專利名稱：：Hpv抗原融合蛋白疫苗組合物及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明一方面提供了包含編碼免疫刺激多肽和突變HPV抗原的融合蛋白的核酸分子的表達載體和宿主細胞，其中該突變HPV抗原是包含至少兩個半胱氨酸殘基替代的E7多肽。在一個實施方式中，在人類乳頭瘤病毒相關的疾病發生之前給予融合蛋白。在另一個實施方式中，在人類乳頭瘤病毒相關的疾病被確診后給予融合蛋白。[0017本發明一方面提供了治療或預防人類乳頭瘤病毒相關疾病的方法，包括給予有效量的編碼包含免疫刺激多肽和突變HPV抗原的融合蛋白的核酸，其中該突變HPV抗原是包含至少兩個半胱氨酸殘基替代的E7多肽。在具體實施方式中，該編碼融合蛋白的核酸選自由以下成員構成的組SEQIDNOS:5，7,11和13。在一個實施方式中，核酸可以被直接提供給受試者。在另一個實施方式中，該核酸與免疫細胞通過離體方式(exv/vo)4妻觸。圖2示出了重組HPV融合多肽在還原條件下(圖1A)或非還原條件下(圖1B)的SDS-PAGE分析圖。兩塊膠上樣順序相同，分別為第1道在4度貯存7天的C7E7樣品；第2道在4度貯存7天的C7E7m2樣品；第3道在4度貯存7天的C7E7m3樣品；第4道在-20度貯存7天的C7E7樣品；第5道在-20度貯存7天的C7E7m2樣品；第6道在-20度貯存7天的C7E7m3樣品。本發明總體而言涉及包含突變形式的HPVE7抗原和免疫刺激多肽的融合蛋白，該融合蛋白可用作疫苗來預防和/或治療人類乳頭瘤病毒相關的疾病。盡管不希望受理論的限制，免疫刺激多肽和HPV抗原的融合能促進針對HPV的免疫應答，例如，通過輔助MHCI類分子/肽裝配。因此，這種組合可以增強疫苗在治療或預防HPV-相關疾病中的治療效果。單位，前綴和符號可以以它們被接受的SI形式表示。除非另外說明，核酸按從5，到3，的順序從左到右書寫；氨基酸序列按從氨基端到羧基端的順序從左到右書寫。氨基酸可以以IUPAC-IUBMB命名委員會推薦的廣為人知的三字母符號或單字母符號來指代。同樣地，核普酸可以以被廣泛接受的單字母代碼來指代。本發明中應用的術語"藥學上可接受的載體"包括藥用兼容的任一和所有的溶劑，分散劑，包衣，抗細菌和抗真菌物質，等滲和延遲吸收物質等。在一個實施方式中，人CRT的N端結構域(如SEQIDNO:2序列中的18-366位氨基酸，縮寫為C6)連接到HPV-16E7抗原以形成C6E7融合蛋白。編碼C6E7的核酸序列參見表5。在這個實施方式中，密碼子被優化以適于在大腸桿菌中表達。編碼C6E7的氨基酸序列參見表6。表5.編碼C6E7的多核苦齡列(SEQIDNO:3)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>在一個實施方式中，人全長CRT(SEQIDNO:2序列，縮寫為C7)連接到HPV-16E7m3抗原以形成C7E7m3融合蛋白。編碼C7E7m3的核酸序列參見表15。編碼C7E7m3的氨基酸序列參見表16。表15.編碼C7E7m3的多核苦^f列(SEQIDNO:13)<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>含免疫刺激多肽，該免疫刺激多肽可以增強與之相連的突變HPVE7抗原的免疫原性。在一個實施方式中，免疫刺激蛋白具有伴侶功能。不希望受理論的限制，具有伴侶功能的蛋白可以在內質網內輔助其它蛋白進行正確折疊。具體地，一些伴倡蛋白可以輔助MHCI類分子的裝配。在一些實施方式中，該免疫刺激多肽是屬于分子伴侶超家族的蛋白，它能夠輔助非天然多肽的折疊，該免疫刺激多肽包括，但不限于，Hsp27，Hsp40，Hsp70，Hsp90，HsplOO，HspllO和其它一些小分子Hsp。在一些具體實施方式中，一免疫刺激多肽可以輔助MHCI類分子/肽復合物在抗原呈遞細胞中的裝配，該免疫刺激多肽包括，但不限于，4丐網蛋白，鉤聯接蛋白(calnexin)，tapasin和ER60。如下文討i侖的，含有本發明疫苗的一個或多個合適的單位劑型可被制成持續釋放的劑型(如采用微膠嚢，參考WO94/07529和U.S.Pat.NO.4,962,091),可通過不同的途徑給藥，包括非經腸(包4舌,爭脈注射和肌內注射)途徑以及直4妻注射入患病組織。例如，本疫苗可以直接注射入肺瘤。制劑可以方便地以單獨的單位劑型形式存在，并可以通過任一廣為人知的藥劑學方法制備獲得。這些方法包括將治療劑(HPV融合多肽疫苗)與液態載體、固態介質、半固態載體、精細分割的固態載體或其組合相互結合的步驟，必要時，將產品導入或加工到期望的遞藥系統中。藥學上可接受的載體、稀釋劑或輔藥組合而形成藥用制劑或單位劑型。制劑中的總活性成份占制劑重量的0.1至99.9%。"藥學上可接受的"指載體、稀釋劑、輔藥，和/或鹽與制劑中的其他成份能相容，并對其受藥者無毒害。藥物的活性成份可以以粉末或顆粒的形式或以溶液、懸浮液或乳狀液的形式存在。所有涉及本發明公開的出版物、專利申請、出版的專利、以及其它文件都被并入本文作為參考，猶如把每一篇出版物、專利申請、出版的專利、以及其它文件的全部都明確地、單獨地并入本文作的矛盾時以本文中的定義為準。實施例0126本發明由以下實施例進一步說明，但無論如何不以此為限。實施例1-本發明中的HPV疫苗多肽的制備5.HPV疫苗多肽的表達6.HPV融合多肽的純化0140上清液中的蛋白用PEI(聚乙烯亞胺，Sigma-Aldrich,St.,Louis，MO)沉淀。簡要的步驟是，10%的PEI和離心獲得的上清按0.08:1的比例混合。混合物在4。C條件下靜置15分鐘后，12000rc/離心30分鐘。然后，沉淀物使用含0.3MNaCl的緩沖液A(50mMTris，0.5mMEDTA，50mMNaCl，5%甘油，PH7.9)洗滌，棄去上清。使用20倍體積的含0.9MNaCl的緩沖液A洗提目的蛋白。離心去除沉淀，收集上清。接著，上清使用55%的硫酸銨(7.5g硫酸銨/20mL液體)過夜沉淀。離心收集沉淀。為了確定蛋白從大腸桿菌中表達和純化出來后的穩定性和純度，新鮮制備的C6E7、C6E7m2和C6E7m3樣品經過SDS-PAGE電泳進行分析(分別見圖1A、1B和1C)。凝膠經掃描后，進行光密度測定以確定HPV融合蛋白的相對含量。結果具體表示為C6E7,C6E7m2和C6E7m3相對應的條帶的像素點數量與整條泳道的像素點總數量的百分比。對每一種HPV疫苗多肽而言，樣品在還原條件下比非還原條件下表現更大量的具有預期分子量的蛋白(表18)。這說明在每個制備品中多肽與多肽之間有二硫鍵形成。但是在非還原條件下，檢測到的C6E7m2的含量顯著高于野生型C6E7的含量(88.18%對66.43%)。表18通過光密度測定法測定蛋白條帶的含量(4'C儲存)<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>[0146為了確定HPV融合多肽儲存時的穩定性，樣品在4。C放置2個月，然后再進行SDS-PAGE分析(見圖1D和表18)。SDS-PAGE分析表明C6E7m2的純度顯著高于C6E7和C7E6m3。儲存后的野生型C6E7表現大量降解。如非還原和還原SDS-PAGE所示(圖1D),所有的C6E7樣品在儲存期間都發生降解。部分C6E7m3也發生降解，但沒有達到與野生型一樣的程度。在儲存期間，幾乎所有的C6E7m2都保持完整。比較還原和非還原條件下的電泳結果，發現大多數的C6E7m2是聚集的(SDS-PAGE上的高分子量條帶可以證明)。這可能是在儲存期間由于半胱氨酸的交聯導致的，然而，當在還原條件下進行SDS-PAGE時，二硫鍵是打開的。本發明也斗全測了C7E7、C7E7m2和C6E7m3疫苗多肽在4"C或-20"C放置7天后的穩定性。結果如圖2所示。在(C放置7天后，還原或非還原條件下的SDS-PAGE顯示野生型C6E7幾乎全部被降解(圖2A和圖2，泳道1)。相反地，4X:放置7天后的突變體C7E7m2和C7E7m3大部分是完整的(圖2A和圖2B,泳道2-3)。同樣地，與突變體C7E7m2和C7E7m3相比(圖2A和圖2B,泳道5-6),-20°C放置7天后野生型C7E7出現大量的降解(圖2A和圖2,泳道4)。與野生型相比，C7E7m2和C7E7m3突變體對降解和聚合更具有4氐抗力，這可被用于生產出從生產到用藥期間保持穩定的由這些多肽組成的HPV疫苗。因此，與含野生型E7抗原的多肽相比，本發明中的HPV融合多肽提供的疫苗組合物具有在儲存期間表現增強的穩定性的特征。實施例3_本發明HPV融合多肽對體內腫瘤發生的預防作用|0149采用人腫瘤小鼠模型檢測了本發明HPV融合多肽預防HPV誘導的肺瘤發生的能力。在具體實施中，小鼠在給予本發明的HPV融合多肽后，接種HPV16E6/E7轉化的小鼠TC-1細胞。用本發明的HPV融合多肽免疫小鼠后，除肺瘤發生率下降外，肺瘤的體積也變小。第0天在小鼠(n=10只/組)右側皮下接種1.5xl()5個能表達E7的TC-1細胞。第5天，分別給小鼠注射PBS、單獨200(xgBCG或C6E7m2、單獨60|agE7或E7m2,或注射BCG分別與E7、E7m2、或C6E7m2的混合物。每隔3到4天觀察腫瘤生長狀態，并使用游標卡尺測量腫瘤的長度和寬度。腫瘤體積通過如下公式計算長度x寬度x寬度+2，同時將腫瘤的生長變化繪制成曲線圖。。在第三項研究中研究了經全長鈣網蛋白與野生型或突變型HPVE7抗原組成的融合蛋白聯合BCG免疫后小鼠產生的T細胞的細胞溶解活性。圖6C比較了分別從100嗎C7E7m2或100pgC7E7m2耳關合不同劑量的BCG(50|ig,100pg,200pg或400(ig)或單獨400pgBCG免疫小鼠來源的效應T淋巴細胞的細胞溶解活性。實驗結果表明BCG能協助本發明的HPV疫苗發揮作用，誘導CTL應答。[0169在第四項研究中研究了經4丐網蛋白N端結構域(18-366位氨基酸)與野生型或突變型HPVE7抗原組成的融合蛋白聯合BCG免疫后小鼠產生的T細胞的細胞溶解活性。圖6D比較了從lOOiagC6E7m2或lOO^igC6E7m2聯合不同劑量的BCG(50嗎，lOOpg,200(xg或400^ig)或單獨400|agBCG免疫小鼠來源的效應T'淋巴細胞的細胞溶解活性。實驗結果表明BCG能協助本發明的HPV疫苗發揮作用，誘導CTL應答。在第三項研究中研究了經全長鈣網蛋白與野生型或突變型HPVE7抗原組成的融合蛋白聯合BCG免疫后小鼠脾細胞的細胞因子產生情況。圖7C比較了分別經100pgC7E7m2或100jxgC7E7m2聯合不同劑量的BCG(50嗎，IOO嗎，200|iig或400)ig)或單獨400昭BCG免疫后小鼠脾細胞的IFN-Y產生情況。實驗結果表明BCG能協助本發明的HPV融合多肽疫苗發揮作用，誘導Thl型細胞因子產生。這些研究表明本發明的HPV疫苗組合物能被用于誘導特異的免疫應答-細胞因子產生(當用HPVE7抗原在體外刺激時)。這些結果支持本疫苗組合物可以被用于在人類誘導出針對HPV誘發的癌細胞的免疫攻擊。因此，本發明的HPV融合多肽疫苗組合物能夠通過誘導免疫應答來治療或預防HPV相關的疾病。實施例7-人類中的治療性和預防性免疫(預示性的)[0177本發明的HPV融合多肽可^^用于治療HPV感染和其感染所導致的疾病。特別的，對于有患HPV感染相關病癥風險的(或易患HPV感染相關病癥的)或已患有HPV感染相關病癥的受試者，本發明提供了預防和治療的方法。可以在感染的癥狀特征表現之前給予預防性HPV融合多肽，從而預防或延遲疾病或病情的發展。在治療性應用中，本發明的HPV融合多肽被用于疑似感染或已經感染了HPV的受試者。本發明將一個適當的、能發揮治療或預防效果的給藥劑量定義為治療或預防有效劑量。0178在本實施例中，用本發明的疫苗組合物免疫患HPV相關疾病(如宮頸癌)的受試者。HPV融合多肽的制備如實施例1所描述。由C6E7m2或C7E7m3組成的疫苗(包含或不包含BCG佐劑)可以被給予巴氏涂片檢測結果異常的人類受試者。巴氏涂片檢測能檢測出宮頸細胞的改變，并能檢測出異常的宮頸細胞。因此，巴氏涂片檢測能提示已患或易患HPV相關疾病的受試者的宮頸細胞的改變情況。在經過治療后，監測患者的腫瘤的發生情況和/或腫瘤體積的縮小情腫瘤的發生，或與正常的受試者(即沒有遭受病毒感染)相比受試者的肺瘤體積縮小。等同物[01791本發明不限于本申請中所述的具體實施方案，這些實施方案僅僅為了解釋說明本發明的各個方面。可以在不脫離本發明的精神和范圍的情況下，對本發明作出多種修改和變化，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。除了本說明所列舉的方法和裝備以外，從本發明先前的描述中，功能上等同的方法和裝置對本領域技術人員而言是顯而易見的。這些修改和變化意圖落入本發明所附權利要求的范圍內。本發明將僅由所附權利要求的術語以及這些權利要求對應的等同物的全部范圍所限定。應該理解的是本發明并不限定于所描述的特定方法，試劑，化合物，組合物或生物系統，這些毫無疑問地是可以變化的。也應當理解，這里所使用的術語僅用來描述特定的實施方案，并不用于限定。10180其它的實施方案在如下的權利要求中被闡述。權利要求1.疫苗組合物，包含免疫刺激多肽和突變HPV抗原的融合蛋白，其中該突變HPV抗原為包含至少兩個半胱氨酸殘基的替代的HPV16E7多肽。2.權利要求1的疫苗組合物，其中所述的免疫刺激多肽選自由以下成員構成的組4丐網蛋白，鈣聯接蛋白，tapasin，ER60，Hsp27，Hsp40,Hsp70,Hsp90,HsplOO和Hspl10。3.權利要求1的疫苗組合物，其中所述的免疫刺激多肽是釣網蛋白或其生物活性結構域，片段或同源物。4.權利要求3的疫苗組合物，其中所述的免疫刺激多肽是人鈣網蛋白的N端結構域，包含SEQIDNO:2的18-366位氨基酸。5.權利要求3的疫苗組合物，其中所述的免疫刺激多肽是人鈣網蛋白的N端結構域，包含SEQIDNO:2的18-180位氨基酸。6.權利要求l的疫苗組合物，其中所述的突變E7多肽具有SEQIDNO:1的一個或多個半胱氨酸殘基上的替代，所述半胱氨酸殘基選自由半胱氨酸-24,半胱氨酸-59和半胱氨酸-68構成的組。7.權利要求6的疫苗組合物，其中所述的突變E7多肽具有SEQIDNO:1的半胱氨酸-59和半胱氨酸-68上的替代。8.權利要求1的疫苗組合物，其中所述的融合蛋白選自由以下成員構成的組SEQIDNOS:6，8，12和14。9.權利要求l的疫苗組合物，進一步包含佐劑。10.權利要求9的疫苗組合物，其中所述的佐劑是BCG。11.治療或預防人類乳頭瘤病毒相關疾病的藥物組合物，包含有效量的權利要求1的融合蛋白和藥學上可接受的載體。12.權利要求11的藥物組合物，進一步包含佐劑。13.權利要求12的藥物組合物，其中所述的佐劑是BCG。14.編碼免疫刺激多肽和突變HPV抗原的融合蛋白的核酸分子，其中該突變HPV抗原為包含至少兩個半胱氨酸殘基的替代的E7多肽。15.權利要求14的核酸分子，其中所述的免疫刺激多肽是鈣網蛋白或其生物活性同源物，結構域或片段。16.權利要求15的核酸分子，其中所述的免疫刺激多肽是人鈣網蛋白的N端結構域，包含SEQIDNO:2的18-366位氨基酸。17.權利要求15的核酸分子，其中所述的免疫刺激多肽是人鈣網蛋白的N端結構域，包含SEQIDNO:2的18-180位氨基酸。18.權利要求14的核酸分子，其中所述的突變E7多肽具有SEQIDNO:1的一個或多個半胱氨酸殘基上的替代，所述半胱氨酸殘基選自由半胱氨酸-24,半胱氨酸-59和半胱氨酸-68構成的組。19.權利要求18的核酸分子，其中所述的突變E7多肽具有SEQIDNO:1的半胱氨酸-59和半胱氨酸-68上的替代。20.權利要求14的核酸分子，其中所述的融合蛋白選自由以下成員構成的組SEQIDNOS:6，8,12和14。21.權利要求14的核酸分子，其中所述的編碼融合蛋白的核酸選自由以下成員構成的組SEQIDNOS:5，7,11和13。22.包含權利要求14的核酸分子的表達載體。23.權利要求22的表達載體，進一步包含可操作地連接到所述核酸分子的啟動子。24.包含權利要求20的表達載體的宿主細胞。25.治療或預防人類乳頭瘤病毒相關疾病的方法，包括給予受試者有效量的包含免疫刺激多肽和突變HPV抗原的融合蛋白，其中該突變HPV抗原是包含至少兩個半胱氨酸殘基替代的E7多肽，從而治療或預防該受試者中的HPV-相關疾病。26.纟又利要求25的方法，其中所述的人類乳頭瘤病毒相關疾病選自由以下成員構成的組宮頸癌，肛門上皮內瘤樣病變，宮頸上皮內瘤樣病變，肛門生殖器疣，復發性呼吸道乳頭狀瘤和陰道上皮內瘤樣病變。27.根據權利要求25的方法，其中在人類乳頭瘤病毒相關疾病發生之前給予所述融合蛋白。28.權利要求25的方法，其中所述的免疫刺激多肽選自由以下成員構成的組4丐網蛋白，4丐耳關4妾蛋白，tapasin,ER60,Hsp27，Hsp40,Hsp70，Hsp90,Hsp100和Hsp110。29.權利要求25的方法，其中所述的免疫刺激多肽是鈣網蛋白或其生物活性同源物，結構域或片段。30.權利要求29的方法，其中所述的免疫刺激多肽是人鈣網蛋白的N端結構域，包含SEQIDNO:2的18-366位氨基酸。31.權利要求29的方法，其中所述的免疫刺激多肽是人釣網蛋白的N端結構域，包含SEQIDNO:2的18-180位氨基酸。32.權利要求25的方法，其中所述的突變E7多肽具有SEQIDNO:1的一個或多個半胱氨酸殘基上的替代，所述半胱氨酸殘基選自由半胱氨酸-24，半胱氨酸-59和半胱氨酸-68構成的組。33.權利要求32的方法，其中所述的突變E7多肽具有SEQIDNO:1的半胱氨酸-59和半胱氨酸-68上的替代。34.權利要求24的方法，其中所述的融合蛋白選自由以下成員構成的組SEQIDNOS:6，8，12和14。35.權利要求24的方法，進一步包含給予有效量佐劑的步驟。36.權利要求35的方法，其中所述的佐劑是BCG。37.權利要求36的方法，其中所述的BCG與所述融合蛋白同時給予。38.治療或預防人類乳頭瘤病毒相關疾病的方法，包括給予受試者有效量的編碼包含免疫刺激多肽和突變HPV抗原的融合蛋白的核酸，其中該突變HPV抗原是包含至少兩個半胱氨酸殘基替代的E7多肽，/人而治療或預防該受試者中的HPV-相關疾病。39.權利要求38的方法，其中所述的免疫刺激多肽是鈣網蛋白或其生物活性同源物，結構域或片段。40.權利要求39的方法，其中所述的免疫刺激多肽是人鈣網蛋白的N端結構域，包含SEQIDNO:2的18-366位氨基酸。41.權利要求38的方法，其中所述的免疫刺激多肽是人鈣網蛋白的N端結構域，包含SEQIDNO:2的18-180位氨基酸。42.權利要求38的方法，其中所述的突變E7多肽具有SEQIDNO:1的一個或多個半胱氨酸殘基上的替代，所述半胱氨酸殘基選自由半胱氨酸-24,半胱氨酸-59和半胱氨酸-68構成的組。43.權利要求42的方法，其中所述的突變E7多肽具有SEQIDNO:1的半胱氨酸-59和半胱氨酸-68上的替代。44.權利要求38的方法，其中所述的融合蛋白選自由以下成員構成的組SEQIDNOS:6，8，12和14。45.權利要求38的方法，其中所述的編碼融合蛋白的核酸選自由以下成員構成的組SEQIDNOS:5，7,11和13。46.制備疫苗組合物的方法，包括在宿主細胞中表達編碼免疫刺激多肽和突變HPV抗原的重組融合蛋白的核酸，其中該突變HPV抗原是包含至少兩個半胱氨酸殘基替代的E7多肽。47.權利要求46的方法，其中所述的宿主細胞是五.co//細胞。48.權利要求46的方法，其中所述的免疫刺激多肽是鈣網蛋白或其生物活性同源物，結構域或片段。49.權利要求48的方法，其中所述的免疫刺激多肽是人鈣網蛋白的N端結構域，包含SEQIDNO:2的18-366位氨基酸。50.權利要求48的方法，其中所述的免疫刺激多肽是人鈣網蛋白的N端結構域，包含SEQIDNO:2的18-180位氨基酸。51.;f又利要求46的方法，其中所述的突變E7多肽具有SEQIDNO:1的一個或多個半胱氨酸殘基上的替代，所述半胱氨酸殘基選自由半胱氨酸-24,半胱氨酸-59和半胱氨酸-68構成的組。52.權利要求50的方法，其中所述的突變E7多肽具有SEQIDNO:1的半胱氨酸-59和半胱氨酸-68上的替代。53.權利要求46的方法，其中所述的融合蛋白選自由以下成員構成的組SEQIDNOS:6，8,12和14。權利要求46的方法，其中所述的編碼融合蛋白的核酸選自由以下成員構成的組SEQIDNOS:5，7，11和13。全文摘要本發明提供了包含免疫刺激多肽和突變的人乳頭瘤病毒E7蛋白的融合蛋白。本發明還提供了編碼該融合蛋白的基因，含有該基因的表達載體，包含該融合蛋白的藥物組合物，用該融合蛋白治療或預防人類乳頭瘤病毒相關疾病的方法，以及該融合蛋白在制備治療或預防人類乳頭瘤病毒相關疾病的藥物中的應用。文檔編號A61K39/12GK101528255SQ200780039068公開日2009年9月9日申請日期2007年10月19日優先權日2006年10月19日發明者崔俊生,冰朱,楊世方申請人:沙東生物藥業(天津)有限公司;北京沙東生物技術有限公司