專利名稱：：用于治療糖尿病血管并發癥的方法用于治療糖尿病血管并發癥的方法相關申請的交叉參考本申請要求2006年6月14日提交的美國臨時專利申請No.60/804,656以及20O6年IO月18日提交的美國非臨時專利申請No.11/582,894的優先權，所述申請通過參考全文并入本文。
背景技術：
：本發明涉及糖尿病血管并發癥的藥物治療，特別涉及用薯蕷屬(Z)/o^^M)物種的提取物治療糖尿病血管并發癥的方法。己經提示在糖尿病血管并發癥的病理中有非酶糖基化(Maillard反應)。最近的免疫組化研究顯示高度糖基化終產物(AGE)的形成在糖尿病對象中被加強(Liuetal.，Diabetes.48:2074-2082,1999)。已知AGE形成本身改變組織蛋白質的結構和功能性質。另夕卜，AGE修飾的蛋白質和各種類型的細胞之間的相互作用被認為在糖尿病對象體內觀察到的異常情況中具有病理作用。因此，體內AGE的過量積累被認為是激發糖尿病血管并發癥例如粥樣硬化病變、腎病、血管損傷、神經病和視網膜病的主要因素(Vlassaraetal.，JournalofInternalMedicine251:87-101，2002)。慢性高血糖實質上涉及糖尿病血管并發癥的發生和發展。在肝臟中，AGE修飾的蛋白質的內吞導致清道夫受體的丟失和肝竇內皮細胞中胞內運輸的延遲(Hansenetal.，Diabetologia45:1379-1388,2002)。在腎臟中，AGE修飾的IV型膠原和層粘連蛋白降低了它們與帶負電荷的蛋白聚糖相互作用的能力，提高了對白蛋白的血管通透性(Silbigeretal.，KidneyInt43:853-64，1993)。迄今為止，已經有了一些尋求預防AGE形成、降低AGE對細胞的作用和破壞已經存在的AGE交聯的方法。一種重要的藥物學策略利用了小親核肼化合物氨基胍(AGE介導的交聯的一種強抑制劑)。另一種AGE抑制藥物仍在開發之中，包括已經示出在大鼠中阻止糖尿病性腎小球硬化癥的四4氫噻唑衍生物OPB-9195。也已發現血管緊張肽轉變酶抑制劑(ACEI)例如雷米普利(mmipril)在用鏈脲佐菌素(STZ)處理的糖尿病小鼠體內緩解腎病。盡管目前己經開發的化合物或藥物己用于抑制AGE和AGE交聯的形成，但是已有AGE不能被所述特定化合物清除，或者所述藥物損傷糖尿病對象體內的細胞和組織。確認與給予糖尿病對象的化合物或藥物相關的毒性和副作用也是困難的。薯蕷是一種用于傳統中藥的非常重要的藥用植物，并且其藥理作用已經研究了很多年。在1936年，Tsukamotoetal從薯蕷科(Z)zVwcoreacea)植物中分離了薯蕷皂苷配基(薯蕷的一種類固醇皂苷)，并將所分離的薯蕷皂苷配基用作迅速合成藥用類固醇的原料。然而，尚未進行在糖尿病血管并發癥的治療中使用薯蕷提取物的研究。發明概述本發明涉及治療糖尿病血管并發癥的方法，包括給予需要的對象治療有效量的薯蕷屬物種的提取物。或者，本發明涉及薯蕷屬物種的提取物用于制備治療糖尿病血管并發癥的藥物的用途，其中所述藥物以治療有效量給予需要其的對象。當與附圖一起閱讀時，上文概述以及下文發明詳述可以被更好地理解。為了闡明本發明，在附圖中示出了目前優選的實施方案。然而應當理解本發明不限于與附圖相關的確切實驗條件及參數。在附圖中圖IA和IB分別是示出薯蕷屬物種的甲醇和乙醇提取物的HPLC分析產生的峰的層析圖2是示出14種薯蕷屬物種的測試組用單一隨機擴增多態DNA(RAPD)引物(SEQIDNO:l)擴增的擴增產物的電泳標記模式的合成圖像；圖3是示出Kupffer細胞中一系列基因表達的合成圖像；圖4A至4D是示出STZ誘導的糖尿病小鼠的不同肝臟組織學的顯微圖像，每一幅圖像放大倍數為400X，比例標尺表示50)im;圖5A至5D是示出STZ誘導的糖尿病小鼠的不同腎臟組織學的顯微圖像，每一幅圖像放大倍數為400X，比例標尺表示50Mm;圖6A至6E是示出注射了AGE的小鼠的不同肝臟組織學的顯微圖像，每一幅圖像放大倍數為640X,比例標尺表示2(Him;圖7A至7E是示出注射了AGE的小鼠的不同腎臟組織學的顯微圖像，每一幅圖像放大倍數為640X，比例標尺表示20pm。發明詳述為了更好地理解本發明，進一步詳細地解釋本文所用的一些術語。術語"一個"在本文中是指一個或多于一個(即至少一個)文中的語法賓語。例如，"一個元件"意味著一個元件或多于一個元件。術語"糖尿病血管并發癥"在本文中是指在糖尿病病程中出現的血管病變，包括心血管疾病、神經病、視網膜病和腎病，其可導致糖尿病患者的殘疾和高死亡率。如本文所用，"百分之"或"％"是指成份的重量百分比，其基于包含所述成份作為一部分的組合物的重量使用。如本文所用，"對象"是指任何動物例如哺乳動物、特別地包括人，所述動物受到或可能受到糖尿病血管并發癥的影響。本發明提供了治療糖尿病血管并發癥的方法，所述方法包括給予需要的對象治療有效量的薯蕷屬物種的提取物。在本發明的一個實例中，所述薯蕷屬物種的提取物通過包括如下步驟的過程制備(a)將薯蕷屬物種的塊莖與基于醇的溶劑在存在乙酸的情況下混和以獲得提取組合物；(b)對步驟(a)中獲得的提取組合物進行分離處理以獲得可溶性級分；和(c)從步驟(b)中獲得的可溶性級分中除去溶劑以獲得薯蕷屬物種的提取物。所述基于醇的溶劑包括任何能夠作為溶劑的合適的醇。例如但不限于，所述基于醇的溶劑包括甲醇、乙醇、異丙醇或丁醇或其混和物。根據一個實施方案，所述薯蕷屬物種的塊莖在存在大約1%乙酸溶液的情況下用乙醇提取。優選地，所述薯蕷屬物種的塊莖在存在大約1%乙酸溶液的情況下用大約50至大約90%乙醇提取。在本發明的一個實施方案中，所述薯蕷屬物種的塊莖在存在大約1%乙酸溶液的情況下用大約85%乙醇提取。根據另一個實施方案，碾磨所述薯蕷屬物種的塊莖并在存在大約1%乙酸溶液的情況下與大約30%至大約卯％甲醇(例如大約40%甲醇)混和。提取的混和物可以靜置過夜并通過過濾步驟例如真空過濾分離以獲得濾液。之后可以將所述濾液凍干以獲得薯蕷的粗提取物。在本發明的一個實例中，所述方法任選地在制備過程的步驟(a)之前包括對所述薯蕷屬物種的塊莖進行預處理，所述預處理包括如下步驟(i)將薯蕷屬物種的塊莖浸入大約1%乙酸溶液中；(ii)碾磨所述薯蕷屬物種的塊莖；和(iii)凍干經過碾磨和乙酸處理過的薯蕷屬物種的塊莖，產生經過碾磨的、凍干的及乙酸處理過的薯蕷屬物種的塊莖。根據本發明的一個實施方案，所述薯蕷屬物種提取物可以如下制備-將薯蕷屬物種的塊莖浸入大約1%乙酸溶液中、之后進行研磨以及之后將乙酸處理過的塊莖凍干以及之后通過用基于醇的溶劑浸泡而提取凍干的塊莖，以及將經過碾磨的凍干的塊莖與基于醇的溶劑混和以形成混和物，以及將該混和物靜置過夜以獲得提取物。本發明還提供了治療糖尿病血管并發癥的方法。所述方法包括給予需要這種治療的對象治療有效量的薯蕷屬物種的提取物，其中所述提取物通過包括如下步驟的過程制備(a)將薯蕷屬物種的塊莖浸入1%乙酸溶液中；(b)碾磨乙酸處理過的薯蕷屬物種的塊莖；和(C)凍干經過碾磨和乙酸處理過的薯蕷屬物種的塊莖；產生經過碾磨的、凍干的及乙酸處理過的薯蕷屬物種的塊莖；(d)將至少一部分步驟(c)的經過碾磨的、凍干的及乙酸處理過的薯蕷屬物種的塊莖與基于醇的溶劑在存在大約1%乙酸溶液的情況下混和以獲得提取組合物；(e)對步驟(d)中獲得的提取組合物進行分離處理以獲得可溶性級分；和(f)從步驟(e)中獲得的可溶性級分中除去溶劑以獲得薯蕷屬物種的提取物。根據本發明的一個實施方案，在本發明的制備過程和治療方法中使用的薯蕷屬物種是參薯CD/ojcwe""/ataL.)cv.Phyto，其特征為當薯蕷屬物種的基因組DNA通過SEQIDNO:9的引物擴增時隨機擴增多態性DNA(RAPD)指紋包括如下14個DNA條帶428bp、452bp、537bp、602bp、723bp、817bp、934bp、H40bp、1242bp、1478bp、1641bp、1904bp、2151bp和2918bp，當薯蕷屬物種的基因組DNA通過SEQIDNO:9的引物擴增時。所述隨機擴增多態性DNA(RAPD)分析描述于實施例4。根據一個實施方案，治療有效量的薯蕷屬物種的提取物通過口服途徑給予需要治療糖尿病血管并發癥的對象。但是，所述提取物可以通過任何其他適當的給予途徑給予需要的對象以獲得相似的治療效果，例如靜脈內、腹膜內、透皮途徑，特別是透粘膜途徑包括經鼻途徑。對于本領域技術人員，所述治療有效量以及給予的劑量和頻率可以容易地根據他們的知識和基于本公開的僅僅常規實驗的標準方法學確定。所述劑量可以是大約1至大約100mg/kg體重/日，優選地大約5至大約40mg/kg體重/日，以及最優選地大約10至大約30mg/kg體重/曰。提供下文的實施例以進一步說明本發明。這些實施例不是為了限制本發明的范圍，并且它們也應當被這樣解釋。實施例實施例l:薯蕷屬物種的粗提取物(PH)的制備將薯蕷屬物種的去皮塊莖在存在1%乙酸的情況下浸入基于醇的溶液。攪拌后，將該混和物溶液靜置過夜。通過此過程獲得的可溶性部分進行凍干以得到薯蕷屬物種的粗提取物(PH)。特別地，將1.4kg薯蕷屬物種的去皮塊莖切成小塊并浸入1%乙酸溶液。將所述小塊浸入所述乙酸溶液中過夜并除去上清。在提取之前將所述小塊凍干。將凍干的小塊進行碾磨并與大約30%至大約90%甲醇(例如大約40%甲醇)作為大約1.5L至大約2.5L的溶劑在存在大約1%乙酸溶液的情況下混8和。將所述混和物靜置過夜并通過真空過濾進行過濾以獲得濾液。之后將所述濾液凍干以獲得薯蕷屬物種的粗提取物(PH)。或者，將凍干的小塊進行碾磨并與大約50%至大約90%乙醇(例如大約85%乙醇)作為大約1.5至大約2.5L的溶劑在存在大約1%乙酸溶液的情況下混和。相似地，將所述混和物靜置過夜并通過真空過濾進行過濾以獲得濾液。之后將所述濾液凍干以獲得薯蕷屬物種的粗提取物(PH)。實施例2:薯蕷屬物種的粗提取物(PH)的分析將實施例1中得到的粗提取物(包括甲醇和乙醇提取物)使用具有兩個泵(LC-10AT)、一個SPD-10A程控可調波長UV/Vis光電二極管陣列檢測器、一個SCL-10A系統控制器和一個配有保護柱(35mmx4.6mm,并且具有5pm填充；Supdco)的C-18柱(Supdcosil,250mmx4.6mm,并且具有5|im填充；Supelco,Bellefonte，USA)的ShimadzuHPLC系統(具有ClassVP6.12版軟件的ClassVP系列；Shimadzu,Kyoto,Japan)通過HPLC進行分析。PH的HPLC樣品(10mg/mL)使用含有88%水(流動相A)和12%甲醇(流動相B)的流動相制備為20pL等份并上樣至用所述流動相以流速0.9mL/min平衡的柱。全部有機溶劑都是HPLC級，并在使用之前用0.22^im濾器過濾并脫氣。將HPLC方法的總運行時間設定為20min。在所述ShimadzuSPD-10AUV-Vis光電二極管陣列檢測器上在260nm監測洗脫譜。結果基于下文表1所列出的參數進行定量。得到的色譜結果用ClassVP6.12版軟件(Shimadzu,Kyoto,Japan)進行處理和記錄。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>參考圖IA和IB,譜中的峰可以很好地分辨。在所述譜中觀察到幾個峰，其中峰4示出PH中的活性成份。如在圖IA和IB中示出的，峰4的保留時間是大約7.045min(對于甲醇提取物)和大約7.474(對于乙醇提取物)。因此，薯蕷屬物種的甲醇提取物的HPLC譜與乙醇提取物的HPLC譜相似。在化學成份上薯蕷屬物種的甲醇提取物與薯蕷屬物種的乙醇提取物幾乎相同，因此在治療中它們應當提供同樣的活性和效力。實施例3:含有粗提取物(PH)的小鼠詞料的制備將PurinaChow5001(—種可商購的小鼠飼料)碾磨為粉末。將凍干的粗提取物PH以代替相同量的被碾磨的飼料的量加入到所述被碾磨的飼料中，形成詞料混和物。將所述詞料混和物均一地與蒸餾水混和，通過擠壓成型重塑形狀，在微波爐中以適當的功率烘烤2min，并在冷卻至室溫后在-70"C冷凍。在凍干后，將所述飼料混和物制成與最初的PurinaChow飼料非常相似的顆粒。將所述顆粒儲存于-2(TC冰箱。在喂養當天將所述顆粒溫至室溫，并用UV燈輻射在無菌工作臺上滅菌。制備具有不同濃度粗提取物的飼料混和物。實施例4:在隨機擴增多態DNA(RAPD)分析中鑒定薯蕷屬物種DNA提取一種未知薯蕷屬物種(一式二份示于樣品編號100或102)與13種已知薯蕷屬物種的測試組一起進行鑒定，所述己知薯蕷屬物種包括參薯cv.(栽培變種)TainungNo.1(樣品編號1)、甘薯(D^cwea"c"/wta)(樣品編號3)、黃獨(D/oworeaZm仏z/era)(樣品編號4)、參薯cv.8702(樣品編號5)、參薯cv.SanzhiA(樣品編號6)、參薯cv.SanzhiB(樣品編號7)、參薯cv.Dayeshoufeng(樣品編號9)、參薯cv.TainungNo.2(樣品編號10)、參薯cv.Jifa(樣品編號67)、參薯cv.ZhangerNo,2(樣品編號64)、參薯cv.DashanNo.3(樣品編號13)、參薯cv.DashanNo.2(樣品編號12)和參薯cv.Taidong(樣品編號11)，全部在臺灣生長。為了通過測序鑒定薯蕷屬物種，每一種薯蕷屬樣品收集0.2g新鮮葉片并在研缽中與液氮混和碾磨。將碾磨的組織與900|il2%CTAB提取緩沖液(含有1.4MNaCl、lOOmMTris-HClpH8.0、20rnMEDTA和0.2%卩-巰基乙醇)在1.5ml離心管中混和，之后在65X:水浴中溫育30分鐘。之后對樣品離心，并將上清液轉移至含有600pL氯仿/異戊醇(24:l)的干凈管并振蕩直至樣品處于乳化狀態。將樣品進一步離心，并將上清液轉移至干凈管并與40pL10%CTAB(含有0.7MNaCl)和400)iL氯仿/異戊醇(24:l)混和。再次離心樣品，并將上清液(400iiL)轉移至干凈管中并與400^LCTAB沉淀緩沖液混和并置于冰上大約15-20分鐘以沉淀DNA。用400mL高鹽TE(10mMTris-HCl,pH8.0;lmMEDTA;禾卩1MNaCl)和800pL95%乙醇漂洗所述DNA樣品。離心所述DNA樣品，并用400|^75%乙醇進一步漂洗沉淀，之后將所述DNA沉淀重懸于蒸餾并去離子(dd)H20中并儲存于-2(TC。RAPD反應使用隨機RAPD引物SEQIDNO:1(在此情況中是OPA-18(AGGTGACCGT)(OperonTechnologies,USA))在RAPD分析中擴增薯蕷屬物種的基因組DNA。在含有10x緩沖液、2.5mM每種dNTP(dATP,dCTP,dGTP和dTTP)、2.0pM引物(Operon)、5單位7^DNA聚合酶(TaKaRaBiomedicals)和5ng模板DNA的25pL體積中進行聚合酶鏈反應(PCR)。對樣品進行41個由在94'C變性lmin、在36°。退火lmin、在72"C延伸2min組成的循環，以及一個在72'C進行10分鐘的最終延伸循環。在PCR完成后，將10pL反應混和物上樣至含有0.5pg/mL溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠進行電泳。數據分析在凝膠電泳中，在凝膠的第一條泳道(最左邊)和最后一條泳道(最右邊)都上樣DNA分子量標記(M)，例如0X174DNA/Haelll標記(PromegaCo.,USA)，以提供不同大小的參考條帶，例如500bp、1000bp、1500bp、2000bp、2500bp、3000bp、3500bp和4000bp，之后在每一條泳道上樣每種薯蕷屬物種的PCR樣品。從每個樣品擴增的DNA產物的譜用熒光顯象劑顯影，并且用圖像獲取軟件Alphalmager1220獲取攝影圖像。由于測試組的每一種薯蕷屬物種在RAPD指紋中產生其自己的DNA條帶，因此確定本發明的薯蕷屬物種的RAPD指紋以與其他薯蕷屬物種區別。當薯蕷屬物種的基因組DNA用SEQIDNO:9的引物擴增時，特定薯蕷屬物種的指紋包括如下14個DNA條帶428bp、452bp、537bp、602bp、723bp、817bp、934bp、1140bp、1242bp、1478bp、1641bp、1904bp、2151bp和2918bp，當薯蕷屬物種的基因組DNA用SEQIDNO:1的OPA-18引物擴增時，該引物用于鑒定未知薯蕷屬物種(圖2中一式二份示于樣品編號100或102)。也使用Gel-Compar軟件進行了聚類分析或對分析(pairanalysis)以計算兩種薯蕷屬物種之間的相似性指數。用于所述分析的參數來自RAPD指紋。接下來，通過未加權對組算術平均值分析(unweightedpair-groupingmeanarithmeticalanalysis,UPGMA)，用如下方程在聚類分析中計算相似性指數ii<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>其中nxy是薯蕷屬物種x和y的相同DNA條帶的數目，和ny分別是薯蕷屬物種x和y的總DNA條帶(Nei,M.andW.H.Li.1979，MathematicalModelforstudyinggeneticvariationintermsofrestrictionendonucleases，Proc.Natl.Acad.Soc.U.S.A,76:5269-5273)。未知薯蕷屬物種與參薯cv.SanzhiA或參薯cv.ZhangerNo.2具有大約88.9%的相似性指數。進一步地，所述薯蕷屬物種與黃獨或甘薯具有大約37.5%的相似性指數。另外，所述未知薯蕷屬物種與參薯cv.TainungNo.1、參著cv.8702、參暮cv.SanzhiB、參著cv.Dayeshoufeng、參蓄cv.TainungNo.2、參薯cv.DashanNo.3或參薯cv.DashanNo.2具有超過75.5%的相似性指數。基于聚類分析或對分析結果，了解該未知薯蕷屬物種與己知物種不同，而是與參薯(Z)zVwcowaa/ato)亞種更為相似。因此，該未知薯蕷屬物種被命名為參薯cv.Phyto，如在2005年ll月15日提交的美國專利申請Ser.No.11/274,775、2006年3月30日公開的美國專利申請公開No.20060068036Al中描述的那樣，所述公開的文獻通過引用并入本文。實施例5:粗提取物對體外吞噬測定的作用Kupffer細胞的分離和培養對C57BL6/j小鼠腹膜內(ip)注射以1:3的比例混和的Rompim⑧甲苯噻嗪麻醉劑和氯胺酮(S-(+)-氯胺酮)麻醉劑的混和物。每一只小鼠的中心靜脈插入一根聚乙烯導管，用10ml無Ca2+HBSS緩沖液以lml/min的灌注速度對肝臟灌注10分鐘，并用含有0.05%IV型膠原酶的HBSS緩沖液以lmL/min的灌注速度灌注10分鐘以軟化肝組織。切下軟化后的肝組織，清洗并用鑷子切開以從肝組織中釋放細胞懸液。在分離結締組織后，將細胞懸液用#53尼龍網過濾并在30g離心3分鐘。之后將細胞懸液在600g離心5分鐘。棄去上清并在15mLRBC裂解緩沖液中重懸細胞沉淀并使反應進行2分鐘。向細胞懸液中加入15mLRPMI1640培養基并離心，之后在5mLRPMI1640培養基中重懸細胞沉淀并鋪在含有25%(v/v)PercollTM密度梯度培養基的PercolFM溶液頂部。對細胞液進行離心，并收集含有富集的Kupffer細胞的細胞沉淀。用RPMI1640培養基漂洗富集的Kupffer細胞并重懸于無血清的RPMI1640培養基中。12Kupffer細胞的吞噬測定將Kupffer細胞接種于96孔培養板上(4x105細胞/孔)并在添加了10%FCS的RPMI培養基(下文中也稱為10%FCSRPMI培養基)中培養至少24小時。將培養基更換為添加了不同濃度PH(1000嗎/mL，100pg/mL,10pg/mL和lpg/mL)的2%FCSRPMI培養基。在培養2小時后，向每一孔中加入重懸于50plPBS中的liLim大小的FITC珠(5x106/孔)并進一步在37。C培養1.5小時。之后，通過用PBS漂洗四次除去未結合的lpm大小的FITC珠。加入FluoroQuenchTM染料(0.5iiL/孑L)以使從被攝取的lpm大小的FITC珠發射的熒光猝滅。在一小時后用細胞熒光測量儀測量被攝取的1,大小的FITC珠的熒光并用對照組的熒光歸一化以確定相對吞噬指數，如表2所示。表2小鼠Kupffer細胞分組濃度(照/ml)攝取吞噬指數對照2%FCS1陽性對照1001.01(促吞噬肽)101.2*I1.4910001.171001.41"PH101.22"11.25#a.數據用Student'st-檢驗分析。*P<0.05,#P<0.02,**PO.01用不同濃度的粗提取物PH(1000^ig/mL，100昭/mL,10pg/mL和l昭/mL)處理的小鼠Kupffer細胞與沒有進行任何處理的小鼠Kupfifer細胞對照組相比都示出提高的攝取吞噬。不同濃度的能夠促進K邵ffer細胞吞噬的促吞噬肽在此測定中是陽性對照。因此，結果提示薯蕷屬的粗提取物顯著促進小鼠Kupffer細胞的細胞吞噬。實施例6:PH對于相關基因表達的作用從用PH處理的細胞分離總RNA在6孔平板中培養Kupffer細胞。將培養基用無血清培養基替換并維持4小時。分別用濃度為100ng/mL，10|ig/mL和l昭/mL的PH處理細胞48小13時。在用PH處理之后，收集細胞并懸浮于lmLUltraspecTMRNA分離試劑盒(BiotexLaboratoriesInc.(USA))中。通過進行所述試劑盒的標準方案獲得總RNA。定量鑒定所獲得的總RNA。逆轉錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)分析根據如下步驟進行逆轉錄。首先使mRNA通過在26.5DEPC處理過的含有O.lpgoligo-dT、5昭總RNA的無菌反應混和物中在7(TC熱處理10分鐘變性。逆轉錄如下進行向反應混和物中加入4pL10mMdNTP、0.5^1rRNasin、lpiLAMV(禽類成髓細胞性白血病病毒)反轉錄酶(RT)(10單位)和8pl5xRT緩沖液，使得總體積為40iiL，在42"C溫育60分鐘，之后在90"C熱失活5分鐘，從而獲得cDNA產物。接下來，向2.5pLcDNA產物中加入0半10mMdNTP、0.5(iLProzymeDNA聚合酶(ProtechEnterprise,Taipei,Taiwan)(2單位)、2}iL10xProzymeTM緩沖液、引物(1^L的ljag/joL有義DNA和lpL的l嗎4iL反義DNA)和無菌水以使總體積為20pL，并在DNA熱循環儀(Perkin-Elmer-Cetus)中溫育。之后，在變性溫度94°C、退火溫度5CTC和延伸溫度72"C的條件下進行30個循環的PCR反應。用于靶基因(小鼠CD36、小鼠組織蛋白酶和小鼠肝細胞生長因子(HGF))的引物序列包括有義和反義引物列于下面的表3中。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>CD36是一種與已知AGE結合的B型清道夫受體(Vlassaraetal.,JournaloflntemalMedicine251:87-101,2002)。組織蛋白酶D是一種降解AGE的酸性溶酶體蛋白酶(Miyataetal.,TheJournalofBiologicalChemistry272(7):40374042，1997)。HGF在肝臟中由Kupffer細胞產生，是一種促進肝細胞功能的生長因子(Lalanietal.，InternationalJournalofMolecularMedicine15:811-817,2005)。在確定粗提取物PH的作用中，在Kupffer細胞中評估CD36基因(345bp)(參考GeneBankNumber(Accession):NM—007643，稱為基因小家鼠(Musmusculus)CD36抗原(Cd36),mRNA，根據ShoreWa/.,NucleicAcidReasearch,30(8):1767-1773，2002中公開的進行定義)、組織蛋白酶D基因(867bp)(參考GeneBankNumber(Accession):BC54758,稱為小家鼠組織蛋白酶D,mRNA，完全編碼序列)和HGF基因(250bp)(參考GeneBankNumber(Accession):NM—010427.2，稱為小家鼠肝細胞生長因子(HGF)，mRNA,根據Ikarietal.,DevelopmentalDynamics228:173-184，2003中公開的進行定義)的表達模式，同時提供p-肌動蛋白基因(510bp)(參考GeneBankNumber(Accession):NM_007393，稱為小家鼠肌動蛋白，beta,細胞質(Actb):mRNA)的表達作為內部對照。如圖3所示，所述粗提取物增加了組織蛋白酶D以及CD36和HGF在細胞中的表達。同時，所述表達模式顯示與Kupffer細胞的吞噬線性相關。因此，鑒于組織蛋白酶D、CD36和HGF基因的增加的表達，粗提取物PH會明顯地增強AGE的肝清除。實施例7:PH對鏈脲佐菌素(STZ)動物模型的作用STZ小鼠模型在此實驗中選擇8周齡C57BL/6j小鼠。將所述小鼠隨機分組為正常組(沒有STZ誘導的DM(糖尿病)正常小鼠)、對照STZ組(STZ-誘導的DM小鼠)、200mg/kg/日PH組(給予200mg/kg/日PH的STZ-誘導的DM小鼠)和1000mg/kg/日PH組(給予1000mg/kg/日PH的STZ-誘導的DM小鼠)。每一組中有5只小鼠。為了在所述小鼠中誘導DM，第一天以120mg/kg劑量腹膜內(ip)注射STZ(溶于0.3mL0.1M檸檬酸緩沖液，pH4.5)，并且在隨后3天以80mg/kg劑量ip注射。在最后一次注射STZ后，每周監控血漿葡萄糖，選擇具有高血漿葡萄糖水平O400mg/dL)的小鼠作為后續實驗中的STZ誘導的小鼠。用PH喂養PH組小鼠2個月，而對照和正常組小鼠用普通小鼠飼料喂養。兩個月后，評估肝臟和腎臟組織病理學以確定藥物效力。尿白蛋白濃度分析將尿液稀釋IOOX用于蛋白質定量。將牛血清白蛋白(BSA)標準進行系列稀釋(2mg/mL，lmg/mL,500嗎/mL,250嗎/mL,125jig/mL，61.5pg/mL,31.25嗎/mL和Ojig/mL)用于BCA分析。在37卩溫育30分鐘之后，進行O.D.570nm吸收測量，并且進行標準曲線作圖。進行線性回歸分析以獲得定量標準曲線和W值。從所述標準曲線計算總蛋白質濃度。尿白蛋白的ELISA測試將96孔平板的每一個孔用具有固定的總蛋白質含量(100iiLPBS中100嗎總蛋白質)的稀釋的尿液樣品包被并且在4i:儲存過夜。之后用漂洗緩沖液(含有0.05%v/v，Tween20的PBS)漂洗所述尿液樣品四次，之后用5%牛乳在室溫封閉2小時。用所述漂洗緩沖液再次漂洗四次，之后向每一個孔中加入5(HxL抗-MSA多克隆抗體稀釋液(I:IOOO于3%牛乳中)并在室溫溫育2小時。用所述漂洗緩沖液漂洗六次，之后向每一個孔中加入與過氧化物酶偶聯的山羊抗雞IgG稀釋液(I:IOOO于PBS-BSA中)并在室溫溫育2小時。通過與lOOpLlmg/mL鄰苯二胺(于0.1M檸檬酸，pH5.5中)和5pLH202溫育確定結合的過氧化物酶。在10分鐘后通過加入2NNH2S04(20pL/孔)終止反應，在波長490nm通過ELISA讀數計測量吸收并用正常小鼠的平均吸收歸一化以確定相關指數，如表4所示。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>***P<0.001表4所示的結果顯示在給予了200mg/kg/日PH或1000mg/kg/日PH的小鼠中，尿白蛋白水平顯著低于對照組的STZ誘導的小鼠。因此，上述結果提示當給予200mg/kg/日或1000mg/kg/日粗提取物PH時，STZ誘導的小鼠的腎臟功能得到恢復。組織病理學在處死之后，收集小鼠的肝臟和腎臟組織，除去其周圍肌肉組織和結締組織。之后將組織在4%多聚甲醛中固定并用石蠟包埋，然后將所述組織切為切片，每一切片的厚度為5pm。將組織切片在二甲苯中去石蠟并在梯度乙醇(100%乙醇，95%乙醇,80%乙醇)中漂洗，之后用蘇木精和曙紅(H&E)染色。接下來，在光鏡下觀察如上文描述所制備的肝組織切片。圖4A示出了來自正常小鼠的具有肝細胞的健康肝組織切片。參考圖4B，在STZ誘導的小鼠的肝組織切片中發現了一些囊泡，提示在肝細胞中發生脂肪變性。在給予了不同劑量PH的STZ誘導的小鼠中，肝組織被修復，并且以劑量依賴性方式防止了破壞，如圖4C和4D所示，盡管在這些肝組織切片中可能仍舊觀察到輕度的糖原積累。圖5A示出了來自正常小鼠的具有腎小球的健康腎組織切片。在圖5B中，STZ誘導的小鼠的腎組織切片示出了受損腎小球(與正常小鼠的健康腎臟切片對比)。當STZ誘導的小鼠被給予不同劑量PH時，腎組織被修復，并且以劑量依賴性方式防止了破壞，如圖5C和5D所示，盡管在這些腎組織切片中可能仍舊觀察到一些受損的腎小球。實施例8:PH對AGE-BSA小鼠模型的作用小鼠血清制備每兩周通過眼眶放血從小鼠收集全血樣品。使血液在室溫凝固至少2小時，之后離心以獲得血清。將血清在-20。C儲存至進行測定。血清白蛋白純化將小鼠血清在0至4"C保存。沉淀通過在相同溫度在9000g離心15分鐘除去。將上清液用等體積50。/。乙醇(pH6.7)調節至pH6.9并靜置10分鐘，之后進一步在9000g離心15分鐘以獲得上清液的級分I、II和III。將上清液的級分I、II和III用一半體積的70。/。乙醇(pH5.8)再次滴定以調節至pH5.8并靜置10分鐘，之后進一步在9000g離心15分鐘以獲得級分IV沉淀。將級分IV上清液調節至pH4.8，之后在冰上在-5'C靜置60分鐘，并在9000g離心10分鐘以獲得級分V。將級分V冷凍并干燥用于重量分析。AGE-MSA制備將0.1g/mlMSA(小鼠血清白蛋白)和180mg/ml葡萄糖分別溶于磷酸鈉緩沖液(pH7.4)。溶液用0.22pm無菌濾器過濾。將5mL溶液加入至用封口膜(parafibn)密封的15mL試管并在黑暗中在37。C溫育。儲存8周后，將所述溶液在4r用蒸餾水(1/100，v/v)透析3或4次以完全出去葡萄糖。得到的AGE-MSA用0.22jjm無菌濾器過濾，凍干成為粉末并定量，之后重新溶解并儲存于-2(TC。AGE小鼠模型將10周齡C57BL/6J小鼠隨機分組為正常組(沒有任何注射的正常小鼠)、MSA對照組(注射了MSA的小鼠)、200mg/kg/日PH組(給予200mg/kg/日PH的注射了AGE的小鼠)、1000mg/kg/日PH組(給予1000mg/kg/日PH的注射了AGE的小鼠)和AGE-MSA對照組(注射了AGE-MSA以誘導糖尿病血管并發癥的小鼠)。每一組中有5只小鼠。所述小鼠靜脈內注射體積為200|xL的AGE-MSA。給予小鼠八次靜脈內注射，每一次注射含有4mg/次/小鼠對照MSA或AGE-MSA(2次/周，4周)。從第15日給予小鼠含有不同劑量PH的小鼠飼料。兩個月后，處死小鼠并取出它們的肝臟和腎臟用于組織病理學。參考圖6E，在AGE-MSA對照組的小鼠肝組織切片中肝細胞形狀不規則，具有細胞外基質(ECM)積累，提示大量肝細胞被破壞。相反，在得自給予了粗提取物PH的小鼠的肝組織切片中未觀察到這種破壞(圖6C和6D)。因此，證明了粗提取物PH可以使AGE-MSA導致的肝臟破壞最小化。在正常或MSA對照小鼠的腎組織切片中，腎小球保持完好，細胞外基質(ECM)沒有增加(圖7A和7B)。相反，在得自注射了AGE-MSA的小鼠的腎組織切片中觀察到腎小球被明顯破壞并且肥大(圖7E)。當注射了AGE的小鼠被給予不同劑量的PH(200mg/kg/日PH和1000mg/kg/日PH)時，腎組織被修復并恢復如同正常小鼠的腎臟。本領域技術人員應當了解對于上文描述的實施方案可以進行改變而不偏離其廣泛的發明概念。因此，理解本發明不限于公開的特定實施方案，其涵蓋本發明的精神和范圍內的各種修飾，如所附權利要求書所定義。18權利要求1.薯蕷屬物種提取物在制備用于治療糖尿病血管并發癥的藥物中的用途，其中所述藥物以治療有效量給予需要其的對象。2.權利要求1的用途，其中所述薯蕷屬物種提取物通過口服給予。3.權利要求1的用途，其中所述薯蕷屬物種是參薯p/o^w^丄.)cv.Phyto，其特征為當所述薯蕷屬物種的基因組DNA通過SEQIDNO:9的引物擴增時，隨機擴增多態DNA(RAPD)指紋包括如下14個DNA條帶428bp、452bp、537bp、602bp、723bp、817bp、934bp、1140bp、1242bp、1478bp、1641bp、l卯4bp、2151bp和2918bp，當所述薯蕷屬物種的基因組DNA通過SEQIDNO:9的引物擴增時。4.權利要求1的用途，其中所述薯蕷屬物種提取物通過包括如下步驟的方法制備(a)將薯蕷屬物種的塊莖與基于醇的溶劑在存在乙酸的情況下混和以獲得提取組合物；(b)對步驟(a)中獲得的提取組合物進行分離處理以獲得可溶性級分；和(c)從步驟(b)中獲得的可溶性級分中除去溶劑以獲得薯蕷屬物種提取物。5.權利要求4的用途，其中所述基于醇的溶劑是基于甲醇的溶劑、基于乙醇的溶劑或其混和物。6.權利要求1的用途，其中所述薯蕷屬物種提取物通過包括如下步驟的方法制備-(a)將薯蕷屬物種的塊莖浸入1%乙酸溶液中；(b)碾磨乙酸處理過的薯蕷屬物種的塊莖；(C)凍干經過碾磨和乙酸處理過的薯蕷屬物種的塊莖；產生經過碾磨的、凍干的及乙酸處理過的薯蕷屬物種的塊莖；(d)將至少一部分步驟(c)的經過碾磨的、凍干的及乙酸處理過的薯蕷屬物種的塊莖與基于醇的溶劑在存在大約1%乙酸溶液的情況下混和以獲得提取組合物；(e)對步驟(d)中獲得的提取組合物進行分離處理以獲得可溶性級分；和(f)從步驟(e)中獲得的可溶性級分中除去溶劑以獲得薯蕷屬物種提取物。7.權利要求6的用途，其中所述基于醇的溶劑是基于甲醇的溶劑、基于乙醇的溶劑或其混和物。全文摘要本發明提供了一種用于治療糖尿病血管并發癥的方法，包括給予需要的對象治療有效量的薯蕷屬物種提取物。所述提取物優選地通過包括(a)用基于醇的溶劑在存在乙酸溶液的情況下提取薯蕷屬物種的塊莖以形成提取組合物，(b)對步驟(a)中獲得的產物進行處理以獲得可溶性級分，和(c)從步驟(b)中獲得的可溶性級分中除去溶劑以獲得提取物的過程制備。文檔編號A61K36/00GK101500586SQ200780030215公開日2009年8月5日申請日期2007年6月14日優先權日2006年6月14日發明者吳榮燦申請人:國立陽明大學