肝病的治療的制作方法

專利名稱：：肝病的治療的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及患肝病的個體的治療。本發(fā)明還涉及治療此類個體的方法以及用于此類治療的系統(tǒng)和設備。
背景技術：
：據(jù)估計，僅在美國每年死于肝衰竭的人達60,000例，而與等待名單上的1618,000相比，供體庫(donorpool)恒定，保持在大約4000例左右。等待名單上的受試者接受供體肝的幾率，僅僅是1/8，然而，沒有可用來延長此類患者壽命的有效治療。肝衰竭導致多器官功能障礙，死亡率處于80%的級別中。在肝硬化患者中，導致肝功能急性惡化的主要打擊(precipitant)是感染。在此類患者中通常所觀察到的感染的具體形式是自發(fā)的細菌性腹膜炎。即便治療基礎感染(underlyinginfection),但末梢器官功能(end-organfunction)的這種急性惡化仍將繼續(xù)，通常觀察到高達40%的死亡率。然而，感染后導致這種肝功能急性惡化的機制尚不清楚。發(fā)明概述本發(fā)明涉及肝病的治療，并闡述了影響發(fā)病率和死亡率的兩個至關重要的因素，即肝病患者的白蛋白結構、功能和水平的缺陷以及此類患者血液中內毒素水平的增加。因此，本發(fā)明提供了用于治療患有肝病個體的器械，包含(a)用于從個體血液中選擇性地除去白蛋白的裝置；以及(b)用于從個體血液中選擇性地除去內毒素的裝置；本發(fā)明還提供-治療患有肝病個體的方法，包括如下步驟(a)從個體的血液中除去白蛋白；以及(b)降低個體血液中內毒素的水平。-治療肝病的方法，包括使來自個體的血液與本發(fā)明的器械接觸以便將白蛋白和內毒素從個體的血液中除去的步驟。-通過從血液中選4奪性地除去白蛋白和內毒素體外處理血液的方法，其中血液來自患有肝病的個體。附圖簡要說明圖1:發(fā)現(xiàn)缺血》務飾白蛋白(ischaemiamodifiedalbumin,IMA)水平的增加與肝病的嚴重性有關。將值表示為每g/L血漿白蛋白的IAM吸光度單位，(平均值+或-SEM)。*=p<0.05，***=p<0.001。圖2:(A)對照、僅患有肝硬化患者和患有肝硬化+AH患者的靜止氧化猝發(fā)(restingoxidativeburst),(B)在對照、僅患有肝硬化患者和患有肝硬化+AH患者中，靜止氧化猝發(fā)與用大腸桿菌體外(exvivo)刺激后的氧化猝發(fā)之間的差異，(C)熒光強度的幾何平均值(geometricmeanoffluorescenceintensity,GMFI)，作為由對照、僅患有肝硬化患者和患有肝硬化+AH患者的一個嗜中性粒細胞吞噬的細菌(FITC標記的大腸桿菌)數(shù)目的測量值。上標表示統(tǒng)計上的顯著差異。1=與對照相比有顯著性。2=與肝硬化相比有顯著性。圖3:(A)接受者工作曲線(receiveroperatingcurve)下的面積，測定氧化捽發(fā)的測量在測定存活中的預測性用途。截止〈55。/。的靜止猝發(fā)(restingburst),預測死亡的靈敏度為75%，特異性為64%。(B)劃分為高靜止氧化猝發(fā)(〉/=55%)或低靜止氧化猝發(fā)(<55%)的患者的Kaplan-Meier存活曲線(Kaplan-Meiersurvivalcurve)和對數(shù)秩分析(log-rankanalysis)。天數(shù)20406080事項41012處于風險50443633圖4:(A)接受者工作曲線下的面積，測定熒光強度幾何平均值(GMFI)的測量在測定存活中的預測性用途。對于預測死亡而言，截止<295%GMFI,預測死亡的靈l文度為86%，特異性為67%。面積=0.80;標準標準誤差(StdErrors)=0.08;顯著性=0.02;截止=42;靈敏度=0.86;特異性=0.70。(B)劃分為低GMFI(<42)或高GMFI(〉/=42)患者的Kaplan-Meier存活曲線和對數(shù)碎失分析。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>圖5:患者全血和與患者血漿一起溫育的正常嗜中性粒細胞的靜止氧化猝發(fā)。高猝發(fā)患者的血漿也誘導了正常嗜中性粒細胞的高猝發(fā)，而低靜止猝發(fā)患者的血漿不能誘導正常嗜中性粒細胞的高猝發(fā)。WB表示全血，NN表示正常嗜中性粒細胞，PP表示患者血漿，H表示高靜止猝發(fā)(>/=55%),L表示低靜止猝發(fā)<55%)。*與正常相比，p=0.002。**與正常相比，p=0.0005。圖6:通過將患者的嗜中性粒細胞與正常血漿一起溫育，靜止氧化猝發(fā)的可逆性。PN表示患者的嗜中性粒細胞，PP表示患者的血漿，NP表示正常血漿。圖7:通過與內毒素一起溫育，靜止猝發(fā)的劑量依賴性增加。*pO.05;**p<0.001。圖8:與內毒素一起溫育不改變正常嗜中性粒細胞的吞噬作用，但進一步降低了患者嗜中性粒細胞的吞噬作用。圖9:通過使血漿通過內毒素去除柱或將血漿與CD14抗體一起溫育，靜止氧化猝發(fā)是可逆的。當使用低猝發(fā)患者的血漿或對照血漿時，柱或CD14抗體不影響靜止猝發(fā)。NN+PPH對比NN+PPHCD14pO.OOl。NN+PPH對比NN+PPHB柱p<0.001。圖10:通過使血漿通過內毒素去除柱或將血漿與CD14抗體一起溫育，吞噬作用的降低是可逆的。當使用低猝發(fā)患者的血漿或對照血漿時，柱或CD14抗體不影響l爭止猝發(fā)。NN+PPH對比NN+PPHCD14p=0.04,NN+PPH對比NN+PPHB柱p=0.03。圖11:白蛋白替代系統(tǒng)的示例。圖12:測量的血漿樣品的內毒素水平，所述血漿是在實施例3中的實—瞼終止時收集的(T=3小時)。與所有其他的組相比，在鹽水處理的動物中發(fā)現(xiàn)了顯著較高的內毒素水平(pO.OOl)。如圖所示，根據(jù)制造商的說明書，該測定的檢測限度是0.5EU/ml。圖13:在實施例3的實驗終止時采集的血液樣品中測量的水平A:白蛋白水平。BDL手術后4周，發(fā)現(xiàn)白蛋白顯著減少(與未處理的動物相比，**p<0.01),但在白蛋白治療后顯著增力口(與鹽水組相比，#p<0.05，曼-惠特尼(Mann-Whitney)檢驗)。B:血漿ALT水平。與所有給予了鹽水的動物相比，盡管治療組的血漿ALT明顯減少，但這些差異證明是不顯著的。C:血漿脲濃度。發(fā)現(xiàn)接受白蛋白和多粘菌素B組合的動物與僅施用了白蛋白的組相比，具有顯著較低的脲水平pp0.05,曼-惠特尼檢驗)。圖14:貫穿實施例3研究時程的測量的平均動脈壓(meanarterialpressure,MAP)。盡管沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異，但看起來好像接受白蛋白/多粘菌素B組合治療的組與僅接受白蛋白的動物相比，MAP增加，上述兩組的MAP都高于鹽水處理的組，該鹽水處理的組90分鐘后表現(xiàn)出明顯惡化。圖15:在整個實驗期收集的動脈血液樣品的嗜中性粒細胞活性。Y軸表示響應細菌猝發(fā)的嗜中性粒細胞的百分比?？梢钥闯?，在研究結合期(tiecourse),響應致病菌產(chǎn)生氧化猝發(fā)的嗜中性粒細胞的百分比既在白蛋白處理的組中又在和白蛋白/多粘菌素處理的組中進行性增加。在第3小時，在鹽水處理的動物中，觀察到輕微改善，但其低于其他的組，并且發(fā)現(xiàn)不顯著。發(fā)明的詳細描述在整個說明書中，詞語"包含(comprise)"和其諸如"包含(comprised)"或"包含(comprising)"等變化，應當理解為意指包括所述的元件、整體或步驟，或元件、整體或步驟組，但不排斥任何其他元件、整體或步驟或元件、整體或步驟組。在本說明書中對任何現(xiàn)有技術的引用，不是且不應當認為是對現(xiàn)有技術在澳大利亞或其他地方構成了常識的一部分這一點的認可或任何形式的提示。目前，患有肝病的患者特別是患有肝衰竭的患者可利用的治療范圍是有限的。對許多患者而言，唯一的選擇就是移植，然而，還沒有可用來延長此類患者壽命的有效治療。因此需要找到可用于改善患肝病個體狀況的治療方案。白蛋白是在肝臟中產(chǎn)生的主要血漿蛋白。白蛋白承擔多種功能，包括脂肪酸轉運、金屬螯合、藥物結合和抗氧化劑活性。在肝病中，白蛋白濃度的降低是由于合成減少或者由較高的降解速率導致的。本發(fā)明人另外證明，在患有肝病的患者中，血液循環(huán)中白蛋白的比例在結構上是異常的。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，患有肝病的患者的缺血修飾白蛋白(IMA)的量與健康的對照受試者相比是增加的。一定比例的來自患有肝衰竭患者的白蛋白的功能能力受到永久破壞。因此，本發(fā)明一方面涉及從患有肝病的個體的血液中除去白蛋白。本文中的除去白蛋白既指除去存在于個體血液中的正常白蛋白，也指除去任何結構上或功能上修飾形式的白蛋白。也就是說，優(yōu)選地，本發(fā)明所用的除去白蛋白的裝置不但能除去正常的天然存在的白蛋白，也能除去具有異常結構的白蛋白或經(jīng)修飾的白蛋白。除去任何受損的或異常白蛋白，在治療上也是有用的，因為受損的白蛋白功能很差并且與有破壞性的副作用有關。例如，除去白蛋白的裝置也可除去與正常的未修飾的白蛋白相比，分子柔性(molecularflexibility)降低、脂肪酸結合親和性降低、轉運特性降低、轉運效率減低和/或解毒能力降低的白蛋白。除去白蛋白的裝置也可以除去具體修飾形式的白蛋白，如缺血修飾白蛋白(IMA)。利用常規(guī)技術如實施例1所述的技術，可以檢測此類結構和功能修飾。特別是，利用自旋標記物(spinlabel)和電子順磁共振光譜術(electronparamagneticresonancespectroscopy),可評估白蛋白的功能性。通過檢查白蛋白與金屬原子的結合能力，可以檢測IMA的存在。除去白蛋白也可通過除去與白蛋白結合的任何毒素而使血液解毒。即，除去白蛋白的裝置也可因此除去血液中與白蛋白結合的毒素。優(yōu)選地，從血液中除去白蛋白的裝置選擇性地除去白蛋白。即，白蛋白優(yōu)先于血清中的其他物質如其他的蛋白而除去。優(yōu)選地，從血液中除去的白蛋白的量顯著地高于除去的其他血液成分的量。例如，在此方面，除去的組分以重量計超過99。/。的是白蛋白，在此方面，除去的組分中98%多、95%多、90%多、80%多、70%多、60%多或50%多是白蛋白。在此，除去白蛋白包括除去本文所述的各種修飾形式的白蛋白。除去白蛋白的裝置可以是能從血液中選擇性地除去白蛋白的任何裝置。一方面，利用與白蛋白結合的配體，選擇性地除去白蛋白。配體可以是與白蛋白結合的任何分子。例如，已知許多活性染料(reactivedyes)與白蛋白結合。配體可以是抗體或其他與白蛋白特異性結合的親和配體。通常，與白蛋白特異性結合的配體是如上文所述能從血液中選擇性地除去白蛋白的配體。例如，配體能比血液的其他組分更牢固地與白蛋白結合。例如，配體可以是與人白蛋白特異性結合的抗體。配體可以是與對白蛋白具特異性的表位結合的抗體。配體可以是分子的組合，所述分子中的每一個都與白蛋白結合，如與白蛋白分子的不同部分結合的分子的組合。配體可以是多克隆抗體或與白蛋白上多個表位結合的抗體的混合物。此類組合方法可用于除去修飾形式的白蛋白，因為不同的抗體可以靶向白蛋白分子的不同部分?？舍槍Π椎鞍追肿拥木唧w表位產(chǎn)生抗體。例如，可以產(chǎn)生特異性地針對這些區(qū)域的抗體，預期所述區(qū)域在未修飾的和具體修飾形式的白蛋白中在結構上相似。出于本發(fā)明的目的，術語"抗體"，除非另有說明，包括與白蛋白結合的片段。此類片段包括Fv、F(ab')和F(ab')2片段以及單鏈抗體。此外，抗體和其片段可以是嵌合抗體、CDR移植抗體或人源化的抗體。方法在本領域內是公知的，參閱例如HarlowandLane(1988)"Antibodies:ALaboratoryManual(抗體實驗室手冊)"，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY。例如，抗體可通過在宿主動物中產(chǎn)生針對完整多肽或其片段例如其抗原表位(下文稱為"免疫原")的抗體來制備。產(chǎn)生多克隆抗體的方法包括，用免疫原使適宜的宿主動物如實驗動物免疫，并從動物血清中分離免疫球蛋白。因此可用免疫原接種動物，隨后從動物中除去血液，并純化IgG組分。產(chǎn)生單克隆抗體的方法包括，使產(chǎn)生期望抗體的細胞永生。雜交瘤細胞可通過將來自接種動物的脾細胞與腫瘤細胞融合產(chǎn)生(KohlerandMilstein(1975)Ato紅e256，495-497)。產(chǎn)生期望抗體的永生細胞可通過常規(guī)方法選擇?？蓪㈦s交瘤培養(yǎng)于培養(yǎng)物中或腹膜內注射用于形成腹水或進入同種異體宿主或免疫功能受損宿主的血流中。可以通過體外賦予人類淋巴細胞免疫性，隨后用EB病毒(Epstein-Barrvirus)轉化淋巴細胞來制備人類抗體。對于產(chǎn)生單克隆和多克隆抗體兩者，適宜的實驗動物是山羊(goat)、兔(rabbit)、大鼠(rat)或小鼠(mouse)。如果需要，免疫原可作為共軛物施用，在該共軛物中，免疫原是例如經(jīng)由一個氨基酸殘基的側鏈偶聯(lián)于適宜的載體。載體分子通常是生理學上可接受的載體?？煞蛛x獲得的抗體，并且如果需要，進行純化。當抗體或其他配體以優(yōu)先的親和性或高親和性與其特異性的蛋白結合時，其特異性地與該蛋白結合，而與其他的蛋白基本上不結合或僅以低親和性結合。即，如果抗體與白蛋白的結合比其與其他的血液成分如血液中的其他蛋白的結合更牢固，則該抗體與該白蛋白特異性結合。如上文所解釋的，結合特異性可以是這樣的結合，即抗體與結構或功能上改變的白蛋白形式以及未修飾的白蛋白結合。優(yōu)選地，抗體以與未修飾的白蛋白相同或基本上相同的結合親和性與結構上或功能上改變的白蛋白形式結合。優(yōu)選地，抗體以比其他的血液成分如血液中的其他蛋白更高的親和性與修飾和未修飾的白蛋白形式兩者結合。有關測定抗體特異性結合能力的竟爭性結合或免疫放射分析的多種實驗方案在本領域內是公知的(參閱例如Maddoxetal,J.Exp.Med,J^，1211-1226,1993)。此類免疫分析通常涉及在特異性蛋白和其抗體之間形成復合物并測量復合物的形成。如果利用配體除去白蛋白，則可將該配體以附著于固相支持體的方式提供?？蓪⑴潴w固定于此類固相支持體上。適宜的固相支持體可以是柱的形式，血液可以流經(jīng)該柱。適宜的固相支持體可以是例如有孔的足以允許血液通過的多孔材料如膜、顆粒床(particlebed)或過濾器。優(yōu)選地，固相支持體具有大的表面積，以便使個體血液和附著于支持體的配體之間的接觸面積最大化。固相支持體可采用可填入容器中的珠的形式，可將血液可加入該容器或流經(jīng)該容器。珠優(yōu)選具有一定尺寸，當裝入柱或過濾床(filterbed)中時，該尺寸足以允許足夠的多孔性。各種不同的珠材泮+是本領域已知的。因此，根據(jù)本發(fā)明的除去白蛋白的裝置可包含附著有或固定有能與白蛋白結合的配體的此類固相支持體或由其組成。除去白蛋白的裝置可包含使血液流過的容器，或由其組成。容器可因此包含入口和出口。確定入口和出口的位置，以便流過容器的血液與本文所述的固相支持體接觸。優(yōu)選地，設計或選擇除去白蛋白的裝置，以使血液和固相支持體之間的接觸面積最大化。多種此類設計方案在本領域內是已知的。例如，除去白蛋白的裝置可以是裝有珠的柱或過濾床，其中將白蛋白的配體固定于珠上。另一方面，白蛋白的除去可經(jīng)由透析實現(xiàn)。這種方法也可導致除去與白蛋白一起透析的其他血液成分。通常，白蛋白應當是除去的主要成分。這種透析步驟可利用任何白蛋白透析系統(tǒng)。多種此類系統(tǒng)在本領域內是已知的。一種此類系統(tǒng)是分子吸附再循環(huán)系統(tǒng)(molecularabsorbancerecirculatingsystem,MARS)?？蛇x的系統(tǒng)是通用單通道白蛋白透一斤(singlepassalbumindialysis,SPAD)系統(tǒng)。這些系統(tǒng)利用50kDa的孔膜透析血液中的白蛋白。這種系統(tǒng)經(jīng)特殊設計，可從患者的血液中除去白蛋白結合的毒素。作為這種系統(tǒng)的可選方式，也可利用較大孔的膜，以便將來自患者血液的白蛋白經(jīng)由透析與新鮮的白蛋白進行主動交換。這允許在同一步驟中除去毒素和異常形式的白蛋白。如下文進一步所討論的，這也允許將不是來自個體的新白蛋白導入血液中。其中MARS系統(tǒng)經(jīng)改良以包括更大孔的膜的研究表明，與標準的50kDa孔的設備相比，對蛋白結合毒素的除去具實質改進。例如，可以使用孔徑大于50kDa、大于60kDa、大于70kDa、大于80kDa、大于90kDa或大于100kDa的膜。膜的孔徑可小于60kDa、小于75kDa、小于100kDa或小于150kDa。取決于除去白蛋白所用的具體裝置，其他的血液成分可與白蛋白一起除去。在一個實施方案中，可將與白蛋白一起除去的其他成分返回到個體的血液。待返回的成分可從已經(jīng)被從血液中除去的白蛋白混合物中純化，或由不是來自該個體的新鮮等同成分替代。從血液中除去白蛋白的各種方法在本領域內是已知的。例如，美國專利第4,093,612號公開了可用于從流體中除去白蛋白的活性染料組合物。根據(jù)該發(fā)明，此類組合物可用于從個體的血液中除去白蛋白。因此，這是基于與白蛋白特異性結合的化合物的選擇性白蛋白捕集系統(tǒng)(selectivealbumintrappingsystem)。這些4b合沖勿可以是例3口美國專利第4,093,612號所述的活性染料，如汽巴藍(cibacron-blue)，可以是能與白蛋白結合的其他分子，如白蛋白特異性抗體。因此，根據(jù)本發(fā)明，將白蛋白從患有肝病的個體的血液中除去。一方面，這種白蛋白可由不是來自該個體的新的白蛋白替代。新的白蛋白優(yōu)選在結構上或功能上是正常的。即，新的白蛋白不包含或基本上不包含結構上或功能上修飾形式的白蛋白。如果從個體的血液中除去的白蛋白包含一種或多種修飾形式的白蛋白，則返回該個體血液的白蛋白優(yōu)選與已被除去的白蛋白相比包含較少的修飾的白蛋白。例如，返回到個體血液的白蛋白可包含少于50%、少于30%、少于20%、少于10%、少于5%或少于1%的量的從該個體除去的修飾的白蛋白。優(yōu)選地，返回個體的白蛋白不包含修飾的白蛋白或從個體中除去的一種或多種類型的修飾的白蛋白，例如無缺血》務飾白蛋白(IMA)。新的白蛋白可來自另一個個體，如未患有肝病的個體、未患有肝衰竭的個體或具有正常肝功能的個體。新的白蛋白可以是已被從個體中除去但已經(jīng)進行清理或純化而除去毒素和/或修飾的白蛋白分子的白蛋白。新的白蛋白通常比已從個體中除去的白蛋白具有更高比例的結構和功能上正常的白蛋白。新的白蛋白可以是藥物級別的白蛋白。將這種新的白蛋白導入個體的血液中，確保個體具有適宜水平的循環(huán)白蛋白。其可直接替代除去的白蛋白，例如，可將與除去的白蛋白相同或等同量的白蛋白返回血液中。在這種系統(tǒng)中，用新白蛋白來有效交換個體的白蛋白?？蛇x地，通過改變在此階段導入的白蛋白的量，如果需要，可增加或降低血液中總的白蛋白濃度。導入血液中的白蛋白的量因此可大于或小于除去的白蛋白的量。例如，肝病可導致循環(huán)白蛋白的水平降低。這可導致較低的功能能力。根據(jù)本發(fā)明，導入患者血液中的新白蛋白的量，可大于除去的白蛋白的量。這可補充個體循環(huán)中白蛋白的水平。例如，導入的新白蛋白的量增加了血液中總白蛋白水平，所述水平與未患有肝病的個體中所觀察到的水平相同或相似?？蓪⑿迈r的白蛋白引入個體的血液中，同時除去該個體的白蛋白。例如，通過透析可實現(xiàn)白蛋白的交換?？蛇x地，白蛋白除去和白蛋白返回的步驟可順序或單獨進行。例如，如果本發(fā)明在體外實施，則將個體的血液流經(jīng)除去白蛋白的裝置，隨后將新鮮的白蛋白加入血液中。這可通過同一器械的不同部分實現(xiàn)?？蛇x地，新鮮白蛋白的加入可單獨進行。通常在將白蛋白從患者的血液中除去后，進行新鮮白蛋白的加入。在本文所述的其他研究中，本發(fā)明人證明，內毒素是患有肝病個體血液中的成分，其與這些患者的預后有關，例如他們對感染或器官衰竭的易感性、他們的致死性風險以及他們對某些治療如免疫抑制的潛在反應性。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，這些預后因素與患有肝病個體血液中嗜中性粒細胞因此，來自嗜中性粒細胞激活程度高的個體的血漿，能增加正常嗜中性粒細胞的激活水平。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，通過使正常的嗜中性粒細胞與內毒素接觸，可實現(xiàn)相似的效果，并且從嗜中性粒細胞激活程度高的患者的血液中除去內毒素，可降低該血液中嗜中性粒細胞的激活水平。因此，認為除去內毒素可用于治療嗜中性粒細胞處于激活狀態(tài)的患有肝病的患者。通過恢復正常嗜中性粒細胞的功能，這些個體抵抗感染的能力可獲得改善。因此，本發(fā)明也涉及從患者的血液中除去內毒素。除去白蛋白解決了解毒這一問題，除去內毒素涉及另一個減少免疫應答的問題。通過將這兩種途徑組合于單一器械或方法中，實現(xiàn)了肝病特別有效的治療。優(yōu)選地，從血液中除去內毒素的裝置選擇性地除去內毒素。即，內毒素優(yōu)先于血液中的其他物質被除去。優(yōu)選地，從血液中除去的內毒素的量顯著地大于除去的其他血液成分的量。例如，在此方面，除去的成分按重量計，超過99%的是內毒素。在此方面，除去的成分中98%多、95%多、90%多、80%多、70%多、60%多或50。/。多是內毒素。除去內毒素的裝置可以是能從血液中選擇性地除去內毒素的任何裝置。一方面，利用與內毒素結合的配體可選擇性地除去內毒素。配體可以是與內毒素結合的任何分子。例如，已知抗內毒素抗體、LPS結合蛋白、多粘菌素B、聚乙烯亞胺、精氨酸配體以及各種肽都與內毒素結合。配體可以是抗體或與內毒素特異性結合的其他親和配體。例如，配體可以是與內毒素特異性結合的抗體。通常，與內毒素特異性結合的配體是如上文所述能從血液中選擇性地除去內毒素的配體。例如，配體能比血液的其他組分更牢固地與內毒素結合。配體可以是與內毒素特異性的表位結合的抗體。配體可以是分子的組合，所述分子中的每一個都與內毒素結合，如與內毒素分子的不同部分或不同的內毒素分子結合的分子的組合。配體可以是多克隆抗體，或者與內毒素分子上多個表位結合或與不同內毒素結合的抗體的混合物?？梢葬槍榷舅胤肿拥奶禺愋员砦划a(chǎn)生抗體。如上文有關白蛋白所述的，適宜的抗體類型是任何抗體類型，如抗體片度。通過任何方式如上文有關白蛋白結合抗體所述的實例，制備與內毒素結合的抗體?？煞蛛x獲得的抗體，如果需要，進行純化。當抗體或其他配體優(yōu)先或高親和性地與其特異性的蛋白結合時，其與該蛋白特異性地結合，而與其他的蛋白基本上不結合或僅以低親和性結合。即，其與內毒素的結合比與其他的血液成分如血液中的其他蛋白的結合更牢固。結合特異性可以是這樣的結合，即其與不同形式的內毒素結合。優(yōu)選地，其與多種形式的內毒素結合的親和性高于與他血液成分結合的親和性。如果配體用于除去內毒素，則可將該配體以附著于固相支持體的方式提供?？蓪⑴潴w固定于此類固相支持體上。適宜的固相支持體是如上文有關白蛋白結合配體所討論的支持體。因此，根據(jù)本發(fā)明除去內毒素的裝置可包含附著有或固定有能與內毒素結合的配體的此類固相支持體或由其組成。除去內毒素的裝置可包含使血液流過的容器，或由其組成。該容器因此可包括入口和出口。確定入口和出口的位置，以便流過容器的血液與本文所述的固相支持體接觸。優(yōu)選地，設計或選擇裝置，以使血液和固相支持體之間的接觸面積最大化。多種此類設計方案在本領域內是已知的。例如，裝置可以是裝有珠的柱或過濾床，其中將白蛋白的配體固定于珠上。另一方面，可將藥劑施用于個體以減少內毒素水平，而不是以物理方式從血液中除去內毒素。例如，可在功能上將血液中的內毒素中和而不是除去。中和內毒素的各種方法在本領域內是已知的。其包括向個體施用藥劑，該藥劑能選擇性地除去內毒素或中和內毒素的活性。這可依賴宿主的免疫系統(tǒng)，輔助除去內毒素。例如，適宜的藥劑可與內毒素結合，并允許個體的免疫系統(tǒng)從血液中清理內毒素-藥劑復合物。減少循環(huán)內毒素水平的各種藥劑是已知的，例如，抗內毒素抗體、白蛋白和LPS結合蛋白、LPS中和CD-14抗體。取決于除去內毒素所用的具體裝置，其他的血液成分可與內毒素一起除去。例如，除去內毒素的某些方法也可以除去血液中的其他毒素。這對患者是有利的。除去內毒素的某些方法也可以除去期望保持在血液中的其他血液成分。在此情況下，可將與內毒素一起除去的血液成分返回個體的血液?？蓮某サ膬榷舅鼗旌衔镏屑兓祷氐某煞郑蚩梢杂貌皇莵碜栽搨€體的新鮮等同成分來替代。從樣品中除去內毒素的各種方法在本領域內已有記載。例如，EP-A-0129786記載了利用共價固定于聚苯乙烯纖維上的多粘菌素B從血液中除去內毒素。Falkenhagen等(ArtificialOrgans(1996)20:420)記載了利用聚乙烯亞胺包被的珠從血漿中除去內毒素。WO01/23413記載了用于從血液或血漿中選擇性地除去內毒素的具有高度分散性的寡肽。US5,476,715記載了用于從樣品中除去內毒素的材料，該材料包含具有具體粒徑(particlesize)和間距的、由丙烯酸和曱基丙烯酸的多聚體制備的多孔載體。Staubach等(TransfUsionandApheresisScience(2003)29:93-98)i己載了吸附內毒素的設備，該設備基于固定的白蛋白。因此，有多種可用方法，用于從樣品中除去內毒素。任何這些方法的任一種可用于本發(fā)明或適合用于本發(fā)明。熟練的技術人員能選擇使用的適宜方法和條件。優(yōu)選地，本發(fā)明的器械或方法有效實現(xiàn)循環(huán)血液內毒素水平的顯著降低。例如，器械或方法可導致個體血液中內毒素水平降低至少25%、至少50%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或更多。本發(fā)明的這兩個方面也是相關的。白蛋白能與血液中的內毒素結合。因此，白蛋白的除去也導致與白蛋白結合的一些內毒素的除去。此外，通過增加個體正常白蛋白的水平，血液中的白蛋白可以與循環(huán)內毒素再次結合，且可降低血液中游離內毒素的水平。然而，以這種方式實現(xiàn)的內毒素減少的量，相對較小，因此本發(fā)明優(yōu)選利用單獨的裝置，用于(a)除去白蛋白，以及(b)減少內毒素水平。白蛋白除去和/或替代的這種作用可以補充減少內毒素的其他裝置，并且有助于清理保留于個體血液中的內毒素。基于這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人已經(jīng)研發(fā)了用于治療患有肝病個體的新方法和器械。這些包含用于A^患有肝病個體的血液中除去白蛋白和內毒素兩者的組件的組合。特別是本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了用于治療患有肝病個體的器械，該器械包含從個體的血液中選擇性地除去白蛋白的裝置以及從該個體的血液中選擇性地除去內毒素的裝置。優(yōu)選地，它們是兩個單獨的裝置，每個都針對實現(xiàn)這些作用之一。該器械也可包含向個體的血液供應不是來自該個體的新的白蛋白的裝置。因此此類器械的使用，可導致從個體的血液中除去白蛋白，減少個體血液中內毒素水平，并任選地將新的白蛋白導入個體的血液。這在許多方面都是有治療益處的。從個體血液中除去內源性白蛋白可以除去與該白蛋白結合的有害的毒素，也可以使異常的修飾形式的白蛋白從血液中除去。此類修飾形式通常具有降低的功能能力。選擇性地導入新的白蛋白可用于以新鮮的白蛋白替代已經(jīng)除去的白蛋白。優(yōu)選地，新鮮的白蛋白不包含于白蛋白分子結合的毒素，且優(yōu)選地，新鮮的白蛋白是處于未修飾的形式。向血液中加入新鮮的白蛋白也可以用于補償內源性白蛋白的水平，其中由于肝病的原因，這些內源性白蛋白的水平已降低。最后，從患有肝病個體的血液中除去內毒素，可有助于減少個體血液中嗜中性粒細胞的激活水平。這種嗜中性粒細胞激活的減少，可導致感染、器官衰減以及死亡率的降低，并且可改善個體對免疫抑制治療和類固醇或抗生素治療的反應性。本發(fā)明的方法和器械因此提供了治療肝病的靶向途徑，提出了與此類疾病有關的多個因子，并以多種方式使個體獲益。因此，本發(fā)明一方面涉及用于治療患有肝病的個體的器械。該器械可包含許多組件，所述組件可單獨使用或組合使用。本發(fā)明的器械包含從個體的血液中選擇性地除去白蛋白的裝置以及從個體的血液中選擇性地除去內毒素的裝置，或基本上由其組成。本文所述的任何裝置可用于除去白蛋白或內毒素。一方面，器械的單個組件既可用于除去白蛋白也可用于除去內毒素。通常，器械的此類組件既包含除去白蛋白的裝置又包含除去內毒素的裝置。例如，如果白蛋白和內毒素兩者都通過與特異性配體結合而除去，則對白蛋白具特異性的一種或多種配體以及對內毒素具特異性的一種或多種配體可一起用于器械的同一組件中。例如，器械可包含如柱或過濾床的單個容器，該柱或過濾床包含固定有兩種配體的固相支持體?？蓪⑴潴w固定于不同的支持體或同一個支持體。因此可將白蛋白和內毒素從個體的血液中同時除去。可選地，器械包括除去白蛋白和內毒素的單獨裝置。器械可包括能除去白蛋白的多于一個的裝置和/或能除去白蛋白的多于一個的裝置。器械可包含其他的組件。例如，器械可包含向血液供應新的白蛋白即不是來自個體的白蛋白的裝置。器械可用于體外使用。例如，設計器械使來自個體的血液通過該器械，從而在返回個體的身體前實現(xiàn)白蛋白的除去和內毒素的除去。兩種可能的器械在圖11中進行了舉例說明。根據(jù)本文的討論以及圖11所例舉的兩種器械，顯然為了實現(xiàn)期望的效果，可以以多種組合使用許多不同的組件。圖11中第一個例舉的器械的組件如下1.捕集白蛋白的裝置。白蛋白捕集將白蛋白從患者的血液中選擇性地除去。2.用于實施白蛋白透析以除去毒素的裝置。例如，允許白蛋白交換的大孔(大于50kDa)膜的使用，通過允許患者的白蛋白與"清理"過濾器相互作用，改善了毒素的除去。3.清理白蛋白的過濾器。4.內毒素除去組件。5.新的白蛋白lf注。圖11中第二個列舉的器械的組件如下1.細菌脂多糖捕集器。這是用于從患者的血液中除去LPS/內毒素的裝置。2.用于實施白蛋白透析以除去毒素的裝置。例如，圖11中第一個例舉的器械所討論的。3.清理白蛋白的過濾器。4.白蛋白替代裝置。例如，用于除去患者的白蛋白并用新鮮白蛋白替代的擴散梯度。5.新的白蛋白IIT注。個體的血液與本發(fā)明的器械接觸，以便將白蛋白和內毒素從血液中除去，并且，可將不是來自該個體的白蛋白任選地供應于血液。這種方法可體外實施，并且可將血液隨后返回到該個體。本發(fā)明涉及治療患有肝病個體的方法。該方法包含下列步驟，或基本上由其組成(a)從個體的血液中除去白蛋白；以及(b)降低個體血液中內毒素的水平。這可通過本文所述的任何方法或裝置實現(xiàn)。該方法可體外實施。步驟(a)可利用透析實現(xiàn)。步驟(a)可利用能與白蛋白特異性結合的配體實現(xiàn)。步驟(b)可通過從血液中直接除去內毒素實現(xiàn)。步驟(b)可利用與內毒素特異性結合的配體實現(xiàn)。步驟(b)可通過向個體施用能降低血液中內毒素水平的治療有效量的藥劑實現(xiàn)?？衫蒙衔乃龅牟襟E(a)方法和步驟(b)方法的任何組合。任選地，該方法還包括將不是該個體的白蛋白導入該個體的血液中。本發(fā)明也涉及通過從血液中選^H"生地除去白蛋白和內毒素在體外處理血液的方法，其中血液來自患有肝病的個體。這一方法可通過本文所述的任何適宜裝置來實現(xiàn)，并且可包含向血液中加入不是來自該個體的白蛋白的附加步驟。出于治療目的，可將以此方式處理的血液返回到該個體，或用于其他目的。例如，在向不同的個體輸血前，以此方式處理血液。根據(jù)本發(fā)明的待治療的個體是患有肝病的個體。肝衰竭是肝病的最終階段。取決于發(fā)作的快速性，肝衰竭分為多個類型。急性肝衰竭發(fā)展迅速，而慢性肝衰竭的發(fā)展可需要數(shù)月或數(shù)年。根據(jù)定義，當肝患病且功能不佳以致腦病明顯時，發(fā)生肝衰竭。任何漸進性肝病都可導致肝衰竭；實例包括對乙醯氨基酚毒素、肝硬化、病毒性肝炎、肝轉移癌。肝病的其他體征如黃疽、腹水、肝病性口臭以及凝血障礙表明，肝執(zhí)行其正常生理功能有困難，但直到出現(xiàn)精神狀態(tài)變化，才稱為肝衰竭?；加懈尾』颊叩念A后難以評估，因為該狀況具有許多因素。因此，待治療的個體可以是肝代償失調或表現(xiàn)出肝性腦病(hepaticencephalopathy)的個體。個體的肝可處于^/f嘗期一犬態(tài)(compensatedstate)。個體可以患有慢性肝病。個體可以患有肝石更化，例如，伴有或不伴有酒精性肝炎。個體可以患有急性肝衰竭。個體可以患有肝性腦病。急性和慢性肝病兩者的發(fā)作都可以歸因于異生素原因。例如，個體可能暴露于引起肝損傷的化學品、藥物或某些其他藥劑。個體對引起肝損傷的非處方藥、處方藥以或"娛樂性"藥有反應。個體可能已經(jīng)服用了RezulinTM(troglitazone(曲才各歹1)酉同)；Parke-Davis)、SerzoneTM(nefazodone(鹽酸奈法唑酮)；Bristol-MyersSquibb)或i人為引起肝損傷的其他藥物。個體可能服用了過度劑量的具體藥物或服用了超過推薦劑量的能引起肝損傷的藥物。例如，個體可能已經(jīng)服用了過度劑量的樸熱息痛。個體可能已經(jīng)解觸了引起肝損傷的化學品，例如在工作的地方。例如，個體可能已接觸如工業(yè)和農(nóng)業(yè)環(huán)境下的化學品。個體可能已食用了含有能引起肝損傷的化合物的植物，特別是，在個體是動物如食草動物的情況下。例如，個體可能已食用了含有吡咯里西啶生物4^的植物如澤菊(ragwort)。藥物相關的肝毒性，包含所有患有急性肝病(急性肝衰竭)的病例的50%多。在美國和英國，對乙酰氨基酚(也稱為樸熱息痛和N-乙酰基-p-氨基苯酚)毒性是急性肝衰竭最常見的原因。以治療性劑量或適度過量劑量服用對乙酰氨基酚的長期適量至大量飲用酒精者，處于嚴重肝損傷且可能是急性肝衰竭風險中。酒精的飲用加強了對乙酰氨基酚的毒性作用。特異質藥物(idiosyncraticdrug)毒性也促進了急性肝衰竭。特異質藥物毒性被認為是超敏性應答，其中，個體以藥理異常方式響應藥物。這種異常應答可導致急性肝衰竭。急性肝衰竭或慢性肝病可由感染致病性有機體引起。例如，肝病可歸因于病毒感染。特別是，個體感染或可能已經(jīng)感染了引起肝炎的病毒。個體可能患有慢性病毒肝炎。病毒可以是例如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或丁型肝炎病毒。在某些情況下，特別是如果個體患有病毒性肝炎時，該個體可能也感染了HIV-I或II。個體可能患有AIDS。個體可能已經(jīng)感染或感染了引起肝病的其他有機體，特別是在生命周期的某些階段存在于肝中的那些有機體。例如，個體可能有或可能已經(jīng)有肝吸蟲。個體可以患有導致慢性肝病或增加患慢性肝病風險的遺傳性疾病。例如，個體可患有一種或多種肝性血色病(hepatichemochromatosis),肝豆^j夫才亥變寸生(Wilson'sdisease)或a-1-4元月夷蛋白酶缺乏癥(o;-1-antitrypsindeficiency)。個體可患有引起肝結構或功能異常的某些遺傳病癥，這增加了肝纖維化的可能性。個體可以是從遺傳上傾向于發(fā)展自體免疫病癥，該自體免疫病癥損傷肝并因此促進了肝纖維化。慢性肝病可以是酒精誘導的。待治療的男性或女性可能是或已經(jīng)是酗酒者。他或她平均每周可能或可能已經(jīng)飲用了50或更多單位的酒精、每周60或更多單位的酒精、每周75或更多單位的酒精以及甚至每周100或更多單位的酒精。一單位酒精的測量在國家與國家之間不同。在文本中，根據(jù)英國標準，一單位等于8克乙醇。男性或女性可能已經(jīng)飲用此類級別的酒精達5年或更長、15年或更長或20年或更長。個體可能已經(jīng)飲用了此類級別的酒精達最多10年、最多20年、最多30年甚至最多40年。在酒精誘導的肝硬化的情況下，個體可以是年長者，例如25歲或更大、35歲或更大、45歲或更大甚至超過60歲。個體可以是雄性或者雌性。女性比男性更易于受酒精副作用的影響。女性在比男性更短的時間范圍內且因更小量的酒精發(fā)展成酒精慢性肝病。看起來沒有解釋雌性酒精肝損傷易感性增加的單一因素，但激素對酒精代謝的影響可以起重要作用。因此，個體可以患有酒精性肝炎。酒精性肝炎的范圍從具有異常實驗室測試(abnormallaboratorytests)為唯一疾病指征的適度肝炎，到伴有并發(fā)癥的嚴重肝功能障礙，所述并發(fā)癥如黃疸(膽紅素滯留引起的黃皮膚)、肝性腦病、腹水、出血性食管靜脈曲張(bleedingesophagealvarices)、凝血異常和昏迷。個體可患有已知導致肝損傷的多種其他狀況中的一種或多種，所述狀況如原發(fā)性膽汁性肝硬化(primarybiliarycirrhosis)、自體免疫慢性活動寸生肝炎(autoimmunechronicactivehepatitis)禾口/或血吸蟲病(寄生感染)。個體可患有或可能已患有膽道阻塞(bileductblockage)。在某些情況下，不知道肝病的根本原因。例如，個體可能已經(jīng)被診斷為患有隱源性肝硬化(cryptogeniccirrhosis)。因jt匕，個體l是似患有上文所列的4壬<可^犬況。i貪斷肝病如急性肝衰竭和肝性腦病的方法在本領域內是公知的，特別是對于本領域的臨床醫(yī)生和獸醫(yī)而言。優(yōu)選，個體將被例如醫(yī)藥專業(yè)人員或獸醫(yī)專業(yè)人員診斷為已患有肝病和肝性腦病。個體可顯示與肝病有關的一種或多種癥狀，如黃疰、腹水、皮膚變化、液體潴留(fluidretention)、指曱變化、易于擦傷(easybruising)、鼻出血、食管靜脈曲張，且在雄性個體中可患有胸部增大。個體可出現(xiàn)筋疲力盡(exhaustion)、疲勞(fatigue)、失去胃口、惡心、虛弱和/或體重減少。個體也可出現(xiàn)與肝性腦病有關的一種或多種癥狀，如一種或多種意識錯亂、定向障礙、癡呆、恍惚、昏迷、腦水肺、多器官衰竭(呼吸衰竭、心血管衰竭或腎衰竭)、肌肉堅硬/僵直、癲癇癥或難語癥(speechimpairment)。待治療的個體可正在或未服用治療肝病的其他藥物。待治療的個體可以處于發(fā)展為肝性腦病風險中。肝病可已經(jīng)由或可由體檢證實，所述體檢包括諸如超聲波的技術?？梢砸呀?jīng)采用肝活4企來尋找纖維化、壞死細胞、細胞變性(cellulardegeneration)和/或炎癥的病灶以及肝病的其他特征?？赡芤呀?jīng)評估了個體的肝功能，以確定它是否在個體體內受到損傷?？梢员碚鞲尾〉谋举|以及根本的原因?？梢源_定接觸導致肝病的藥劑的任何病史。待治療的個體可處于肝性腦病事件風險中，例如，等待肝移植的患者、手術和/或門靜脈高壓癥患者。處于肝性腦病事件風險中的患者是未曾遭受任何肝性腦病事件或在延長的一段時間(約12周或更長)內未遭受任何肝性腦病事件但患有產(chǎn)生肝性腦病事件風險的病癥或醫(yī)學狀況的人。肝性腦病是特征為在患有肝病或肝功能障礙的患者中存在腦功能障礙的臨床狀況。在肝性腦病中，智力障礙(mentaldisturbance)的范圍很廣，從主要影響是生活質量下降的最輕障礙到導致昏迷和最終死亡的明顯障礙。為本發(fā)明方法實施對象的個體可以是肝移植患者、遭受再灌注損傷(reperfusioninjury)的個體(如肝移植后移植物內發(fā)生的再灌注損傷)、或處于發(fā)展成多器官衰竭或已發(fā)展為多器官衰竭的患者。如果利用待施用于個體的藥劑，降低內毒素水平，則可以多種劑量形式施用該藥劑。因此，藥劑可口服施用，例如，作為片劑(tablets)、troches(藥片)、錠劑(lozenges)、水性或油性懸浮液、可分散的4分劑或顆粒。藥劑也可以腸道外施用，或者皮下、靜脈內、肌肉內、胸骨內、跨皮或通過輸注技術施用。藥劑也可以以栓劑的形式施用。醫(yī)師能為每個具體患者確定所需的施用途徑。藥劑的劑型取決于諸如以下的因素藥劑的確切性質、是否規(guī)定藥物用途或獸醫(yī)學用途等?？蓪⒂糜谥委煾尾〉乃巹┡渲茷楣┩瑫r、單獨或順序使用。本發(fā)明中用于施用的藥劑通常與藥學上可接受的載體或稀釋劑一起配制。藥物載體或稀釋劑可以是例如等滲液。例如，固體口服形式可含有如下物質以及活性化合物稀釋劑，如乳糖、葡萄糖、蔗糖、纖維素、玉米淀粉或馬鈴薯淀粉；潤滑劑，如硅石、云母、硬脂酸、硬脂酸鎂或鈣和/或聚乙二醇；粘合劑(bindingagents),如淀粉、阿拉伯樹膠、明膠、曱基纖維素、羧甲基纖維素或聚乙烯吡咯烷酮；崩解劑(disaggregatingagents),如淀粉、褐藻酸、硅藻鹽或羧曱淀粉鈉；沸騰混合物(effervescingmixtures);染料；增甜劑；潤濕劑，如卵磷脂、聚山梨醇酯、烷基硫酸鹽；以及通常，藥物劑型所用的無毒且藥理學上無活性的物質。此類藥物制劑可以已知的方式制造，例如，通過混合、成顆粒、成片劑、包糖衣或包膜過程?？诜┯玫囊后w分散劑(liquiddispersions)可以是糖漿、乳劑或懸浮液。糖漿可以含有例如蔗糖或具有甘油和/或甘露醇和/或山梨醇的蔗糖，作為載體。懸浮液和乳劑可以含有例如天然樹膠、瓊脂、藻酸鈉、果膠、甲基纖維素、羧曱基纖維素或聚乙烯醇，作為載體。用于肌肉內注射的懸浮液或溶液可含有下列物質以及活性化合物藥學上可接受的載體，如無菌水、橄欖油、油酸乙酯，乙二醇，如丙烯乙二醇，以及，如果需要，適當量的鹽酸利多卡因。靜脈內施用或輸注的溶液可含有例如無菌水作為載體，或優(yōu)選地，它們采用無菌、水性、等滲鹽溶液的形式。根據(jù)各種參數(shù)特別是根據(jù)所用的物質、待治療患者的年齡、體重和狀況、施用途徑以及所需的方案，確定藥劑的劑量。同樣，醫(yī)師能確定任何具體患者所需的施用途徑以及劑量。根據(jù)特異性抑制劑的活性、待治療個體的年齡、體重和狀況、變性的類型和嚴重性以及施用的頻率和途徑，每日劑量通常是每kg體重約0.1-50mg。優(yōu)選地，每日劑量水平是5mg-2g。本說明書提到的所有出版物和專利申請代表本發(fā)明所述
技術領域：
技術人員的水平。通過引用將所有出版物和專利申請并入本文的程度，如同明確和單獨地指出每個單一出版物或專利申請通過引用并入。盡管出于理解的目的，以圖解和實例的方式，稍微詳細地描述了前述發(fā)明，但對本領域技術人員顯然的是，在附加的權利要求的范圍內，可做出某些變化和修飾。下列實施例說明了本發(fā)明。實施例實施例l:患有肝硬化患者的白蛋白研究我們旨在利用自旋標記物和電子順磁共振光譜術進行嚴重性漸增的肝病的白蛋白功能性定性評估。將白蛋白的自旋標記物16-氮氧自由基硬脂酸(16-doxilstearicacid,SL)加入來自健康志愿者(對照，n=5)、穩(wěn)定性良好的代償期肝硬化受試者(肝硬化的，11=5)以及患有急性或慢性肝衰竭(acuteorchronicliverfailure,ACLF,n=10)患者的血漿。5名患者用分子吸附劑再循環(huán)系統(tǒng)(molecularadsorbentsrecirculatingsystem,MARS,4|殳時間(sessions)處理，以及5名用標準的醫(yī)藥療法處理。MARS前以及MARS7天后，進行測量。隨后將乙醇的等分試樣加入到標記的血漿樣品中，且每次加入后記錄EPR光譜。對記錄的光譜的分析提供了有關白蛋白構象和結合特性的信息。對于所測量的每個參數(shù)，發(fā)現(xiàn)患者的白蛋白比健康的志愿者對照的白蛋白具有更低的功能能力。在肝衰竭中，發(fā)現(xiàn)功能進一步降低。采用MARS治療，未觀察到白蛋白狀態(tài)變化。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>與穩(wěn)定的肝硬化受試者相比，p<0.01,與AoCLF,0天相比，卞，p<0.05，P<0.01。[]內的值表示之前建立的正常健康對照值。本研究的結果清楚地顯示，患者的白蛋白在結構和功能上嚴重地受到損害，其在肝衰竭中惡化。這些患者通常與血漿白蛋白濃度降低有關，且這種因素組合將導致非常低的功能能力。盡管已表明MARS除去白蛋白結合毒素，但其不能解釋患者白蛋白性能低劣的根本問題。在此同一組患者中，我們也檢測了存在缺血修飾白蛋白(IMA)的血漿樣品。通過檢查白蛋白與金屬原子結合的能力，確定IMA。在功能白蛋白中，金屬結合功能很高，但氧化應激(如缺血和再輸注過程中所經(jīng)歷的)后，蛋白的結構受到破壞，且與金屬結合的能力減弱。在我們的患者組中，我們發(fā)現(xiàn)，IMA的量(相對于血漿白蛋白含量，參閱圖l)在患有肝病的患者中，與健康的對照受試者相比，顯著增加(p<0.001)。在穩(wěn)定的肝硬化受試者和ACLF受試者間也發(fā)現(xiàn)了顯著的增力口，再次表明白蛋白的進一步損傷與疾病的嚴重性增加有關。盡管，IMA形成過程中產(chǎn)生的蛋白精確修飾仍然是研究的主題，但已將區(qū)域鑒定為N末端20個氨基酸殘基內。這非常有意義，因為其明顯并且表明，存在許多與嚴重的肝病有關的翻譯后修飾過程。實施例2:嗜中性粒細胞的功能研究我們研究的目的是系統(tǒng)地檢測患有酒精性肝炎患者的基本的嗜中性粒細胞功能(氧化猝發(fā)和吞噬作用)，并檢測其與感染速率、器官衰竭和存活的關系。在體外研究中，我們研究了嗜中性粒細胞功能缺陷是否歸因于激素因素以及從血漿中除去內毒素是否恢復患者的嗜中性粒細胞功能。對于具有細胞的實驗，用全血或分離的嗜中性粒細胞(以及患者的血漿)進行Phagoburst⑧分析或Phagotest⑧分析(OrpegenPharma,Heidelberg,Germany)。對于所有的實驗，采取嚴緊防范措施，通過在無菌條件下操作并使用無內毒素的設備避免內毒素污染。方法患者的選捧所有患者或他們的親屬都簽訂了知情同意書，并且本研究獲得當?shù)貍惱砦瘑T會的許可。在有臨床指征的經(jīng)頸靜脈肝活4企時，篩查被確認具有酒精性肝硬化跡象的患者進行該研究。如果患者被確認具有表現(xiàn)為黃疽、腹水或肝性腦病1級或2級的酒精性肝硬化急性代償失調(acutedecompensation),且不存在感染微生物的跡象(尿、血液、痰和腹水的常規(guī)培養(yǎng))，則包括他們。如果患者小于18或大于75歲，或在胃腸出血的三天內具有下列跡象器官衰竭(變力需要(motroperequirement),腎衰竭-肌酸酐〉150、肝性腦病3級或4級，需要機械通氣，嚴重的心功能障礙)、<氐鈉血癥(hyponatremia)、肝性/肝夕卜惡性月中瘤(hepatic/extra-hepaticmalignancy),或在加入本研究前，接受了任何免疫調節(jié)治療，則將他們排除。研究的設計方案校正任何相關的電解液干擾或；容量不足后，采集血液樣品，并用于常規(guī)生物化學、嗜中性粒細胞功能、細胞因子譜(cytokineprofile)以及硫代巴比妥酸(T-BARS/修飾的MDA)檢測。將來自患者和健康志愿者的外周靜脈血在無菌的條件下收集于無熱原試管(BD肝素鋰真空抗凝管(VacutainerLithium-Heparin)，每個i式管60U，BecktonandDickinson,Plymouth,UK)中。對于具有細胞的實驗，將血液保持在室溫下；用于收集血漿時，將血液立即放置于冰上。離心后，將血漿在無熱原的條件下等分到無內毒素的低溫保存管(cryotube,ComingInc.,Coming,NY)中，并儲存于-80。C，直到進一步分析。用100]LtL全血或50iLtL分離的嗜中性粒細胞以及50血漿進行？1138011^@或Phagotest。對于所有的實驗，采取嚴緊預防措施，通過無菌操作和使用無內毒素設備避免內毒素污染。用常規(guī)方法評估膽紅素、白蛋白、肝功能實驗、血凝結參數(shù)、全血計數(shù)以及C反應蛋白(C-reactiveprotein,CRP)。計算Maddrey辨識功能(Maddrey'sdiscriminantftmction)矛口Pughi平分(Pughscore)。在超過90天的時間段內，對患者進行前瞻性地追蹤研究。記錄器官功能障礙的發(fā)生和死亡率。按常規(guī)方進行血液培養(yǎng)物的篩選，我們小組的策略是在大多數(shù)患者呈遞時，使用預防性抗生素。嗜中性粒細胞在全血分析(如下文所述)中研究嗜中性粒細胞，或通過一步梯度離心(如結果部分所示，參閱附件)分離后研究嗜中性粒細胞。嗜中性粒細胞激活(氧化猝發(fā))和吞噬作用根據(jù)制造商的說明書，用Phagoburst⑧試劑盒(OrpegenPharma,Heidelberg,Germany)測定嗜中性粒細胞的百分比，所述嗜中性粒細胞通過用經(jīng)處理易受調理素作用的大腸桿菌刺激或不用任何刺激物刺激產(chǎn)生活性氧化劑。利用FITC標記的經(jīng)處理易受調理素作用的大腸桿菌(參見附件)，用Phagotest(OrpegenPharma.Heidelberg,Germany)測量表現(xiàn)出吞噬作用以及單個細胞吞噬活性的嗜中性粒細胞的百分比。對嗜中性粒細胞正向和側向散射特征(圖2)進行設門，隨后分析CD16陽性細胞-FITC陽性細胞的百分比以及熒光強度幾何平均值(GMFI)，所述百分比對應于經(jīng)歷吞噬作用的嗜中性粒細胞，所述熒光強度幾何平均值對應于被一個細胞吞噬的細菌的數(shù)目。為了避免由于細菌的批次差異而導致的變異性，對于所用的每批新細菌，將結果根據(jù)至少3個健康對照樣品的平均值進行標準化。將樣品分析兩次或三次。與內毒素一起溫育制備(大腸桿菌0111:B4Lot085K4068,SigmaAldrich，St.Louis,MO,USA)內毒素，作為lmg/ml的母液，并用PBS新鮮稀釋為指定的濃度。在進行？113經(jīng)(^81@或811^加81@前，將全血在水浴中37°C與各自濃度的內毒素一起溫育1小時。從患者的柱中除去內毒素利用Detoxigel:用含有由固定的多粘菌素B組成的內毒素除去凝膠的親禾口'l"生包裝子貞土真充4主(Affinity-packprepackedcolumns,PierceBiotechnology,Rockford,IL),從血漿樣品中除去內毒素，所述多粘菌素B與細菌脂多糖的脂質A部分結合。將100/xL這種無內毒素的、稀釋的血漿樣品與50]LtL細胞懸浮液一起溫育，進行所示的811^681@或Phagotest⑧(參閱附件)。利用CD14抗體在進行81^加81@或Phagotest敏前，將100/iL血漿和50jLiLPBS與5/iL抗人CD14抗體(克隆11D18,Immuntools，F(xiàn)riesoythe,Germany)(已知中和LPS)—起溫育60分鐘。細胞因子利用商購裝置(BioSourceInternational,Nivelles，Belgium),測定血漿的TNFce、sTNFgR1、sTNFceR2、1L-6以及1L-8。丙二醛(Malondialdehyde)和前列腺素F2a利用本領域內已知的修飾的硫代巴比妥酸反應物分析法，測定丙二醛(MDA)。用商購的EIA試劑盒(CaymanChemical,AnnArbor,MI)分析無8-異前列腺素的F2ce。統(tǒng)計學為了對兩組進行比較，如果適用，進行卡方檢驗(Chi-Squaretest)、t檢驗(t-test)或曼-特尼檢驗(Mann-Whitneytest);為了對多于兩組進行比較，如果適用，使用ANOVA檢驗以及用于數(shù)據(jù)組(datasets)的Turkey事后分析(兩方差齊(equalVanances))或DunnettC事后分析(無兩方差齊)。為了評估診斷的準確性，構建接受者工作特4正(receiveroperatingcharacteristic,ROC)曲線，計算曲線下的面積(AUROC)。通過對數(shù)秩檢驗(logranktest),分析存活差異。Pearson相關系數(shù)用來評估變量之間的關系。將結果表示為平均值士SEM。p〈0.05認為是有意義的。結果患者特征在篩查的72名患者中，包括了63名患者。與僅肝硬化相比，利用改良的NASH評分系統(tǒng)(肝硬化+AH)，患者從組織學上被歸為患有顯著炎癥的患者。與僅患有肝硬化的患者(11=40)相比，患有肝硬化+AH的患者(r^23)的疾病更嚴重，如更高的MELD和Pugh評分(pO.001)所證明的。患有肝硬化+AH的患者也具有顯著升高的CRP(p<0.005)、白細胞(pO.OOl)、膽紅素(p〈0.001)以及凝血酶原時間(pO.OOl)?；颊叩腡NFo;、IL6、IL8、sTNFoRl、sTNFoR2、MDA和前列腺素F2a水平明顯比對照的高?；加懈斡不?AH的患者的IL6、IL8和sTNFoR2水平明顯升高，但對于TNFce、sTNFqR1和氧化應激而言，并未注意到有統(tǒng)計學意義的變化。未發(fā)現(xiàn)與疾病嚴重性相互關聯(lián)。使用來自這些63名患者的血液或血漿進行體外實驗。這些63名患者的基線臨床數(shù)據(jù)，并未明顯不同于全隊列(thewholecohort)。表1表示所有患者以及具有高靜止猝發(fā)和低靜止猝發(fā)的亞組的基線特征(見下文)。患有酒精性肝硬化患者的氧化幹發(fā)和吞噬作用在未受刺激的患者的嗜中性粒細胞中，與對照相比，嗜中性粒細胞的氧化猝發(fā)增加。來自所有患有酒精性肝硬化患者的嗜中性粒細胞的氧化猝發(fā)是健康對照的5.6倍(pO.OOl)。與僅患有肝硬化的患者(pO.OOl)或對照(pO.OOl,圖2A)相比，來自患有肝硬化+AH的嗜中性粒細胞的靜止猝發(fā)明顯升高。指示激發(fā)的fMLP刺激，與對照相比，在患有肝硬化(p=0.01)和患有肝硬化+AH(p=0.001)的患者中引起明顯升高的氧化猝發(fā)，然而對于響應PMA，組之間沒有差別。靜止猝發(fā)和艦LP應答之間的差異在患有肝硬化+AH的患者(1.8土4.7)中比患有肝硬化的患者中(22.4+6.9，pO.02)明顯更低，表明在患有肝硬化+AH的患者中加入fMLP不能增強細胞功能。而且，用大腸桿菌刺激后，與僅患有肝硬化的患者(p^.001)或對照(pO.OOl,圖2B)相比，在肝硬化+AH患者中，來自靜止水平的氧化猝發(fā)的相對增加顯著地減少。通過熒光強度幾何平均值(GMFI)測量吞噬能力，熒光強度幾何平均值表示被一個細胞吞噬的細菌的數(shù)目。患有肝硬化+AH的患者吞噬的細菌明顯少于對照(p-0.031,圖2C)。吞噬至少一個細菌的細胞的百分比在組之間沒有差異。氧化幹發(fā)和吞噬作用與感染、器官衰竭以及存活的關聯(lián)17名發(fā)展為器官衰竭，13名(所有經(jīng)研究的患者的21%)在索引入(indexhospitaladmission)院期間死亡。遇到的最常見的器官衰竭是腎臟衰竭，在患者中發(fā)現(xiàn)15名患有器官衰竭(88%)、4名發(fā)展為器官衰竭，作為多器官衰竭的一部分，需要通氣和循環(huán)支持。90天末，14名患者(22%)死亡，47名存活，2名失去追蹤。發(fā)現(xiàn)靜止氧化猝發(fā)可預測90天的存活(AUROC0.77，p=0.003，圖3A)和器官衰竭(AUROC0.76,pO.OOl)。對于預測死亡而言，截止<55%的靜止猝發(fā)具有77%的靈壽丈度、69%的特異性。靜止氧化猝發(fā)<55%的患者的存活明顯好于靜止猝發(fā)35%的患者(p<0.005，圖3B)。吞噬功能也預測存活(AUROC0.80,p-0.02，圖4A)和器官衰竭(AUROC0.91，p0.0001)。在所研究的患者群體中低于標準的42%的GMFI具有預測死亡率的86%的靈敏度、70%的特異性(圖4B)。在42名患者(66%)中，臨床上懷疑在入院過程中感染，盡管包括的患者中沒有一個在評估嗜中性粒細胞功能時患有證實的感染。在上下文中應該考慮這些數(shù)據(jù)，因為一旦懷疑感染，我們的處理方案就必須使用光語抗生素。在這些患者(62%)的26名患者中，證實培養(yǎng)物陽性感染。在13名中，發(fā)現(xiàn)多于一種有機體。在住院的早期，具有高靜止猝發(fā)(〉55%)的患者更可能發(fā)展為培養(yǎng)物陽性感染(57%對比27%,卡方(chi-square)p=0.01)，且多于一種有機體(n二10;在具有低靜止猝發(fā)的患者中n=3)?；加懈斡不?AH的患者更可能發(fā)展為培養(yǎng)物陽性感染(65%對比28%,p=0.004)。發(fā)展為培養(yǎng)物陽性感染的那些患者更可能發(fā)展到器官衰竭(p二0.001)和死亡(pK).002)。GMFH氐于42。/。的患者中的67。/。發(fā)展為培養(yǎng)物陽性感染，而GMFI高于42%的患者僅有21%發(fā)展為培養(yǎng)物陽性感染(p=0.007)。低GMFI的患者在住院早期出現(xiàn)了感染(9天對比47天，p=0.03)。患者血漿以及正常血漿對嗜中性粒細胞氧化猝發(fā)的影響來自高靜止猝發(fā)患者的血漿(>55%;!1=6)在正常嗜中性粒細胞(p二0.005)中誘導靜止猝發(fā)，而低靜止猝發(fā)患者的血漿(<55%;11=6)不能如此誘導(圖5)。捽發(fā)誘導作用可在混合血漿和細胞后立即檢測，但在最多一個小時的溫育后也可顯示(結果未顯示)。這種結果表明，在患者的血漿中存在使嗜中性粒細胞激活的可傳遞因子。當將在全血分析中分離的高靜止猝發(fā)患者的嗜中性粒細胞與正常血漿一起溫育時，與和患者自身的血漿一起溫育的分離的嗜中性粒細胞相比，靜止猝發(fā)顯著降低&=0.02;圖6)。這些實驗表明，除去血漿中的因子能減少患者細胞的高靜止猝發(fā)。患者的血漿以及正常血漿對吞噬作用的影響與來自低靜止猝發(fā)患者的血漿一起溫育的正常嗜中性粒細胞，不同于對照，而與來自高靜止猝發(fā)患者的血漿一起溫育的正常嗜中性粒細胞表現(xiàn)出GMFI減少22%(p=0.03，n二6)。和與自身血漿一起溫育的患者的嗜中性粒細胞相比，與正常血漿一起溫育60分鐘的患者的嗜中性粒細胞表現(xiàn)出吞噬作用增加22%(p=0.03,n=6)。這些結果表明，吞噬功能的損傷可以歸因于血清因子，該因子是可傳遞的并且是可逆的。內毒素對氧化猝發(fā)和吞噬作用的影響將來自5名健康志愿者的血液與濃度漸高的內毒素一起溫育。靜止猝發(fā)存在劑量依賴性增加(pO.OOOl,單因素ANOVA及Turkey事后分析)。通過將患者的嗜中性粒細胞與內毒素一起溫育，相對GMFI減少了20%(n=8,p=0.02,圖8)。這些結果表明，內毒素以劑量依賴性方式激活正常嗜中性粒細胞，由此模擬通過與患者的血漿一起溫育所觀察的影響。從患者血漿中除去內毒素的影響a.利用去毒凝膠(Detoxi-Gel)柱來自在全血分析中證明具有高靜止猝發(fā)患者的血漿，能在正常的嗜中性粒細胞中誘導高靜止猝發(fā)。無內毒素血漿(通過流經(jīng)柱獲得)在正常的嗜中性粒細胞中不誘導高靜止猝發(fā)(p<0.001,n=9)。來自低靜止猝發(fā)患者的血漿&=0.91,11=4)和正常血漿止猝發(fā)(圖9)。與和未處理的血漿一起溫育的細胞相比，從高靜止猝發(fā)患者的血漿(t^ll)中除去內毒素使GMFI增加了31%(p=0.03)。來自低靜止猝發(fā)患者的血漿&=0.16，11=8)以及穿過柱的正常血漿(p二0.85,i^5)引起GMFI的任何變化(圖11)。這組實驗表明，通過多粘菌素B除去內毒素逆轉患者血漿的猝發(fā)誘導和吞噬作用降低作用。b.利用LPS中和抗體與中和LPS的抗人CD14抗體一起溫育，防止來自高摔發(fā)患者的血漿(pO.OOl,11=7)誘導正常細胞高猝發(fā)。來自低猝發(fā)患者的血漿^=0.733,11=8)或正常血漿^=0.25,11=3)與抗體一起溫育，未改變摔發(fā)(圖9)。來自高猝發(fā)的患者的血漿與LPS中和抗人CD14抗體一起溫育，使GMFI增加了20%(p=0.04,n=ll)，而當使用來自低猝發(fā)患者的血漿(p^.17,11=8)或正常血漿^=0.78，11=3)時，這種抗體未引起GMFI的任何變化(圖10)。這些發(fā)現(xiàn)支持內毒素負責誘導嗜中性粒細胞的高靜止猝發(fā)的觀點。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>與低猝發(fā)相比具有顯著性:與對照相比具有顯著性表2<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>與對照相比，lp<0.05與兒童B相比，2p<0.05與兒童A相比，3p<0.05感染表記錄的受研究的患者的培養(yǎng)物陽性感染<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>452CNS3CNS4820大腸桿菌616白色念^朱菌627白色念珠菌9ECEC:腸球菌屬(^^racocc^)，MRSA:甲氧苯青霉素抗性金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant/SVa//^/ococcw51awrew力,CNS:凝固酶陰性葡萄球菌(coagulase-negative/Stop/z;;fococci^)，St.:葡萄球菌屬(S鄉(xiāng)/23;/ocom^)，Str.:鏈球菌屬(iSW/tococc—，C.:念珠菌屬(Caw^/W(2)方法學嗜中性粒細胞的激活(氧化猝發(fā))和吞嗟作用根據(jù)制造商的說明書，用Phagoburst試劑盒(OrpegenPharma，Heidelberg,Germany)測定通過用經(jīng)處理易受調理素作用的大腸桿菌刺激或無任何刺激物刺激而產(chǎn)生活性氧化劑的嗜中性粒細胞的百分比。簡而言之，將100肝素化的全血或分離的嗜中性粒細胞(如所示)與20W細菌、N-曱酸基曱二磺?；?亮氨酰-苯丙氨酸(N-formylmethionyl-leucyl-pehnylalanine,fMLP)、佛波J旨(phorbol12-myristate13-acetate,PMA)一起或無任何刺激物的情況下37。C溫育20分鐘。通過二氫羅丹明123(Dihydrorhodamme123)的加入和氧化，監(jiān)控氧化猝發(fā)過程中活性氧化劑的形成。為了鑒定嗜中性粒細胞，將細胞用抗-CD16-PE抗體(IOTest，BeckmanCoulter)染色，并利用CellquestTM軟件，通過熒光激活細胞分選術(fluorescenceactivatedcellsorting,FACS),(BectonDickinsonFACScan，SanJose,CA.)進行分析。根據(jù)嗜中性粒細胞正向和側向散射特性進行設門，并隨后通過綠色熒光(FL-I)測量法，測定產(chǎn)生活性氧代謝物(reactiveoxygenmetabolites)的CD16陽性細胞的百分比。將樣品分析三次或兩次。靜止猝發(fā)的分析間(interassay)變異系數(shù)(coe伍cientofvariation,CV)為5.4%,經(jīng)刺激的猝發(fā)的分析間CV為4.2%，靜止猝發(fā)的分析內(mtrassay)CV為4.7%,經(jīng)刺激的猝發(fā)的分析內CV為2.4%。嗜中性粒細胞的吞噬作用利用FITC標記的、經(jīng)處理易受調理素的作用的大腸桿菌，用Phagotest*(OrpegenPharma，Heidelberg,Germany)測量表現(xiàn)出吞p盆作用和單個細胞吞噬活性的嗜中性粒細胞的總百分比。將100]Ltl全血或分離的嗜中性粒細胞(如下文所示)與20gl細菌37°C溫育20分鐘，而陰性對照樣品置于水上。為了鑒定嗜中性粒細胞，將細胞用抗-CD-16-PE抗體(IOTest,BeckmanCoulter)染色。根據(jù)嗜中性粒細胞的正向和側向散射特性進行設門，并隨后分析CD16陽性細胞-FITC陽性細胞的百分比以及熒光強度幾何平均值(GMFI)，所述百分比對應于經(jīng)歷吞噬作用的嗜中性粒細胞，所述熒光強度幾何平均值對應于被一個細胞吞噬的細菌的數(shù)目。為了避免細菌批次變異性導致的對結果的曲解，對于所用的每批新細菌，將結果基于至少3個健康對照樣品的平均值進行標準化。將樣品分析三次或兩次。吞噬作用百分比的分析間CV為6.8%,GMFI的為10.1%，吞噬作用百分比的各自分析內CV位4.1%，GMFI的為1.6%。嗜中性粒細胞的分離將4ml全血分層于5ml密度梯度分離液(Polymorphoprep)(Axis-Shield,Oslo,Norway)上，室溫下400g離心30分鐘。從第二界面收獲嗜中性粒細胞，并用PBS(SigmaAldrich,St.Louis,MO,USA)洗滌。在Thoma-血球計(Thoma-hemocytometer)中計凄t嗜中性粒細月包，并以50/xL中5xl06個細胞的濃度重懸浮于PBS中。用50細胞懸浮液和50jLtL血漿進行一次分析。通過臺盼藍拒染法(Trypanblueexclusion),檢測變異性，其超過98%。內毒素除去柱用含有由固定的多粘菌素B組成的內毒素除去凝膠的親和性包裝預填充柱，從血漿樣品中除去內毒素，所述多粘菌素B與細菌脂多糖的脂質A部分結合。室溫下，用脫氧膽酸鈉(SigmaAldrich,St.Louis,MO，USA)^吏柱再生、用無菌水洗滌并用補充了50lU/ml肝素(Multipharm,Waxham,UK)的0.9%無菌氯化鈉平衡。用PBS將血漿樣品1:1稀釋，并施加于柱上，并在丟棄空的后，將樣品收集于無熱原的樣品試管中。將150/xL這種無內毒素的、稀釋的血漿樣品與50mL細胞懸浮液一起溫育，并如所述進行Bursttest⑧或Phagotest恥。細胞因子利用商購的裝置(BioSourceInternational,Nivelles,Belgium),才艮據(jù)制造商的i兌明書，測定乙二胺四乙酸抗凝結的血漿樣品的TNFa、sTNFoRl、sTNFoR2、IL-6和IL-8。檢測細胞因子的較低限度是3pg/mL。分析內變異系數(shù)為5.4%-6.4%。在對照中，IL-6和IL-8是不可檢測的。實施例3:白蛋白施用和細菌內毒素隔離在代償失調的肝硬化嚙齒動物模型中的作用這項研究的目的是檢測白蛋白和/或內毒素除去在代償失調肝硬化(decompensatedcirrhosis)嚙齒動物模型中是否有益。在此模型中，通過輸注細菌內毒素(月旨多糖，LPS)，研究了繼發(fā)于肝硬化的其他身體損傷，所述細菌內毒素通常用于激發(fā)感染作用。方法所有的研究按照基于動物法案1986的內政部指導方針(HomeO伍ceguidelinesundertheAnimalsinScientificProceduresAct1986)進行。雄性SD大鼠(Sprague-Dawleyrats,230—280g,CharlesRiversLtd.)可自由食用標準的嚙齒動物食物和々大水，明暗周期12小時、19-23°C，濕度約為50%。麻醉下通過在腹部正中作一切口，進行膽管結扎(bileductligation,BDL)。在BDL組中，分離普通膽管，用3-0絲線進行三重結扎，并在結扎間切斷。BDL后，所有動物的體重繼續(xù)增加，并且可與未處理的對照相比。總死亡率小于10%，且手術后36小時內發(fā)生。手術后24-26天內，對動物實施安樂死，并將留置插管插入左頸動脈和右頸靜脈內。動脈管路(arterialline)(BiopacSystems,Goleta,CA.USA)用于連續(xù)監(jiān)控血壓、采集血液樣品，靜脈管路用于連續(xù)輸注流體。所有BDL動物接受超過20分鐘的LPS靜脈內輸注(lmg/Kg,克雷白氏月申炎菌C^/efc&〃a/wewmom'ae),Sigma,Poole.UK.),隨后連纟賣專lr注(10mls/Kg/hour):i)鹽水；ii)溶于鹽水的白蛋白(1.5g/Kg,Zenalb,BPL,Elstree.UK);iii)多粘菌素B(2mg/Kg,Sigma,Poole,UK);或iv)白蛋白加多粘菌素B(如上)，達手術后3小時的總實驗時間。在0、1、2和3小時，收集動脈樣品，進行嗜中性粒細胞功能分析。在麻醉情況下通過放血處死動物,并采集血液進行分析。所有的研究在BDL后25-8天在肝組織上進行，在每一組中，4只動物用于最后分析。在試驗末，將血液收集于冰冷的無菌試管(BDVacutainersystem,BectonDickenson.UK)內，冰上放置后，離心(3000rpm，4°C,10分鐘)，以分離血漿，隨后將血漿在分析前儲存于80。C。根據(jù)制造商的說明書，利用商購的用TecanSunrise96孔板讀數(shù)器(Tecan，Austria)觀'J量的Endosafe系統(tǒng)(CharlesRiversLaboratories,Cedex,France),分析血漿內毒素的含量(參閱，例如StadlbaueretalJ,Hepatol2007;47:726-727)。還利用CobasIntegra400實'險分析儀(RocheDiagnostics,o、。一ttt八、、m'U7厶妙A疋AUattJf—Flf.k3u。&cA.ujv"<vq主j~LUi_^Lg'忠q'e主、1，y年。根據(jù)制造商的說明書，利用FACScanto流式細胞儀，使用Phagoburst分析試劑盒(Orpegen，Heidelberg,Germany),測量嗜中性粒細胞的功能(參閱，例如MookerjeeetalHepatology2007;46:831-840)。用上述方法，利用GraphpadPrism軟件包(Graphpad，Ca，USA),進行統(tǒng)計學分析。結果由圖12可以看出，3小時后，內毒素在鹽水處理動物的血漿中4艮容易檢測。在給予了僅多粘菌素B或與白蛋白組合的多粘菌素的組中，發(fā)現(xiàn)內毒素水平低于分析的檢測限度。發(fā)現(xiàn)小量內毒素存在于僅白蛋白處理的組中，盡管與鹽水處理的動物相比，這仍然是小部分(pO.OOl)。盡管已知白蛋白具有與白蛋白結合的能力，但未發(fā)現(xiàn)在施用的劑量與多粘菌素一樣有效。已知由于進行中的肝損傷，BDL動物具有顯著減少的血漿白蛋白濃度。發(fā)現(xiàn)施用白蛋白顯著增加測量的血漿白蛋白水平(與鹽水組相比，p<0.05)，達25%。盡管發(fā)現(xiàn)這仍然顯著低于從未處理的健康動物收集的樣品(pO.Ol，圖13A)。盡管預料DBL動物具有增加的轉氨酶水平(ALT，圖13B),但指出發(fā)現(xiàn)每個治療組具有更低的ATL得分仍令人感興趣。盡管由于組內變化，發(fā)現(xiàn)這些差異不顯著，但看起來內毒素惡化了潛在的肝臟疾病狀態(tài)，除去內毒素對于肝臟是有利的。與未處理的健康動物相比，所有組的都是升高的，但發(fā)現(xiàn)與僅白蛋白組相比，白蛋白/多粘菌素組中的脲水平顯著降低(p0.05，圖13C)。在僅有多粘菌素的組中，也觀察到脲水平降低。圖14表示測量的平均動脈壓數(shù)據(jù)，其是在整個研究期收集的?？梢钥闯觯瑑H有鹽水的組在第一個90分鐘內維持最初的壓力，之后，觀察到漸進性惡化。白蛋白和白蛋白/多粘菌素這兩組在整個研究期維持血壓，白蛋白/多粘菌素動物在3小時時表現(xiàn)出壓力升高。應當指出，認為在研究開始時，所有BDL動物是低血壓的，因為麻醉大鼠的正常MAP是約120醒Hg。由圖15可以看出，在白蛋白和白蛋白/多粘菌素這兩組中，嗜中性粒細胞響應致病菌的能力有漸進性的改善，且白蛋白/多粘菌素的聯(lián)合治療，具有明顯更好的響應。在鹽水處理的動物中沒有變化。在該圖中，未包括僅有多粘菌素的組，因為凝血不規(guī)則阻止了呈現(xiàn)的有代表性的樣品大小。也測量了自發(fā)性嗜中性粒細胞活性，盡管在這些樣品中未觀察到組間差異。討論顯然，向建立的大鼠肝硬化模型施用白蛋白有利于預防暴露于細菌毒素后的急性惡化。而且，這些作用通過加入與內毒素結合并除去內毒素的增效藥劑得到改善。在圖12中，從系統(tǒng)中除去可測量的內毒素僅在用多粘菌素B處理的組中實現(xiàn)，盡管僅有白蛋白的組的確達到了大量減少。可能是進一步增加白蛋白劑量會進一步降低血漿內毒素水平，然而，選擇的這種劑量反應了給予住院病人的典型量，并非針對LPS特異性結合。還不清楚發(fā)揮陰性生理應答，系統(tǒng)內需要多少游離內毒素。盡管，如所預料的，白蛋白的施用使測量的血漿水平顯著增加，但仍然發(fā)現(xiàn)低于健康動物的水平。盡管期望住院患者在連續(xù)的日期內接受這種治療，但在這項研究中，我們的目的是提供白蛋白的典型治療日劑量?？赡苓@些動物內的現(xiàn)有白蛋白已經(jīng)受到疾病過程的破壞，因而提供新的"健康"的白蛋白對動物具有實質的代謝益處。由于進行中的肝損傷，預計發(fā)現(xiàn)所有BDL動物的ATL水平增加，然而，看起來好像施用內毒素導致治療組中得到改善的肝臟狀態(tài)進一步惡化。盡管由于組內變化，發(fā)現(xiàn)這些差別不顯著，但看起來用多粘菌素B治療在預防肝進一步損傷中是最有效的。脲水平是蛋白分解引起的合成過程以及腎臟排泄體內廢物的能力這兩者的反映。令人感興趣的是，在僅由白蛋白和白蛋白/多粘菌素處理的組之間，觀察到顯著差異。與鹽水組相比，白蛋白處理的動物表現(xiàn)出脲水平輕微增加，這反映了施用的蛋白的量。有意思的是，接受組合治療的動物的血漿脲水平顯著較低。血漿脲的這種減少與在這些動物中觀察到的平均動脈壓水平的改善有關(圖15)。如上文所述，發(fā)現(xiàn)所有這些BDL動物是低血壓的，已知低血壓引起腎臟血流減少，因此導致功能降低。通過提高系統(tǒng)壓力，即便是小幅度提高，都可能因此對腎臟血流和排泄功能產(chǎn)生有益效果?？傊?，發(fā)現(xiàn)向肝硬化動物施用白蛋白，改善動物的狀態(tài)并預防誘發(fā)的代償失調的許多癥狀。而且，加入除去內毒素的藥劑顯著改善白蛋白的作用。權利要求1.用于治療患有肝病個體的器械，包含(a)用于從個體的血液中選擇性地除去白蛋白的裝置；以及(b)用于從個體的血液中選擇性地除去內毒素的裝置。2.如權利要求l所述的器械，還包含(c)向所述個體的血液補充不是來自所述個體的白蛋白的裝置。3.如權利要求1或2所述的器械，還包含(d)用于從所述個體的血液中除去與白蛋白結合的毒素的裝置。4.如上述權利要求中任一項所述的器械，其用于體外使用。5.如上述權利要求中任一項所述的器械，其中所述裝置(a)包含能與白蛋白選擇性結合的固相支持體。6.如上述權利要求中任一項所述的器械，其中所述裝置(b)包含能與內毒素選擇性結合的固相支持體。7.如權利要求2-6中任一項所述的器械，其中(c)部件中所述白蛋白是藥物級別的白蛋白。8.如上述權利要求中任一項所述的器械，其中所述個體的血液在體外穿過該設備。9.如上述權利要求中任一項所述的器械，其中所述裝置(a)包含用于白蛋白透析的裝置。10.如權利要求9所述的器械，其中所述用于白蛋白透析的裝置包含孔徑大于50kDa的膜。11.治療患有肝病個體的方法，包括下列步驟(a)從所述個體血液中除去白蛋白；以及(b)降低所述個體血液的內毒素水平。12.如權利要求11所述的方法，還包括下述步驟(c)將不是來自所述個體的白蛋白導入所述個體的血液中。13.如權利要求11所述的方法，其中步驟(a)通過透析實施。14.如權利要求12所述的方法，其中步驟(a)和(c)通過透析實施。15.如權利要求11-14中任一項所述的方法，其中步驟(b)包括從所述個體的血液中除去內毒素。16.如權利要求11-15中任一項所述的方法，其中所述方法在體外實施。17.如權利要求11-14中任一項所述的方法，其中步驟(b)包括向所述個體施用能降低血液中內毒素水平的治療有效量的藥劑。18.如上述權利要求中任一項所述的方法，其中步驟(c)的所述白蛋白是藥物級別的白蛋白。19.如權利要求11-18中任一項所述的方法，其利用權利要求1-10中任一項所述的器械來實施。20.治療肝病的方法，包括使來自個體的血液與權利要求1-10中任一項所述的器械接觸以便從所述個體的血液中除去白蛋白和內毒素的步驟。21.如權利要求20所述的方法，其在體外實施。22.通過從血液中選擇性地除去白蛋白和內毒素體外處理所述血液的方法，其中所述血液來自患有肝病的個體。23.如權利要求22所述的方法，其包括(a)用與白蛋白選擇性結合的固相支持體溫育所述血液，并由此從所述血液中除去白蛋白；以及(b)用與內毒素選擇性結合的固相支持體溫育所述血液，并由此從所述血液中除去內毒素。24.如才又利要求22或23所述的方法，還包括向所述血液加入不是與所述血液來自同一個體的白蛋白。全文摘要本發(fā)明提供了用于治療患肝病個體的器械，包含(a)從個體的血液中選擇性地除去白蛋白的裝置；以及(b)從個體的血液中選擇性地除去內毒素的裝置。文檔編號A61M1/34GK101541357SQ200780038883公開日2009年9月23日申請日期2007年10月29日優(yōu)先權日2006年10月27日發(fā)明者內森·戴維斯,拉吉夫·加蘭申請人:Ucl商業(yè)有限公司