寡核苷酸非病毒遞送系統的制作方法

專利名稱：：寡核苷酸非病毒遞送系統的制作方法
技術領域：
：本發明總地涉及核酸遞送和基因表達領域。具體說，本發明涉及用于寡核苷酸，尤其是小干擾RNA(siRNA)的新的非病毒遞送系統。
背景技術：
：RNA干擾(RNAi)是一種涉及由雙鏈短干擾RNA(siRNA)特異性下調靶基因表達的天然機制[l]。RNAi越來越多地成為功能基因組學以及靶標篩選和體外驗證中的常用工具[2，3]。更重要地，基于siRNA的藥物的開發有希望發現復雜疾病如糖尿病、癌癥和病毒感染的療法[4-7]。對于其他形式的核酸如質粒DNA(pDNA)，血清穩定性差，不利的體內藥動學性質以及無效的細胞攝取仍然是成功的基因沉默應用的主要挑戰[8]。一種方案部分地克服了這些問題，該方案利用了耐受核酸酶降解且細胞攝取改善的化學修飾的siRNA[9-11]。另一種方案涉及利用基于聚陽離子的siRNA制劑。例如，基于陽離子脂質的制劑在體外和體內siRNA的遞送中有效[12-15]。相反，最初認為陽離子聚合物不適合用作寡核苷酸遞送[16]。然而，近來研究發現，陽離子聚合物如聚乙烯亞胺(PEI)、聚酰胺型胺(PAMAM)樹狀聚合物和聚-L-賴氨酸(PLL)可用于siRNA遞送[17-19]。在pDNA優化條件下進行配制和遞送的陽離子聚合物作為寡核苷酸遞送系統的效率有相反報導。而且，一些報道關注上述聚陽離子的體內毒性可能妨礙其未來臨床應用[20-22]。因此，激發了用于siRNA遞送的無毒有效載體的研究。發明概述本發明涉及一種組合物，其包含以下成分的復合物(a)數均聚合度(DPn)為30-300的低分子量殼聚糖，其中低分子量殼聚糖的脫乙酰化程度大于卯％;和(b)寡核苷酸。如權利要求1所述的組合物，該組合物包含利用化學或酶方法由高分子量殼聚糖獲得的低分子量殼聚糖。低分子量殼聚糖的脫乙酰化程度大于95%，最優選大于99%。此外，組合物的凈電荷比基本上為正。所述低分子量殼聚糖用尋靶配基和穩定劑進行衍生化。寡核苷酸包含引入宿主細胞時表達其功能的沉默序列。寡核苷酸選自RNA分子、反義分子、核酶和微小RNA。本發明組合物的pH為3.5-8.0，更優選7.1-7.6。本發明還涉及制備本發明組合物的方法，該方法包括以下步驟(a)使低分子量殼聚糖與水性溶劑相接觸；(b)將步驟(a)的水性溶液與寡核苷酸在水性溶劑中混合；和(c)保持組合物的pH為3.5-8.0，更優選為7.1-7.6。本發明還涉及制備組合物的方法，該方法包括在步驟(b)之后，降低步驟(b)所得產物溶液的體積以實現所需的組合物濃度。本發明還涉及將核酸給予哺乳動物的方法，該方法包括利用所述的組合物并將該組合物引入哺乳動物內。將組合物引入哺乳動物體內的方法可通過肺部、鼻腔、口服、眼睛、含服、舌下、局部、直腸或陰道途徑給予粘膜組織來實現。或者，組合物可通過靜脈內、肌內、真皮內、顱內、椎管內、皮下或心內的胃腸外途徑給予粘膜下組織，或給予內臟器官、血管或外科手術期間暴露的其他體表或體腔而引入哺乳動物。本發明方法包括將所述組合物給予哺乳動物，其中所述寡核苷酸能夠在至少一種哺乳動物的細胞內表達其功能。本發明還涉及制備成預防性或治療性治療哺乳動物的藥物的所述組合物制備的使用方法。這些應用包括但不限于用于預防性或治療性治療惡性腫瘤、自身免疫病、遺傳病癥、病原感染和其他病理學疾病的基因療法、反義療法、或基因疫苗接種。而且，本發明還涉及利用所述組合物作為體內和體外診斷方法中使用的診斷試劑。附圖簡要說明和序列表圖1顯示了siRNA制劑的物理穩定性(A)和RNA酶A的保護作用(B)。用線型DPn85殼聚糖配制的siRNA復合物在兩種pH值和所有測試的電荷比的條件下顯示最高的物理穩定性。所有選擇的聚陽離子能夠保護siRNA免于RNA酶A的降解。對于瓊脂糖凝膠電泳，將100ngsiRNA加載到各個孔中。對于殼聚糖DP。18制劑，復合物以30:1(+/-)和60:1(+/-)的電荷比進行配制。對于PEI制劑則采用電荷比15:1(+/-)，而siRNA與脂質轉染胺試劑2000的復合物則以重量比2:1(+/-)配制。顯示了三次獨立實驗的代表性凝膠。圖2顯示了在正常HEK293細胞(A)以及穩定表達螢光素酶的HEK293細胞(293-Luc)(B,C)中siRNA的體外遞送。與對照未處理細胞相比，用特異性siRNA-Luc與pLuc(A)或pGFP(C)共轉染時實現了顯著的螢光素酶沉默。僅將siRNA-Luc遞送至293-Luc細胞時螢光素酶抑制效率降低(B)。轉染后48小時分析螢光素酶基因表達。利用已為pDNA遞送作了優化的殼聚糖(支化DPn34)[27]，與siRNA以電荷比10:1配制形成復合物。對于PEI復合物采用電荷比5:l(+Z-)，而siRNA與LF2000的復合物則以重量比2:1(+/-)配制。基因表達結果表示為平均值±S.D.;n=4。圖3顯示了在293-Luc細胞中與寡核苷酸形成復合物的線型(A)和支化(B)殼聚糖的結構變化對螢光素酶沉默活性的影響。雖然對于鏈長大于34個單體單元(數均聚合度高于34個單體單元)的線型殼聚糖形成的復合物來說鏈長和電荷比似乎不是關鍵，但支化殼聚糖復合物介導有效的螢光素酶沉默要求對于較長的殼聚糖鏈長有較高的電荷密度和較高的電荷比。采用siRNA濃度150納摩爾(100納克/孔)。轉染后48小時分析螢光素酶基因表達。以電荷比30:1(+A)配制殼聚糖復合物。基因表達結果表示為平均值士S.D.;『4。圖4顯示了線型低分子量殼聚糖的siRNA濃度依賴性和相對效率。對于較低的siRNA濃度(15-30納克/L，相當于22-44納摩爾/孔siRNA濃度)，線型DPn85低分子量殼聚糖顯示最高效能，即將螢光素酶表達相對于對照未處理293-Luc細胞敲減72-95%。轉染后48小時分析螢光素酶基因表達。以電荷比30:1(+/-)配制殼聚糖復合物。基因表達結果表示為平均值±S.D.;n=4。圖5顯示了血清對螢光素酶沉默活性的影響。在測試的各種聚陽離子制劑中，在轉染介質中存在10%血清時，在293-Luc細胞中，所有線型殼聚糖和支化DPn85保留其螢光素酶沉默活性。采用siRNA濃度150納摩爾。轉染后48小時分析螢光素酶基因表達。對于低分子量殼聚糖和PEI，分別以電荷比30:1和15:1(+/-)配制siRNA復合物。siRNA與LF2000的復合物以重量比2:1(+/-)配制。基因表達結果表示為平均值±S.D.;n=4。圖6顯示了siRNA制劑的細胞毒性。用各種siRNA制劑轉染293-Luc細胞后立即或24小時后通過MTT方法測定胞內脫氫酶活性(細胞毒性的衡量)。與PEI和LF2000相反，用線型DPn85配制的siRNA復合物轉染后細胞形態和胞內脫氫酶活性均保留。雖然LF2000復合物在轉染后立即顯示顯著的毒性，但轉染24小時后細胞活力恢復。采用siRNA濃度150納摩爾。對于低分子量殼聚糖和PEI，分別以電荷比30:1和15:1(+/-)配制siRNA復合物。siRNA與LF2000的復合物以重量比2:1(+/-)配制。基因表達結果表示為平均值±S.D.;n=4-5。圖7顯示了在體外293-Luc(A、B、C)中和穩定表達螢光素酶的SKOV-3細胞(D)中螢光素酶沉默的時程。在293-Luc和SKOV-3-Luc細胞中，DPn85的線型殼聚糖在起效較早和持續的螢光素酶沉默(持續5天)方面顯示最佳的螢光素酶沉默動力學，提示完整siRNA胞內穩定釋放。采用siRNA濃度44納摩爾(30納克/孔)。對于低分子量殼聚糖和PEI，分別以電荷比30:1和15:1(+/-)配制siRNA復合物。siRNA與LF2000的復合物以重量比2:1(+A)配制。基因表達結果表示為平均值±S.D.;n=4。序列表簡述SEQIDNO.1:siGL3(正義，5'-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdTSEQIDN0.2:反義，5'誦UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT-Sl)是耙向螢光素酶基因(siRNA-Luc)的未修飾的siRNA雙鏈體，從瑞典蘭德的醫學探針公司(MedProbe，Lund,Sweden)定購[28]。SEQIDN0.3:錯配siRNA;siCONTROL非耙向siRNA#l(siCONl;正義，5'-UAGCGACUAAACACAUCAAUU-3';SEQIDNO.4:反義，5，-UUGAUGUGUUUAGUCGCUAUU-3')從科羅拉多州拉斐特的DR有限公司(DharmaconResearch,Inc.，Lafayette,CO)定購。發明詳述殼聚糖是一類由(l-4)連接的2-氨基-2-脫氧-(3-D-葡萄糖(GIcN)和N-乙酰化類似物2-乙酰氨基-2-脫氧-P-D-葡萄糖(GIcNAc)構成的線型二元多糖，是生物相容的陽離子聚合物，其已顯示適用于質粒pDNA基因遞送[23-27]。在體外和體內快速有效的基因遞送可利用分子量分布充分確定的線型和支化殼聚糖寡聚體來實現[25，27]。基于殼聚糖寡聚體的復合物具有改善的物理性質，包括粘度降低和聚合傾向較低。這些復合物還具有改善的效率，包括改善的細胞攝取、起效早和高水平體內基因表達。在本發明中，實現了在新型siRNA遞送系統中潛在的低分子量(7-17kDa)基本完全脫乙酰化(大于99%脫乙酰化)的殼聚糖。利用脂質轉染胺2000(LF2000)和PEI(線型和支化)作為對照，研究用低分子量殼聚糖配制的siRNA復合物的物理穩定性和抗RNA酶降解性。在大多數關于siRNA遞送的報道中，采用共轉染方法將非生理學相關靶標或無關pDNA摻入siRNA制劑中。因此，我們首先在穩定表達螢光素酶的細胞系中體外檢查這種摻入對通過各種聚陽離子的siRNA遞送效率的影響。然后，我們研究了siRNA制劑和低分子量殼聚糖復合物的配方和結構。更具體說，研究了低分子量殼聚糖(鏈長和支化程度)結構變化的作用、配方參數(電荷比，siRNA濃度)、血清影響，并將這些因素與體外基因沉默活性的效率相關聯。比較了各種siRNA制劑的細胞毒性，例如螢光素酶基因沉默的體外動力學。這些研究表明，低分子量殼聚糖有可能用作小干擾RNA(siRNA)的新型遞送系統。采用聚乙烯亞胺(PEI)和脂質轉染胺2000(LF2000)作為對照，使各種鏈長的殼聚糖與siRNA形成復合物并檢査其物理穩定性和針對酶降解的保護作用。在穩定表達螢光素酶的293細胞中體外研究siRNA復合物的細胞毒性和螢光素酶基因沉默活性。也研究了殼聚糖結構變化以及配方參數對siRNA復合物螢光素酶沉默活性的影響。低分子量殼聚糖能與siRNA復合形成物理穩定的納米粒(34-86nm)，提供針對RNA酶降解的保護作用。殼聚糖鏈較長和/或低分子量殼聚糖與siRNA之間的電荷比較高導致正電荷數較高的重要性表現在體外介導螢光素酶沉默活性最高。與PEI和LF2000不同，用低分子量殼聚糖配制的siRNA復合物在含10%血清的轉染培養基中保留其螢光素酶沉默活性。與PEI和LF2000相比，低分子量殼聚糖的細胞毒性也最小。數均聚合度(DP。)為85個單體單元(DP。85)的低分子量殼聚糖要求低至44nM的siRNA濃度以實現在293-Luc細胞中維持5天的螢光素酶基因表達95%沉默。同時考慮這些因素，我們的發現表明，低分子量殼聚糖是用于siRNA的有效替代遞送系統。我們過去曾報道，鏈長非常短的基本完全脫乙酰化的低分子量殼聚糖(18-34個單體單元)在體外和體內最宜用于pDNA遞送。在目前的研究中，我們報道了基本完全脫乙酰化的殼聚糖寡聚體作為siRNA體外遞送系統的結構-性質關系。為此，選擇各種鏈長的線型和三糖-取代(支化)的殼聚糖寡聚體。我們發現，與pDNA遞送相反，34個單體單元以上的線型殼聚糖寡核苷酸與siRNA形成物理穩定的復合物，并在表達螢光素酶的HEK293(293-Luc)細胞中體外介導最高螢光素酶沉默活性。顯然，siRNA和pDNA之間的結構-性質關系顯著不同。這種差異可能是因為與pDNA相比，siRNA分子較短，柔韌性較低且負電荷密度較低。因此，siRNA復合形成物理穩定且有效的納米粒需要與聚陽離子較強的離子間相互作用[18，33]。我們的研究中用基本完全脫乙酰化的低分子量殼聚糖配制的siRNA復合物的粒度(小于100nm)意外地遠比過去報道的脂質、PLL和高分子量殼聚糖(85%脫乙酰化)的粒度小[33,34]。這可能是因為基本完全脫乙酰化殼聚糖主鏈上較高的電荷密度。此外，低分子量殼聚糖的溶解度提高和粘度降低可能是因為siRNA復合物的粒度小[35]。與過去的報道相一致，siRNA-Luc與無關pDNA(pGFP)以單一基因包(package)形式共轉染在體外293-Luc細胞中導致顯著的螢光素酶沉默活性[17]。然而，我們發現當siRNA制劑不含pDNA時，基因沉默活性顯著受損。因此，我們認為，pDNA，這種高負電荷密度大分子的存在顯著促進siRNA通過改良的協同作用與各種聚陽離子形成復合物的效率。我們還發現，較長的殼聚糖鏈的高電荷密度和/或較高的電荷比不僅將產生物理穩定的復合物，而且還能在體外獲得最有效的基因沉默。我們的發現與過去報道的PAMAM樹狀聚合物的結果相一致，siRNA/樹狀聚合物復合物要得到較好的復合作用和基因沉默活性，就要求較高的代數(generationnumber)、較高的電荷比和較高的siRNA濃度(100nM)[18]。基于LF2000的制劑也推薦類似的高濃度siRNA。在本發明中，最有效的低分子量殼聚糖(線型DPn85)要求siRNA濃度低至44nM，以在293-Luc細胞中實現大于95%的螢光素酶基因表達沉默。而且，在本研究的實驗條件下，用長鏈線型低分子量殼聚糖配制的siRNA復合物在含10%血清的轉染培養基中保留其螢光素酶沉默活性。沉默活性被保留最可能的原因是，與PEI和LF2000相反，這些復合物在這種相對較高的血清濃度中抗聚集，反映了增強的膠體穩定性。發現較短且支化的殼聚糖寡聚體具有較低的基因沉默活性，可能的原因是，電荷密度降低以及殼聚糖主鏈與siRNA之間電荷相互作用的空間位阻導致siRNA復合受損。與報道的用高分子量殼聚糖配制的siRNA復合物的細胞毒性最小相一致，我們發現在該研究中，即使制劑中釆用高siRNA濃度(150nM)，用DP85低分子量殼聚糖轉染后293-Luc細胞保留其胞內脫氫酶活性[33]。低分子量殼聚糖的細胞毒性遠低于過去公開的PAMAM樹狀聚合物所得結果，PAMAM樹狀聚合物中利用50-100nM的siRNA濃度可導致細胞活力顯著降低(60-50%)。最后，與過去報道的PEI[17]相比，用線型低分子量殼聚糖配制的siRNA復合物起效較早且保留螢光素酶沉默活性。估計DPn85殼聚糖寡核苷酸動力學的改善是小的納米級siRNA復合物的細胞攝取改善以及完整siRNA胞內持續釋放的結果。2.材料和方法2丄材料含巨細胞病毒啟動子和螢火蟲螢光素酶(pLuc)或綠色熒光蛋白(pGFP)的GMP-級質粒(gWizTM)購自美國北達科他州法戈的愛德聞公司(Aldevron,Fargo,ND,USA)。脂質轉染胺2000(LF2000)購自英杰公司(Invitrogen)。線型PEI;ExGen500(分子量22kDa)購自德國弗萊蒙塔公司(Ferementas)。支化PEI(分子量25kDa)購自瑞典斯德哥爾摩的瑞典阿爾得里奇公司(AldrichSweden,Stockholm,Sweden)。2.2.siRNA雙鏈體SEQIDNO.1:siGL3(正義，5'-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT10SEQIDN0.2:反義，5'-UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT-3')是耙向螢光素酶基因(siRNA-Luc)的未修飾的siRNA雙鏈體，由瑞典蘭德的醫學探針公司(MedProbe，Lund,Sweden)定制[28]。SEQIDN0.3:錯配siRNA;siCONTROL非耙向siRNA弁l(siCONl;正義，5'隱UAGCGACUAAACACAUCAAUU-3';SEQIDNO.4:反義，5'-UUGAUGUGUUUAGUCGCUAUU-3')由科羅拉多州拉斐特的DR有限公司(DharmaconResearch,Inc.,Lafayette,CO)定制。2.3.低分子量殼聚糖制備了各種鏈長的完全N-脫乙酰化(脫乙酰化程度〉99.8%;FA<0.001)的線型和7%三糖取代的低分子量殼聚糖(支化殼聚糖)并根據所述進行表征[25,29]。全部采用數均聚合度(DPn)為34、50和85個單體單元的低分子量殼聚糖。用多角度激光散射的大小排阻色譜(SEC-MALLS)分析鏈長分布。2.4.細胞人胚腎細胞系HEK293(293細胞)得自美國馬里蘭州羅克維爾(Rockville,MD,USA)的ATCC。表達螢火蟲螢光素酶的穩定表達螢光素酶的HEK293(293-Luc細胞)由芬蘭庫奧皮奧大學藥學院的帕弗豪卡斯基博士(Dr.PaavoHonkakoski,DepartmentofPharmaceutics,UniversityofKuopio:Finland)贈送[30]。穩定表達螢光素酶的卵巢癌細胞系(SKOV-3-Luc)是由德國馬爾堡菲利普大學藥理與毒理學院的阿奇埃尼博士(Dr.AchimAigner，DepartmentofPharmacologyandToxicology,Philipps-UniversityMarburg,Germany)贈送[17]。所有細胞根據供應商的建議進行培養。2.5.siRNA復合物的配制將殼聚糖溶解在pH6.2的MilliQ無菌水中并進行除菌過濾而制備殼聚糖儲備液(0.2毫克/毫升)。在渦旋混合機(HddolphREAX2000，4級，瑞典斯帕歌凱伯實驗室(KeboLab，Spanga,Sweden))上劇烈攪拌的同時，依次將殼聚糖和siRNA儲備液或siRNA/pDNA(在共轉染的情況下)加入MilliQ無菌水中，配制殼聚糖復合物，如[25]所述。每微克pDNA或siRNA采用以下各種含量的殼聚糖來制備電荷比1:1(+/-)的殼聚糖復合物0.58微克線型殼聚糖，0.69微克被7%A-A-M取代的殼聚糖(支化殼聚糖)[25，27]。在渦旋混合機上劇烈攪拌的同時，將PEI溶液加入siRNA儲備液或siRNA/pDNA(在共轉染的情況下)中，制備PEI的siRNA復合物，如[31]所述。將該制劑在室溫下靜置約IO分鐘后進行轉染。為形成LF2000復合物，在渦旋混合機上劇烈攪拌的同時將siRNA儲備液或siRNA/pDNA(在共轉染的情況下)加入殼聚糖溶液中。用轉染介質OptiMEMI稀釋siRNA和LF2000溶液。將LF2000復合物在室溫下靜置約30分鐘后進行轉染。根據基礎試驗，全部選擇和使用電荷比15:1(+A)的PEI復合物和重量比2:1(+/-)的LF2000復合物(數據未顯示)。2.6.凝膠阻滯試驗利用瓊脂糖凝膠阻滯試驗研究siRNA復合物的物理穩定性。采用40mMTAE緩沖液中配制的4Q/Q瓊脂糖(MetaPhor⑧瓊脂糖，美國馬薩諸塞州羅克蘭的CBS羅克蘭有限公司(CambrexBioScienceRockland,Inc.,Rockland,ME,USA),如[25]所述。用1.5URNA酶A(英國安碧公司(Ambion,UK))孵育30-90分鐘后研究形成復合物的siRNA抵御酶降解的保護作用，如[18]所述。孵育后，用肝素(5毫克/毫升)使復合物解離，用瓊脂糖阻滯試驗檢査siRNA的完整性。從儲備液獲得的siRNA作為對照。2.7.殼聚糖多聚復合體(polyplex)的大小測定復合物的大小采用納米篩選儀ZS(英國馬勒文的馬勒文設備公司(MalvernInstruments,Malvern,UK)，通過光子相關光譜學進行測定，如[25]所述。用MilliQ水制備siRNA濃度為5微克/毫升的復合物。所有測量在25"C下進行。2.8.體外傳染試驗轉染試驗前24小時，將HEK293(293,293-Luc)細胞和SKOV-3-Luc細胞接種到96-孔組織培養板(英國劍橋的科斯塔公司(Costar，Cambridge,UK))中，轉染當天達到80-90。/。細胞匯合。在pH7.4無血清培養基(OptiMEMI血清減少的培養基，瑞典戴比的吉布可/BRL生命科學AB(Gibco/BRLLifeTechnologiesAB，Taby,Sweden))中或在10。/。血清(FBS)存在下進行轉染。加入甘露醇實現等滲(300mOsm/kg)。用預熱的OptiMEM洗滌細胞，并在各孔中加入50微升siRNA復合物制劑。在共轉染實驗中，每孔中加入0.33微克pDNA(pLuc或pGFP)。所有體外實驗中包括錯配(對照)siRNA。5小時孵育后，去除制劑，加入0.2毫升新鮮培養液。對于超過兩天的實驗，每個第二天更換培養液。在轉染后24-120小時的預定時間點，用預熱的PBS(pH7.4)洗滌細胞，并用螢光素酶裂解緩沖液(威斯康星州麥迪遜的普洛麥格公司(Promega，Madison，WI))裂解細胞。然后用發光計(澳大利亞維也納的米迪塔公司(MediatorsPhL,Vienna,Austria))測定螢光素酶基因表達。由螢火蟲螢光素酶(密蘇里州圣路易斯的西格瑪公司(Sigma，StLouis,MO))制備的標準曲線確定螢光素酶的表達量。2.9.胞內脫氫酶活性(MTT方法)通過MTT方法評價各種siRNA制劑在293-Luc細胞中對胞內脫氫酶活性的影響(細胞毒性的衡量)，如[32]所述。簡言之，如上所述轉染293-Luc細胞。轉染5小時后，加入用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)配制的MTT(溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑餘》(德國迪森豪夫的西格瑪公司(Sigma,Deisenhofen,Germany))溶液。4小時后，加入100微升酸-異丙醇(配制的0.04M鹽酸)溶解甲膘結晶。釆用讀板儀(澳大利亞格勞迪的TA有限公司(TECANSafire2，TecanAustriaGmbH，Grodig，Austria))測定570nm的吸光度，在690nm進行背景校正。設備將以相同方式處理的培養基的吸光度設定為0。處理細胞的胞內脫氫酶活性與對照(未處理)細胞相關聯，并由以下方程進行計算%相對胞內脫氫酶活性=[八(試驗)*100/A(對照)]，其中A(試驗)和A(對照)分別是處理細胞和對照細胞的吸光度值。在另一設定條件下，轉染后使細胞在培養基中生長24小時。然后，用MTT試劑處理細胞以檢測各種制劑的延遲毒性。132.10.數據分析試驗利用一式四份樣品進行至少兩次。所有數據表示為平均值士標準偏差。用ANOVA分析平均值之間的統計學差異。p<0.05時認為組間均值間差異顯著。物理穩定性和酶保護作用我們首次在凝膠阻滯試驗中研究了各種鏈長的線型和支化殼聚糖寡聚體與siRNA形成穩定復合物的能力。只有用較高電荷比的較長的線型寡核苷酸配制的復合物才能在pH8.0保留siRNA，該pH是電泳緩沖液常用的pH(圖1A)。數均聚合度(DPJ為85個單體單元(DP。85)的線型低分子量殼聚糖在所有檢測的電荷比下提供的物理穩定性最高。相反，當凝膠緩沖液的pH降至7.4時，所有檢測的低分子量殼聚糖能夠與siRNA形成穩定的復合物。在升高的pH值下支化或較短的殼聚糖寡聚體的siRNA制劑的物理穩定性降低提示，為形成與過去優化的用低分子量殼聚糖配制的pDNA復合物相比物理穩定的復合物，要求較高的聚陽離子電荷密度和較強的siRNA相互作用[25,27]。由于酶降解可能是基因沉默活性的限制性因素，我們也研究了選定低分子量殼聚糖保護siRNA免于RNA酶A酶降解的能力(孵育時間采用30-90分鐘)。根據基因遞送的要求，與裸siRNA相比，所有檢測的低分子量殼聚糖以及陽性對照(PEI和LF2000)提供對抗酶降解的保護作用，而裸siRNA被RNA酶A完全降解(圖1B)。需要與肝素進行較長的孵育時間(2小時)以破壞用線型DPn85和LF2000配制的復合物，反映出與其他檢測的聚陽離子相比物理穩定性提高(數據未示出)。粒度由于siRNA制劑的粒度可大大影響其組織分布和細胞攝取，因此我們研究了用低分子量殼聚糖配制的siRNA的粒度。表1顯示，低分子量殼聚糖與siRNA自組裝形成納米化粒子(34-86nm)。所得粒子的粒度取決于組14分的+/-電荷比。雖然在最低電荷比10:1(+/-)的情況下得到小粒度(34-46nm)，使用較高電荷比導致相對較大的粒度(61-86nm)。粒度通過光子相關光譜學進行測定。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>比較共轉染和穩定表達靶標的沉默由于在大多數體外試驗中，siRNA分子與其pDNA靶標同時遞送(共轉染)，我們利用錯配(非沉默)siRNA作為對照，首次檢測了低分子量殼聚糖遞送編碼螢火蟲螢光素酶報告序列的pDNA(pLuc)與靶向相同報告序列的siRNA(siRNA-Luc)的基因包的效率。在pDNA劑量、我們實驗室中為pDNA遞送而優化的最有效低分子量殼聚糖和電荷比的優化轉染條件下[27],在293細胞(不表達螢光素酶報告序列)中進行轉染。通過支化D巳34殼聚糖寡聚體或LF2000遞送的siRNA-Luc導致與對照制劑(僅pLuc)相比，螢光素酶表達顯著敲減(圖2A)。對于兩種遞送系統，均未觀察到錯配siRNA顯著抑制螢光素酶表達。然而，當在相同條件下siRNA-Luc改為僅由選定聚陽離子遞送至穩定表達螢光素酶的293-Luc細胞(與基因沉默應用較相關的情況)時，所得螢光素酶沉默活性非常低，要實現螢光素酶表達的顯著性沉默要求較高的siRNA濃度(圖2B)。為研究共轉染技術是否會影響293-Luc細胞中的基因沉默活性，將無關質粒(pGFP)摻入上述檢測的相同siRNA-Luc制劑中。與293細胞所得結果類似，支化殼聚糖寡聚體、PEI和LF2000以最低siRNA濃度(1-30納克/孔，相當于1.5-40納摩爾/L)介導顯著的螢光素酶表達敲減(40-85%)(圖2C)。在siRNA制劑中摻入pDNA(共轉染)對基因沉默活性有正面作用。這些結果提示，用于siRNA遞送的制劑要求與pDNA不同，為在體外通過聚陽離子成功遞送siRNA需要表征重要的參數。低分子量殼聚糖的結構變化和配方參數對基因沉默活性的影響a)鏈長、主鏈支化程度和電荷比為了檢查殼聚糖結構和配方參數對低分子量殼聚糖遞送siRNA的影響，我們首先測試了鏈長、支化程度和電荷比對siRNA復合物在293-Luc細胞中體外介導螢光素酶表達沉默的影響。對于線型殼聚糖，鏈長大于34個單體單元的殼聚糖介導不依賴電荷比的顯著螢光素酶沉默(圖3A)。用支化殼聚糖寡聚體配制的復合物介導螢光素酶沉默同時取決于電荷比和鏈長(圖3B)。對于較長的支化殼聚糖寡聚體，較高的電荷比可彌補殼聚糖主鏈支化(取代)的負面作用。這些結果強調，低分子量殼聚糖的高電荷密度不僅能夠產生物理穩定的復合物，而且能夠提供在體外有效的siRNA制劑。b)線型低分子量殼聚糖的siRNA濃度和相對效率下一步，在293-Luc細胞中研究siRNA濃度對用各種線型低分子量殼聚糖(以恒定的電荷比)配制的復合物的螢光素酶沉默活性的影響。對于最低siRNA濃度(15-50納克/L，相當于22-73納摩爾/L)，線型DPn85復合物將螢光素酶表達相對于對照未處理細胞敲減72-95%而顯示最高效能(圖4)。當siRNA濃度從70增加至300納克/L(103-440納摩爾/孔)時，除DPn18之外，所測試的線型殼聚糖復合物顯示相當的螢光素酶沉默曲線。用線型、較長鏈低分子量殼聚糖配制的復合物的效能較高支持siRNA制劑的物理穩定性在實現最高基因沉默活性中有作用。血清存在下的體外轉染我們還研究了轉染介質中的血清對各種siRNA制劑效率的影響。在10%血清的存在下，用DP值為34-85個單體單元的線型殼聚糖及支化DPn85殼聚糖寡聚體配制的siRNA復合物在293-Luc細胞中保留其基因沉默活性(圖5)。)。相反，用PEI和LF2000配制的siRNA復合物的基因沉默活性受損。效率受損一種可能的原因是轉染期間粒子聚集。體外細胞毒性為確保較高的螢光素酶沉默效率不是細胞毒性升高的結果，我們采用MTT方法研究了用相對較高濃度的siRNA(150納摩爾)配制的各種聚陽離子復合物對細胞形態和胞內脫氫酶活性的影響。轉染5小時后，未觀察到用線型DPn85配制的siRNA復合物對細胞形態和胞內脫氫酶活性(細胞毒性的衡量)有影響(圖6)。相反，用PEI和LF2000觀察到顯著的毒性影響，其中線型PEI毒性最高。雖然用LF2000復合物處理的細胞在24小時后恢復其胞內脫氫酶活性，但用PEI處理的細胞顯示24小時后脫氫酶活性的進一步降低。這些結果表明，即使使用較高濃度的siRNA，線型DPn85低分子量殼聚糖的急性細胞毒性亦低于PEI和LF2000。siRNA體外動力學最后，研究了將siRNA-Luc遞送至293-Luc細胞后螢光素酶沉默的時程。測試了DP值為34-85個單體單元的低分子量殼聚糖、PEI和LF2000。不包括DP18殼聚糖，因為它不如長鏈殼聚糖有效(圖4)。用線型DPn85配制的siRNA復合物介導螢光素酶沉默起效早，1天后檢測到顯著作用(70%)，2天后達到最大(92%)(圖7A)。基因沉默活性持續5天，提示完整siRNA胞內穩定釋放。支化殼聚糖寡聚體的螢光素酶沉默動力學效率不如線型寡聚體(圖7B)。LF2000和PEI的基因沉默作用比低分子量殼聚糖介導的作用低(圖7C)。在另一種細胞系SK0V-3-Luc細胞中，螢光素酶沉默動力學給出類似于293-Luc細胞的結果(圖7D)。參考文獻MeisterQTuschlT，雙鏈RNA的基因沉默機制(Mechanismsofgenesilencingbydouble-strandedRNA),Nature.431(7006)(2004)343-9。SachseC,KrauszE,KronkeA,HannusM,WalshA,GrabnerA,OvcharenkoD,DorrisD，TrudelC，So皿ichsenB等，利用合成的短干擾RNA17進行靶標發現和驗證的高通量RNA干擾方案生物途徑的功能基因組學石開究(High-throughputRNAinterferencestrategiesfortargetdiscoveryandvalidationbyusingsyntheticshortinterferingRNAs:functionalgenomicsinvestigationsofbiologicalpathways),MethodsEnzymol.392((2005)242-77。DallasA，VlassovAV,RNAi:—種新的反義技術及其治療潛力(RNAi:anovelantisensetechnologyanditstherapeuticpotential),MedSciMonit.12(4)(2006)RA67-74。CejkaD，LosertD,WacheckV,短干擾RNA(siRNA):工具還是治療？(ShortinterferingRNA(siRNA):toolortherapeutic),ClinSci(Lond).110(1)(2006)47-58。BurkhardtBR,LyleR,QianK,ArnoldAS,ChengH，AtkinsonMA，ZhangYC，將siRNA有效遞送至細胞因子刺激的胰島素瘤細胞使Fas表達沉默并抑制Fas介導的凋亡(EfficientdeliveryofsiRNAintocytokine-stimulatedinsulinomacellssilencesFasexpressionandinhibitsFas-mediatedapoptosis),FEBSLett.580(2)(2006)553-60。DeviGR，癌癥療法中基于siRNA的方法(siRNA-basedapproachesincancertherapy),CancerGeneTher,(2006)。NishitsujiH,KoharaM,KannagiM,MasudaT,通過耙向逆轉錄病毒整合必需序列的短或長發夾RNA有效抑制1型人免疫缺陷病毒(EffectiveSuppressionofHumanImmunodeficiencyVirusType1throughaCombinationofShort-orLong-HairpinRNAsTargetingEssentialSequencesforRetroviralIntegration),JVirol.80(15)(2006)7658-66。SioudM，小干擾RNA遞送至哺乳動物細胞(OnthedeliveryofsmallinterferingRNAsintomammaliancells),ExpertOpinDrugDeliv.2(4)(2005)639-51。ElmenJ,ThonbergH,LjungbergK,FriedenM,WestergaardM,XuY，WahrenB,LiangZ,OramH,KochT等，閉鎖核酸(LNA)介導siRNA穩定性禾口功會g的改善(Lockednucleicacid(LNA)mediatedimprovementsinsiRNAstabilityandfunctionality),NucleicAcidsRes.33(1)(2005)439-47。ChenX,DudgeonN,ShenL,WangJH，用于藥物發現和開發的基因沉默寡核苷酸的化學修飾(Chemicalmodificationofgenesilencingoligonucleotidesfordrugdiscoveryanddevelopment),DrugDiscovToday.10(8)(2005)587-93。LorenzC，HadwigerP，JohnM，VornlocherHP,UnverzagtC,siRNA的類固醇和脂質偶聯物以提高肝細胞的細胞攝取和基因沉默(SteroidandlipidconjugatesofsiRNAstoenhancecellularuptakeandgenesilencinginlivercells),BioorgMedChemLett.14(19)(2004)4975-7。DalbyB,CatesS,HarrisA,OhkiEC,TilkinsML,PricePJ,CiccaroneVC,脂質轉染胺2000試劑的高級轉染主要神經元，siRNA和高通量應用(AdvancedtransfectionwithLipofectamine2000reagent:primaryneurons,siRNA,andhigh-throughputapplications),Methods.33(2)(2004)95-103。HassaniZ，LemkineGF，ErbacherP，PalmierK，AlfamaQGiovannangeliC，BehrJP,DemeneixBA,皮摩爾水平脂質介導的siRNA遞送下調外源性基因小鼠腦中的表達(Lipid-mediatedsiRNAdeliverydown-regulatesexogenousgeneexpressioninthemousebrainatpicomolarlevels),JGeneMed.7(2)(2005)198-207。SantelA,AlekuM,KeilO，EndruschatJ,EscheV，FischQDamesS，LofflerK，FechtnerM,ArnoldW等，小鼠血管內皮細胞中用于RNA干擾的新型siRNA-脂質復合體技術(AnovelsiRNA-lip叩lextechnologyforRNAinterferenceinthemousevascu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)產生的產物溶液的體積以得到所需的組合物濃度。13.將核酸給予哺乳動物的方法，所述方法包括將如權利要求1所述的組合物引入哺乳動物。14.如權利要求13所述的方法，其特征在于，通過肺部、鼻腔、口服、眼睛、含服、舌下、局部、直腸或陰道途徑給予粘膜組織而將所述組合物引入哺乳動物體內。15.如權利要求13所述的方法，其特征在于，通過靜脈內、肌內、真皮內、顱內、椎管內、皮下或心內的胃腸外途徑給予粘膜下組織，或給予內臟器官、血管或外科手術期間暴露的其他體表或體腔而將所述組合物引入哺乳動物。16.如權利要求13所述的方法，其特征在于，所述組合物是能夠在至少一種哺乳動物細胞中表達其功能的寡核苷酸。17.—種使用如權利要求1所述組合物的方法，所述方法包括制造用于預防性或治療性治療哺乳動物的藥物，所述藥物包含如權利要求1所述的組合物。18.—種使用如權利要求1所述組合物作為診斷試劑的方法，所述方法包括在體內或體外診斷方法中使用。19.如權利要求17所述的組合物在制造用于預防性或治療性治療惡性腫瘤、自身免疫病、遺傳病癥、病原感染和其他病理疾病的基因治療、反義治療或遺傳疫苗接種中使用的藥物中的應用，所述應用包括通過以下給藥途徑給予將所述組合物弓I入哺乳動物體內a)通過肺部、鼻腔、口服、眼睛、含服、舌下、直腸或陰道途徑給予粘膜組織，b)通過靜脈內、肌內、真皮內、顱內、椎管內、皮下或心內給予的胃腸外途徑給予粘膜下組織，c)給予內臟、血管或外科手術期間暴露的其他體表或體腔。全文摘要低分子量殼聚糖寡聚體能夠將siRNA自組織成納米化的顆粒，提供針對酶降解的保護作用并介導在體外長時間穩定的基因沉默。用低分子量殼聚糖配制siRNA復合物過程中對結構變量的控制提供了有效的siRNA體內外替代遞送系統。文檔編號A61K48/00GK101588821SQ200780034344公開日2009年11月25日申請日期2007年9月14日優先權日2006年9月15日發明者K·M·瓦姆,M·M·伊薩,P·A·S·阿爾圖松,S·P·斯特蘭德申請人:Fmc生物聚合物聯合股份有限公司