專利名稱：：眼病的治療的制作方法眼病的治療本發明涉及治療血管新生相關疾病的藥物。血管新生定義為從已存在的血管長出內皮細胞形成新血管的過程。在這個過程中，內皮細胞到達下層的基底膜，增殖、遷移至鄰近組織內并形成管狀結構。最后，管與管之間的連接形成，血流建立。能夠適合改變要求的成熟組織既需要可溶性因子例如缺氧誘導因子(HIF)和血管內皮因子(VEGF)，又需要細胞-細胞間以及細胞-基質間的相互作用。VEGF最初被描述為弓I起實質性血管滲漏的因子，并被命名為血管通透性因子(VPF)。基于其對內皮細胞的促有絲分裂效應，該蛋白后來被重命名為血管內皮細胞生長因子(VEGF)。VEGF增加微血管床的通透性，并因此促進液體和蛋白從血管的滲漏。這導致水腫、傷口滲液和血清腫(例如手術后)、滲出(例如慢性炎性疾病中的滲出)、腹水(例如癌癥中的腹水)的發生發展。VEGF在誘導血管通透性方面比組胺強10000倍。此外，VEGF是內皮細胞增殖的最有效的剌激物之一。最終，它刺激內皮細胞形成毛細血管，因此促進對血管生成必要的事件的級聯。血管新生(即在新形成的組織甚至是沉積物(如斑塊等)中從已存在的血管中長出新的毛細血管)促進眾多病理狀態的發生和發展。在生理狀態下，血管生成是嚴密調節的過程。在病理狀態如癌癥、類風濕性關節炎、子宮內膜異位癥、銀屑病或眼部新生血管形成中，該過程顯著增強并失調。越來越多的證據表明抗血管生成藥物將改進將來對如癌癥、類風濕性關節炎、銀屑病和眼部新生血管形成和其它疾病的治療。體內實驗證明缺氧(例如腫瘤壞死區域附近)在不同類型的細胞中既能誘導VEGF的表達又能誘導VEGF受體(VEGFR-1)的表達。缺氧引起缺氧誘導因子-1(HIF-1)的表達。隨后，HIF-1復合物積聚在細胞核中，并結合到DNA的HIF-1結合位點上，分別啟動、上調VEGF-mRNA的轉錄(VEGF-mRNA的轉錄啟動鄰近血管以出芽方式長入缺氧組織中的血管生成過程)。此外，VEGF表達能被多種促炎性細胞因子誘導/上調，這一點已在多種慢性炎癥模型如銀屑病或類風濕性關節炎中所證實。VEGF可經a2巨球蛋白((x2M)途徑通過蛋白酶激活的a2M從循環中去除。(x2M-蛋白酶復合物能夠與VEGF結合在表面隆起上。形成的a2M-酶-VEGF復合物與如巨噬細胞和內皮細胞的細胞表面表達的LRP受體(低密度脂蛋白受體相關蛋白受體)結合而被吞噬和破壞掉。蛋白水解酶的口服治療增加了激活的cx2M分子的數目，因此提高了有機體細胞因子/生長因子的破壞能力(DesserLetal.CancerChemotherPharmacolSuppl(2001)47:S10-S15;LauerDetal.CancerChemotherPharmacolSuppl(2001)47:S4-S9)。最近，已提出將一些使用VEGF受體阻斷劑或抗VEGF抗體的治療性方法用于治療涉及血管生成增加的疾病，主要是癌癥，也可用于治療涉及眼部血管生成的疾病如黃斑變性。已證明眼部新生血管形成或血管新生是失明的最普遍原因，并是約20種不同眼病的病理基礎。例如在糖尿病中，視網膜中形成的新毛細血管侵入玻璃狀液，引起出血和失明。WO2005/110453涉及人野生型和突變型MT-SP1蛋白酶用于剪切VEGF和VEGF受體的用途。這樣的剪切引起血管生成減少并因此可用于治療血管生成相關病狀。JP60112720A涉及番木瓜蛋白酶和擰檬酸在治療與血管生成無關的疾病(例如青光眼)中的用途。WO2004/046199公開了硫酸軟骨素治療眼病的用途。WO2005/056784j歩及納豆激酶(nattokinase)治療糖尿病的用途。SU1342500描述了番木瓜蛋白酶在治療如青光眼的眼病的用途。US6103756涉及可用于治療眼病的包含抗氧化劑和黃酮類化合物的組合物。本發明的目標是提供用于治療或預防與血管新生有關的眼病的藥物。因此，本發明涉及至少一種蛋白酶在制備用于治療和/或預防與血管新生相關眼病的藥物中的用途，所述血管新生相關眼病選自老年性黃斑變性(AMD)、脈絡膜新生血管形成、Hippel-Lindau病、虹膜新生血管形成、缺血性增殖性視網膜病、角膜新生血管形成或增殖性鐮狀細胞視網膜病，其中至少一種蛋白酶選自植物、非哺乳動物或微生物蛋白酶。令人驚奇地發現，特別是包含至少一種優選選自植物、非哺乳動物或微生物蛋白酶的蛋白酶組合的藥物，當對個體使用時，使VEGF水平顯著降低(與所述個體使用本發明的藥物之前的VEGF水平相比，降低至少40%，優選至少50%，更優選至少60%，再更優選至少70%，最優選至少80%，特別是至少90%)，從而減少血管生成。因此，至少一種蛋白酶，優選至少兩種(至少三種、至少四種、至少五種、至少六種)蛋白酶的組合，能用于預防和/或治療個體血管新生相關眼病。特別適合使用微生物、非哺乳動物和植物蛋白酶，因為所述蛋白酶當與人或動物細胞，特別是與內皮細胞接觸時不表現出顯著的毒性。即使是這里公開的蛋白酶的組合對動物或人也沒有毒性，但卻作用于血管生成過程。有趣的是，可表明源自哺乳動物(即人或動物)的蛋白酶如胰蛋白酶或糜蛋白酶不能抑制或預防血管生成。因此，向個體單獨使用這種蛋白酶不可以用于預防或治療血管新生相關疾病。如這里所定義的術語"藥物"不僅包括藥物制品而且包括膳食補充劑。如這里所用的"植物蛋白酶"和"動物蛋白酶"和"非哺乳動物蛋白酶"是指植物或非哺乳動物中天然存在并由此提取或獲得的蛋白酶。"植物蛋白酶"和"動物蛋白酶"和"非哺乳動物蛋白酶"也可是重組蛋白酶，該重組蛋白酶的蛋白酶編碼DNA(如cDNA)分別源自或獲自植物和動物(在其基因組中天然包含所述DNA)，并被克隆進入合適載體并在培養的原核(如細菌)或真核(如昆蟲細胞、哺乳動物細胞)細胞中表達。如這里所用的"微生物蛋白酶"是微生物例如細菌和真菌(如酵母、霉菌)中天然存在的蛋白酶。但是所述蛋白酶也可從其他細胞或有機體中分離，只要所述細胞和有機體具有微生物蛋白酶的DNA并能產生重組所述蛋白酶。當治療和/或預防的血管生成相關眼病選自以上所列眼病時，特別合適使用根據本發明的藥物。所有這些疾病表現出血管生成增加，主要是由于體內血管內皮生長因子(VEGF)水平增加。但是，特別優選使用本發明的藥物治療老年性黃斑變性。也可使用本發明的藥物治療一些血管新生相關疾病。例如，眼部新生血管形成是失明最常見的原因(老年性黃斑變性、Hippel-Lindau病、Behcet's綜合征、原發性眼部新生血管形成)。特別優選使用本發明的藥物預防和/或治療罹患高水平VEGF引起和血管生成相關的疾病的個體，憑此這些疾病不是主要或完全與增殖活性增加相關。至少一種植物蛋白酶優選選自菠蘿蛋白酶、番木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶或黃瓜素。根據本發明優選使用的植物蛋白酶如上所列。這些蛋白酶可通過在宿主中重組表達或者通過從天然產生所述蛋白酶的植物中提取而獲得，憑此提取物本身可直接用于制備根據本發明的藥物。蛋白酶的提取方法在本領域中是熟知的。例如，菠蘿蛋白酶可從收獲果實之后的菠蘿樹樁或根部制備。從田地里搜集這些樹樁或根部，剝落并碾碎以提取含有可溶性菠蘿蛋白酶的汁液。進一步的處理包括將酶沉淀并進一步將其純化。通過收集番木瓜樹果實的乳漿可將番木瓜蛋白酶制成粗制干燥材料。在果實頸部刻痕之后，使乳漿在果實上干燥或者滴入容器以收集乳漿。然后將乳漿進一步千燥。干燥的乳漿這時稱為粗制干燥材料。有必要進行純化步驟以去除污染物。該純化步驟由溶解和提取活性番木瓜蛋白酶所構成。-根據本發明的優選具體實施方式，微生物蛋白酶選自納豆激酶、米曲霉菌酶(brinase)、灰色鏈絲菌蛋白酶(pronase)、蜂蜜曲霉蛋白酶(seaprose)、舍雷肽酶(serrapeptase)或枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)。微生物蛋白酶也可通過重組技術獲得或直接從包含產生所述蛋白酶的微生物的微生物培養物中分離獲得。7例如，納豆激酶是從納豆(一種由大豆發酵制成的日本傳統食品)中獲得，或從包含能夠產生所述蛋白酶的枯草桿菌(Bacillussubtilis)的特定亞種(納豆菌)有機體的培養物獲得。納豆菌可從天然肥料和曰本商品納豆中分離。該菌株能夠產生降解纖維蛋白的高活性納豆激酶產物。必須優化碳源、有機氮源或無機氮源、礦物鹽、最初pH和溫度以從納豆菌中生產納豆激酶。發現，例如，納豆菌的優化的接種物體積是大約5%(v/v)。優化的培養基可含有2.8%大豆蛋白、1%酵母提取物和0.8%麥芽糖。此外，優化的pH和溫度可分別是約6.5±0.5和約30°C至40°C。優化的孵育時間為18至48小時。發酵培養液中的納豆激酶活性可增高至超過40FU/ml。例如，舍雷肽酶是從位于蠶腸道的沙雷氏菌E15中分離的蛋白水解酶。該酶能用作治療疼痛和炎癥的天然補充劑，并在亞洲和歐洲的部分地區用于臨床應用。舍雷肽酶用作通常用于治療關節炎和炎癥的非甾體抗炎藥物(NSAIDS)的替代藥物。非哺乳動物蛋白酶優選選自立止血(reptilase)、磷蝦酶、巴曲酶(batroxobin)或蟲引^斂酉每(lumbrokinase)。這些蛋白酶可通過本領域已知方法重組制備或直接從各自動物中分離制備。特別優選的藥物包含菠蘿蛋白酶和/或番木瓜蛋白酶(作為植物蛋白酶)和任選的納豆激酶(作為微生物蛋白酶)。根據本發明的藥物中這些蛋白酶的優選比率能在下表中找到，憑此番木瓜蛋白酶、納豆激酶和/或菠蘿蛋白酶的量可彼此獨立地在藥物中存在的蛋白酶總量的0至80%之間，優選10至75%之間，更優選為15(或16、67)至75%之間變化。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>物、非哺乳動物和/或微生物蛋白酶的量是10至90。/。w/w，優選20至80%w/w，更優選30至70%w/w。至少一種植物、非哺乳動物和/或微生物蛋白酶優選以1至100mg/kg體重，優選2至50mg/kg體重，更優選5至20mg/kg體重的量對個體使用。藥物可優選進一步包含至少一種藥學上可接受的載體、稀釋劑和/或賦形劑，優選粘合劑、填充物、崩解劑、潤滑劑、防腐劑和/或包衣劑。可根據本發明的藥物的劑型使用各種其他物質如賦形劑、包衣劑等。此外，本發明的藥物可優選地適用于口服、外用、腸道或胃腸外給藥。根據本發明的優選具體實施方式，將藥物制成選自下列的劑型滴眼劑、滴耳劑、滴鼻劑、鼻腔噴霧、片劑、優選可溶性片劑、泡騰片、腸溶片、舌下含片、膠囊、優選腸溶膠囊、散劑、顆粒劑、口服液、口服滴劑、軟膏、洗劑、乳劑、水凝膠、栓劑、陰道栓劑、浸劑或注射劑。本發明的特別優選具體實施方式中，藥物適合于口服給藥。這種給藥模式是非侵入性的，因此可以重復給藥而對患者無害。本發明的藥物可特別制成固態或液態的給藥形式，包括那些適用于下列的給藥形式(1)口服給藥，例如灌服劑(drench)(水或非水溶液或懸浮液)、片劑、大丸劑(boluse)、散劑、顆粒劑、舌用糊劑；(2)胃腸外給藥，例如通過皮下、肌肉或靜脈注射，例如制成無菌溶液或懸浮液；(3)外用，例如，制成用于皮膚的乳膏、軟膏或噴霧劑；或者(4)陰道內或直腸內給藥，例如制成陰道栓劑、乳膏或泡沫劑。這里所用的短語"藥學上可接受的"是指那些在合理醫學判斷范圍內的適于與人類和動物組織接觸而無額外的毒性、興奮作用、過敏反應或其他問題或并發癥的復合物、材料、組合物和/或劑型，并具有相當的合理受益/風險比率。能作為藥學上可接受載體的材料的例子包括(l)糖類，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；(3)纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和纖維素乙酸鹽；(4)粉末狀的黃芪膠；(5)麥芽；(6)明膠；(7)云母；(8)賦形劑，可可脂和栓劑蠟；(9)油脂，如花生油、棉花籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；(10)乙二醇，如丙烯二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇；(12)酯類，如油酸乙酯、月桂酸乙酯；(13)瓊脂；(14)緩沖劑，如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(15)褐藻酸；(16)無致熱原水；(17)等滲鹽水；(18)林格氏液；(19)乙醇；(20)磷酸鹽緩沖液；和(21)其他用于藥物制劑的無毒的相容性物質。根據本發明的藥物也能使用潤濕劑、乳化劑和潤滑劑，如十二烷基硫酸鈉和硬脂酸鎂，以及著色劑、釋放劑、包衣劑、甜味劑、香味劑和芳香劑、防腐劑和抗氧化劑。藥學上可接受的抗氧化劑包括(1)水溶性抗氧化劑，如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、重硫酸鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，如抗壞血酸棕櫚酸酯、叔丁對甲氧酚(butylatedhydroxyanisole，BHA)、二叔丁對甲酚(butylatedhydroxytoluene，BHT)、卵磷脂、丙基沒食子酸酯(propylgallate)、a-生育酚等；和(3)金屬螯合劑，如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。本發明的制劑包括那些適合于口、鼻、外用(包括口腔和舌下)、直腸、陰道和/或胃腸外給藥的制劑。制劑可方便地制成單元劑型并可通過藥劑學領域熟知的任何方法制備。能與載體材料組合以產生單一劑型的活性成分的量將根據被治療主體，特別是給藥模式而變化。能與載體材料組合以產生單一劑型的活性成分的量通常是產生治療性效應的化合物的量。制備根據本發明的藥物和制劑的方法包括使本發明的化合物與載體和任選一種或多種附加成分形成組合的步驟。通常，制劑可通過使本發明的化合物與液態載體或細分的固態載體或與二者一起均一地緊密地組合起來，然后如果必要話使產物成形而制備。適于口服給藥的本發明的制劑可是以下形式膠囊、扁膠囊(cachet)、丸劑、片劑、錠劑(lozenge)(用于調味的主要成分通常是蔗糖和阿拉伯膠或黃芪膠)、散劑、顆粒劑、或作為水性液體或非水性液體中的溶液或懸浮液、或作為水包油或油包水乳狀液或作為糖漿或作為軟錠劑(pastille)(用惰性基質，如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠)，每種均含有預定量的作為活性成分的本發明的蛋白酶組合物。本發明的蛋白酶也可以大丸劑、藥糖劑(electuary)或糊劑給藥。在本發明所述用于口服給藥的固態劑型(膠囊、片劑、丸劑、糖衣片、散劑、顆粒劑等)中，活性成分與一種或多種藥學上可接受的載體混合，載體如檸檬酸鈉或磷酸二鈣，和/或以下任意種類(1)填充物或添加劑，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合劑，如羧甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯酮、蔗糖和/或阿拉伯膠；(3)保濕劑，如甘油；(4)崩解劑，如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯淀粉、褐藻酸、某些硅酸鹽和碳酸鈉；(5)溶解阻滯劑，如石蠟；(6)吸收促進劑，如季銨化合物；(7)潤濕劑，如十六烷基醇和單硬脂酸甘油酯；(8)吸附劑，例如高嶺土和膨潤土；(9)潤滑劑，例如云母、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固態聚乙二醇、十二垸基硫酸鈉，及其混合物；(10)著色劑。對于膠囊、片劑和丸劑，藥物組合物也可包含緩沖劑。相似類型的固態組合物也可用作以如乳糖或奶糖，以及高分子量的聚乙二醇等為賦形劑填充的軟和硬明膠膠囊中的填充物。片劑可通過壓制或塑形來制備，任選具有一種或多種附加成分。壓制片劑制備可使用粘合劑(例如，明膠或羥丙基甲基纖維素)、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(例如淀粉羥乙酸鈉或交聯的羧甲基纖維素鈉)、表面活性劑或分散劑。塑形片劑可通過將潤濕的粉末狀化合物與惰性液態稀釋劑的混合物在合適的機器中塑型而制成。本發明的藥物組合物的片劑和其他固態劑型，如糖衣片、膠囊、丸劑和顆粒劑，可任選用包被劑和外殼(如腸包被劑以及藥物制劑領域熟知的其他包被劑)配制(score)或制備。也可使用如各種比例的羥丙基甲基纖維素以產生所需釋放譜、其他多聚體基質、脂質體和/或微球體將其制成活性成分可緩釋或控釋的劑型。可通過例如阻滯細菌的過濾器過濾，或通過在能溶于無菌水的無菌固態組合物形式中加入滅菌試劑，或在使用前立即加入一些其他無菌的可注射介質的方法將其滅菌。這些組合物還可任選地含有乳濁劑(opacifyingagent)并可以是或優選在胃腸道的某個部位或任選以緩釋方式僅釋放活性成分的的組合物。能使用的包埋組合物的例子包括多聚體物質和蠟。蛋白酶也能是微膠囊化形式，如果適合的話，能含有一種或多種上述賦形劑。本發明化合物用于口服給藥的液態劑型包括藥學上可接受的乳劑、微乳劑、溶液、懸浮液、糖漿和酏劑。除了活性成分以外，液態劑型還可含有本領域通常使用的惰性稀釋劑(如水或其他溶劑)、增溶劑和乳化劑(如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油脂(特別是棉花籽油、落花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、聚乙二醇和去水山梨糖醇(sorbitan)脂肪酸酯、及其混合物。除了惰性稀釋劑，口服組合物還能包括輔料，如潤濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、香味劑、著色劑、芳香劑和防腐劑。懸浮液中除了活性化合物外，可含有懸浮劑，如乙氧基異硬脂酸醇、聚氧乙烯山梨醇和去水山梨糖醇酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁、膨潤土、瓊脂-瓊脂和黃芪膠，及其混合物。本發明的藥物組合物的直腸或陰道給藥的劑型可是栓劑，該栓劑可通過將本發明的蛋白酶與一種或多種合適的無剌激賦形劑或載體混合來制備，這些賦形劑或載體包括例如可可油、聚乙二醇、栓劑蠟或水楊酸酯，這些物質在室溫下為固態，但在體溫時為液態，因此將在直腸或陰道腔內融化并釋放活性化合物。本發明的適合于陰道給藥的劑型還包括含有本領域已知的合適載體的陰道栓劑、陰道塞、乳膏、凝膠劑、糊劑、泡沫或噴霧劑。本發明的化合物的外用或透皮給藥的劑型包括散劑、噴霧劑、軟膏、糊劑、乳膏、洗劑、凝膠、溶液、貼劑和吸入劑。蛋白酶可在無菌條件下與藥學上可接受載體以及任何防腐劑、緩沖劑和所需拋射劑混合。軟膏、糊劑、乳膏和凝膠除了含有本發明的活性化合物以外，還可含有賦形劑，如動物和植物脂肪、油脂、蠟、石蠟、淀粉、黃芪膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨潤土、硅酸、云母和氧化鋅，或其混合物。散劑和噴霧劑中除了含有本發明的蛋白酶以外還能含有賦形劑，如乳糖、云母、硅酸、氫氧化鋁、硅酸鈣和聚酰胺粉末，或這些物質的混合物。噴霧劑能另外含有通常的拋射劑，如氯氟烴和揮發性非取代烴，如丁烷和丙烷。透皮貼劑還具有以可控方式向體內釋放本發明的蛋白酶這一增加的優點。這種劑型可通過將蛋白酶溶解或分散在合適的介質中制備。也能使用吸收增強劑來促進蛋白酶透過皮膚的擴散。該擴散的速率能通過提供速率控制膜或將化合物用多聚體基質或凝膠分散來實現。眼用劑型、眼用軟膏、散劑、溶液等也視為包含在本發明的范圍之內。本發明的適合于胃腸外給藥的藥物組合物包含本發明的蛋白酶與下列物質的組合一種或多種藥學上可接受的無菌等滲水溶液或非水溶液、分散液、懸浮液或乳狀液，或無菌粉末(可將其于使用前立即重新溶解配制成無菌注射液或分散液)，這些液體或粉末中可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑、溶質(以使制劑與服藥患者的血液等滲)或助懸劑或增稠劑。可用于本發明的藥物組合物的合適的水性和非水性載體的例子包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙烯甘油等)及其合適的混合物、植物油(如橄欖油)和注射用有機酯類(如油酸乙酯)。例如使用包衣材料如卵磷脂，如果是分散劑的情況，通過保持所需顆粒大小，和使用表面活性劑能使劑型保持適當的流動性。這些組合物也可含有輔料如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。可通過加入各種抗細菌和抗真菌劑例如羥基苯甲酸酯(paraben)、三氯叔丁醇、苯酚山梨酸酯等來保證防止微生物對本組合物的作用。也可按需向組合物中加入等滲劑如糖類、氯化鈉等。此外，通過加入延遲吸收的試劑如單硬脂酸鋁和明膠可使注射用藥物劑型的吸收延遲。在一些情況下，為了使藥物效應延長，需要使皮下或肌肉注射的藥物吸收減慢。這一點可以通過使用水溶性差的晶體或非晶材料的液態懸浮液來實現。或者，延遲胃腸外給藥劑型的吸收可通過將藥物溶解或分散在油脂載體中來實現。可通過將本化合物在可生物降解多聚體(例如聚交酯-聚乙醇酸交酯)中形成微膠囊化基質來制備注射用貯存形式。根據藥物與多聚體的比率和所用的特定多聚體的特性，能控制藥物釋放的速率。其他可生物降解多聚體的例子包括多正酯類(poly(orthoesters))和聚(酸酐)(poly(anhydrides))。.注射用貯存制劑也可通過將藥物裝入與身體組織相容的脂質體或微乳劑內來制備。當本發明的蛋白酶作為藥品對人和動物使用時，可單獨給藥或作為含有例如0.1至99.5%(更優選地含有0.5至90%)的蛋白酶和藥學上可接受載體的藥物組合物給藥。本發明的制劑可口服、胃腸外、外用或直腸給藥。本發明的制劑當然要以適合每種給藥途徑的形式使用。例如，本發明的制劑可以片劑或膠囊形式通過注射、吸入、眼用洗劑、軟膏、栓劑等使用，通過注射、滴注或吸入使用；外用則為洗劑或軟膏；直腸給藥則為栓劑。優選口服和外用。如這里所用的短語"胃腸外給藥"和"胃腸外使用"意思是腸道以外和外用的給藥模式，通常為注射，包括但不限于靜脈、肌肉、動脈、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、腹腔、氣管內、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下腔、椎管內和胸骨內注射和滴注。本發明的藥物可通過任何合適的給藥途徑對人和其他動物治療使用，合適的給藥途徑包括口服、經鼻(例如以鼻腔噴霧的形式經鼻)、直腸、陰道內、胃腸外、腦室內和外用(以散劑、軟膏或滴劑的形式，包括口腔和舌下)。不論所選的給藥途徑是什么，本發明的蛋白酶(可以合適的水合形式)和/或本發明的藥物組合物均通過本領域技術人員已知的常規方法制成藥學上可接受的劑型。本發明的藥物組合物中活性成分的實際劑量水平可不同，以獲得對特定的患者、組合物和給藥模式達到期望的治療反應而不對患者產生毒性的有效的活性成分的量。所選劑量水平取決于眾多因素，該因素包括所用的本發明的特定蛋白酶的活性、給藥途徑、給藥時間、所用特定化合物的排泄速率、治療持續時間、與所用蛋白酶組合使用的其他藥物、化合物和/或材料，所治療患者的年齡、性別、體重、狀態、一般健康狀況和既往病史等醫學領域熟知的因素。具有本領域普通技術水平的內科醫生或獸醫可易于地確定和開出所需要的藥物組合物的有效量。例如，內科醫生或獸醫可將所需藥物組合物中含有的本發明的蛋白酶從低于達到期望治療效果所需的劑量水平開始，逐漸增加劑量直至達到所需效果。雖然可能單獨使用本發明的蛋白酶，但優選以藥物制劑(組合物)形式使用該蛋白酶。根據本發明的另一優選具體實施方式，藥物進一步包含至少一種進一步活性成分。所述活性成分可以是任何一種可支持用本發明的蛋白酶預防和治療血管生成性疾病的成分。但是，當然也可能加入與所述蛋白酶的效應不同的活性成分。至少一種進一歩活性成分優選選自黃酮類化合物特別是生物黃酮類化合物、抗氧化劑或其他物質例如白柳樹皮提取物。根據本發明的另一優選具體實施方式，藥物包含至少一種(兩種、三種甚至是四種)選自菠蘿蛋白酶、番木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶、納豆激酶、米曲霉菌酶、灰色鏈絲菌蛋白酶、舍雷肽酶、立止血、磷蝦酶、巴曲酶、蚓激酶、黃瓜素、枯草桿菌蛋白酶、蜂蜜曲霉蛋白酶的蛋白酶，和任選的進一步活性成分，其中所述進一步活性成分優選是黃酮類化合物，特別是蕓香甙(rutin)。根據本發明優選具體實施方式，黃酮類化合物選自蕓香甙或其衍生物。例如，菠蘿蛋白酶和番木瓜蛋白酶，被稱為巰基蛋白酶，其活性位點含有半胱氨酸殘基。在氧化條件下，該半胱氨酸的巰基基團失去氫原子并可與另一個巰基基團交聯形成二硫鍵，或者與另一個殘基通過相同的氧化過程交聯。在這種氧化狀態下，菠蘿蛋白酶和番木瓜蛋白酶失活。通過加入抗氧化劑維生素C、生物黃酮類化合物如蕓香甙和原花青素(proanthocyanidins)能防止巰基蛋白酶的活性巰基基團的氧化。本發明的藥物中包含的所述進一步活性成分的量優選是5至35%w/w，優選10至30%w/w，更優選15至25%w/w。本發明通過以下圖示和實施例進一步闡明。圖1顯示酶處理HUVEC后，上清液中細胞釋放的LDH(毒性試驗)。圖2顯示酶處理HUVEC后的MTT分析(抗增殖活性)。圖7(A)顯示聯合應用25%菠蘿蛋白酶、50%納豆激酶和25%番木瓜蛋白酶抑制VEGF誘導的管腔樣結構形成。圖7(B)顯示僅用VEGF處理的對照組。在VEGF對照組中可見細窄的管腔樣結構形成，而酶處理的樣品顯示大部分區域無管腔樣結構形成，表明多種酶聯合應用具有抗血管生成活性。圖4顯示保心納豆激酶(Rutozym)治療患者血液中的VEGF濃度。圖5顯示VEGF和蕓香甙(rutoside)剌激HUVEC的MTT分析。觀察不到對增殖的抑制作用。圖6顯示蕓香甙對HUVEC的毒性效應。在靜息HUVEC中觀察不到毒性效應，而在VEGF激活HUVEC中顯示出輕微的效應。圖7(左)顯示抑制HUVEC自發管腔樣結構形成。菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶、納豆激酶、番木瓜蛋白酶和舍雷肽酶抑制管腔樣結構形成，而糜蛋白酶或胰蛋白酶不能抑制管腔樣結構的形成。圖7(右)顯示抑制HUVEC的VEGF誘導的管腔樣結構形成。菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶、納豆激酶、番木瓜蛋白酶和舍雷肽酶的抑制程度幾乎與其對未經VEGF誘導的HUVEC管腔樣結構形成的抑制程度相同。但是糜蛋白酶或胰蛋白酶不能抑制管腔樣結構的形成。實施例材料菠蘿蛋白酶，來自菠蘿樹莖部，活性為3.51U/mg，獲自奧地利SigmaAldrich公司。納豆激酶，活性為10.000U/ml，購自日本BioScienceLaboratoryCo:Ltd.公司。番木瓜蛋白酶，來自番木瓜，活性為大于3U/mg，獲自奧地利SigmaAldrich公司。實施例l:毒性試驗用乳酸脫氫酶(LDH)試驗測定菠蘿蛋白酶、納豆激酶和番木瓜蛋白酶的抗增殖活性。胰蛋白酶處理收取半融合培養的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)，以2500個細胞/孔的密度接種到預先以人纖連蛋白包被的96孔微孔板中。為使其恰當貼壁，將細胞在內皮細胞基礎培養基2MV(CambrexBiochemicals)(含有10%胎牛血清、60嗎/ml內皮細胞生長補充物、hrEGF、hrFGF2、hrIGF、hrVEGF、抗壞血酸和肝素)中培養24小時。貼壁之后，在37。C/95。/。濕度，不含生長因子的M199培養基+10°/。胎牛血清(FCS)下孵育細胞使其饑餓。24小時后，用含有10%FCS、VEGF和各種濃度酶的M199培養基置換培養上清液。孵育48小時后，收集上清液并根據生產商(Promega,德國)的說明進行LDH分析從所有孔中取50pl轉移至新鮮的96孔平底板(酶學分析用)。將分析緩沖液加入到底物混合物中并輕輕混勻。每孔加入50^1重新溶解復原的底物混合物。將孔板在室溫下孵育30分鐘。每孔加入50pl終止液。一小時內，測定490nm參照620nm波長的光密度值。結果以占未處理對照組的百分率表示。結果如圖1所示。這些結果清楚地表明孵育兩天后，高達包括25pg/ml水平的菠蘿蛋白酶、納豆激酶和番木瓜蛋白酶未表現出對HUVEC的毒性效應。實施例2:抗增殖活性菠蘿蛋白酶、納豆激酶和番木瓜蛋白酶及其混合物的抗增殖活性用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)分析進行測定。胰蛋白酶處理收取半融合培養的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)，以1000個細胞/孔的密度接種到預先以人纖連蛋白包被的96孔微孔板中。為使細胞恰當貼壁，將細胞在內皮細胞基礎培養基2MV(CambrexBiochemicals)(含有10%胎牛血清、60pg/ml內皮細胞生長補充物、hrEGF、hrFGF2、hrIGF、hrVEGF、抗壞血酸和肝素)中培養24小時。貼壁之后，在37'C/95。/。濕度，不含生長因子的M199培養基+10。/。胎牛血清(FCS)下孵育細胞使其饑餓。24小時后，用含有10。/。FCS和各17種濃度的菠蘿蛋白酶、納豆激酶和番木瓜蛋白酶的M199培養基置換培養上清液。將細胞在37。C/95。/。濕度下繼續培養48小時。使用EZ4UMTTKit試劑盒(Biomedica,奧地利)根據生產商的說明進行MTT分析。測定450nm參照620nm波長的光密度。結果以％增殖表示，100%為VEGF處理的對照組細胞的增殖。圖2中顯示濃度-效應實驗的結果。該結果清楚地證明菠蘿蛋白酶、納豆激酶和番木瓜蛋白酶的抗增殖活性，其中菠蘿蛋白酶和番木瓜蛋白酶在低至25pg/ml的濃度下達到75%的生長。與LDH釋放分析的結果綜合來看，這些數據表明上述酶具有明確的抗增殖活性，但無細胞毒活性。表l顯示混合物的結果。能看出明確的抗增殖效應。表1:在VEGF存在時聯合使用菠蘿蛋白酶、納豆激酶和番木瓜蛋白酶抑制HUVEC的生長。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>實施例3:抗血管生成活性方法使用管腔樣結構試驗對抗血管生成活性進行了測定。在4。C溫度下使生長因子誘導的基質膠(BectonDickinson,Vienna)融化。以每孔50^1將該基質膠加入到96孔微量滴定板的孔中。將滴定板置于4。C24小時。實驗之前，將滴定板在37。C孵育30-60分鐘以使凝膠凝固。以胰蛋白酶處理收取HUVEC，在內皮細胞生長培養基2(MV)(Lonza,Brussels)(根據生產商的說明補充了抗壞血酸和氫化可的松以及5000U/ml肝素和1%胎牛血清)中以20.000個細胞/孔的密度接種到基質膠包被的96孔微孔板中。加入藥物和VEGF至所需的濃度。繼續培養16至18小時后，對孔照相。使用ImageJ軟件以神經元長度測定插件(NeuronLengthDeterminationPlugin)測量管腔樣結構的總長度。結果圖3、圖7和表1顯示酶和酶混合物的管腔樣結構形成試驗的結果。表1顯示各種菠蘿蛋白酶、納豆激酶和番木瓜蛋白酶的混合物對管腔樣結構形成的抑制作用。結果清楚地表明1.菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶、納豆激酶、番木瓜蛋白酶和舍雷肽酶抑制管腔樣結構的形成。2.聯合應用菠蘿蛋白酶、納豆激酶和番木瓜蛋白酶對于單獨使用這些藥物來說具有更強的效應。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>^—1—rHUVEC在VEGF薦泰下管腔樣結構的形一歳1%對照)。結果顯示為％管腔樣結構的形成，100%相當于僅用VEGF處理的樣品管腔樣結構的形成。聯合應用未顯示不能抑制管腔樣結構的形成。結論菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶、納豆激酶、番木瓜蛋白酶或舍雷肽酶單獨處理后和菠蘿蛋白酶、納豆激酶和番木瓜蛋白酶的混合物處理后，檢測到VEGF介導的微脈管樣結構的形成顯著減少。實施例4在這個實施例中，研究了酶治療(酶混合物納豆激酶、菠蘿蛋白酶、番木瓜蛋白酶+蕓香甙生物黃酮類化合物、白柳樹皮提取物)對血液中VEGF濃度的量的影響。可顯示出(參見以下結果)酶治療顯著降低了人血液中升高的VEGF濃度。在兩平行可比較的組間以隨機開放性多中心初步研究的方式對111名男女兩性II型糖尿病患者進行試驗。54名患者接受4周的酶混合物治療(酶混合物納豆激酶(20000FU/gm)25mg、菠蘿蛋白酶(2450GDU/gm)卯mg、番木瓜蛋白酶N.R(2.400USP單位/mg).100mg、蕓香甙生物黃酮類化合物制劑(蕓香甙&蕓香糖苷)120mg、白柳樹皮提取物(15%水楊苷/7%多酚)100mg，MarlynNutraceuticals，USA)。補充前和補充4周后立即對患者血漿VEGF濃度進行測定。以患者最初值作為對照(自身對照)。血液VEGF濃度分成4個不同組(四分；見圖4):治療前患者血液VEGF濃度<50ng/ml(s50是指起始(start)<50ng/ml;e50是指最終(end));slOO:治療前患者血液VEGF濃度<100ng/ml;s200:治療前〈200ng/ml;和s300:治療前>200ngVEGF。可以顯示出包含植物和/或微生物來源的蛋白酶的本發明的藥物能用于降低血液VEGF水平，因此能用于治療與血管新生相關的疾病。一實施例5:蕓香甙對HUVEC的抗增殖效應用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)試驗評價Rutosid(蕓香甙)可能的抗增殖活性。胰蛋白酶處理來收取半融合培養的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)，以1000個細胞/孔的密度接種到預先用人纖連蛋白包被的96孔微孔板中。為使細胞恰當貼壁，將細胞在內皮細胞基礎培養基2MV(CambrexBiochemicals)(含有10%胎牛血清、60ng/ml內皮細胞生長補充物、hrEGF、hrFGF2、hrIGF、hrVEGF、抗壞血酸和肝素)中培養24小時。貼壁之后，在37"/95%濕度，不含生長因子的M199培養基+10。/。胎牛血清(FCS)下孵育細胞使其饑餓。24小時后，用含有10°/。FCS和各種濃度蕓香甙和VEGF的M199培養基置換培養上清液。將細胞在37tV95。/。濕度下繼續培養48小時。使用EZ4UMTTKit試劑盒(Biomedica，Austra)根據生產商的說明進行MTT試驗。測定450nm參照620nm波長的光密度值。結果以％增殖表示，將VEGF處理的對照組細胞的增殖視為100%。結果清楚地表明蕓香甙沒有抑制VEGF刺激的HUVEC增殖(見圖5)。實施例6:蕓香甙對HUVEC的毒性效應用乳酸脫氫酶(LDH)試驗評價蕓香甙可能的細胞毒性活性。胰蛋白酶處理收取半融合培養的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)，以2500個細胞/孔的密度接種到預先以人纖連蛋白包被的96孔微孔板中。為使細胞恰當貼壁，將細胞在內皮細胞基礎培養基2MV(CambrexBiochemicals)(含有10%胎牛血清、60fig/ml內皮細胞生長補充物、hrEGF、hrFGF2、hrIGF、hrVEGF、抗壞血酸和肝素)中培養24小時。貼壁之后，將細胞在37°(:/95%濕度，不含生長因子的M199培養基+10%胎牛血清(FCS)下孵育使其饑餓。24小時后，用含有10%FCS、VEGF和不同濃度的酶的M199培養基置換培養上清液。孵育48小時后，收集上清液，根據生產商(Promega,German)的說明進行LDH試驗從所有各孔取50^加入到新的96孔平底板(酶學分析用)。向底物混合物中加入分析緩沖液并輕輕混勻。向每個孔中加入50重新溶解復原的底物混合物。將板在室溫下孵育30分鐘。向每個孔中加入50)il的終止液。一小時內測定490nm處參照620nm波長的光密度值。結果以占未處理的對照組的百分率表示。結果清楚地表明蕓香甙對于HUVEC的毒性可以忽略不計(見圖6)。實施例7:來自植物的蛋白酶對氧誘導的視網膜病和激光誘導的脈絡膜新生血管形成的小鼠模型VEGF的抑制在工業化國家中血管增生性視網膜病是視力嚴重喪失的主要原因。潛在的疾病有糖尿病、視網膜靜脈阻塞、早產兒視網膜病或晚期老年性黃斑變性(AMD)。缺血性視網膜病的標準治療基于破壞外周視網膜組織以使如VEGF的血管生成性因子產生最少。由于神經元組織的破壞是不可逆的，所以需要以血管生成性因子抑制劑進行局部治療以保護出現視網膜或脈絡膜新生血管形成的風險的增加的患者。同時，在AMD中，用血管生成抑制性藥物進行局部治療成為治療標準。方法A.氧誘導視網膜病(OIR)按照Smith及其同事(Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.(1994)35:101-111)的描述建立氧誘導視網膜病(OIR)的小鼠模型。將7日齡(P7)C57/B16J小鼠置于75%氧氣中直至第12天(P12)。在恢復正常氧氣水平后，動物由于相對缺氧而出現視網膜新生血管形成。這個效應通過在一只眼以玻璃體內注射方式注射試驗物質而在另一只眼內注射對照溶液來影響。P17時灌注熒光素葡聚糖之后通過鋪片(flatmoimt)來評估視網膜增殖。這些完整鋪片得以編碼方式對視網膜脈管系統中血管的變化進行評價。根據評分系統對每個鋪片確定分I女并用Wilcoxon酉己X寸符號'秩檢驗(Wilcoxonmatched-pairssigned-rankstest)進行比較，結果是處理組和對照組間存在顯著性差異。每組共用30只小鼠。在第二個試驗中，于P12腹腔注射試驗物質。在這種情況下，不可能在兩只眼睛之間進行同體比較，因此需要另外一個對照組。每組共使用25只小鼠。B.激光誘導脈絡膜新生血管形成(激光-CNV)按照Campochiaro及其同事(Tobe等人，Am.J.Pathol.(1998)153:1641-1646)的描述建立激光誘導脈絡膜新生血管形成的小鼠模型。將不大于12周齡的C57/B16J小鼠麻醉，在第0天(d0)使用3次可視可控激光燒傷視網膜，以此來誘導血管新生。動物在創傷兩周內在激光作用位點形成脈絡膜新生血管。于第7天或數天后，在一只眼以玻璃體內注射方式注射試驗物質而在另一只眼內注射對照溶液，觀察是否影響視網膜或脈絡膜血管生成。13天后，第14天，以葡聚糖-熒光素灌注動物，制備脈絡膜的完整鋪片。完整鋪片得以評價脈絡膜血管的變化以及CNV-膜的大小。通過Wilcoxon配對符號秩檢驗法比較每組激光斑點的數值，結果是處理組和對照組之間存在顯著性差異。每組共使用30只小鼠。22在另一個實驗中，于P7或數天腹腔注射試驗物質。在這種情況下，不可能進行兩只眼睛之間的同體比較，因此需要另外一個對照組。每組共使用25只小鼠。權利要求1、至少一種蛋白酶在制備治療和/或預防血管新生相關眼病的藥物中的用途，所述血管新生相關眼病選自老年性黃斑變性(AMD)、脈絡膜新生血管形成、Hippel-Lindau病、虹膜新生血管形成、缺血性增殖性視網膜病、角膜新生血管形成或增殖性鐮狀細胞視網膜病，其中至少一種蛋白酶選自植物、非哺乳動物或微生物蛋白酶。2、根據權利要求1所述的用途，其特征是至少一種植物蛋白酶選自菠蘿蛋白酶、番木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶或黃瓜素。3、根據權利要求1所述的用途，其特征是微生物蛋白酶選自納豆激酶、灰色鏈絲菌蛋白酶、米曲霉菌酶、蜂蜜曲霉蛋白酶、舍雷肽酶或枯草桿菌蛋白酶。4、根據權利要求1所述的用途，其特征是非哺乳動物蛋白酶選自立止血、磷蝦酶、巴曲酶或蚓激酶。5、根據權利要求1至4任一項所述的用途，其特征是藥物中包含的至少一種植物、非哺乳動物和/或微生物蛋白酶的量是10至90%w/w，優選20至80。/。w/w，更優選30至70%w/w。6、根據權利要求1至5任一項所述的用途，其特征是至少一種植物、非哺乳動物和/或微生物蛋白酶以1至100mg/kg體重，優選2至50mg/kg體重，更優選5至20mg/kg體重的量對個體使用。7、根據權利要求1至6任一項所述的用途，其特征是藥物進一步包含至少一種藥學上可接受的載體、稀釋劑和/或賦形劑，優選為粘合劑、填充物、崩解劑、潤滑劑、防腐劑和/或包衣劑。8、根據權利要求1至7任一項所述的用途，其特征是藥物適用于眼內、口服、外用、腸道或胃腸外給藥。9、根據權利要求1至8任一項所述的用途，其特征是藥物選自下列藥物形式滴眼劑、滴耳劑、滴鼻劑、鼻腔噴霧、片劑、優選可溶性片劑、泡騰片、腸溶片、舌下含片、膠囊、優選腸溶膠囊、散劑、顆粒劑、口服液、口服滴劑、軟膏、洗劑、乳劑、水凝膠、栓劑、陰道栓劑、浸劑或注射劑。10、根據權利要求1至9任一項所述的用途，其特征是藥物進一步包含至少一種進一步活性成分。11、根據權利要求10所述的用途，其特征是至少一種進一步活性成分是黃酮類化合物和/或抗氧化劑。12、根據權利要求ll所述的用途，其特征是黃酮類化合物是蕓香甙。13、根據權利要求10至12任一項所述的用途，其特征是藥物中包含的進一步活性成分的量為5至35y。w/w，優選10至30。/。w/w，更優選15至25。/。w/w。14、根據權利要求1至13任一項所述的用途，其特征是藥物包含至少一種選自菠蘿蛋白酶、番木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶、納豆激酶、米曲霉菌酶、灰色鏈絲菌蛋白酶、舍雷肽酶、立止血、磷蝦酶、巴曲酶、蚓激酶、黃瓜素、枯草桿菌蛋3酶、J蜜曲霉蛋白酶的蛋白酶，和任選的進一步活性成分，其中所述進一步活性成分優選黃酮類化合物，特別是蕓香甙。全文摘要本發明涉及至少一種蛋白酶在制備用于治療和/或預防血管新生相關眼病的藥物中的用途，所述血管新生相關眼病選自老年性黃斑變性(AMD)、脈絡膜新生血管形成、Hippel-Lindau病、虹膜新生血管形成、缺血性增殖性視網膜病、角膜新生血管形成或增殖性鐮狀細胞視網膜病，其中至少一種蛋白酶選自植物、非哺乳動物或微生物蛋白酶。文檔編號A61K38/48GK101505790SQ200780030509公開日2009年8月12日申請日期2007年8月16日優先權日2006年8月16日發明者A·阿夫塔卜,B·洛奇,L·德瑟爾,T·莫里申請人:馬林大藥廠