、克瓦塔 病毒、La Joya病毒、Malpais Spring病毒、芒特埃爾崗蝙蝠病毒、Perinet病毒、Tupaia病毒、Farmington>大巴伊亞病毒、Muir Springs病毒、Reed Ranch病毒、哈特公園病 毒、費蘭杜病毒、凱米斯病毒、Mosqueiro病毒、莫蘇里病毒、巴魯病毒、Fukuoka病 毒、克恩峽谷病毒、恩科比遜病毒、利丹特病毒、Keuraliba病毒、Connecticut病毒、新 明托病毒、莎草病毒、查可病毒、Sena Madureira病毒、蒂姆博病毒、阿爾姆皮瓦病毒、 阿魯卡病毒、班戈蘭病毒、卞博病毒、Bivens Arm病毒、Blue crab病毒、查里維勒河病 毒、Coastal Plains病毒、Da kArK7292病毒、Entamoeba病毒、加巴病毒、戈薩斯病毒、 Humpty Doo病毒、約英杰卡卡病毒、肯納曼格拉姆病毒、科隆各病毒、Koolpinyah病 毒、Kotonkon病毒、蘭德幾亞病毒、Manitoba病毒、馬可病毒、Nasoule病毒、納瓦魯病 毒、Ngaingan病毒、Oak-Vale病毒、奧博第安病毒、奧衣塔病毒、奧安戈病毒、帕里河 病毒、Rio Grandecichlid病毒、圣德吉姆巴病毒、西格馬病毒、Sripur病毒、Sweetwater Branch病毒、Tibrogargan病毒、Xiburema病毒、雅塔病毒、羅德島病毒(RhodeIsland)、 Adelaide River病毒、Berrimah病毒、金伯利病毒或牛短暫熱病毒。在某些方面，非VSV 彈狀病毒可以指Dimarhabdovirus的超級群(supergroup)(定義為能夠感染昆蟲和哺乳動 物細胞的彈狀病毒)。在特定的方面，非VSV彈狀病毒是Carajas病毒、Maraba病毒、 Muir Springs病毒和/或大巴伊亞病毒，包括其變體。
本發明的一個實施方案包括方法和組合物，其包含含有異源G蛋白的溶瘤VSV 彈狀病毒或重組溶瘤VSV彈狀病毒，所述重組溶瘤VSV彈狀病毒編碼非VSV彈狀病毒 N、P、M、G和/或L蛋白，或其變體(包括其嵌合體和融合蛋白)的一種或多種，所 述變體與非VSV彈狀病毒的N、P、M、G和/或L蛋白具有至少或至多20、30、40、 50、60、65、70、75、80、85、90、92、94、96、98、99、100% (包括其間的所有范圍 和百分數)的氨基酸同一性。在本發明的另一個實施方案中，包含異源G蛋白的VSV彈狀病毒或其重組體可 包含核酸，所述核酸包含編碼非VSV彈狀病毒的N、P、M、G或L蛋白(包括其嵌合 體和融合蛋白)的至少或至多 10，20、30、40、45、50、60、65、70、80、90、100、 125、175、250個或更多連續氨基酸(包括其間所有值和范圍)的核酸片段。在某些方 面，嵌合G蛋白可包含VSV或第二非VSV病毒或非VSV彈狀病毒的細胞質部分、跨膜 部分或細胞質及跨膜部分。本發明的方法和組合物可包括第二治療性病毒，例如溶瘤病毒或復制缺陷型病 毒。第二病毒包括但不限于腺病毒、痘苗病毒、新城疫病毒、皰疹病毒、彈狀病毒、非 VSV彈狀病毒等。在其他方面，組合物是藥學上可接受的組合物。組合物還可包括第二 抗癌劑，例如化學治療劑、放射治療劑或免疫治療劑。本發明的另外方面包括殺傷過度增殖的細胞的方法，所述方法包括將細胞與分 離的溶瘤彈狀病毒、包含異源G蛋白分子的VSV、或非VSV彈狀病毒組合物接觸。另 外的方法包括癌癥患者的治療，所述治療包括施用有效量的此類病毒組合物。在本發明的某些方面，細胞可包含在患者中，其可以是過度增殖的細胞、贅生 性細胞、癌前細胞、癌細胞、轉移性細胞或已轉移的細胞。可對具有易于被至少一種 病毒或包括病毒的治療方案或組合物殺傷的細胞的患者施用本發明的病毒。可單獨地 或以各種組合施用具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種病毒的治療性組合物 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。施用的組合物可具有10、100、IO3, 104、ΙΟ5、ΙΟ6、ΙΟ7、ΙΟ8、ΙΟ9、ΙΟ10、ΙΟ11、ΙΟ12、ΙΟ13、IO14個或更多病毒顆粒或空斑形成單位 (pfo)。可通過腹膜內、靜脈內、動脈內、肌內、皮內、皮下或鼻內施用來進行給藥。在 某些方面，可全身性，特別是通過血管內施用(其包括注射、輸注等)施用組合物。本 發明的方法還可包括施用第二抗癌治療，例如第二治療性病毒。在特定的方面，治療性 病毒可以是溶瘤病毒，例如包含異源G蛋白的VSV，更特別地非VSV彈狀病毒。在其 他方面，第二抗癌劑是化學治療劑、放射治療劑、免疫治療劑、手術等。本發明的其他實施方案通過本申請來進行描述。關于本發明的一個方面所描述 的任何實施方案同樣可用于本發明的其他方面，反之亦然。發明詳述和實施例部分的實 施方案理解為可用 于本發明的所有方面的本發明的非限定性實施方案。術語“抑制”、“減少”或“預防”或這些術語的任何變型，當用于權利要求 和/或說明書時，包括任何可測量的減少或完全抑制以獲得期望的結果。期望的結果包 括但不限于癌性或過度增殖狀況的減輕、減少、減緩或根除以及生命的提高的質量或延 長。詞匯“一”或“一個”的用途，當與權利要求和/或說明書中的術語“包 括”、“包含”結合使用時，可以表示“一”，但其也與“一個或多個”、“至少一 個”和“一個或多于一個”的意義一致。在整個本申請中，術語“大約”用于表示值包括用于測定值的裝置或方法的誤 差的標準差。除非明確指出表示只是選擇性的或選擇是相互排斥的，權利要求中的術語 “或”用于表示“和/或”的意義，盡管公開內容支持只表示選擇性的和“和/或”的定義。如本說明書和權利要求中所使用的，詞匯“包含”(和包含的任何形式，例如 “包括”和“含有”)、“具有”(和具有的任何形式，例如“擁有”和“有”)、“包
括”(和包括的任何形式，例如“包含”和“含有”)或“含有”(和含有的任何形式， 例如“包含”和“包括”)是包括界限端點的或兩端未封閉的(open-ended)并且不排除 額外的、未引述的元件或方法步驟。本發明的其他目的、特征和有利方面將通過下列詳細描述而變得顯然。然而， 應當理解，詳細描述和具體實例，當表示本發明的特定實施方案時，僅通過舉例說明的 方式來給出，因為根據下面的詳細描述，本發明的精神和范圍內的各種改變和修飾對于 本領域技術人員將變得很明顯。附圖概述下列附圖構成了本說明書的部分并且用于進一步例證本發明的某些方面。參考 一個或多個這些附圖和本文中提供的特定實施方案的詳細描述可更好地理解本發明。

圖1.基于N蛋白的相對保守區域(119個氨基酸)的GDE比對，和使用副粘病毒 人副流感病毒1 (HPIV-I)作為外類群產生的彈狀病毒之間的系統發生關系。通過鄰接法 (Neighbor Joining Method)產生進化樹和使用1000個樹replica評估自展支持率(bootstrap value)(對于各分支節點所指示的)。分支長度與遺傳距離成正比。標尺條相應于每氨基 酸位點的置換(Courtesy of H.Badrane and P.J.Walker)。圖2.體外腫瘤細胞殺傷測定的總結。用不同病毒的系列稀釋物感染來自NCI 60細胞組(cell panel)的細胞，進行96小時。使用結晶紫染色法測定細胞生存力以檢測殘留 的存活細胞。根據所得的細胞殺傷曲線計算EC5tl，并且將其總結于表格中。為了明了， 將EC5tl值轉化成圖例說明中描述的1至7的值。此外，陰影用于標示EC5tl范圍(即， 最暗至最亮表示最高的EC5tl至最低的EC5tl值)。病毒縮寫如下MS = Muir Springs、 BG=大巴伊亞病毒、NGG = Ngaingan、TIB = Tibrogargan、FMT = Farmington、MRB =Maraba、CRJ = Carajas、VSVHR =水泡性口膜炎病毒HR株系和VV =痘苗病毒 JX-963。該數據表明并非所有彈狀病毒具有相同的溶瘤性，事實上密切相關的彈狀病毒 在相同腫瘤細胞系中行為非常不同。因此，目前不存在預測具有溶瘤潛力的彈狀病毒的 方法。需要經驗檢測來鑒定良好的溶瘤候選病毒。圖3A-3B.腫瘤細胞系中彈狀病毒的生產力。用不同的彈狀病毒(MOI = 3)感 染SNB 19人成膠質細胞瘤和NCI H226人肺癌細胞系，并在一段時間內通過空斑測定就 病毒的產量對其進行監測。數據顯示并非所有彈狀病毒在這些腫瘤細胞系中具有相同的 復制能力。NCIH226細胞在病毒生產力方面顯示巨大的差異，大巴伊亞病毒根本不產生 病毒，然而Maraba病毒卻能夠產生大量有感染性的病毒體。
圖4.從質粒DNA形式回收重組彈狀病毒的拯救系統的圖示。在該實施例中， 已將Maraba病毒克隆入DNA質粒(在T7啟動子和來自丁型肝炎病毒的核酶(rybozyme) 序列之間)。用T7表達痘苗病毒感染A549細胞，然后用經基因工程改造而表達GFP的 Maraba基因組載體轉染所述細胞。純化被拯救的病毒體，然后將其用于感染Vero細胞， 進行24小時，從而當通過熒光顯微術顯現時，在這些細胞中導致GFP表達。圖5.生物選擇溶瘤彈狀病毒的改良株系。彈狀病毒是準種(quasi-species)。大巴 伊亞病毒不是神經致病性的(neuropathogenic)但具有殺傷人成膠質細胞瘤細胞的能力。 本發明者預期提高其毒性但同時保持其對于癌細胞的選擇性。為了提高彈狀病毒對于腫 瘤細胞的毒性，本發明者選擇在人成膠質細胞瘤細胞系中具有增加的復制能力的病毒突 變體。簡而言之，使用2.5X IO6個病毒顆粒感染5X IO5個SNB19細胞，即MO I為5。 初次接種物具有200 μ 1的體積，并且在用PBS清洗細胞10次之前進行1小時感染。通 過空斑測定就病毒顆粒分析最后的清洗物以確保輸入病毒的恰當清除。在不斷增加的時 間點上，收集整個上清液，然后更換新鮮培養基。將收集的培養基用于感染新細胞以進 行擴增，并通過空斑測定就病毒顆粒的存在對其進行分析。對于第一代，測定在第4、 8、12和24hpi(感染后的小時)直至病毒釋放的初始時間上產生的收集物。將來自最早 時間點的病毒擴增回IO6個的群體，然后再傳代(re-passed)。圖6.生物選擇溶瘤彈狀病毒的改良株系。在本實施例中，大巴伊亞病毒經歷多 達6輪重復的生物選擇。在感染后第4、6和8小時就SNB19細胞中的病毒產量監測親 本株系(WT)和第4至6代的傳代株系。初始病毒復制速度的明確和漸進的提高在不斷 增加的生物選擇輪次中是很明顯的。MRB = Maraba病毒，其用作在癌細胞系中快速的 和期望的病毒復制的示例。圖7.經歷13輪生物選擇的大巴伊亞病毒P13。該病毒不僅在生物選擇方案中使 用的人成膠質細胞瘤(glioblastoma)中而且在不相關的人成膠質細胞瘤和人卵巢癌細胞系 上顯示提高的病毒復制。這證明可生物選擇彈狀病毒以提高它們的溶瘤性質并且這些提 高對其他不同的癌癥是有效的。
圖8.用指定的病毒顱內感染Balb/C小鼠并且就發病率和/或死亡率對其進行監 測。野生型VSV(HR株系)和VSV的ΔΜ51突變體株系都具有極強的神經毒性，顯示 后肢在感染的數天內麻痹，然而大巴伊亞病毒和Muir Springs病毒顯示沒有神經毒性。大 巴伊亞病毒P6是在人成膠質細胞瘤細胞中具有提高的復制的大巴伊亞病毒的經生物選擇 的株系。該株系也顯示沒有神經毒性，表明可生物選擇彈狀病毒以提高對腫瘤細胞的毒 性同時保持它們在正常健康組織中的安全特征。圖9.與金迪普拉病毒和WT VSV和Δ 51 VSV相比，Maraba和Carajas彈狀病毒
的體內功效。通過在左乳腺、后乳腺中注射IO6個腫瘤細胞在5-8周齡的Balb/C雌性小鼠 中建立4T1腫瘤(表達螢火蟲熒光素酶)。一周后，在第1和第2天靜脈內注射小鼠(每 劑量=IO7PfuWT V SV、Δ 5IGFP VSV> Maraba 或金迪普拉病毒；或 108pfo Carajas)。使 用IVIS 200 (Xenogen)通過生物發光成像測定腫瘤響應(測量為光子/s/cm2)。圖10.用伊斯法罕病毒G蛋白和VSV G蛋白假型化的G-IessVSV的感染性。圖11.VSVWT、伊斯法罕病毒和RVRIsfGl病毒的一步生長曲線。圖12.包含伊斯法罕病毒G蛋白的RVR保持溶瘤性質。評估伊斯法罕病毒、 VSV d51和RVRIsfGl對各種癌細胞系的細胞毒性。圖13A-13C.包含IsfGl的RVR能夠在體內逃脫對VSV的免疫反應。體內熒光 素酶檢測用于測定用RVRIsfGl或VSV接種的小鼠中的病毒的量。圖13A，注射入初次 接受實驗的小鼠的重組病毒的體內檢測。圖13B，注射入用VSV免疫的小鼠的VSV的 體內檢測。圖13C，注射入用VSV免疫的小鼠的重組RVRIsfGl病毒的體內檢測。圖14.來自感染的腫瘤的病毒產量。在使用VSV的免疫存在或不存在的情況下 (如所指示的)用重組病毒或VSV感染腫瘤。圖解數據顯示通過腫瘤的感染產生的病毒 的量。圖15.VSVWT、金迪普拉病毒和RVRchaG1的一步生長曲線。結果顯示重組體產 生與VSV相同量的病毒。圖16.VSVWT、金迪普拉病毒和RVRchaG1的細胞毒性。結果顯示重組體是與 VSV細胞毒性一樣。圖17.VSVWT、Maraba病毒和RVRlvfaG1的一步生長曲線。結果顯示重組病毒 滴度在第48和72小時比VSV大。 圖18.VSV WT> Maraba病毒和RVRmmG1的細胞毒性。結果顯示maraba和 RVRmmG1在腫瘤細胞系中都是有細胞毒性的并且它們對于腫瘤細胞通常比VSV WT更具 細胞毒性。發明詳述本發明的方面基于非VSV彈狀病毒或假型化的彈狀病毒對幾個類型或種類的癌 細胞的殺傷作用，所述癌細胞抗VSV的殺傷作用。這些溶瘤彈狀病毒和重組彈狀病毒的 一些有利方面包括下列方面(1)抗發明的彈狀病毒的抗體極少不存在于大多數世界人 口中。(2)彈狀病毒比其他溶瘤病毒例如腺病毒、呼腸病毒、麻疹病毒、細小病毒、逆轉 錄病毒和HSV復制更快。(3)彈狀病毒可培養至高滴度，并且可通過0.2微米的濾器過 濾。(4)溶瘤彈狀病毒和其重組體具有廣譜宿主性，能夠感染許多不同種類的癌細胞并且 不受特定細胞上的受體的限制(例如，柯薩奇病毒、麻疹病毒、腺病毒)。(5)本發明的彈狀病毒易于進行遺傳操作。(6)彈狀病毒也具有細胞質生活周期并且不整合入宿主細胞 的遺傳物質，這賦予了更有利的安全特征。本發明的實施方案包括涉及非VSV彈狀病毒或假型化的彈狀病毒的組合物和方 法和它們作為抗癌治療劑的用途。I、彈狀病毒科(Family Rhabdoviridae)(彈狀病毒)
原型彈狀病毒是狂犬病病毒和水泡性口膜炎病毒(VSV)，該病毒科研究最詳盡 的病毒。盡管這些病毒共有相似的形態學，但它們在它們的生活周期、宿主范圍和病理 學方面極其不同。彈狀病毒是具有非節段(_)有義RNA基因組的子彈狀病毒的科。存 在超過250種已知的感染哺乳動物、魚、昆蟲和植物的彈狀病毒。該科分為至少5個屬 (1)狂犬病病毒屬包括狂犬病病毒、其他哺乳動物病毒、一些昆蟲病毒；(2)水泡性病 毒屬包括水泡性口膜炎病毒(VSV) ； (3)短暫熱病毒屬包括牛短暫熱病毒(脊椎動 物)；(4)質型彈狀病毒屬包括萵苣壞死黃化病毒(植物)；和(5)核型彈狀病毒屬 包括馬鈴薯黃矮病毒(植物)。也已表明，存在包括多種感染哺乳動物和昆蟲的彈狀病毒 的稱為Dimarhabdoviras的彈狀病毒的超級群。彈狀病毒科包括但不限于Arajas病毒、金迪普拉病毒(AF128868/gi 4583436，AJ810083/gi 57833891，AY871800/gi 62861470, AY871799/gi 62861468， AY871798/gi 62861466, AY871797/gi 62861464, AY871796/gi 62861462，AY871795/gi 62861460, AY871794/gi 62861459, AY871793/gi 62861457，AY871792/gi 62861455, AY871791/gi 62861453)、科卡病毒(AF045556/ gi 2865658)、伊斯法罕病毒(AJ810084/gi 57834038)、Maraba 病毒(SEQ ID NO 1-6)、Carajas 病毒(SEQ ID NO 7-12，AY335185/gi 33578037)、皮理病毒(D26175/ gi: 442480，Z15093/gi 61405)、水泡性 口炎阿拉戈斯病毒、BeAn 157575 病毒、博 特克病毒、Calchaqui病毒、美洲鰻病毒、格雷洛奇病毒、朱羅納病毒、克拉馬斯病毒、 克瓦塔病毒、La Joya病毒、Malpais Spring病毒、芒特埃爾崗蝙蝠病毒(DQ457103/ gi|91984805), Perinet 病毒(AY854652/gi 71842381), Tupaia 病毒(NC_007020/gi 66508427)、Farmington> 大巴伊亞病毒(SEQ ID NO 13-18)，Muir Springs 病毒、 ReedRanch 病毒、哈特公園病毒、費蘭杜病毒(AF523199/gi 25140635，AF523197/ gi 25140634，AF523196/gi 25140633，AF523195/gi 25140632，AF523194/gi 25140631，AH012179/gi 25140630)、凱米斯病毒、Mosqueiro 病毒、莫蘇里病毒、巴 魯病毒、Fukuoka病毒(AY854651/gi 71842379)、克恩峽谷病毒、恩科比遜病毒、利 丹特病毒(AY854650/gi 71842377)、Keuraliba 病毒、Connecticut 病毒、新明托病毒、 莎草病毒、查可病毒、Sena Madureira病毒、蒂姆博病毒、阿爾姆皮瓦病毒(AY854645/ gi: 71842367)、阿魯卡病毒、班戈蘭病毒、卞博病毒、Bivens Arm病毒、Blue crab病 毒、查里維勒河病毒、Coastal Plains病毒、DakArK7292病毒、Entamoeba病毒、加巴 病毒、戈薩斯病毒、Humpty Doo病毒(AY854643/gi 71842363)、約英杰卡卡病毒、肯 納曼格拉姆病毒、科隆各病毒(DQ457100/gi|91984799核蛋白(N)mRNA、部分cds)、 Koolpinyah 病毒、Kotonkon 病毒(DQ4570"/gi|9l9^797, AY854638/gi 71842354), 蘭德幾亞病毒、Manitoba病毒、馬可病毒、Nasoule病毒、納瓦魯病毒、Ngaingan病 毒(AY854649/gi 71842375), Oak-Vale 病毒(AY854670/gi 71842417),奧博第安病毒(DQ457098/gi|91984795)、奧衣塔病毒(AB116386/gi 46020027)、奧安戈病 毒、帕里河病毒(AY854647/gi 71842371)、Rio Grande cichlid病毒、圣德吉姆巴病 毒(DQ457102/gi|9l984803)、西格馬病毒(AH004209/gi 1680545, AH004208/gi 1680544，AH004206/gi 1680542)、Sripur 病毒、SweetwaterBranch 病毒、Tibrogargan 病毒(AY854646/gi 71842369)、Xiburema 病毒、雅塔病毒、羅德島病毒、Adelaide River 病毒(UlO36Vgi 600151, AF234998/gi 10443747, AF234534/gi 9971785, AY854635/gi 71842348)、Berrimah 病毒(AY854636/gi 71842350])、金伯利病毒 (AY854637/gi 71842352)或牛短暫熱病毒(NC_002526/gi 10086561)。某些未指定的血清型包括(I)Bahia Grande組(大巴伊亞病毒(BGV)、Muir Springs 病毒(MSV)、Reed Ranch 病毒(RRV) ； (2) HartPark 組(費蘭杜病毒(FLAV)、 哈特公園病毒(HPV)、凱米斯病毒(KAMV)、Mosqueiro病毒(MQOV)、莫蘇里病毒 (MOSV) ； (3) KernCanyon 組(巴魯病毒(BARV)、Fukuoka 病毒(FUKAV)、克恩峽谷 病毒(KCV)、恩科比遜病毒(NKOV) ； (4) Le Dantec組(利丹特病毒(LDV)、Keuraliba 病毒(KEUV)、(5) Sawgrass 組(Connecticut 病毒(CNTV)、新明托病毒(NMV)、莎 草病毒(SAWV) ； (6) Timbo 組(查可病毒(CHOV)、Sena Madureira 病毒(SMV)、蒂 姆博病毒(TIMV)；和 (7)其他未指定病毒(阿爾姆皮瓦病毒(ALMV)、阿魯卡病毒 (ARUV)、班戈蘭病毒(BGNV)、卞博病毒(BBOV)、Bivens Arm 病毒(BAV)、Bluecrab 病毒(BCV)、查里維勒河病毒(CHVV)、Coastal Plains 病毒(CPV)、DakArK 7292 病毒 (DAKV-7292)、Entamoeba 病毒(ENTV)、加巴病毒(GARV)、戈薩斯病毒(GOSV)、 Humpty Doo病毒(HDOOV)、約英杰卡卡病毒(JOIV)、肯納曼格拉姆病毒(KANV)、 科隆各病毒(KOLV)、Koolpinyah 病毒(KOOLV)、Kotonkon 病毒(KOTV)、蘭德幾亞 病毒(LJAV)、Manitoba 病毒(MNTBV)、馬可病毒(MCOV)、Ngaingan> Nasoule 病毒 (NASV)、納瓦魯病毒(NAVV)、Ngaingan 病毒(NGAV)、Oak-Vale 病毒(OVRV)、奧博 第安病毒(OBOV)、奧衣塔病毒(OITAV)、奧安戈病毒(OUAV)、帕里河病毒(PCRV)、 Rio Grandecichlid病毒(RGRCV)、圣德吉姆巴病毒(SJAV)、西格馬病毒[X91062] (SIGMAV)、Sripur 病毒(SRIV)、Sweetwater Branch 病毒(SWBV)、Tibrogargan 病毒 (TIBV)、Xiburema 病毒(XIBV)、雅塔病毒(YATAV)。本發明的方面可包括但不限于基于在哺乳動物細胞系中的生長、在成年小鼠 (動物)中不存在毒性或毒性最低、在乳鼠(動物)中不存在毒性或毒性最低選擇非VSV 彈狀病毒或假型化的彈狀病毒。A、彈狀病毒基因組通常，彈狀病毒基因組大約11至15kb，具有大約50個核苷酸的3’前導序列和 大約60個核苷酸的(-)有義病毒RNA(vRNA)的非翻譯5’區。通常，彈狀病毒VRNA 具有編碼5個蛋白的5個基因。彈狀病毒在各基因的末端具有保守的多腺苷酸化信號并 且在5個基因的各基因之間具有短基因間區域。所有彈狀病毒包含編碼核殼體蛋白(N)、 磷蛋白(P，也稱為NS)、基質蛋白(M)、糖蛋白(G)和大蛋白(L)的5個基因。通常 這些基因如下在負有義vRNA上按順序排列3' -N-P-M-G-(X)-L-5'。基因的順序 很重要，因為其控制合成的蛋白質的比例。彈狀病毒基因組的任何操作物通常將包括至 少5個轉錄結構域以保持以高水平感染和復制的能力。彈狀病毒具有用于轉錄正有義信使RNA(mRNA)的內源RNA聚合酶。X基因并非存在于所有彈狀病毒中。X基因編 碼發現于魚感染性造血組織壞死病毒的非結構蛋白(GenBank DQ164103/gi|76262981 ； DQ164102/gi|76262979 ； DQ164101/gi|76262977 ； DQ164100/gi|76262975 ； DQ164099/ gi|76262973 ； AB250935/gi| 112821165 ； AB250934/gi| 112821163 ； AB250933/ gi|112821161 ； AB250932/gi| 112821159 ； AB25093l/gi| 112821157 ； AB250930/ gi|112821155 ； AB250929/gi| 112821153 ； AB250928/gi| 112821151 ； AB250927/ gi|112821149，描述了 G蛋白編碼核苷酸序列)、牛短暫熱病毒中的非結構糖蛋白和狂犬 病毒中的假基因(pseudogene)。在彈狀病毒基因組的不同位置發現了額外的(X)基因。 感染細胞中M蛋白的合成使細胞產生細胞病變，并且將最終導致細胞死亡。彈狀病毒的傳播視病毒/宿主的變化而變化，但大多數通過直接接觸傳播_例 如，狂犬病病毒通過動物咬傷或昆蟲載體傳播。存在長體內潛伏期，但這不反映在培養 中的病毒復制的動力學中。G蛋白結合宿主細胞表面上的受體，然后病毒通過G蛋白介 導的內吞作用和與載體的膜的融合進入細胞。無意受限于特定理論，彈狀病毒的受體分子據認為是 磷脂而非特定的蛋白。彈 狀病毒復制在細胞質中發生-L和NS蛋白都是進行轉錄所必需的_兩者單獨均不發揮功 能。產生5個單順反子mRNA，其在5'末端加帽和在3'末端多腺苷酸化，并且各自在 信使的5'末端包含來自vRNA的3'末端的前導序列。這些mRNA通過病毒基因組中 ORF的依次轉錄而產生，并且已顯示基因間序列負責終止和通過各基因間的聚合酶重新 起始轉錄，從而產生分開的轉錄物。子代VRNA從(+)有義中間體產生。基因組通過L+P聚合酶復合物(如在轉 錄中)進行復制，但還需要額外的宿主細胞因子。彈狀病毒的特征在于這些事件全都 在充當病毒“工廠”的細胞質的部分中發生并且表現為特征性細胞質內含體(inclusion body)οB、病毒蛋白質變體在某些實施方案中，彈狀病毒或非VSV彈狀病毒可包括N、P、M、G，和/或 L蛋白中的一種或多種的變體。在本發明的某些方面，此類病毒蛋白變體可包含在下面 進一步定義的蛋白質性質的組合物中。蛋白質性質的組合物包括病毒顆粒和具有一種或 多種病毒蛋白組分的其他組合物。此類多肽變體可進行基因工程改造或就一種或多種生 理學或生物學特征例如宿主細胞范圍、宿主細胞特異性、對非靶細胞或器官的毒性、復 制、對靶細胞的細胞毒性、癌細胞的殺傷、癌細胞的阻抑(stasis)、感染性、生產參數、 病毒顆粒的大小、病毒顆粒的穩定性、體內清除、免疫反應性等的改變進行選擇。此類 多肽變體可通過使用多種本領域內已知的方法進行基因工程改造，所述方法包括下面描 述的各種誘變技術。在某些方面，N、P、M、G和/或L蛋白對于病毒可以是異源的 (例如，VSV可包含伊斯法罕病毒G蛋白或其變體)。C、重組彈狀病毒可這樣產生重組彈狀病毒，即通過(1)完全使用CDNA或(2)轉染入輔助細胞的 cDNA的組合或(3)轉染入細胞(所述細胞進一步用minivirus感染，所述miniviras反向 提供產生感染性或非感染性重組彈狀病毒所需的其余組分和活性)的cDNA來產生。通 過使用這些方法中的任一種(例如，miniviras、輔助細胞系或僅cDNA轉染)，所需的最小組分是包含用于(1)通過彈狀病毒N蛋白殼體化基因組(或反基因組(antigenomic)) RNA和(2)基因組和反基因組(復制中間體)RNA等同物的復制的順式作用信號的RNA 分子。通過復制元件或復制子，本發明者產生在5'和3'末端最低限度地包含彈狀病 毒的前導序列和尾隨序列的RNA鏈。在基因組有義鏈中，前導序列位于3'末端，尾隨 序列位于5'末端。位于這兩個復制信號之間的任何RNA將依次進行復制。為了通過 N蛋白進行殼體化和為了起始轉錄和復制所必需的聚合酶結合，前導區和尾隨區還必須 包含最小順式作用元件。對于制備經基因工程改造的彈狀病毒，包含G基因的minivirus也可包含前導 區、尾隨區和具有用于產生G蛋白mRNA的適當的起始和終止信號的G基因。如果 miniviras還包含M基因，則也 必須存在用于產生M蛋白mRNA的適當的起始和終止信號。對于經基因工程改造的彈狀病毒基因組內包含的任何基因，基因應側翼于允許 這些基因表達和蛋白質產物產生的適當的轉錄起始和終止信號。特別地，異源基因(其 為通常不由從天然環境分離的彈狀病毒編碼的基因)在通常未發現其的位置、形式或背 景中包含彈狀病毒編碼區，例如，嵌合G蛋白。為了產生“非感染性”經基因工程改造的彈狀病毒，所述經基因工程改造的彈 狀病毒必須具有最小的復制子元件和N、P和L蛋白，并且其必須包含M基因(一個實 例是缺失G蛋白編碼區的AG或G-Iess構建體)。這產生了從細胞出芽但為非感染性顆 粒的病毒顆粒。為了產生“感染性”顆粒，病毒顆粒必須額外地包含可介導，例如通過 使用附著蛋白或受體配體介導病毒顆粒結合和融合的蛋白質。彈狀病毒的天然受體配體 是G蛋白。“合適的細胞”或“宿主細胞”是指允許重組彈狀病毒的裝配的任何細胞。為制備感染性病毒顆粒，首先用痘苗病毒VTF7-3 (Fuerst等人，1986)或編碼T7 RNA聚合酶或其他合適的噬菌體聚合酶例如T3或SP6聚合酶的等同物(參見Usdin等 人，1993或Rodriguez等人，1990)感染合適的細胞系(例如，BHK細胞)。然后用包 含編碼G、N、P、L和M彈狀病毒蛋白的基因的單獨的cDNA轉染細胞。此類cDNA 將提供用于構建重組彈狀病毒顆粒的蛋白。然后可通過本領域已知的任何方法轉染細胞 (例如，脂質體、電穿孔等)。也將包含彈狀病毒基因組RNA等同物的“多順反子cDNA”轉染入細胞系。如 果期望感染性重組彈狀病毒顆粒在感染的細胞中是裂解性的，那么編碼N、P、M和L蛋 白的基因以及任何異源核酸片段必須存在。如果不期望感染性重組彈狀病毒顆粒是裂解 性的，那么編碼M蛋白的基因不包括在多順反子DNA中。關于“多順反子cDNA”， 其是指至少包含含有編碼N、P和L蛋白的基因的轉錄單位的cDNA。重組彈狀病毒多 順反子DNA還可包含編碼蛋白質變體或其多肽片段的基因或治療性核酸。可選擇地，首 先產生的最初與病毒顆粒結合的任何蛋白或其片段可以反向提供。另一個預期的實施方案是包含編碼報告蛋白或熒光蛋白(例如，綠色熒光蛋白 和其衍生物、半乳糖苷酶、堿性磷酸酶、熒光素酶、氯霉素乙酰轉移酶等)的基因、 N-P-L或N-P-L-M基因和/或融合蛋白或治療性核酸的多順反子cDNA。另一個預期的多順反子DNA可包含編碼蛋白質變體的基因、編碼報告子的基因、治療性核酸和/或 N-P-L基因或N-P-L-M基因。產生重組彈狀病毒的第一個步驟是從cDNA表達作為基因組或反基因組等同物 的RNA。然后該RNA被N蛋白包裝，然后通過P/L蛋白進行復制。可回收所產生的 病毒。如果G蛋白不存于重組RNA基因組中，那么其通常以反向提供。如果G蛋白和 M蛋白都不存在，那么兩者均以反向提供。關于制備“非感染性彈狀病毒”顆粒，其方法可以與上述方法相同，除了轉染 入細胞的多順反子cDNA將只包含彈狀病毒的N、P和L基因外。非感染性彈狀病毒顆 粒的多順反子cDNA可額外地包含編碼報告蛋白的基因或治療性核酸。關于有關產生缺 乏編碼G蛋白的基因的重組彈狀病毒的方法的另外的描述，參見Takada等人(1997)。1.產生病毒的細胞的培養通常在期望的溫度(通常大約37°C )下溫育轉染的細胞，進行至少24小時。對 于非感染性病毒顆粒，收集上清液，分離病毒顆粒。對于感染性病毒顆粒，收獲包含病 毒的上清液，將其轉移至新鮮細胞(fresh cell)。溫育該 新鮮細胞，進行大約48小時，然 后收集上清液。2.重組彈狀病毒的純化術語“分離”或“分離的”彈狀病毒是指培養和純化病毒顆粒(以使極少的細 胞碎片留下)的方法。一個實例是獲取含有病毒體的上清液，然后將它們通過0.1-0.2微 米孔徑大小的濾器(例如，Millex-GS、Millipore)以除去病毒和細胞碎片。可選擇地， 使用梯度例如蔗糖梯度純化病毒體。然后沉淀重組彈狀病毒顆粒，將其重懸于期望的任 何賦形劑或載體中。可使用特異于特定蛋白的抗體，通過間接免疫熒光法測定滴度。3.使用cDNA和Miniviras或輔助細胞系制備重組彈狀病毒的方法"minivirases"和“輔助細胞”(也稱為“輔助細胞系”)提供相同的事物以 提供用于彈狀病毒病毒體裝配的彈狀病毒蛋白的來源。彈狀病毒miniviras的一個實例是 只表達G和M蛋白的VSVminiviras，如由Stillman等人，(1995)所報導的。輔助病毒 和miniviruses用作提供彈狀病毒蛋白的方法，所述彈狀病毒蛋白不從編碼彈狀病毒蛋白 的基因的轉染的DNA產生。當使用miniviras時，為了提供T7 RNA聚合酶，如上所述使用痘苗病毒感染細 胞。將包含N、P和L基因的期望的多順反子RNA和質粒轉染入細胞。在大約3小時 后除去轉染混合物，然后以大約1的感染復數(multiplicity of infection) (m.o.i.)用miniviras 感染細胞。Miniviras提供缺失的G和/或M蛋白。轉染入細胞的多順反子RNA將取 決于想要的是感染性重組彈狀病毒還是非感染性重組彈狀病毒。可選擇地，miniviras可用于提供N、P和L基因。Minivirus還可用于產生除了 N、P和L外的M蛋白。Miniviras還可產生G蛋白。當使用輔助細胞系時，編碼缺失的彈狀病毒蛋白的基因通過輔助細胞系產生。 輔助細胞系具有用于產生不編碼野生型G蛋白的重組彈狀病毒顆粒的N、P、L和G蛋 白。從不為重組病毒基因組的部分的基因或DNA表達蛋白質。將這些質粒或其他載體 系統穩定地整合入細胞系的基因組。然后從細胞的基因組而非從細胞質中的復制子產生 蛋白質。然后可用包含不由輔助病毒表達的其他彈狀病毒基因的多順反子DNA和質粒cDNA轉染輔助細胞系。所使用的多順反子RNA將取決于期望的是感染性還是非感染性 重組彈狀病毒。另外，如上所述提供缺失的基因產物(例如，G和/或M)。II.病毒組合物本發明涉及在研究和治療患者的過度增殖細胞或贅生性細胞(例如，癌細胞)和 過度增殖性病況或瘤病況(neoplastic condition)(例如，癌癥)中是有利的彈狀病毒。其可 涉及但不限于具有減少的神經毒性的彈狀病毒例如非VSV彈狀病毒。在某些方面，彈狀 病毒編碼或包含一個或多個蛋白質組分(N、P、M、G，和/或L蛋白)或與VSV的基因 組不同的 核酸基因組(即，在氨基酸或核苷酸水平上至少或至多10，20，40，50，60， 70，80%同一)和/或用一個或多個突變或變異(與野生型病毒或病毒蛋白相比)來進行 構建，以便所述病毒具有期望的性質以用于抗癌細胞，同時與最初分離的病毒或VSV相 比對非癌細胞具有較低毒性或是無毒性。下面描述的教導提供了各種用于進行本發明的 方法和組合物的方案的實例。它們提供了通過使用生物選擇或重組DNA或核酸技術產生 突變病毒或變異病毒的背景。A、蛋白質性質的組合物本發明的蛋白質性質的組合物包括病毒顆粒和包含病毒顆粒的組合物以及分離 的多肽。在某些實施方案中，本發明涉及產生或分離假型化的或非VSV溶瘤彈狀病毒 (裂解、殺傷或遲滯癌細胞的生長的彈狀病毒)。在某些實施方案，對彈狀病毒進行基因 工程改造以使之包括彈狀病毒蛋白(N、P、M、G和/或L)的多肽變體和/或編碼治療 性多肽的治療性核酸。本發明的其他方面包括分離缺少一個或多個功能性多肽或蛋白的 彈狀病毒。在其他實施方案中，本發明涉及彈狀病毒和它們作為藥學上可接受的制劑的 部分與蛋白質性質的組合物組合的用途或包含在其中的用途。如本文所使用的，“蛋白”或“多肽”是指包含氨基酸殘基的聚合物的分子。 在一些實施方案中，使用蛋白質或多肽的野生型形式，然而，在本發明的許多實施方案 中，病毒蛋白或多肽的全部或部分不存在或經改變以使病毒在治療患者方面更加有用。 上述術語在本文中可互換使用。“經修飾的蛋白”或“經修飾的多肽”或“變體蛋白” 或“變體多肽”是指其化學結構或氨基酸序列相對于野生型或參照蛋白或多肽發生了改 變的蛋白或多肽。在一些實施方案中，經修飾的蛋白或多肽具有至少一種改變的活性或 功能(公認蛋白質或多肽可具有多種活性或功能)。相對于野生型蛋白或多肽的活性或功 能或包含此類多肽的病毒的特征，可以以一些其他方法減小、減少、消除、增強、提高 或改變該經修飾的活性或功能(例如感染特異性)。預期可就一種活性或功能改變經修飾 的蛋白或多肽，然而在其他方面仍保持野生型或未改變的活性或功能。可選擇地，經修 飾的蛋白可以是完全無功能的或其相應核酸序列可進行改變以使多肽根本不再表達，被 截短或作為移碼或其他修飾的結果表達不同的氨基酸序列。在某些實施方案中，重組蛋白或多肽的大小可包含但不限于5、6、7、8、9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99、 100、 110、 120、 130、140、 150、 160、 170、 180、 190、 200、 210、 220、 230、 240、 250、 275、 300、 325、 350、 375、 400、 425、 450、 475、 500、 525、 550、 575、 600、 625、 650、 675、 700、 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1100, 1200, 1300、1400、1500、1750、2000、2250、2500個或更多氨基分子殘基，和可從其推導的
任何范圍。預期，多肽可通過截短、使它們比它們的相應未改變的形式更短或通過可使 改變的蛋白質更長的融合或結構域改組(domain shuffling)來進行修飾。如本文所使用的，“氨基分子”是指本領域技術人員已 知的任何氨基酸、氨基 酸衍生物或氨基酸模擬物。在某些實施方案中，蛋白質性質的分子的殘基是連續的，不 具有間斷氨基分子殘基的序列的任何非氨基分子。在其他實施方案中，序列可包含一個 或多個非氨基分子部分。在特定實施方案中，蛋白質性質的分子的殘基的序列可被一個 或多個非氨基分子部分間斷。因此，術語“蛋白質性質的組合物”包括包含天然合成的 蛋白質中20種普通氨基酸中的至少一種或至少一種經修飾的氨基酸或稀有氨基酸的氨基 分子序列。蛋白質性質的組合物可通過本領域技術人員已知的任何技術來制備，所述技術 包括通過標準分子生物學技術進行的蛋白質、多肽或肽的表達、蛋白質性質的化合物從 天然來源的分離或蛋白質性質的物質的化學合成。不同彈狀病毒基因或基因組的核苷酸 和多肽序列之前已經公開，并且可見于本領域技術人員已知的計算機化的數據庫。一個 這樣的數據庫是美國國家生物技術信息中心(National Center forBiotechnology Information) 的GenBank和GenPept數據庫，其可通過國際互聯網在ncbi.nlm.nih.gov/訪問。可使用 本文中公開的或本領域技術人員已知的技術擴增和/或表達這些已知的基因和病毒的編 碼區。B、功能方面當本發明提及病毒蛋白或多肽的功能或活性時，除非另外指出，其是指該病毒 蛋白或多肽在生理條件下的活性或功能。例如，G蛋白參與特定細胞類型的結合和感染 的特異性和功效。可使用本領域技術人員熟知的測定法例如感染性測定法、蛋白質結合 測定法、空斑測定法等確定具有該活性的分子。C、病毒多肽的變體本發明的多肽的氨基酸序列變體可以為置換、插入或缺失變體。編碼病毒多 肽的基因的突變可影響(與野生型或未改變的多肽或其他參照多肽相比)多肽的1、2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99、 100、 110、 120、 130、 140、 150、 160、 170、 180、 190、 200、 210、 220、 230、 240、 250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500 個或更多非連續或連續氨基 酸(即，片段)。可通過參考本文中公開的每一種病毒的GenBank登錄號和相關公共數 據庫條目來鑒定由彈狀病毒編碼的各種多肽，涉及彈狀病毒科的所有GenBank條目通過 引用合并入本文。
缺失變體缺少天然的、未改變的或野生型蛋白的一個或多個殘基。可缺失單個 殘基，或可缺失結構域(例如催化或結合結構域)的全部或一部分。可將終止密碼子導 入(通過置換或插入)編碼核酸序列以產生截短的蛋白質。插入突變體通常包括在多肽 的非終止點添加物質，特殊類型的插入物是嵌合多肽，所述嵌合多肽包括替代靶蛋白的 相關部分的相關蛋白的同源或相似部分。這可包括免疫反應性表位或僅一個或多個殘基 的插入。還可產生末端添加物，其通常稱為融合蛋白。置換變體通常包括蛋白質內一個或多個位點上的一種氨基酸對另一種氨基酸的 交換，并且可設計用于調節多肽的一個或多個性質(在喪失或不喪失其他功能或性質的 情況下)。置換可以是保守的，即，一個氨基酸用相似形狀和電荷的氨基酸替代。保守置 換在本領域內是熟知的并且包括，例如，丙氨酸至絲氨酸、精氨酸至賴氨酸、天冬酰胺 至谷氨酰胺或組氨酸、天冬氨酸至谷氨酸、半胱氨酸至絲氨酸、谷氨酰胺至天冬酰胺、 谷氨酸至天冬氨酸、甘氨酸至脯氨酸、組氨酸至天冬酰胺或谷氨酰胺、異亮氨酸至亮氨 酸或纈氨酸、亮氨酸至纈氨酸或異亮氨酸、賴氨酸至精氨酸、甲硫氨酸至亮氨酸或異亮 氨酸、苯丙氨酸至酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸、絲氨酸至蘇氨酸、蘇氨酸至絲氨酸、色 氨酸至酪氨酸、酪氨酸至色氨酸或苯丙氨酸以及纈氨酸至異亮氨酸或亮氨酸的改變。可 選擇地，置換可以是非保守的，以便多肽的功能或活性受到影響。非保守性改變通常包 括用化學上不同的殘基置換殘基，例如用極性的或帶電荷的氨基酸置換非極性的或不帶 電荷的氨基酸，反之亦然。術語“功能等同密碼子”在本文中用于指編碼相同氨基酸的密碼子，例如編碼 精氨酸或絲氨酸的6個密碼子，也指編碼生物學上等同的氨基酸的密碼子(參見下面表 1)。表1.密碼子表
權利要求
1.殺傷過度增殖細胞的方法，其包括將所述細胞與分離的溶瘤彈狀病毒接觸，其中 所述彈狀病毒編碼(a)與SEQID NO 5或SEQ ID NO 11具有至少80%的氨基酸序列同一性的G蛋白；(b)與SEQID NO 2或SEQ ID NO 8具有至少90%的氨基酸序列同一性的N蛋白；(C)與SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 10具有至少80%的氨基酸序列同一性的M蛋白；(d)與SEQID NO 3或SEQ ID NO 9具有至少65 %的氨基酸序列同一性的P蛋白；或(e)與SEQID NO 6或SEQ ID NO 12具有至少80%的氨基酸序列同一性的L蛋白。
2.權利要求1的方法，其中所述細胞包含于患者中。
3.權利要求2的方法，其中所述細胞是癌細胞。
4.權利要求3的方法，其中所述癌細胞是轉移性癌細胞。
5.權利要求2的方法，其中對所述患者施用所述溶瘤彈狀病毒。
6.權利要求5的方法，其中通過腹膜內、靜脈內、動脈內、肌內、皮內、瘤內、皮下 或鼻內施用來施用所述溶瘤彈狀病毒。
7.權利要求1的方法，其還包括施用第二抗癌治療。
8.權利要求7的方法，其中所述第二抗癌治療是第二溶瘤病毒。
9.權利要求8的方法，其中所述第二溶瘤病毒是痘苗病毒、皰疹病毒、麻疹病毒、新 城疫病毒、腺病毒、甲病毒、細小病毒或彈狀病毒。
10.權利要求9的方法，其中所述第二抗癌劑是第二溶瘤彈狀病毒。
11.權利要求10的方法，其中所述第二溶瘤彈狀病毒是水泡性口膜炎病毒(VSV)、 Arajas病毒、科卡病毒、伊斯法罕病毒、Maraba病毒、皮理病毒、水泡性口炎阿拉戈斯 病毒、BeAn 157575病毒、博特克病毒、Calchaqui病毒、美洲鰻病毒、格雷洛奇病毒、 朱羅納病毒、克拉馬斯病毒、克瓦塔病毒、La Joya病毒、Malpais Spring病毒、芒特埃 爾崗蝙蝠病毒、Perinet病毒、Tupaia病毒、Farmington、大巴伊亞病毒、Muir Springs 病毒、Reed Ranch病毒、哈特公園病毒、費蘭杜病毒、凱米斯病毒、Mosqueiro病毒、 莫蘇里病毒、巴魯病毒、Fukuoka病毒、克恩峽谷病毒、恩科比遜病毒、利丹特病毒、 Keuraliba病毒、Connecticut病毒、新明托病毒、莎草病毒、查可病毒、Sena Madureira 病毒、蒂姆博病毒、阿爾姆皮瓦病毒、阿魯卡病毒、班戈蘭病毒、卞博病毒、Bivens Arm病毒、Bluecrab病毒、查里維勒河病毒、Coastal Plains病毒、DakArK 7292病毒、 Entamoeba病毒、加巴病毒、戈薩斯病毒、Humpty Doo病毒、約英杰卡卡病毒、肯納曼 格拉姆病毒、科隆各病毒、Koolpinyah病毒、Kotonkon病毒、蘭德幾亞病毒、Manitoba 病毒、馬可病毒、Nasoule病毒、納瓦魯病毒、Ngaingan病毒、Oak-Vale病毒、奧博第 安病毒、奧衣塔病毒、奧安戈病毒、帕里河病毒、Rio Grandecichlid病毒、圣德吉姆巴病 毒、西格馬病毒、Sripur 病毒、Sweetwater Branch 病毒、Tibrogargan 病毒、Xiburema 病 毒、雅塔病毒、羅德島病毒、Adelaide River病毒、Berrimah病毒、金伯利病毒或牛短暫熱病毒。
12.權利要求7的方法，其中所述第二癌癥治療是化學治療劑、放射治療劑或免疫治 療劑。
13.殺傷過度增殖細胞的方法，其包括將所述細胞與分離的溶瘤彈狀病毒接觸，其中 所述彈狀病毒編碼(a)具有SEQID NO 5或SEQ ID NO 11的至少40個連續氨基酸的G蛋白；(b)具有SEQID NO 2或SEQ ID NO 8的至少40個連續氨基酸的N蛋白；(C)具有SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 10的至少40個連續氨基酸的M蛋白；(d)具有SEQID NO 3或SEQ ID NO 9的至少40個連續氨基酸的P蛋白；或(e)具有SEQID NO 6或SEQ ID NO 12的至少40個連續氨基酸的L蛋白。
14.權利要求13的方法，其中所述細胞包含于患者中。
15.權利要求14的方法，其中所述細胞是癌細胞。
16.權利要求15的方法，其中所述癌細胞是轉移性癌細胞。
17.權利要求14的方法，其中對所述患者施用所述溶瘤彈狀病毒。
18.權利要求17的方法，其中通過腹膜內、靜脈內、動脈內、肌內、皮內、瘤內、皮 下或鼻內施用來施用所述溶瘤彈狀病毒。
19.權利要求13的方法，其還包括施用第二抗癌治療。
20.權利要求19的方法，其中所述第二抗癌治療是第二溶瘤病毒。
21.權利要求20的方法，其中所述第二溶瘤病毒是痘苗病毒、皰疹病毒、麻疹病毒、 新城疫病毒、腺病毒或彈狀病毒。
22.權利要求21的方法，其中所述第二抗癌劑是第二溶瘤彈狀病毒。
23.權利要求22的方法，其中所述第二溶瘤彈狀病毒是水泡性口膜炎病毒(VSV)、 Arajas病毒、科卡病毒、伊斯法罕病毒、Maraba病毒、皮理病毒、水泡性口炎阿拉戈斯 病毒、BeAn 157575病毒、博特克病毒、Calchaqui病毒、美洲鰻病毒、格雷洛奇病毒、 朱羅納病毒、克拉馬斯病毒、克瓦塔病毒、La Joya病毒、Malpais Spring病毒、芒特埃 爾崗蝙蝠病毒、Perinet病毒、Tupaia病毒、Farmington、大巴伊亞病毒、Muir Springs 病毒、Reed Ranch病毒、哈特公園病毒、費蘭杜病毒、凱米斯病毒、Mosqueiro病毒、 莫蘇里病毒、巴魯病毒、Fukuoka病毒、克恩峽谷病毒、恩科比遜病毒、利丹特病毒、 Keuraliba病毒、Connecticut病毒、新明托病毒、莎草病毒、查可病毒、Sena Madureira 病毒、蒂姆博病毒、阿爾姆皮瓦病毒、阿魯卡病毒、班戈蘭病毒、卞博病毒、Bivens Arm病毒、Bluecrab病毒、查里維勒河病毒、Coastal Plains病毒、DakArK 7292病毒、 Entamoeba病毒、加巴病毒、戈薩斯病毒、Humpty Doo病毒、約英杰卡卡病毒、肯納曼 格拉姆病毒、科隆各病毒、Koolpinyah病毒、Kotonkon病毒、蘭德幾亞病毒、Manitoba 病毒、馬可病毒、Nasoule病毒、納瓦魯病毒、Ngaingan病毒、Oak-Vale病毒、奧博第 安病毒、奧衣塔病毒、奧安戈病毒、帕里河病毒、Rio Grandecichlid病毒、圣德吉姆巴病 毒、西格馬病毒、Sripur 病毒、Sweetwater Branch 病毒、Tibrogargan 病毒、Xiburema 病 毒、雅塔病毒、羅德島病毒、Adelaide River病毒、Berrimah病毒、金伯利病毒或牛短暫 熱病毒。
24.權利要求19的方法，其中所述第二癌癥治療是化學治療劑、放射治療劑或免疫治療劑。
25.用于治療癌癥患者的方法，其包括施用有效量的分離的溶瘤彈狀病毒，所述彈狀 病毒編碼(a)與SEQID NO 5或SEQ ID NO 11具有至少80 %的氨基酸序列同一性的G蛋白；(b)與SEQID NO 2或SEQ ID NO 8具有至少90%的氨基酸序列同一性的N蛋白；(C)與SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 10具有至少80%的氨基酸序列同一性的M蛋白；(d)與SEQID NO 3或SEQ ID NO 9具有至少65 %的氨基酸序列同一性的P蛋白；或(e)與SEQID NO 6或SEQ ID NO 12具有至少80%的氨基酸序列同一性的L蛋白。
26.權利要求25的方法，其中通過腹膜內、靜脈內、動脈內、肌內、皮內、瘤內、皮 下或鼻內施用來施用所述溶瘤彈狀病毒。
27.權利要求25的方法，其還包括施用第二癌癥治療。
28.權利要求27的方法，其中所述第二抗癌治療包含第二溶瘤病毒。
29.權利要求28的方法，其中所述第二溶瘤病毒是痘苗病毒、皰疹病毒、麻疹病毒、 新城疫病毒、腺病毒或彈狀病毒。
30.權利要求29的方法，其中所述第二抗癌治療包含第二溶瘤彈狀病毒。
31.權利要求30的方法，其中所述第二彈狀病毒是水泡性口膜炎病毒(VSV)、Arajas 病毒、科卡病毒、伊斯法罕病毒、Maraba病毒、皮理病毒、水泡性口炎阿拉戈斯病毒、 BeAn 157575病毒、博特克病毒、Calchaqui病毒、美洲鰻病毒、格雷洛奇病毒、朱羅納 病毒、克拉馬斯病毒、克瓦塔病毒、La Joya病毒、Malpais Spring病毒、芒特埃爾崗蝙 蝠病毒、Perinet病毒、Tupaia病毒、Farmington、大巴伊亞病毒、Muir Springs病毒、 Reed Ranch病毒、哈特公園病毒、費蘭杜病毒、凱米斯病毒、Mosqueiro病毒、莫蘇里病 毒、巴魯病毒、Fukuoka病毒、克恩峽谷病毒、恩科比遜病毒、利丹特病毒、Keuraliba病 毒、Connecticut病毒、新明托病毒、莎草病毒、查可病毒、Sena Madureira病毒、蒂姆博 病毒、阿爾姆皮瓦病毒、阿魯卡病毒、班戈蘭病毒、卞博病毒、Bivens Arm病毒、Blue crab病毒、查里維勒河病毒、Coastal Plains病毒、DakArK 7292病毒、Entamoeba病毒、 加巴病毒、戈薩斯病毒、Humpty Doo病毒、約英杰卡卡病毒、肯納曼格拉姆病毒、科隆 各病毒、Koolpinyah病毒、Kotonkon病毒、蘭德幾亞病毒、Manitoba病毒、馬可病毒、 Nasoule病毒、納瓦魯病毒、Ngaingan病毒、Oak-Vale病毒、奧博第安病毒、奧衣塔病 毒、奧安戈病毒、帕里河病毒、Rio Grandecichlid病毒、圣德吉姆巴病毒、西格馬病毒、 Sripur 病毒、SweetwaterBranch 病毒、Tibrogargan 病毒、Xiburema 病毒、雅塔病毒、羅德 島病毒、Adelaide River病毒、Berrimah病毒、金伯利病毒或牛短暫熱病毒。
32.權利要求27的方法，其中所述第二癌癥治療是化學治療、放射治療或免疫治療或 手術。
33.用于治療癌癥患者的方法，其包括施用有效量的溶瘤彈狀病毒，所述彈狀病毒編碼(a)具有SEQID NO 5或SEQ ID NO 11的至少40個連續氨基酸的G蛋白；(b)具有SEQID NO 2或SEQ IDNO 8的至少40個連續氨基酸的N蛋白；(C)具有SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 10的至少40個連續氨基酸的M蛋白；(d)具有SEQID NO 3或SEQ IDNO 9的至少40個連續氨基酸的P蛋白；或(e)具有SEQID NO 6或SEQ ID NO 12的至少40個連續氨基酸的L蛋白。
34.權利要求33的方法，其中通過腹膜內、靜脈內、動脈內、肌內、皮內、皮下或鼻 內施用來施用所述溶瘤彈狀病毒。
35.包含重組溶瘤彈狀病毒的組合物，所述彈狀病毒編碼N、P、M、G或L蛋白中 的一個或多個的氨基酸變體，所述氨基酸變體與下列病毒的N、P、M、G或L蛋白中的 一個或多個具有至少80%但低于100%的氨基酸同一性，所述病毒是Arajas病毒、科卡 病毒、伊斯法罕病毒、Maraba病毒、皮理病毒、水泡性口炎阿拉戈斯病毒、BeAnl57575 病毒、博特克病毒、Calchaqui病毒、美洲鰻病毒、格雷洛奇病毒、朱羅納病毒、克拉馬 斯病毒、克瓦塔病毒、La Joya病毒、Malpais Spring病毒、芒特埃爾崗蝙蝠病毒、Perinet 病毒、Tupaia病毒、Farmington>大巴伊亞病毒、Muir Spring s病毒、Reed Ranch病毒、 哈特公園病毒、費蘭杜病毒、凱米斯病毒、Mosqueiro病毒、莫蘇里病毒、巴魯病毒、 Fukuoka病毒、克恩峽谷病毒、恩科比遜病毒、利丹特病毒、Keuraliba病毒、Connecticut 病毒、新明托病毒、莎草病毒、查可病毒、Sena Madureira病毒、蒂姆博病毒、阿爾姆 皮瓦病毒、阿魯卡病毒、班戈蘭病毒、卞博病毒、Bivens Arm病毒、Blue crab病毒、查 里維勒河病毒、Coastal Plains病毒、DakArK 7292病毒、Entamoeba病毒、加巴病毒、 戈薩斯病毒、HumptyD00病毒、約英杰卡卡病毒、肯納曼格拉姆病毒、科隆各病毒、 Koolpinyah病毒、Kotonkon病毒、蘭德幾亞病毒、Manitoba病毒、馬可病毒、Nasoule 病毒、納瓦魯病毒、Ngaingan病毒、Oak-Vale病毒、奧博第安病毒、奧衣塔病毒、奧安 戈病毒、帕里河病毒、RioGrandecichlid病毒、圣德吉姆巴病毒、西格馬病毒、Sripur病 毒、Sweetwater Branch病毒、Tibrogargan病毒、Xiburema病毒、雅塔病毒、羅德島病 毒、Adelaide River病毒、Berrimah病毒、金伯利病毒或牛短暫熱病毒。
36.權利要求35的組合物，其中所述彈狀病毒是Maraba病毒、Carajas病毒、Muir Springs病毒、Farmington或大巴伊亞病毒。
37.權利要求35的組合物，其還包含第二溶瘤病毒。
38.權利要求37的組合物，其中所述第二溶瘤病毒是痘苗病毒、皰疹病毒、麻疹病 毒、新城疫病毒、腺病毒或彈狀病毒。
39.權利要求38的組合物，其中所述第二溶瘤病毒是彈狀病毒。
40.權利要求39的組合物，其中所述第二彈狀病毒是Arajas病毒、科卡病毒、伊斯 法罕病毒、Maraba病毒、皮理病毒、水泡性口炎阿拉戈斯病毒、BeAn 157575病毒、博 特克病毒、Calchaqui病毒、美洲鰻病毒、格雷洛奇病毒、朱羅納病毒、克拉馬斯病毒、 克瓦塔病毒、La Joya病毒、Malpais Spring病毒、芒特埃爾崗蝙蝠病毒、Perinet病毒、 Tupaia病毒、Farmington>大巴伊亞病毒、MuirSprings病毒、Reed Ranch病毒、哈特公園 病毒、費蘭杜病毒、凱米斯病毒、Mosqueiro病毒、莫蘇里病毒、巴魯病毒、Fukuoka病 毒、克恩峽谷病毒、恩科比遜病毒、利丹特病毒、Keuraliba病毒、Connecticut病毒、新明托病毒、莎草病毒、查可病毒、SenaMadureira病毒、蒂姆博病毒、阿爾姆皮瓦病毒、 阿魯卡病毒、班戈蘭病毒、卞博病毒、Bivens Arm病毒、Blue crab病毒、查里維勒河病 毒、Coastal Plains病毒、DakArK 7292病毒、Entamoeba病毒、加巴病毒、戈薩斯病毒、 Humpty Doo病毒、約英杰卡卡病毒、肯納曼格拉姆病毒、科隆各病毒、Koolpinyah病 毒、Ko tonkon病毒、蘭德幾亞病毒、Manitoba病毒、馬可病毒、Nasoule病毒、納瓦魯病 毒、Ngaingan病毒、Oak-Vale病毒、奧博第安病毒、奧衣塔病毒、奧安戈病毒、帕里河 病毒、Rio Grandecichlid病毒、圣德吉姆巴病毒、西格馬病毒、Sripur病毒、Sweetwater Branch病毒、Tibrogargan病毒、Xiburema病毒、雅塔病毒、羅德島病毒、Adelaide River 病毒、Berrimah病毒、金伯利病毒或牛短暫熱病毒。
41.權利要求35的組合物，其中所述組合物是藥學上可接受的組合物。
42.權利要求41的組合物，其還包含第二抗癌劑。
43.權利要求42的組合物，其中所述第二抗癌劑是化學治療劑、放射治療劑或免疫治 療劑。
44.包含分離的溶瘤彈狀病毒的組合物，所述彈狀病毒具有編碼下列病毒的變體N、 P、M、G或L蛋白中的一個或多個的至少40個連續氨基酸的核酸片段，所述病毒是 Arajas病毒、科卡病毒、伊斯法罕病毒、Maraba病毒、皮理病毒、水泡性口炎阿拉戈斯 病毒、BeAnl57575病毒、博特克病毒、Calchaqui病毒、美洲鰻病毒、格雷洛奇病毒、朱 羅納病毒、克拉馬斯病毒、克瓦塔病毒、La Joya病毒、Malpais Spring病毒、芒特埃爾崗 蝙蝠病毒、Perinet病毒、Tupaia病毒、Farmington>大巴伊亞病毒、Muir Spring s病毒、 Reed Ranch病毒、哈特公園病毒、費蘭杜病毒、凱米斯病毒、Mosqueiro病毒、莫蘇里病 毒、巴魯病毒、Fukuoka病毒、克恩峽谷病毒、恩科比遜病毒、利丹特病毒、Keuraliba病 毒、Connecticut病毒、新明托病毒、莎草病毒、查可病毒、Sena Madureira病毒、蒂姆博 病毒、阿爾姆皮瓦病毒、阿魯卡病毒、班戈蘭病毒、卞博病毒、Bivens Arm病毒、Blue crab病毒、查里維勒河病毒、Coastal Plains病毒、DakArK 7292病毒、Entamoeba病毒、 加巴病毒、戈薩斯病毒、HumptyD00病毒、約英杰卡卡病毒、肯納曼格拉姆病毒、科隆 各病毒、Koolpinyah病毒、Kotonkon病毒、蘭德幾亞病毒、Manitoba病毒、馬可病毒、 Nasoule病毒、納瓦魯病毒、Ngaingan病毒、Oak-Vale病毒、奧博第安病毒、奧衣塔病 毒、奧安戈病毒、帕里河病毒、RioGrandecichlid病毒、圣德吉姆巴病毒、西格馬病毒、 Sripur 病毒、Sweetwater Branch 病毒、Tibrogargan 病毒、Xiburema 病毒、雅塔病毒、羅 德島病毒、Adelaide River病毒、Berrimah病毒、金伯利病毒或牛短暫熱病毒。
45.權利要求44的組合物，其中所述彈狀病毒是Maraba病毒、Carajas病毒、Muir Springs病毒或大巴伊亞病毒。
46.權利要求44的組合物，其還包含第二溶瘤病毒。
47.權利要求46的組合物，其中所述第二溶瘤病毒是痘苗病毒、皰疹病毒、麻疹病 毒、新城疫病毒、腺病毒或彈狀病毒。
48.權利要求47的組合物，其中所述第二溶瘤病毒是彈狀病毒。
49.權利要求48的組合物，其中所述第二彈狀病毒是Arajas病毒、科卡病毒、伊斯 法罕病毒、Maraba病毒、皮理病毒、水泡性口炎阿拉戈斯病毒、BeAn 157575病毒、博 特克病毒、Calchaqui病毒、美洲鰻病毒、格雷洛奇病毒、朱羅納病毒、克拉馬斯病毒、克瓦塔病毒、La Joya病毒、Malpais Spring病毒、芒特埃爾崗蝙蝠病毒、Perinet病毒、 Tupaia病毒、Farmington>大巴伊亞病毒、MuirSprings病毒、Reed Ranch病毒、哈特公園 病毒、費蘭杜病毒、凱米斯病毒、Mosqueiro病毒、莫蘇里病毒、巴魯病毒、Fukuoka病 毒、克恩峽谷病毒、恩科比遜病毒、利丹特病毒、Keuraliba病毒、Connecticut病毒、新 明托病毒、莎草病毒、查可病毒、SenaMadureira病毒、蒂姆博病毒、阿爾姆皮瓦病毒、 阿魯卡病毒、班戈蘭病毒、卞博病毒、Bivens Arm病毒、Blue crab病毒、查里維勒河病 毒、Coastal Plains病毒、DakArK 7292病毒、Entamoeba病毒、加巴病毒、戈薩斯病毒、 Humpty Doo病毒、約英杰卡卡病毒、肯納曼格拉姆病毒、科隆各病毒、Koolpinyah病 毒、Kotonkon病毒、蘭德幾亞病毒、Manitoba病毒、馬可病毒、Nasoule病毒、納瓦魯病 毒、Ngaingan病毒、Oak-Vale病毒、奧博第安病毒、奧衣塔病毒、奧安戈病毒、帕里河 病毒、Rio Grandecichlid病毒、圣德吉姆巴病毒、西格馬病毒、Sripur病毒、Sweetwater Branch病毒、Tibrogargan病毒、Xiburema病毒、雅塔病毒、羅德島病毒、Adelaide River 病毒、Berrimah病毒、金伯利病毒或牛短暫熱病毒。
50.權利要求44的組合物，其中所述組合物是藥學上可接受的組合物。
51.權利要求50的組合物，其還包含第二抗癌劑。
52.權利要求51的組合物，其中所述第二抗癌劑是化學治療劑、放射治療劑或免疫治 療劑。
53.包含分離的重組彈狀病毒的組合物，所述重組彈狀病毒包含來自第一病毒的異源 病毒G蛋白和編碼至少一個來自第二彈狀病毒的第二病毒蛋白的RNA基因組，其中所述 異源病毒G蛋白的胞外結構域與伊斯法罕病毒G蛋白、金迪普拉病毒G蛋白、Maraba病 毒G蛋白、大巴伊亞病毒G蛋白、克拉馬斯病毒G蛋白、Farminton病毒G蛋白、埃博 拉病毒G蛋白或Jaagsietke綿羊逆轉錄病毒G蛋白具有至少大約80%的同一性。
54.權利要求53的組合物，其中所述RNA基因組不編碼異源病毒G蛋白。
55.權利要求54的組合物，其中所述RNA基因組編碼來自第二彈狀病毒的G蛋白。
56.權利要求53的組合物，其中所述RNA基因組編碼治療性基因。
57.權利要求53的組合物，其中RNA基因組編碼來自下列病毒的G、M、P、N或 L蛋白，所述病毒是VSV、Arajas病毒、科卡病毒、伊斯法罕病毒、Maraba病毒、皮 理病毒、水泡性口炎阿拉戈斯病毒、BeAn 157575病毒、博特克病毒、Calchaqui病毒、 美洲鰻病毒、格雷洛奇病毒、朱羅納病毒、克拉馬斯病毒、克瓦塔病毒、La Joya病毒、 Malpais Spring病毒、芒特埃爾崗蝙蝠病毒、Perinet病毒、Tupaia病毒、Farmington>大 巴伊亞病毒、Muir Spring s病毒、ReedRanch病毒、哈特公園病毒、費蘭杜病毒、凱米 斯病毒、Mosqueiro病毒、莫蘇里病毒、巴魯病毒、Fukuoka病毒、克恩峽谷病毒、恩 科比遜病毒、利丹特病毒、Keuraliba病毒、Connecticut病毒、新明托病毒、莎草病毒、 查可病毒、Sena Madureira病毒、蒂姆博病毒、阿爾姆皮瓦病毒、阿魯卡病毒、班戈蘭 病毒、卞博病毒、BivensArm病毒、Blue crab病毒、查里維勒河病毒、Coastal Plains病 毒、DakArK 7292病毒、Entamoeba病毒、加巴病毒、戈薩斯病毒、HumptyDoo病毒、 約英杰卡卡病毒、肯納曼格拉姆病毒、科隆各病毒、Koolpinyah病毒、Kotonkon病毒、 蘭德幾亞病毒、Manitoba病毒、馬可病毒、Nasoule病毒、納瓦魯病毒、Ngaingan病 毒、Oak-Vale病毒、奧博第安病毒、奧衣塔病毒、奧安戈病毒、帕里河病毒、RioGrandecichlid病毒、圣德吉姆巴病毒、西格馬病毒、Sripur病毒、Sweetwater Branch病毒、 Tibrogargan病毒、Xiburema病毒、雅塔病毒、羅德島病毒、Adelaide River病毒、 Berrimah病毒、金伯利病毒或牛短暫熱病毒。
58.權利要求57的組合物，其中RNA基因組編碼VSVG、M、P、N或L蛋白。
59.權利要求58的組合物，其中RNA基因組編碼VSVG、M、P、N和L蛋白。
60.用于治療癌癥患者的方法，其包括(a)對所述患者施用有效量的第一溶瘤彈狀病毒；和(b)對所述患者施用有效量的至少第二溶瘤彈狀病毒，其中所述第二溶瘤彈狀病毒包 含與所述第一溶瘤彈狀病毒不同的G蛋白。
61.權利要求60的方法，其中所述癌癥患者患有轉移癌。
62.權利要求60的方法，其中所述癌癥患者是具有免疫能力的。
63.權利要求60的方法，其中通過腹膜內、靜脈內、動脈內、肌內、皮內、瘤內、皮 下或鼻內施用來施用所述第一溶瘤或第二溶瘤彈狀病毒。
64.權利要求60的方法，其還包括施用額外的抗癌治療。
65.權利要求64的方法，其中所述額外的癌癥治療是化學治療劑、放射治療劑或免疫 治療劑。
66.權利要求60的方法，其中所述第一或第二溶瘤彈狀病毒包含來自下列病毒的G 蛋白，所述病毒是水泡性口膜炎病毒(VSV)、Arajas病毒、科卡病毒、伊斯法罕病毒、 Maraba病毒、皮理病毒、水泡性口炎阿拉戈斯病毒、BeAn 157575病毒、博特克病毒、 Calchaqui病毒、美洲鰻病毒、格雷洛奇病毒、朱羅納病毒、克拉馬斯病毒、克瓦塔病 毒、La Joya病毒、Malpais Spring病毒、芒特埃爾崗蝙蝠病毒、Perinet病毒、Tupaia病 毒、Farmington>大巴伊亞病毒、Muir Springs病毒、Reed Ranch病毒、哈特公園病毒、 費蘭杜病毒、凱米斯病毒、Mosqueiro病毒、莫蘇里病毒、巴魯病毒、Fukuoka病毒、 克恩峽谷病毒、恩科比遜病毒、利丹特病毒、Keuraliba病毒、Connecticut病毒、新明 托病毒、莎草病毒、查可病毒、Sena Madureira病毒、蒂姆博病毒、阿爾姆皮瓦病毒、 阿魯卡病毒、班戈蘭病毒、卞博病毒、Bivens Arm病毒、Blue crab病毒、查里維勒河 病毒、Coastal Plains病毒、DakArK 7292病毒、Entamoeba病毒、加巴病毒、戈薩斯病 毒、Humpty Doo病毒、約英杰卡卡病毒、肯納曼格拉姆病毒、科隆各病毒、Koolpinyah 病毒、Kotonkon病毒、蘭德幾亞病毒、Manitoba病毒、馬可病毒、Nasoule病毒、納瓦 魯病毒、Ngaingan病毒、Oak-Vale病毒、奧博第安病毒、奧衣塔病毒、奧安戈病毒、 帕里河病毒、Rio Grande cichlid病毒、圣德吉姆巴病毒、西格馬病毒、Sripur病毒、 SweetwaterBranch病毒、Tibrogargan病毒、Xiburema病毒、雅塔病毒、羅德島病毒、 Adelaide River病毒、Berrimah病毒、金伯利病毒或牛短暫熱病毒。
67.權利要求66的方法，其中所述第一或第二溶瘤彈狀病毒包含來自VSV或伊斯法 罕病毒的G蛋白。
68.權利要求67的方法，其中所述第一溶瘤彈狀病毒包含來自VSV的G蛋白，且所 述第二溶瘤彈狀病毒包含來自伊斯法罕病毒的G蛋白。
69.權利要求67的方法，其中所述第一溶瘤彈狀病毒包含來自伊斯法罕病毒的G蛋 白，且所述第二溶瘤彈狀病毒包含來自VSV的G蛋白。
70.權利要求60的方法，其還包括(C)對所述患者施用有效量的至少第三溶瘤彈狀 病毒，其中所述第三溶瘤彈狀病毒包含與所述第一和所述第二溶瘤彈狀病毒不同的G蛋 白。
全文摘要
本發明的實施方案包括涉及非VSV彈狀病毒的組合物和方法以及它們作為抗癌治療劑的用途。此類彈狀病毒具有在體外和體內殺傷腫瘤細胞的性質。
文檔編號A61K48/00GK102026645SQ200780040733
公開日2011年4月20日 申請日期2007年9月17日 優先權日2006年9月15日
發明者C·布朗, D·斯托耶德爾, J·貝爾 申請人:渥太華健康研究所