通過抑制成骨阻抑基因控制骨發生的制作方法

專利名稱：：通過抑制成骨阻抑基因控制骨發生的制作方法通過抑制成骨阻抑基因控制骨發生相關申請的交叉引用本申請要求于2006年8月11日提交的美國申請號60/822,184的權益，將其全部內容作為參考引入本文。
背景技術：
：認為組織-特異性(或成熟)干細胞是正常組織體內穩態和組織修復的來源。它們還為再生醫學提供了巨大前景，這歸因于它們增殖和分化為多種成熟細胞類型的能力。人間充質干細胞(hMSCs)能夠分化為骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、肌肉細胞和神經細胞。然而，沒有很好地理解解釋這些分化過程的分子機制。RNA-介導的干擾(RNAi)是高度保守的基因沉默事件，其通過由同源雙鏈小干擾RNA(siRNA)引起的單獨mRNA革fi破壞起作用(Fire，A.等，^然("AtoM9391:806-811(1998))。已經證明了通過化學合成和經由基于載體的表達系統的體外或體內轉錄生成的siRNA是研究哺乳動物細胞中基因功能喪失的非常有效的工具(Brummelkamp,T.R.等，辟學C"'e"cd296:550-553(2002);Caplen,N.J.等，夷房嵐家辟學腐學叛OVociV^Mc^C/W;98:9742-9747(2001);Elbashir,S.M.等，^然(M^J411:494-498(2001);Lee,N.S.等，^然生激發術A0fec/7"0U20:500-505(2002);Miyagishi,M.等，y^然全激發術OV^5/Wec/z"o〃20:497-500(2002):Paddison,P.J.等，基茵發fTGe"^6:948-958(2002);Paul,C.P.等，^然生激發術r7VW祝ofec/z"o/J20:505-508(2002);Sui，G.等，夷房M^辨學綜學叛CracAto"c^/^SW"&4;99:5515-5520(2002);Yu,J.Y,等，夷房房^^棄學綜學叛(T^ocA^/v4cad&ZL/iSyO99:6047-6052(2002))。雖然成功地在哺乳動物細胞中進行了利用基因組規模siRNA文庫的高通量篩選(Berns,K.等，y^然(7Va"rc,428:431-437(2004);Paddison,P.J.等，^然fVflwre」428:427-431(2004);Zheng,L.等，夷房M^辨學綜學叛OVociVa/3JcaJSc/[75*^0103:135-140(2004))，但是尚未報告陣列合成siRNA文庫在干細胞中的有效應用。能夠容易地從成年人中分離人間充質干細胞(hMSCs)，并迅速體外擴增。由于它們分化為不同成熟細胞類型的能力(Prockop，D.J.^然f激發術(7V^歷ofec/7朋/J20:791-792(2002);Ryan，J.M.等，炎i^^,若(7/"/JawmJ(Lond)2:8(2005))(Campagnoli,C,等，虛,(^/ooJJ98:2396-2402(2001);Dezawa,M.等，辟學Cc/e"cd309:314-317(2005);Dezawa，M.等，aC7/"/m^〃113:1701-1710(2004);Pittenger,M.F.等,辨學r5We"cd284:143-147(1999);Pittenger,M.F.等,翁l銀究fOc/^W95:9-20(2004);Woodbury，D.等，辨經辨學銀究染,吉A^wYwc/7eW61:364-370(2000))，所以探索關于退化性疾病包括骨病癥的以細胞為基礎的治療法的研究者對它們非常感興趣(Dezawa,M.等，辨學J309:314-317(2005);Dezawa,M.等，游^^^^^^志aC//"/"vm〃113:1701-1710(2004);Horwitz,E.M.等，夷,M^搏學綜學叛。rac7Vw/t/W999:8932-8937(2002);Pittenger,M.F.等，薪l,究fOc95:9-20(2004);Prockop，D.J.辨學^'e"ce;>276:71-74(1997))。細胞從干細胞自我-更新到分化的命運轉換不僅涉及正向調節基因，也涉及通常抑制分化的反向調節基因。存在對這樣的方法學的需要，所述方法學影響間充質干細胞，例如向成骨細胞譜系細胞的分化途徑。本發明解決這個以及其他需要。發明簡述本發明提供篩選這樣的試劑的方法，所述試劑通過抑制一種或多種表1中所列出的多肽的活性或表達而促進骨發生。本發明還提供通過抑制一種或多種表1中所列出的多肽的活性或表達而在細胞中促進骨發生的方法。因此，在第一方面，本發明提供用于鑒別促進骨發生的試劑的方法。在一些實施方案中，所述方法包括(a)使多種試劑與表1中所列出的至少一種多肽或多核苷酸相接觸；(b)測量至少一種所述多肽或多核苷酸的活性；(c)選擇所述多種試劑中的至少一種，其中所選擇的試劑抑制至少一4種所述多肽或多核苷酸的活性；和(d)測量所選擇的試劑促進骨發生的能力，由此鑒別促進骨發生的試劑。在一些實施方案中，所述多肽或多核苷酸在宿主細胞中表達。在另一個實施方案中，所述方法包括(a)使多種試劑與表達至少一種選自表1的多肽或多核苷酸的細胞接觸；(b)測量至少一種所述多肽或多核苷酸的表達(即，轉錄或翻譯)；(c)選擇所述多種試劑中的至少一種，其中所選擇的試劑抑制至少一種所述多肽或多核苷酸的表達；和(d)測量所選擇的試劑促進骨發生的能力，由此鑒別促進骨發生的試劑。在所述篩選方法的一些實施方案中，所述測量步驟(b)包括測量轉錄水平。在所述篩選方法的一些實施方案中，所述測量步驟(d)在體外進行。在一些實施方案中，所述測量步驟(d)在體內進行。接觸和測量步驟中使用的細胞可以是原核的或真核的。在一些實施方案中，所述細胞是哺乳動物細胞，例如，干細胞或間充質干細胞。在另一方面，本發明提供用于促進細胞內骨發生的方法。在一些實施方案中，所述方法包括使所述細胞與抑制至少一種選自表l中的基因產物表達的siRNA相接觸。在相關的方面中，本發明提供用于促進細胞內骨發生的方法。在一些實施方案中，所述方法包括使所述細胞與抑制選自表1中的多肽活性的試劑相接觸。關于促進哺乳動物細胞內骨發生的實施方案，在一些實施方案中，在體內執行本方法。在一些實施方案中，在體外執行本方法。在一些實施方案中，先體外后體內執行本方法。在所述篩選和處理方法的一些實施方案中，所述細胞是哺乳動物細胞。在一些實施方案中，所述細胞是干細胞。在一些實施方案中，所述干細胞是間充質干細胞。附圖簡述圖1舉例說明hMSC中的siRNA轉染效率高于90%。被siTOX成功轉染的細胞經歷程序性細胞死亡，而被非-TOXsiRNA轉染的細胞保持存活。圖2舉例說明鑒別和確認誘導hMSC成骨分化的siRNA擊中(hit):a.堿性磷酸酶活性，如通過染色顯示地，與對照siRNA轉染的細胞相比，在擊中siRNA(hitsiRNA)轉染的或OS處理的細胞中受到上調作用。b.早期(Cbfal和Osx但非Dk5)和晚期(Bsp)成骨標記的表達在轉染或OS處理后3天時制備的不同擊中siRNA或OS處理的樣品中受到區別性誘導。c.與擊中siRNA和siCon共-轉染的細胞相比，ALP活性在擊中siRNA和siCbfal共-轉染細胞中降低。d.在siRNA轉染后36小時觀察到靶基因的表達擊倒。OS，成骨分化培養基；Osx，osterix。圖3舉例說明與被siCon轉染的細胞相比，在被精選的擊中siRNA轉染的hMSC中增強的堿性磷酸酶活性染色。圖4舉例說明利用siADK或siCon以及隨后OS連續處理hMSC證明siADK對比siCon對骨細胞成熟的增強作用。2+60S,OS處理從siRNA轉染后2天時開始，并持續6天。類似的縮寫應用于3+50S和4+40S。利用茜素紅溶液染色細胞以獲得磷酸鈣沉積。圖5舉例說明大多數成骨擊中siRNAs增強骨細胞成熟，但是抑制hMSC的脂肪形成分化。a.如通過茜素紅染色所證明地，全部12種選擇的擊中siRNAs,除siMJD和siTBX3夕卜，當與OS處理相結合時，增強骨細胞成熟，b.基于油紅O染色，全部12種選擇的擊中siRNAs,除siGNAS外，抑制在siRNA轉染后第二天受到脂肪形成誘導培養基處理的hMSC的脂肪形成分化。siCon,對照siRNA;OS,成骨誘導培養基；3+90S,OS處理從siRNA轉染后3天時開始并持續9天。圖6舉例說明組合siKCNTl和siSLC12a2轉染對增強由OS誘導的骨細胞成熟過程具有協同效應(茜素紅染)。1+130S，在siRNA轉染后1天時利用OS處理細胞，并且處理持續13天。OS,成骨誘導培養基。圖7舉例說明細胞內cAMP信號傳導在hMSC中的成骨對比脂肪形成分化中起相反的作用。a.腺苷酸環化酶激動劑毛喉素以劑量依賴的方式抑制OS培養基對hMSC的成骨作用(a-c),而腺苷激酶抑制劑5-碘代殺結核菌素增強OS培養基的成骨作用(d-f,g-i)并以劑量依賴的方式抑制hMSC的脂肪形成分化(j-l).a-f，ALP染色；g-i，茜素紅染色;j-l,油紅o染色。b.利用cAMP類似物(DB-cAMP&CPT-cAMP)或IBMX的處理促進hMSC經歷脂肪形成分化，特別是在存在地塞米松(DEX)的條件下。c.通過CPT-cAMP、IBMX或PGE2應用增強的cAMP水平能夠在被OS處理的細胞中將細胞命運決定從成骨轉變為脂肪形成分化。Adipo,脂肪形成的誘導培養基;OS,成骨誘導培養基。圖8舉例說明hMSC的成骨和脂肪形成分化二者都需要CREB活性。a.通過蛋白質印跡檢查CREB蛋白質活性證明了與被siCon轉染的細胞或未處理細胞相比，被擊中siRNA轉染的細胞中增高的pCREB水平。b.被與耙基因中內源CRE競爭的CRE(CREB響應元素)誘殺劑轉染的細胞對脂肪形成誘導培養基(Adipo)或成骨誘導培養基(OS)的刺激具有較低的響應。圖9舉例說明hMSC成骨分化中涉及的另外的信號傳導通路。a.僅在siRNA轉染后第7天或第12天收集的被siMJD和OS處理而非被其他擊中siRNA處理的樣品中誘導了PLZF1的表達。b.由PD98059或SB202190引起的ERK1/2或p38信號通路的抑制分別抑制OS對hMSC的成骨誘導作用。c.p38的磷酸化形式在被siDUSP6轉染的細胞中受到上調。OS，成骨誘導培養基。圖10舉例說明ATP對OS-誘導的hMSC骨發生，以及在與OS處理相結合時，對siP2RY11和siSLC12a2誘導的hMSC骨發生具有劑量-依賴性抑制作用。在siRNA轉染后第3天時加入OS和ATP并持續一周。染色細胞，以獲得堿性磷酸酶活性。OS,成骨誘導培養基。圖11舉例說明siCOMP促進hMSC的脂肪形成和成骨分化。上兩排(第二排圖是相對應上圖的放大圖)顯示siCOMP處理增強由脂肪形成誘導培養基(Adipo)誘導的hMSC脂肪形成。在siRNA轉染后第3天時利用Adipo處理細胞，并且在利用油紅0染色細胞前持續處理12天。下排顯示siCOMP誘導hMSC的成骨分化。在siRNA轉染后9天時測定細胞的堿性磷酸酶活性。OS,成骨誘導培養基。發明詳述I.概述篩選了耙向5,000種人基因的合成siRNA文庫，從而鑒別成骨特化的內源阻抑物，其在沉默時起始hMSC向成骨細胞的分化。該篩選在hMSC中產生53種成骨特化阻抑基因。見，表l。此外，確定cAMP在骨發生對比脂肪形成中起相反的作用。本發明發現了在調整遺傳網絡控制骨發生和在治療骨疾病中的用途。II.定義"骨發生",當用于本文時，指從未分化的干細胞和成骨細胞譜系的細胞向骨細胞增殖和骨組織生長(即，新骨基質的合成與沉積)。骨發生還指祖細胞或前體細胞向骨細胞(即，成骨細胞)的分化或轉分化。祖細胞或前體細胞可以是多能干細胞，其包括，例如，間充質干細胞。祖細胞或前體細胞可以是預-定向為成骨細胞譜系的細胞(例如，前-成骨細胞的細胞)或沒有預-定向為成骨細胞譜系的細胞(例如，前-脂肪細胞或成肌細胞)。術語"試劑"指在本文所述的篩選測定中有效的任何化合物。試劑可以是，例如，有機化合物、多肽(例如，肽或抗體)、核酸(例如，DNA、RNA、雙鏈、單鏈、寡核苷酸、反義RNA,小抑制RNA、微小RNA、核糖核酸酶，等)、寡糖、脂質。通常，本篩選方法中使用的試劑具有小于10,000道爾頓的分子量，例如，小于8000，6000,4000,2000道爾頓。術語"測試化合物"或"藥物候選者"或"調節劑"或語法等價物用于本文時描述任何天然存在的或合成的分子，例如，蛋白質，寡肽(例如，長度為約5-約25個氨基酸，優選地，長度為約10-20或12-18個氨基酸，優選地，長度為12、15、或18個氨基酸)、小有機分子、多糖、脂質，脂肪酸、多核苷酸、RNAi或siRNA、asRNA、寡核苷酸，等。所述測試化合物可以處于測試化合物文庫的形式，諸如提供充足多樣性范圍的組合或隨機化文庫的形式。測試化合物任選地與融合配偶體，例如，耙標化合物、拯救化合物、二聚化合物、穩定化合物、可編址化合物、和其他官能部分相連。常規地，通過識別具有一些理想特性或活性，例如，抑制活性、構建主要8化合物的變體、和評估那些變體化合物特性和活性的測試化合物(叫作"主要化合物")生成具有有效特性的新化學個體。通常，在所述分析中使用高通量篩選(HTS)法。術語"短-抑制RNA"禾B"siRNA"可交替地指介導RNA干擾(也稱為"RNA-介導的干擾，"或RNAi)的短雙鏈RNA寡核苷酸。RNAi是通過由同源雙鏈小干擾RNA(siRNA)引起的單獨mRNA靶破壞起作用的高度保守的基因沉默事件(Fire，A.等，^然O^we9391:806-811(1998))。綜述了RNAi的機制，例如，在Bayne和Allshire,遺傳^^勢0e"A(2005)21:370-73;Morris，細胞分子生命科學(CellMolLifeSci)(2005)62:3057-66;Filipowicz,等，薪/#/|7生激學觀/^fCwre"fQp/w.ow&n/"Mra/(2005)15:331-41中。術語"活性"指對本領域中已知多肽普遍承認的功能。例如，表l中列出的多肽具有普遍承認的酶、受體、細胞黏附分子、細胞內信號傳導介體等的活性。用于測量所列蛋白質活性的測定，包括酶活性測定、受體信號傳導測定、受體-配體結合測定、細胞轉移測定，是本領域中已知的。還可以將蛋白質活性與它的表達，例如，多肽轉錄或翻譯聯系起來。術語"促進"指與未處理的細胞(組織或受試者)相比，在處理的細胞(組織或受試者)中測量的參數(例如，活性、表達、骨發生)的增加。還可以對處理之前或之后的相同細胞或組織或受試者進行比較。該增加足以被檢測到。在一些實施方案中,與未處理的細胞相比，處理的細胞中的增加是至少約50%、60%、70%、80%、90%、1倍、2倍、3倍、4倍或更多。術語"抑制"指與未處理的細胞(組織或受試者)相比，在處理的細胞(組織或受試者)中測量的參數(例如，活性、表達、骨發生)的減小。還可以對處理之前或之后的相同細胞或組織或受試者進行比較。該減小足以被檢測到。在一些實施方案中,與未處理的細胞相比，處理的細胞中的減小是至少約50%、60%、70%、80%、90%、或被完全抑制。在一些實施方案中，與未處理的細胞相比，在處理的細胞中測量的參數是不能檢測到的(即，被完全抑制)。"干細胞"，當用于本文時，指能夠分化成多細胞類型的任何哺乳動物多能(pluripotent)細胞或全能(multipotent)細胞或祖細胞或前體細胞。9適合于用在本發明方法中的干細胞包括能夠分化為成骨細胞譜系的細胞，例如，成骨細胞的那些。本發明方法中使用的合適全能細胞或前體細胞包括，例如，間充質干細胞、前-成骨細胞、前-脂肪細胞、和成肌細胞。"分化(differentiate)"或"分化(differentiation)，"用于本文時，指前體或祖細胞(即，干細胞)分化為特定細胞類型如成骨細胞的過程。能夠通過它們的基因表達和細胞表面蛋白質表達模式來識別分化的細胞。典型地,成骨細胞譜系的細胞表達基因，包括，例如，堿性磷酸酶、I型膠原、骨鈣蛋白、和骨橋蛋白(osteoponin)。典型地，成骨細胞譜系的細胞表達骨特異性轉錄因子，包括，例如，Cbfal/Runx2和Osx(見，例如，Olsen,等，2000，見上和Nakashima等，潘應108(1):17-29(2002)。成骨細胞分化中涉及的其他轉錄因子包括，例如，gsc、Dlxl、Dlx5、Msxl、Cartl、Hoxal、Hoxa2、Hoxa3、Hoxbl、rae28、Twist、AP-2、Mfl、Paxl、Pax3、Pax9、TBX3、TBX4、TBX5、和Brachyury(見,例如，Olsen等，2000，見上)。"轉分化"指預-定向為一種譜系細胞類型的前體或祖細胞(即，干細胞)分化為其他譜系特定細胞類型的過程，例如,前-脂肪細胞轉分化為成骨細胞或成肌細胞轉分化為成骨細胞。能夠通過它們的基因表達和細胞表面蛋白質表達模式來識別轉分化的細胞。典型地，成骨細胞譜系的細胞表達基因，包括，例如，堿性磷酸酶、I型骨膠原、骨鈣蛋白、和骨橋蛋白。典型地，成骨細胞譜系的細胞表達骨特異性轉錄因子，包括，例如，Cbfal/Runx2禾口Osx(見，例如，01sen等，2000，見上和Nakashima等，見上)。成骨細胞分化中涉及的其他轉錄因子包括例如，gsc、Dlxl、Dlx5、Msxl、Cartl、Hoxal、Hoxa2、Hoxa3、Hoxbl、rae28、Twist、AP-2、Mfl、Paxl、Pax3、Pax9、TBX3、TBX4、TBX5、和Brachyury(見,例如，Olsen等，2000見上)。"固體支持物,"當與誘導骨發生相關地用于本文時，指能夠在其上培養干細胞的三維基質或平面表面。所述固體支持物能夠源自天然存在的物質(S卩，基于蛋白質的)或合成的物質。例如，基于天然存在的物質的基質可以由自體骨片段或如例如Clokie等，/W面手術雜志aCram'o/ac.Swgj13(1):111-21(2002)和Isaksson，薪處^"度^V吉潛7^CwWDe脫JSz^p/J84:1-46(1992)中所述的商購骨替代物組成。合適的合成基質記述在，例如,美國專利號5,041,138;5,512,474，和6,425,222中。例如，可生物降解的人10造聚合物，諸如聚乙二醇酸、聚原酸酯、或聚酐可以用于固體支持物。碳酸鈣、文石、和多孔陶瓷(例如，致密的羥基磷灰石陶瓷)也適合用在固體支持物中。聚合物，諸如聚丙烯、聚乙二醇、和聚苯乙烯也能夠用在固體支持物中。典型地，在三維基質固體支持物上培養和分化的細胞在該基質的所有表面上生長，例如，在內部和外部表面上生長。典型地，在平面固體支持物上培養和分化的細胞以單層生長。術語"多種"指兩個或更多。III.篩選促進骨發生的試劑的方法使一種或多種多肽與一種或多種試劑相接觸本發明提供篩選方法，其包括使至少一種表l中列出的多肽與作為抑制一種或多種表l中所列多肽的候選者的一種或多種試劑相接觸。在一些實施方案中，篩選多種不同的試劑，例如，50，100,250,500，1000,10,000或更多種不同試劑。如需要地，所述多肽可以處于宿主細胞中、細胞提取物中或是被純化的(例如，部分地，基本上地或完全地)。當測量，例如，結合活性或酶活性時，可以使用關于表l中多肽的抑制試劑的篩選測定，其中所述多肽不在宿主細胞中。例如，能夠測量候選試劑抑制天然底物或配體結合的能力。在其他實施方案中，能夠測量候選試劑抑制底物的酶消耗或產物積聚的能力。在一些實施方案中，將所述測定設計為通過自動化所述測定步驟和從待測定的任何方便來源提供化合物來篩選大組合文庫,這典型地是平行運作的(例如，在機器人測定中以微滴定形式或在微孔板中)。所述組合文庫可以是完全隨機的，或包括含有基于一種或多種有前景的主要化合物的中心結構的成員。所述組合文庫可以是完全合成的或可以包括一些或全部源自天然存在來源的成員，包括，例如，細菌，真菌，植物，昆蟲和脊椎動物(例如，(青蛙)或J"gm7/a(鰻魚))和無脊椎動物(例如，5Vra^y/oce^ra加(海膽)或軟體動物).也見，Boldi,基f天然產激游jt^游資合游^^成廣Com^"(3ton.a//Syw/Zzes^o/A^a^^a/尸nc/w"5asedZi6nan.&yJ,2006,CRC出版社(CRCPress)。在一個實施方案中，高通量篩選方法涉及提供含有大量潛在治療化合物(潛在調節劑或配體化合物)的組合化學或肽文庫。然后，如本文中所述地，在一種或多種測定中篩選所述"組合化學文庫"或"配體文庫"，從而鑒別顯示理想的特有活性的那些文庫成員(具體地，化學物種或子集)。由此鑒別的化合物能夠起到常規"主要化合物"的作用或其自身能夠被用作潛在的或實際的治療法。組合化學文庫是通過組合大量化學"積木"諸如試劑，由化學合成或生物學合成產生的不同化學化合物的集合。例如，線性組合化學文庫，諸如多肽文庫是通過以各種可能的方式，針對給定化合物長度(即，多肽化合物中氨基酸的數量)，組合一組化學積木(氨基酸)而形成的。數百萬化學化合物能夠通過化學積木的這樣組合混合而合成。制備和篩選組合化學文庫是本領域中技術人員所熟知的。見，例如，美國專利號5,663,046;5,958,792;6,185,506;6,541,211;6,721,665,將其內容作為參考在此引入本文。所述組合化學文庫包括，但不僅限于，肽文庫(見，例如，美國專利號5,010,175;Furka,房尿教,歪A廣,秀染^^7"./力7:487-493(1991);Houghton,等，^然(7Va/M力54:84-88(1991);和資合y^^b^#^;^案廣ComW"aton.a/P印/cfe丄^ra/"7尸ratoco/J,Cabilly版本，1997,Humana出版社。還能夠使用用于產生化學多樣性文庫的其他化學物質。所述化學物質包括，但不僅限于擬肽(例如，PCT公布號WO91/19735)、編碼的肽(例如，PCT公布WO93/20242)，隨機生物-低聚物(例如，PCT公布號WO92/00091)、苯二氮雜萆類(例如，美國專利號5,288,514)、多樣體(diversomer)諸如乙內酰脲、苯二氮雜萆類和二肽(Hobbs等，夷房房家矜學腐學叛Wrac,Ato.^cadt/5^990:6909-6913(1993))、插烯(vinylogous)多肽(Hagihara等，夷房眾學界染,志aC7zem.6bc.力14:6568(1992))、具有葡萄糖支架的非肽肽模擬物(nonpeptidalpeptidomimetics)(Hirschmann等,夷像眾學界森吉CC7zem.Soc.J114:9217-9218(1992))、小化合物文庫的類似有機合成(Chen等，夷房眾學界染志"Ozem.5bcJ116:2661(1994);邀合jt^:合y^'j^遂，應尸ofew"a/J,Cortese版本，1995,WalterDeGruyter公司；禾卩Obrecht禾口Villalgordo,V、分^童眾^激文,游慮沐-支游資合,^療合成Sma〃-vWo/ecMAar-,/g/z/Cbm;xww(i丄Arar;;/esJ,1998,Elsevier禾斗學有限公司(ElsevierScienceLtd))、寡氨基甲酸酯(Cho等，辨學"c/ewce力61:1303(1993))、和/或肽基磷酸酯(Campbell等，有教眾學染,吉aOg.Oze附J59:658(1994))、核酸文庫(見Ausubel,見下，Sambrook和Russell,見下禾口美國專利號6,955,879;6,841,347;6,830,890;6,828,098;6,573,098;禾口6,399,334)、肽核酸文庫(見,例如，美國專利號5,539,083;5,864,010和6,756,199)、抗體文庫(見，例如，Vaughn等，^然全激發術^Vtowe5/otec/2"o/ogyJ,14(3):309-314(1996)和PCT/US96/10287)、碳水化合物文庫(見,例如，Liang等，辨學"c/ewce入274:1520-1522(1996);美國專利號5,593,853;和錄沐支獰激寡獰合成f/7資^薪/大眾^激文,"o/W"6rao^W,Seeberger版本，2004,JohnWiley&Sons(E-book))、小有機分子文庫(見，例如，苯二氮雜萆類，BaumC&EN,l月18日，第33頁(1993)和美國專利號5,288,514;類異戊二烯,美國專利號5,569,588;噻唑烷酮(thiazolidinones)和間噻嗪烷酮(metathiazanones)，美國專利號5,549,974;吡咯烷，美國專利號5,525,735和5,519,134;嗎啉代化合物，美國專利號5,506,337,等)。還見，邀全丈犖設^,伊份，藥激凍紫^游嚴亂教伴工虞、浙應IfComZ>/afon.a/Zj'6rar_yZ)ew'gwaw<i￡Va/wa"ow:尸n'"cz)/es'Sq/h^we7bo&,y^/"c加'oraz'"Z>wgD/scove^J,Ghose，等,版本,2001,MarcelDekker;分f多摔絲，蘊合眾學,文庫浙秀激叛縈。kfo/ecw/wChaiken和Janda,版本，1996,牛津大學出版物(OxfordUnivPr.);,邀版本，2002,Humana出版社。可以商購獲得用于制備組合文庫的裝置(見，例如，觀/e眾學發術6UvawcedC7zem7^c/z^，LouisvilleKY"Symphony,Rainin,Woburn,MA.,應用生物系統(AppliedBioSystems)，FosterCity,CA.,Millipore,Bedford,MA禾卩Caliper生命禾斗學(CaliperLifeSciences),Hopkinton,MA)。在一些實施方案中，能夠在多孔板(例如，96-孔，384-孔，等)上方便地13進行篩選測定，其中分別在單孔中測試每種待篩選的試劑。在一些實施方案中，在單一反應混合物中測試兩種或更多候選試劑。試劑所述篩選方法中使用的試劑可以是，例如，小的有機化合物(例如，分子量小于10,000道爾頓，例如，小于8000,6000，4000,2000道爾頓)、脂質、糖、多肽、核酸(例如，寡核苷酸、DNA、RNA、核糖核酸酶、短抑制RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA),等)。典型地,與細胞接觸的抑制試劑的量是約0.05nM-約50^M,例如，約1nM-約1^M,約0.1)iM-約50pM,或約0.05nM,0.1nM,0.5nM,1.0nM,1.5nM,25nM,100nM,1.0^M，10(iM,或50岸。夯教眾合笏在一些實施方案中，所述一種或多種試劑是小的有機化合物。基本上，在本發明的測定中可以將任何化學化合物作為一種或多種表1中多肽的潛在抑制劑進行篩選。最優選的通常是能夠溶于水性或有機(具體地基于DMSO的)溶液的化合物和符合Lipinski的"第5規則"標準的化合物。將所述測定設計為通過自動化所述測定步驟和從待測定的任何方便來源提供化合物來篩選大化學文庫，這典型地是平行運作的(例如，在機器人測定中以微滴定形式或在微孔板中)。應該理解存在許多化學化合物的供應商，包括西格瑪-奧德里奇(Sigma-Aldrich)(圣路易斯，Mo.);FlukaChemika-BiochemicaAnalytika(Buchs瑞士),以及許多現成可用于篩選的小有機分子文庫供應者，特別包括Chembridge公司(圣地亞哥，CA)、DiscoveryPartenersInternational(圣地亞哥,CA)、Triad治療(TriadTherapeutics)(圣地亞哥，CA)、Nanosyn(MenloPark,CA)、Affymax(PaloAlto,CA)、ComGenex(南舊金山，CA)、Tripos,公司.(圣路易斯，MO)、反應生物公司(ReactionBiologyCorp.)(Maivern，PA)、BiomolIntl.(PlymouthMeeting,PA)、TimTec(Newark,DE)、禾卩AnalytiCon(Potsdam,德國)。多,微沐14在一些實施方案中，所述一種或多種試劑是多肽(包括但不僅限于具有8-30個氨基酸的肽、抗體，等)。有效用于篩選的多肽文庫可商購自許多來源，例如，來自劍橋肽(CambridgePeptides),劍橋，英國；JPT肽技術(JPTPeptideTechnologies),柏林，德國；生物-合成(Bio-Synthesis),Lewisville,TX;和Presrwick化學(PresrwickChemical),華盛頓特區。用于生成肽文庫的方法也是本領域中所熟知的。見，例如，^成^^iv使—賴(&"Ae"cPe/^/w^GWA)，Grant,版本，2002,牛津大學出版社(OxfordUniversityPress);Benoiton,,會成眾學(C7z渭/欣y尸取油6y"r/^s&)，2005，CRC出版社；Jones，富^^^^7i合成"""'"o4c/dad尸印^fe^wAewS),2002,牛津大學出版社(OxfordUniversityPress)。肽合成器可以商購自，例如，TechniKrom,公司，Evanston,IL;應用生物系統(AppliedBioSyst畫),FosterCity，CA;和高級自動化肽蛋白質技術(AdvancedAutomatedPeptideProteinTechnologies)(AAPPT)，Louisville,KY。在一些實施方案中，所述一種或多種試劑是抗體，包括多克隆或單克隆抗體，Fab片段，單鏈抗體(scFv),來自組合文庫的互補區，等。有效用于篩選目的的組合抗體文庫可以獲自MorphoSys,Martinsried/Planegg,德國。用于生成抗體文庫的方法在本領域中是已知的。鄉絲絲微在一些實施方案中，所述一種或多種試劑是抑制性寡核苷酸，包括反義寡核苷酸、核糖核酸酶、短抑制性RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)。隨機化的寡核苷酸文庫可以商購自，例如，完整DNA技術(IntegratedDNATechnologies)(IDT),Coralville,IA;Ambion，Austin,TX禾卩Qiagen,Valencia,CA。在一個實施方案中，所述抑制性寡核苷酸抑制一種或多種表1中列出的多肽的活性或表達水平。發義誠辦"反義"寡核苷酸與編碼其的RNA序列以及DNA序列相對應，其與該反義RNA特異于的具體mRNA分子充分互補，從而導致反義RNA和mRNA之間的分子雜交，以使mRNA的翻譯受到抑制。所述雜交可以發生在體外和體內條件下。所述反義分子必須對靶基因具有充足的互補性，這樣該反義RNA能夠與靶基因(或mRNA)雜交，并且無論該行為處于剪接、轉錄還是翻譯水平，都抑制靶基因表達。在一些實施方案中，所述互補的反義序列長度為約15-30個核苷酸,例如，15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26，27，28,29或30個核苷酸，或更長或更短，如所需地。本發明的反義成分可以能夠與靶cDNA的若干部分的任一個，或與靶mRNA雜交，所述靶cDNA的若干部分包括編碼序列、3'或5'未翻譯區、或其他內含子序列。反義寡核苷酸可以包括能夠與靶DNA的若干部分的任一個，或與靶mRNA雜交的序列，所述耙cDNA的若干部分包括編碼序列、3'或5'未翻譯區、或其他內含子序列。稀劍扁就微siRNA技術涉及能夠發生在真核細胞中的序列-特異性轉錄后基因抑制過程。通常，該過程涉及由與所述序列同源的雙鏈RNA(dsRNA)誘導的特殊序列的mRNA的降解。siRNA可以受到引入或表達相對短的同源dsRNA的影響。為了篩選的目的，用于在轉錄或翻譯水平實施表達抑制的雙鏈寡核苷酸可以具有任何方便的長度。siRNA分子典型地長度為約15-約30個核酸，例如，長度為約19-25個核酸，例如，長度為約15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26，27,28，29,30個核酸。任選地，所述dsRNA寡核苷酸可以包括3'突出端末端。示范性2-核苷酸3'突出端可以由任何類型的核糖核酸殘基組成，并可以由2'-脫氧胸苷殘基組成，這降低RNA合成的成本并能夠增強細胞培養基中和轉染細胞內siRNA的核酸酶抗性(見，Elbashi等，2001,^然411:494-8)。本發明的某些實施方案中還可以使用50、75、100或甚至500對堿基對或更多的較長dsRNA。用于實施抑制的dsRNA的示范濃度是約0.05nM,0.1nM,0.5nM,1.0nM,1.5nM,25nM或100nM，盡管根據受處理細胞的性質、基因靶標和技術人員容易辨別的其他因素可以使用其他濃度。示范性dsRNA可以化學合成或利用合適的表達載體在體外或體內產生。示范性合成的RNA包括利用本領域中已知方法化學合成的21個核苷酸的RNA。優選地，利用本領域中已知方法，對合成的寡核苷酸進行去保護和凝膠-純化(見，例如，Elbashir,等，2001,基茵發廖^^""DevJ15:188-200)。備選地，可以從哺乳動物表達載體轉錄所述dsRNA。以兩種可能的方向位于哺乳動物細胞中所使用的合適啟動子下游的單一RNA靶標應該轉錄該靶標的兩條鏈，從而構建理想靶序列的dsRNA寡核苷酸。應該將任何以上RNA種類設計為包括靶核酸中顯示的核酸序列的一部分。在設計siRNA寡核苷酸中使用的特異性序列可以是所述靶標的表達基因信使內包含的任意連續的核苷酸序列。本領域中已知的程序和運算法則可以用于選擇適當的靶序列。見，位于ambion.com的Ambion網頁。另夕卜,可以利用設計用于預測特定單鏈核酸序列的二級結構的程序，并容許那些序列的選擇可能發生在折疊的mRNA的暴露單鏈區域中，來選擇最佳序列。用于設計合適的siRNA寡核苷酸方法和組合物可以見于，例如,美國專利號6,251,588中，將其內容作為參考引入本文。樣麟纖核糖核酸酶是能夠催化RNA特異性分裂的酶RNA分子。核糖核酸酶分子的組合物優選地包括一種或多種與靶mRNA互補的序列，和眾所周知負責mRNA分裂的催化序列或功能等價序列(見，例如，美國專利號5,093,246,將其全部內容作為參考引入本文)。設計用于催化地分裂靶mRNA轉錄物的核糖核酸酶分子還可以用于阻止該耙mRNA的翻譯雖然在位點-特異性識別序列處分裂mRNA的核糖核酸酶可以用于破壞耙mRNA，但是優選使用錘頭核糖核酸酶。錘頭核糖核酸酶分裂位于由與耙mRNA形成互補堿基對的旁側區指示的位置處的mRNA。優選地，所述靶mRNA具有下列兩個堿基的序列5'-UG-3'。錘頭核糖核酸酶的構建和產生是本領域中眾所周知的.。靶向核糖核酸酶的基因必要地含有與靶mRNA的兩個區域互補的雜交區，其中每個區域長度為至少5個連續核苷酸和優選地每個為6,7，8,9,10,11,12,13,14，15,16,17,18,19或20個連續核苷酸。另外，核糖核酸酶具有高度特異性內切核糖核酸酶活性，其自催化地分裂靶點有義mRNA。17對于反義，可以使用siRNA或核糖核酸酶寡核苷酸，硫代磷酸寡核苷酸。磷酸二酯連接以及雜環或糖的修飾可以提供增高的效率。硫代磷酸酯用于修飾所述磷酸二酯連接。已經將N3'-P5'氨基磷酸酯連接描述為針對核酸酶穩定寡核苷酸并增加與RNA的結合。肽核酸(PNA)連接是核糖和磷酸二酯主鏈的完全替代，并且對核酸酶穩定，增加針對RNA的結合親和性，且不容許由RNA酶H引起的分裂。其基本結構還依從可以容許其最優化為反義成分的修飾。關于所述雜環的修飾，已經證明了某些雜環修飾在不干擾RNA酶H活性的條件下增加反義作用。所述修飾的實例是C-5噻唑修飾。最后，還可以考慮所述糖的修飾。2'-0-丙基和T-甲氧基乙氧基核糖修飾在細胞培養中和體內針對核酸酶穩定寡核苷酸。可以通過直接轉染或經由表達載體的轉染和表達將抑制性寡核苷酸遞送到細胞中。合適的表達載體包括哺乳動物表達載體和病毒載體，在其中己經克隆了具有包括啟動子的合適的調控序列的抑制性寡核苷酸，從而導致反義RNA在宿主細胞中的表達。合適的啟動子可以是組成型的或發育-特異性啟動子。轉染遞送可以通過本領域中已知的脂質體轉染試劑(例如，Xtreme轉染試劑，羅氏(Roche)Alameda，CA;Lipofectamine制劑，Invitrogen，Carlsbad,CA)實現。由陽離子脂質體，由反轉錄病毒載體介導的遞送和直接遞送是有效的。另一種可能的遞送模式利用抗體靶向關于靶細胞的細胞表面標記。細胞在一些實施方案中，一種或多種表1中的多肽是在宿主細胞內。可以在任何能夠內源或重組表達一種或多種多肽的細胞內測量一種或多種表1中的多肽的活性。所述細胞可以是原核的或真核的。示范性細胞包括細菌細胞(例如，大腸桿菌(￡.co//)、芽孢桿菌(&"'//^))、植物細胞(例如，擬南芥(力raZ^o;^)、蕓苔屬(5ra孤'ca)、煙草)，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞。多肽在不同宿主細胞系統中的重組表達是本領域中已知的。見，例如，Sambrook和Russell,分子克隆實驗室手冊(MolecularCloning:ALaboratoryManual),第3版，2001,冷泉港實驗室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress);Ausubel,等,現代分子克隆方案(CurrentProtocolsinMolecularCloning),1987-2006,JohnWileyInterscience。適合于重組表達一種或多種表1中多肽的宿主細胞和表達載體可商購自，例如,Invitrogen,Carlsbad,CA;普洛麥格(Promega),Madison,WI;禾口Qiagen,Valencia,CA。在一些實施方案中，所述哺乳動物細胞可以是干細胞，典型地，是間充質干細胞(MSCs)、前-成骨細胞、或其他譜系的細胞，諸如，例如，前-月旨肪細胞或成肌細胞。描述了用于分離和分化人和動物MSC的方法(見，例女口，美國專利號5,942,225和5,486，359;和Pittenger等，棄學C"'ewcd284:143(1999))。間充質干細胞("MSC")能夠分化為間充質細胞譜系，包括骨、軟骨、脂肪、肌肉、基質，包括造血支持基質、和腱，并在修復和再生中起重要作用(見，例如，Olsen,2000，潘應浙發,主激學年^^祭述"肌Ce〃Dev.所o/J16:191)。如例如，美國專利號5,643,736中所述，MSC是通過由獨特的單克隆抗體確定的特異性細胞表面標記來識別的。能夠通過從骨髓或其他MSC源中的其他細胞中分離多能間充質干細胞而獲得人間充質干細胞(MSC)。骨髓細胞可以獲自髂嵴、股節、脛骨、脊骨、肋骨或其他髓質空間。人間充質干細胞的其他來源包括胚胎卵黃囊、胎盤、臍帶、胎兒和青少年的皮膚、血液、脂肪組織、和肌肉衛星細胞。典型地，在含有生長因子的培養基中培養來自含有間充質干細胞的組織樣本的細胞，所述生長因子(1)刺激間充質干細胞生長但不分化，且(2)僅容許間充質干細胞與底物表面選擇性黏附。將細胞培養一段合適的時間后，可以從底物表面除去非-黏附的物質，由此提供擴大的間充質干細胞群。因此，能夠通過正向選擇黏附的骨髓或骨膜細胞獲得同源MSC群，所述骨髓或骨膜細胞不具有與造血細胞或分化的間充質細胞相關的標記。將要分化為成骨細胞譜系細胞的細胞可以獲自任何適當的哺乳動物。例如，所述細胞可以獲自嚙齒動物，包括，例如，小鼠、大鼠、豚鼠、和兔;非-嚙齒類哺乳動物，諸如，例如，貓、狗、豬、綿羊、馬、牛、和山羊；靈長類，包括，例如，黑猩猩和人。待分化細胞可以是原代細胞或可以是保持在培養物中的細胞。如果將細胞保持在培養物中，則它們在例如培養的第5代和第15代之間，與本發明的化合物/組合物相接觸。用于構建原19代細胞培養物以用于本發明的方法的技術和方法是本領域中技術人員已知的(見，例如，Humason,動^^資l^^術64m'wa/7!^werec/zm々z/^J,第4版，W.H.Freeman和Company(1979),和Ricciardelli,等,(1989)沐//潘應浙發,主激學(7"附raCe〃Dev,所o/J25:1016)。通用培養方法培養表達表1中的一種或多種多肽的宿主細胞利用細胞培養領域中的常規技術。本領域中的技術人員能夠利用已知的方法學確定合適的細胞培養方法和條件(見，例如，Freshney等，動激潘應薦養(CWft^eo/J"/ma/Ce〃)(第4版，2000);Ausubel,等，見上；Sambrook和Russell,見上；虔蟲潘應潛秉.基欲,應l方,(/rae"Ce〃CW/wmsv尸訓t/a膨"to/朋dJ/;/zWA/ecG),Vlak,等版本，1996,Kluwer學院出版社(KluwerAcademicPub.);和Evans，等，澄激潘應潛養(P/aWCe〃C"http://")，2003,Taylor&Francis。通常，細胞培養環境包括考慮這樣的因素，如用于細胞生長的基底、細胞密度和細胞收縮、氣相、培養基、和溫度。按照本發明的方法，可以使用塑料培養皿、燒瓶、或滾筒瓶培養細胞。合適的培養容器包括，例如，多孔平板、培養皿、組織培養管、燒瓶、滾筒瓶，等。測量多肽的活性或表達水平按照基于多肽的已知功能的方法，可以測量表1中列出的任一種多肽的活性。例如，對于具有己知酶活性(例如，腺苷酸環化酶、腺苷激酶、絲氨酸/蘇氨酸激酶、磷脂酶)的多肽，可以測量酶反應中的底物消耗和/或產物累積。對于作為已知受體(例如，嗅覺受體、整聯蛋白、鉀通道)的多肽，可以測量下游細胞內信號傳導或與配體的結合。所述測定是本領域中已知的。按照本領域中熟知的方法，可以測量表l所列多肽的表達水平，并記述在本文中。可以在轉錄和/或翻譯水平上測量表達的水平。在翻譯水平上,可以利用免疫測定包括免疫組化染色、蛋白質印跡、ELISA等，使用與特定蛋白質或其片段選擇性結合的抗體，測量一種或多種表1所列蛋白質的20表達。在免疫測定中利用蛋白質4寺異性抗體檢測蛋白質是本領域中已知的(見，例如，Harlow&Lane,，;/歷貧沐,^^邀宜手，(爿"/6o^'^:爿Z^6ora一'A/謹a/)(1998);Coligan，等，版本.，^#,資學方案(C鮮e"f尸ratoco/s/"/mm朋o/ogy)(1991-2006);Goding，卓^^摩貧沐.'^"遭f〃^"應(Mowoc/oa/Jwri6odz'es:/W"ci^/esadPrac"ce)(第3版，1996);禾卩Kohler&.Milstein,爐(淑臟)256:495-497(1975)。在轉錄水平上，可以通過例如，擴增，例如PCR、LCR，或雜交測定，例如，RNA雜交、RNA酶保護，或點印跡檢測mRNA，所有方法都是本領域中己知的。例如，利用直接或間接標記的檢測試劑，例如熒光或放射標記的核酸、放射或酶標記的抗體檢測蛋白質或mRNA的水平。這些測定是本領域技術人員所熟知的，且記述在，例如Ausubel,等，版本，苦,分7壘激學;^案(Cwm7Protocol/"Mo/ecw/w5/o/ogy)(1987-2006)中。還可以利用啟動子-報告基因基因融合構建體測量轉錄水平的調節(例如,增高或降低)。例如，編碼表1中多肽的基因的啟動子區域能夠與產生可檢測信號的多肽的編碼序列融合(即，可操作地連接)。報告基因構建體是本領域中熟知的。示范性報告基因序列包括，例如，熒光蛋白質(例如,綠色、紅色、黃色)、磷光蛋白質(例如，螢光素酶)、抗生素抗性蛋白質(例如，(3-內酰胺酶)、酶(例如，堿性磷酸酶)。選擇抑制所述多肽活性的試劑能夠通過與不與一種或多種候選試劑接觸的相同多肽的多肽活性比較，測量一種或多種表1所列的多肽的多肽活性的抑制(細胞內或外)。與未處理樣品相比，處理的樣品(或反應混合物)中受抑制的多肽活性應該是，例如，至少約10%、25%或50%。在一些實施方案中，與未處理樣品中的多肽活性相比，多肽活性可以被抑制至少約60%、70%、80%、90%、或甚至被完全抑制。類似地，能夠通過與相同多肽在不和一種或多種候選試劑接觸的細胞中的多肽表達水平進行比較，測量一種或多種表1所列的多肽的多肽表達的抑制。在一些實施方案中，與未處理細胞相比，處理的細胞中受抑制的多肽表達水平應該是，例如，至少約10%,25°/。或50%。在一些實施方案中,與未處理細胞中的多肽表達水平相比，多肽表達水平可以被抑制至少約60%,70%,80%，90%,或甚至被完全抑制。在其他實施方案中，將在一種或多種測試試劑存在下的多肽活性或表達的抑制與在己知抑制劑存在下的多肽活性或表達水平相比較。在這種情形中，相同或相似的多肽活性或表達水平表示所述一種或多種測試試劑是抑制劑。在一些實施方案中，可以通過向不重組或內源表達任何一種表1中的多肽的細胞施用試劑，來測量該抑制試劑的選擇性或特異性。特異性抑制表1中的多肽的試劑通常不應該在不表達所述多肽的細胞中引起任何可檢測的響應。檢測骨發生可以利用本領域中己知的任何方法在體外或體內檢測骨發生的誘導。例如，通過檢測成骨細胞-特異性蛋白質的表達，檢測骨-特異性轉錄因子的表達，和檢測骨密度的變化進行。成骨細胞-特異性蛋白質包括，例如，堿性磷酸酶(ALP)、I型膠原、骨鈣蛋白、和骨橋蛋白(見，例如，01sen等，潘應f〃發,f激學牟^^貢述Ce〃.Dev.歷o/.)16:191(2000))。在一些實施方案中，將堿性磷酸酶的表達作為骨發生的指示劑進行檢測。骨特異性轉錄因子包括，例如，Cbfal/Runx2,gsc,Dlxl,Dlx5，Msxl,Cartl，Hoxal,Hoxa2,Hoxa3,Hoxbl，rae28,Twist,AP陽2，Mfl,Paxl,Pax3,Pax9,TBX3,TBX4,TBX5,禾BBrachyury(見，例如，Olsen等，2000，見上)。典型地，將Cbfal/Runx2的表達作為骨發生的指示劑進行檢測。檢測成骨細胞-特異性蛋白質可以通過測量成骨細胞-特異性蛋白質或mRNA的水平，檢測成骨細胞-特異性蛋白質的表達。可以利用免疫測定包括免疫組化染色、蛋白質印跡、ELISA等，使用與特定成骨細胞特異性蛋白質或其片段選擇性結合的抗體，方便地測量特定成骨細胞-特異性蛋白質的水平。在免疫測定中利用蛋白質-特異性抗體檢測蛋白質是本領域中技術人員已知的(見，例如,Harlow&Lane,浙y^貧沐'實殺室手，(爿"幼O(iZasv爿Z^oratoryMa"薦/)(1998);Coligan,等，版本，當^"克疫^^;^案(O^reWPratoco/s/mm,o/ogy)(1991-2006);Goding,卓克蘑貧體.'C7kfo"oc/o"a/J/W6c^/e5../V/"c^/ay尸rac".ce)(第3版，1996);禾卩Kohler&Milstein，應然(A^wre)256:495-497(1975)。為了測量mRNA,擴增，例如，PCR、LCR,或雜交測定，例如,RNA雜交、RNA酶保護、點印跡是優選的。例如，利用直接或間接標記的檢測試劑，例如熒光或放射標記的核酸、放射或酶標記的抗體檢測蛋白質或mRNA的水平。這些測定是本領域技術人員所熟知的，且記述在，例如Ausubel,等，版本，^薪分f生激^^案(Cwm7/尸ratoco/s/"Mo/ecw/"r5/o/ogy)(1987-2006)中。典型地，成骨細胞特異性-蛋白質，即堿性磷酸酶的表達用于檢測分化的成骨細胞。堿性磷酸酶(ALP)的表達與骨發生相關聯。ALP將無機焦磷酸鹽水解為磷酸鹽，并促進骨基質中形成羥磷灰石晶體。ALP的失活性突變導致軟骨病，其特征在于很差礦化的骨和頻繁的骨折，這說明ALP在骨形成中起顯著作用(見，例如,Hessle,等，夷房房家辨學腐學叛(尸腦.A^/.Jo^.Sd.99:9445(2002))。ALP是高活性且穩定的酶，這使得直接測定其酶活性很方便。另外，細胞的直接組化染色能夠方便地用于檢測ALP。還通過檢測細胞外基質(ECM)礦化，來檢測骨發生。如本文中所述地，可以通過用茜素紅溶液染色細胞，來檢測與ECM礦化相關的磷酸鈣沉積。然后可以評估紅色染色的范圍和強度。艨活絲對于ALP活性的直接測定，可將細胞涂布在多孔平板(例如，96-孔、384-孔、1536-L)上，并用合適量的一種或多種候選試劑單獨地或與其他生長因子(例如，BMP-4)—起對其進行處理，并然后在37t:，5。/。C02條件下培養。在一段合適的培養時間后，除去培養基，并將裂解緩沖液加入到每個孔中。在裂解緩沖液中培養一段合適的時間后，將堿性磷酸酶底物溶液(例如，2'-[2'-苯并噻唑基]-6'-羥基苯并噻唑磷酸酯(BBTP))加入到每個孔中。在室溫下培養一段合適的時間后，利用本領域中已知的方法，在平板讀數儀上對平板進行讀數。23對于檢測ALP的細胞直接免疫組化染色，將細胞以合適的密度接種到多孔測定平板中，并用合適量的候選試劑單獨地或與其他生長因子(例如,BMP-4)—起對其進行處理一段合適的時間。然后將細胞固定在10%福爾馬林溶液中。再次清洗固定的細胞并利用本領域中技術人員己知的方法(見，例如，Harlow&Lane,見上；Coligan，見上；Goding，見上；，HKohler&Milstein,見上)，用特異于ALP的試劑(例如，特異于ALP的抗體或比色ALP底物)對其進行染色。獲取細胞的照相圖像并從該圖像手工計數ALP陽性細胞。檢測骨4寺異性轉錄因子利用報告基因測定檢測骨-特異性轉錄因子的表達。這些測定是本領域中技術人員所熟知的，并且記述在，例如，Ausubel，等，見上中。檢測骨特異性轉錄因子Cbfal/Runx2的表達水平可以用于檢測骨發生。Cbfal/Runx2在成骨細胞分化中起重要作用。缺乏Cbfal/Rimx2基因的轉基因小鼠出生后不久死亡，這歸因于缺乏骨的形成(見，例如，Ducy等，一智應(CW/)89:747(1997)和Komori等，潘應(CW/)89:755(1997))。報告基因，包括例如，氯霉素乙酰轉移酶、螢火蟲螢光素酶、細菌螢光素酶、熒光蛋白(例如，綠色、黃色、紫色),或(3-半乳糖苷酶，可以用在報告基因測定中。典型地，將報告基因構建體瞬時或穩定地轉染到細胞中。典型地，通過PCR的合適引物擴增相關基因(例如，Cbfal/Runx2)的啟動子區域。將由此產生的PCR產物插入合適的克隆載體中，擴增并測序。利用適當的限制性酶消化由此產生的質粒，并將由此產生的片段插入到包含報告基因的載體中。斷機游潘應對于利用瞬時轉染的細胞進行的報告基因測定，將細胞以合適的密度(例如，約30,000個細胞/孔)接種到處于生長培養基中的多孔平板中，并培養一段合適的時間。利用合適的轉染試劑，將質粒DNA轉染到該細胞中。一段合適的時間(例如，約8小時)后，將轉染的細胞涂布在多孔測定平24板(例如，Corning)中，并合適量的候選試劑進行處理。培養細胞一段合適的時間(例如，數天，例如，2，3或4天)后，然后利用本領域中技術人員已知的方法測定細胞中報告基因的活性。穩定機游潘應對于利用穩定轉染的細胞進行的報告基因測定，將細胞以合適的密度(例如，約30,000個細胞/L)接種到處于生長培養基中的多孔平板中，并培養一段合適的時間。利用合適的轉染試劑，將合適量的報告基因質粒和包含可選擇標記的(例如,抗生素抗性基因)的載體共-轉染到該細胞中。一段合適的培養時間后，將細胞接種到培養皿中，并將合適量的抗生素加入到培養基中。以合適的間隔添加新鮮的抗生素。匯集抗生素抗性集落，從而產生穩定轉染的細胞。將轉染的細胞涂布在多孔測定平板(例如，Corning)中，并用合適量的候選試劑進行處理。培養細胞一段合適的時間(例如，數天，例如,2，3或4天)，然后利用本領域中技術人員已知的方法測定細胞中報告基因的活性。本發明的篩選方法是恰當的高通量篩選。利用多孔平板(例如,96-孔、192-孔、384-L、768-孔、1536-孔，等)和自動化系統能夠同時篩選許多試劑。本篩選方法中使用的自動化系統購自，例如，Thermo實驗室系統(ThermoLabSystems),Waltham,MA;Caliper生命科學(CaliperLifeScience),Hopkinton,MA;BeckmanCoulter,公司,Fullerton，CA;禾口Invitrogen公司,Carlsbad,CA。IV.向細胞遞送siRNA寡核苷酸的方法可以將包括一種或多種抑制一種或多種表1所列多肽的siRNA寡核苷酸的組合物遞送到哺乳動物細胞中，以促進骨發生。能夠利用本領域中熟知的和本發明描述的方法，使所述細胞與一種或多種siRNA寡核苷酸進行體外、先體外后體內或體內的接觸。在一些實施方案中，使哺乳動物細胞與包括一種或多種siRNA序列的組合物相接觸，所述siRNA序列抑制一種或多種表1所列多肽的表達。在一個實施方案中，使哺乳動物細胞與包括一種或多種siRNA寡核苷酸的組合物相接觸，所述siRNA寡核苷酸抑制一種或多種選自由下列各項組成的組中的多肽的表達GNAS(人GNAS復合基因座，轉錄變體3(如2007年8月9日)、Gsa亞基的同種型b，NM—080426)、ADCY8(腺苷酸環化酶8，NM—001115)、ADK(腺苷激酶,NM—001123)、P2RY11(嘌呤能受體P2Y,G-蛋白質偶聯的,11,NM—002566)、TBX3(T-盒3或尺乳綜合癥(ulnarmammarysyndrome),NM—005996)、BIRC4(含有桿狀病毒IAP重復4，NM_001167)、BCL2L2(BCL2-樣2，NM—004050)、SLC12A2(溶質載體家族12，成員2,NM—001046)、KCNT1(鉀通道，亞家族T,成員1,XM_029962.2)、GBDRl(與推定的神經膠質胚細胞瘤細胞分化相關的,NM—016172)、DUSP6(雙特異性磷酸酶6，NMJ)01946)和MJD(神經系統亞速爾病或共濟失調蛋白3，NM—004993)。在一些實施方案中，使哺乳動物細胞與包括一種或多種表1所列的siRNA寡核苷酸序列的組合物相接觸。為了向細胞的體外或體內遞送，組合物可以包括一種或多種用于直接轉染的siRNA分子，例如，處于雙鏈或發夾構型的。備選地，組合物可以包括一種或多種載體，例如，質粒哺乳動物表達載體或病毒表達載體，所述載體表達一種或多種siRNA序列，例如，處于雙鏈或發夾構型的。為了轉染，包括一種或多種siRNA分子(在載體內或無載體)的組合物可以包括用于向受試者施藥的包括脂質體的遞送賦形劑、載體和稀釋劑以及它們的鹽，和/或可以存在于藥用制劑中。關于核酸分子遞送的方法記述在，例如，Gilmore,等，^蕨秀激遂送(CwrDrwgDe/z'vez);)(2006)3:147-5和Patil,等，X4尸S^V志UJ尸SJow77a/)(2005)7:E61-E77中，將其中每篇作為參考引入本文。siRNA分子的遞送還記述在數篇美國專利公布中，包括例如，2006/0019912;2006/0014289;2005/0239687;2005/0222064;和2004/0204377,將其中每篇的內容在此作為參考引入本文。可以用本領域中技術人員已知的多種方法向細胞施用核酸分子，所述方法包括，但不僅限于，脂質體中的包封，通過離子電滲療法，通過電穿孔,或通過結合到其他賦形劑中，所述賦形劑包括可生物降解的聚合物、水凝膠、環糊精(見，例如Gonzalez等，1999,生激綴會眾學(5/oco">gWeC/zem.),10,1068-1074;Wang等，國際PCT公布號WO03/47518和WO03/46185)、聚(乳-共-乙)酸(PLGA)和PLCA微球體(見例如美國專利號6,447,796和美國專利申請公布號2002/130430)、可生物降解的納米膠囊、和生物粘著微球體中，或通過蛋白質樣載體(O'Hare和Normand,國際PCT公布號WO00/53722)。在另一個實施方案中,還可以利用聚乙烯亞胺及其衍生物，諸如聚乙烯亞胺-聚乙二醇-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-GAL)或聚乙烯亞胺-聚乙二醇-三-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-triGAL)衍生物，配制或復合本發明的核酸分子。本發明使用的脂質體轉染試劑的實例包括，例如CellFectin,即陽離子脂質N,NI,NII，NIII-四甲基-N,NI,Nil,NIII-四棕櫚基-精胺和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)(GIBCOBRL)的1:1.5(M/M)脂質體制劑；CytofectinGSV,即陽離子脂質和DOPE(Glen研究)的2:1(M/M)脂質體制劑;DOTAP(N-[1-(2,3-二油酰氧)-N,N,N-三-甲基-甲硫酸銨)(BoehringcrManheim);Lipofectamine,即聚陽離子脂質DOSPA和中性脂質DOPE(GIBCOBRL)的3:1(M/M)脂質體制劑；和(5)siPORT(Ambion);HiPerfect(Qiagen);X-tremeGENE(羅氏)；RNAi載體(Epoch生物實驗室)和TransPass(新英格蘭生物實驗室(NewEnglandBiolabs))。在一些實施方案中，將siRNA序列遞送到克隆了哺乳動物表達載體的細胞中。適合于siRNA表達的哺乳動物表達載體商購自，例如，Ambion(例如，pSilencer載體)，Austin,TX;普洛麥格(Promega)(例如，GeneClip,siSTRIKJE,SiLentGene),Madison,WI;Invitrogen,Carlsbad,CA;InvivoGen,圣地亞哥，CA;和Imgenex，圣地亞哥，CA，典型地，用于轉錄siRNA分子的表達載體應該具有U6啟動子。在一些實施方案中，將siRNA序列遞送到克隆了病毒表達載體的細胞中。適合于向細胞遞送siRNA分子的病毒載體包括腺病毒載體、腺伴隨載體、和反轉錄病毒載體(包慢病毒(lentiviral)載體)。為了遞送和表達siRNA寡核苷酸而開發的病毒載體可以商購自，例如，基因檢測(GeneDetect)，Bradenton,FL;Ambion,Austin,TX;Invitrogen,Carlsbad,CA;開方文生物系統(OpenBioSystems),Huntsville，AL;禾卩Imgenex，圣地亞哥，CA。V.施藥和配制27抑制一種或多種表1所列的多肽活性和/或表達的試劑(例如，siRNA、有機化合物、多肽)能夠用于在哺乳動物細胞中誘導骨發生。使哺乳動物細胞與抑制試劑相接觸，隨之該哺乳動物細胞分化為成骨細胞譜系的細胞。該哺乳動物細胞能夠與抑制試劑(或其組合物)在體內，先體外后體內(均記述如下)或體外(如上所述)相接觸。體內誘導骨發生抑制試劑及其組合物能夠方便地用于在體內誘導骨發生。將本發明的化合物和組合物，以有效誘導哺乳動物細胞分化為成骨細胞譜系的細胞的量，施用于個體，例如,哺乳動物諸如人。由于它們誘導骨發生的能力，抑制試劑有效治療骨病癥和疾病，包括骨質疏松癥、佝僂病、軟骨病、麥_奧綜合癥，和佩吉特病。在一個實施方案中，本發明的化合物和組合物用于治療骨質疏松癥。在一個實施方案中，本發明的化合物和組合物用于增加骨密度。在一個實施方案中，本發明的化合物和組合物用于增加骨密度和減少骨流失。在一些實施方案中，所述藥物組合物包括一種或多種選自表1所列的那些的siRNA寡核苷酸。本領域中的技術人員應該理解本發明組合物能夠單獨或與其他化合物和治療方案組合使用，從而誘導骨發生。例如，所述抑制試劑可以與骨形態發生蛋白("BMPs")或影響骨再造周期的其他抗-再吸收藥物聯合施用。合適的骨形態發生蛋白包括，例如，BMP-2，BMP-4,和BMP-7。合適的抗-再吸收藥物包括，例如，二膦酸鹽，諸如，例如，阿侖膦酸鈉和利塞膦酸鈉;激素，包括，例如，降鈣素和雌激素，和選擇性雌激素受體調節劑，包括,例如，雷洛昔芬。應該通過伴隨施用所述組合物的任何不利副作用的存在、性質、和范圍；所述組合物的LD50;和所述組合物在不同濃度時的副作用來確定所述組合物的有效量。典型地，施用的組合物的量應該在約0.01-約20mg/kg的范圍內，例如約0.05-約15mg/kg，例如約0.1-約10mg/kg體重。通常，最初施用較低劑量，并逐漸遞增直到達到適合的有效劑量。可以例如，口服或腸胃外，例如，靜脈內、肌肉內、腹膜內、皮下施用組合物，或直接施用到骨組織中。口服施藥是優選的施藥方法。所述化合28物制劑可以存在于單一-劑量或多-劑量的密封容器，諸如安瓿和小瓶中。在一些實施方案中，通過可植入的泵遞送所述組合物。典型地，在向個體或受試者施藥前，利用藥用載體配制本發明的組合物。可以部分地通過被施用的具體組合物，以及通過用于施用所述組合物的具體方法，確定藥用載體。因此，存在廣泛多樣的本發明藥物組合物的合適制劑(見，例如，劍藥棄學/〃實應(ie""'"gto":T7ze&^"cea"c/尸ra"/ceo/尸/wrmac;K),費城禾斗學大學(UniversityoftheSciencesinPhiladelphia)，第21版，2005，Lippincott,Williams&Wilkins)。適合于口服施藥的制劑可以由下列各項組成(a)液體溶液，諸如混懸在稀釋劑中的有效量的所述化合物或組合物，所述稀釋劑包括水、鹽水或PEG400;(b)膠囊劑，香囊劑或片劑，各含有預定量的有效成分，如液體、固體、顆粒或明膠；(c)處于合適的液體中的混懸液；和(d)合適的乳劑。片劑形式可以包括下列各項中的一種或多種乳糖、蔗糖、甘露糖、山梨糖醇、磷酸鈣、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、微晶纖維素、明膠、膠狀二氧化硅、滑石、硬脂酸鎂、硬脂酸，和其他賦形劑、著色劑、填充劑、粘合劑、稀釋劑、緩沖劑、濕潤劑、防腐劑、調味劑、染料、崩解劑、和藥物相容的載體。錠劑形式除包括活性成分、本領域中已知的載體外，可以包括處于調味劑，例如，蔗糖中的活性成分，以及包含處于惰性堿，諸如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯樹膠乳劑、凝膠等中的活性成分的軟錠劑。本發明的組合物可以處于適合于其他施藥途徑，諸如，例如，靜脈內灌輸、腹膜內、皮下、肌肉內、直接進入骨的制劑中。所述制劑包括，例如，水性和非-水性的等滲無菌注射溶液，其可以包含抗氧化劑，緩沖劑，細菌抑制劑，和使所述制劑與預期接收者血液等滲的溶質，和可以包括混懸劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑、和防腐劑的水性和非-水性無菌混懸液。可以由無菌粉末劑、顆粒劑、和片劑制備注射溶液和混懸液。在本發明的情形中，向患者施用的劑量應該足以在患者體內隨著時間實現有益的治療響應。例如，如果施用本發明的組合物治療或預防骨質疏松癥，則向患者施用的劑量應該足以預防、延遲、或逆轉骨密度的減少。通過具體使用的組合物的效率和患者的健康狀態，以及待治療患者的體重或表面積，來確定劑量。劑量大小還應該通過伴隨具體組合物在特定患者體內施藥的任何不利副作用的存在、性質、和范圍來確定。如所需地，可以一次或重復施用所述抑制試劑，其包括siRNA組合物。例如，可以以規則的間隔(例如，每日兩次、每日一次、每周兩次、每周一次、每月一次)施用所述抑制試劑持續一段延長的時間(例如，7天、14天、21天、l個月、2個月、3個月、6個月、9個月、12月、或更長)。如所需地，可以隨著時間經常或多或少地施用抑制試劑。先體外后體內誘導骨發生能夠用本領域中技術人員已知的任何方法向受試者施用分化的成骨細胞。在本發明的一個實施方案中，能夠例如，經由外科移植，向受試者施用處在完整的固體支持物(例如，三維基質或平面表面)上的分化的成骨細胞。備選地，在向受試者例如，靜脈內、皮下、肌肉內、腹膜內或直接進入骨施藥前，能夠使分化的成骨細胞與所述基質分離，即，通過用蛋白酶處理。在本發明的一些實施方案中，從人中提取間充質干細胞，并隨后使其與抑制一種或多種表1中的多肽的試劑相接觸，從而增殖和分化為成骨細胞譜系的細胞。能夠從待治療的受試者中，即，自體(由此避免基于免疫的移植排斥)，或能夠從第二受試者中，即，異源提取細胞。在每種情形中，細胞的施藥可以與合適免疫抑制處理相結合。可以通過本領域中已知的任意方法，向受試者施用按照本發明方法分化的成骨細胞。合適的施藥方法包括，例如，靜脈內、皮下、肌肉內、腹膜內、進入骨和外科移植。所述細胞可以處于適合于施藥的制劑中，諸如，例如，水性和非-水性的等滲無菌注射溶液，其可以包含抗氧化劑，緩沖劑，細菌抑制劑，和使所述劑型與預期接收者的血液等滲的溶質，和可以包括混懸劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑、和防腐劑的水性和非-水性無菌混懸液。可以由無菌粉末劑、顆粒劑、和片劑制備注射溶液和混懸液。為了外科移植，可以將分化細胞留在完整固體支持物，例如，三維基質或平面表面上。將所述基質或平面表面外科移植到受試者的合適位點。例如，需要骨移植的患者可以具有在外科植入的完整固體支持物上的分化30的細胞。在確定治療或預防由于減少的或異常的成骨細胞引起的病癥中待施用的細胞的有效量的過程中，醫師評估細胞毒性、移植反應、疾病的發展、和抗-細胞抗體的產生。為了施用，當應用于患者的大多數和全面健康狀態時，在考慮不同濃度成骨細胞的副作用的條件下，可以以有效的量施用按照本發明的方法分化的成骨細胞，以向受試者提供成骨細胞。可以經由單次或分開劑量完成施用。檢測骨密度為了評價本發明的組合物對骨密度的作用，可以在將接受治療的個體內進行骨密度的基線測量。在施用本發明的抑制試劑(例如，一種或多種選自表1所列的那些的siRNA寡核苷酸)的過程中或之后，以合適的間隔周期性測量骨密度。用于測量骨密度的方法和裝置是本領域中眾所周知的，且記述在，例如，美國專利號6,436,042;6,405,068;6,320,931;6,302,582;6,246,745;6，230，036;6,213,934;6,102,567;6,058,157;5,898,753;5,891,033;5,852,647;5,817,020;5,782,763;5,778,045;5,749,363;5,745,544;5,715,820;5,712,892;5,572,998;禾卩5,480,439中。VI.治療和診斷用途本發明的方法和組合物發現了治療骨病癥和由缺陷性或缺乏性成骨細胞形成引起的疾病的用途。作為缺乏性或缺陷性成骨細胞分化結果發展的示范性骨疾病包括，例如，骨質疏松癥、佝僂病、軟骨病、麥-奧綜合癥、和佩吉特病。見，例如，Kasper,等，/^辨,學游給I森嚴廁O/am'so"'s尸〃>7">/^o//"fer"a/Me&'"'"eJ的第333-334章，第16版，2004，McGraw-Hill。此外，本方法還特別有效于體外骨培養、和骨發生的分析下列實施例意欲舉例說明，而非限制本發明。實施例實施例1實驗程序細胞培養、轉染和高通量篩選人間充質干細胞(hMSCs,PT-2501)購自Cambrex公司，并按照供應商的指導進行培養。在用于siRNA文庫篩選前，將細胞擴增至第5代。簡要地，在384-孔板的每個孔中混合稀釋的Xtreme-siRNA轉染試劑(cat弁447611500，羅氏)(0.12|ilXtreme處于4jilDMEM中)和預-點滴的siRNA(14ng/孔)持續1小時。然后，利用自動分配器(Multidrop384,Thermo實驗室系統(ThermoLabSystems))加入處于60pl培養基(無抗生素)中的細胞(4000/孔)(siRNA最終濃度為約15nM)。在第一次更新培養基前，容許轉染繼續8小時。培養7天后，針對堿性磷酸酶(ALP)活性，對細胞進行染色(cat#86R-lKT,西格瑪(Sigma))。在96-孔平板中進行篩選后測定，并以30nM的濃度以8000個細胞/孔的細胞密度轉染siRNA。類似于siRNA，利用Xtreme-siRNA轉染試劑，將CRE誘殺劑寡核苷酸和對照寡核苷酸(在所有核苷酸上硫代磷酸酯鍵修飾)(Park,Y.G.等，f激化學染,吝a歷o/C/2柳J274:1573-1580(1999))轉染到細胞中，只是最終DNA濃度是卯nM。篩選中使用的對照siRNA(siCon)含有一個50個合成序列的庫，所述合成序列具有至少4個與已知的人轉錄物和EST的錯配，和至少2-3個與完整的人基因組的錯配。在初級篩選后的靶點表征中使用的siCon購自Dharmacon(D-001210-01-05)，通過生物信息學將其設計為具有>=4個與已知的人和小鼠基因的錯配。siTOX也購自Dha廳conOD掘500-01-05)。siCBFAl:UAGUAGAGAUAUGGAGUGCtg(SEQIDNO:1)(反義)；GCACUCCAUAUCUCUACUAtt(SEQIDNO:2)(有義)。CRE誘殺劑'24-mer回文序列5'-TGACGTCATGACGTCATGACGTCA-3'(SEQIDN0.3)。CRE錯配對照5'-TGTGGTCATGTGGTCATGTGGTCA-3'(SEQIDNO:4)。磷酸鈣染色用PBS沖洗細胞兩次，室溫下在茜素紅溶液(cat#vw3611-2,VWR)中染色8分鐘，再用PBS清洗，在10%福爾馬林溶液(cat#HT-5014,西32格瑪)中固定20分鐘，然后用水沖洗并空氣干燥。油紅O染色用PBS沖洗細胞兩次，在10%福爾馬林溶液中固定20分鐘，用PBS沖洗兩次并用dH20沖洗一次，用丙二醇清洗5分鐘，并用處于丙二醇中的油紅(12722A,Newcomer供應(NewcomerSupply))染色30分鐘。然后，用85%丙二醇清洗細胞5分鐘，用dH20沖洗3次，并保存在50%甘油中。化合物處理8-CPT-cAMP，Na(cat#116812)、5-碘代殺結核菌素(ca枝407900)、前列腺素E2(PGE2，cat#538904)、SB202190(cat#559388)和U0126(cat#662005)購自Calbiochem;N6，2'-0-聯丁酰基-cAMP(cat#D0260-5MG)、毛喉素(cat^F6886)、抗壞血酸2-磷酸酯(cat#49752-10G)、(3-甘油磷酸酯(G-6251)、地塞米松(D8893)、3-異丁基-l-甲基黃嘌呤(IBMX,15879)和胰島素(19278)購自西格瑪(Sigma)/奧德里奇(Aldrich)/Fiuka。RNA制備和RT-PCR利用來自Qiagen的RNAeasy微型試劑盒(RNAeasyminikit),由約5x10(4)個細胞制備來自每份樣品的總RNA，并進一步用TurboDNA-Free(cat#1907,Ambion)進行處理，以防止DNA污染。按照指示，利用用于RT-PCR的Superscript第一鏈合成系統(SuperscriptFirst-StrandSynthesisSystemforRT-PCR)(cat#11904-018,Invitrogen)或Qiagen—步RT-PCR試劑盒(QiagenOneStepRT-PCRkit)(cat#210210)進行反轉錄。所用的PCR引物如下GAPDH:正向5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'(SEQIDNO:5);反向5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'(SEQIDNO:6)。ALPL:正向5'-TGGAGCTTCAGAAGCTCAACACCA-3'(SEQIDNO:7);反向5'-ATCTCGTTGTCTGAGTACCAGTCC-3'(SEQIDNO:8)。RUNX2:正向5'-TCTTCACAAATCCTCCCC-3'(SEQIDNO:9);反向5'-TGGATTAAAAGGACTTGGTG-3'(SEQIDNO:10)。OSX:正向5'-CCTATGTACCAGGAGTAATGAATAG-3'(SEQIDNO:11);反向5'-CTCCTAGCTCTTTAAGTTCTTTCTC-3'(SEQIDNO:12)。DLX5:正向5'-GAGAAGGTTTCAGAAGACTCAGTA-3'(SEQIDNO.13);反向5'-CTAGAACAGCAAAACACAGTAGTC-3'(SEQIDNO:14)。BSP:正向5'-GAGAATACCACACTTTCTGCTAC-3'(SEQIDNO:15);反向5'-AAGTAGCTGTACTCATCTTCATAGG-3'(SEQIDNO:16)。MJD:正向5'-AGCACAACTAAAAGAGCAAAGAGTC-3'(SEQIDNO:17);反向5'-CTCATAGCATCACCTAGATCACTCC-3'(SEQIDNO:18)。BIRC4:正向5'-GTTTCAGCATCAACACTGGC-3'(SEQIDNO:19);反向5'陽TCCGTGCTTCATAATCTGCC-3'(SEQIDNO:20)。P2RY11:正向5'-GTGTCCACCCTCTACTCTACAT-3'(SEQIDNO:21);反向5'-CTCCACTCTCTCTACTTGGTTCT-3'(SEQIDNO:22)。SLC12A2:正向5'-GGTGTCTATCTCTTGACCTTGT-3'(SEQIDNO:23);反向5'陽GACCTGGTGTCTAGTGTTAAGTG-3'(SEQIDNO:24)。TBX3:正向5'-ATAACTGAGATTGCTGTGGG-3'(SEQIDNO:25);反向5'-AGAGAGGGGGAAAAATACAG-3'(SEQIDNO:26)。BCL212:正向5'-GCTGAGGCAGAAGGGTTATG-3'(SEQIDNO:27);反向5'-ATAGAGCTGTGAACTCCGCC-3'(SEQIDNO:28)。KCNT1:正向5'-TTCTGGAAGTTAGAAGCAGC-3'(SEQIDNO:29);反向5'-ACCGTACAAACCAGTAAGGA-3'(SEQIDNO:30)。ADK:正向5'-CCAGAGTCAGTATTAAAGGTGG-3'(SEQIDNO:31);反向5'-GAGACCAGTTGAGACAGAAAACADCY誦3'(SEQIDNO:32)。Gsa:正向5'-ATCTCTGTGATCCTGTTCCTC-3'(SEQIDNO:33);反向5'-GTGAAATGAGGGTAGCAGTAGT-3'(SEQIDNO:34)。DUSP6:正向5'-TAGATACAGGCAGTAGGTTTGC-3'(SEQIDNO:35);反向5'-CTCTCTTTGGCTCCTCTATATG-3'(SEQIDNO:36)。GBDR1:正向5'-GAGAGACTTCCAGACAGAACTC-3'(SEQIDNO:37);反向5'-CATCTATCACCTCTTTCTCGTC-3'(SEQIDNO:38)。PLZF:正向5'-TCTCAAACGCCACCTGCGCTCACAT-3'(SEQTDNO.39);反向5'-CACTGGCAGGGCGAGGCGCCGTTGT-3'(SEQIDNO:40)。蛋白質印跡細胞裂解緩沖液含有20mMTrispH8.0,1mMEDTA,150mMNaCl和0.5%NP-40，且在使用前，加入蛋白酶抑制劑混合物(Cat#p8340，西格瑪,1:100稀釋)和磷酸酶抑制劑混合物2(Cat#p5726,西格瑪，1:100稀釋)。在12%NovexTris-甘氨酸凝膠(Cat#EC6008box,Invitrogen)中分離蛋白質(60嗎/孔)，并利用XCdlII印跡模塊系統(XCellIIblotmodulesystem)(Cat#EI9051,Invitrogen)將其轉移到硝化纖維膜(Cal#LC2001,Invitrogen)上。室溫下在5。/。牛奶/PBST中封閉該膜l小時，在4度用一抗培養過夜，用PBST(在PBS中的0.05%吐溫20)清洗3次，隨后用處于5。/。牛奶/PBST中的二抗培養1小時，并在室溫下用PBST清洗3次。然而，為了針對pCREB的抗體，在除了最后一步的所有步驟中，用PBS代替PBST。利用ECL蛋白質印跡檢測試劑(安瑪西亞生物科學(AmershamBiosciences))檢測結合抗體的蛋白。抗-磷酸-CREB購自Upstate生物技術(UpstateBiotechnology)(cat#06-519);抗-磷酸-p38購自細胞信號技術(Cellsignalingtechnology)(cat#9910)。結果測試了多種商購的脂轉染試劑后，我們發現來自羅氏(Roche)的XtremesiRNA轉染試劑在hMSC中最有效，其提供超過卯％的轉染效率35和最小的細胞毒性(圖1)。然后，將這種高效SiRNA轉染方法用在高通量篩選中，所述高通量篩選基于堿性磷酸酶(ALP)的酶測定，所述堿性磷酸酶是成骨分化的早期標記(Rodan,G.A.等，蕭應(Ce〃)89:677-680(1997))。鑒別并確認了在hMSC中的siRNA轉染后第7天時引起ALP活性顯著增高的55個擊中(圖2a和表1)。<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>(siRNA,siRNA/DNA)NM—018843MCFPAAUGGACUCAUGGAUCAUCUATG73，74線粒體載體家族蛋白NM—000633BCX2CAUGUGUGUGGAGAGCGUCAACC75，76B-細胞CLL/淋巴瘤2NM—004050BCL2L2CACCCAGGUCUCCGAUGAACUTT77，78BCL2-樣2NM—016346NR2E3CAGCAGCAGCGGGAAGCACUATG79，80核受體亞家族2，組E,成員3NM—016346NR2E3CAGAGGAUGCUGAUGAGAAUATT81,82核受體亞家族2，組E,成員3NM—022571HU畫PIYCACGCUCAGCGUGGCGCUCAUCT83,84推定的白細胞血小板-活化K子受/女NM—002985C(X5AAUGGGUUCGGGAGUACAUCAAC85,86體趨化因子(C-C基序)配體5NM—001946DUSP6AACUGUGGUGUCUUGGUACAUTG87,88雙特異性磷酸酶6NM—0059卯STK10TAGAGCACGAAACCCAGAAACTG89,90絲氨酸/蘇氨酸激酶10畫—022355LOC64174CAUCGGGAUUGGUGGAGAUUATG91,92推定的二肽酶麗—012400PLA2G2DTACCAGAAGCGACUGCGUUUCTA93,94磷脂酶A2，組1ID畫—178134CYP4Z1CAUCCCUAUGCCUUCAUACCATT95，96細胞色素P450NM一001354AKR1C2CAAGCCAGGGCUCAAGUACAAGC97,98醛酮還原酶家族l，成員C2畫—000255MUTTAGCUGAGGGAAUACCUAAACTT99,100甲基丙二酰輔酶A變位酶畫—000787DBHGACCACGUACUGGUGCUACAUTA101,102多巴胺(3-羥化酶(多巴胺(3-單加氧酶)畫—012253TKTUTAUCCGUGUCAUCGACCUGUUTA103,104轉羥乙醛酶-樣1麗—000137FAHAACUUCGGAAGUGUGCAUUCATC105，106延胡索酰乙酰乙酸水解酶(延胡索酰乙酰乙酸酶)雨—006502POLHTAUGCCAGAACACAUGGACUATC107,108聚合酶(DNA-指導的)，T]200780029759.0轉滔*被36/44:K<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>在初級siRNA擊中中，相應的基因編碼蛋白酶、激酶、離子通道、蛋白質受體、配體、轉錄因子、細胞外基質蛋白質和假定的蛋白質等，其中一些是相同基因家族(整聯蛋白家族、血管生成素家族、腺苷酸環化酶家族和嗅覺受體家族)的成員(表1)。雖然骨發育中涉及大部分識別的基因，但是發現兩種基因，TBX3(T-盒3)和GNAS,當分別在小鼠和人中突變時，引起骨骼畸形(Bianco，P.等，骨礦銀究雜,吉a6o恥M/"w)15:120-128(2000);Davenport,T.G.等，發,(Deve/opme"0130:2263-2273(2003);Eddy,M.C.等，骨rW究染岳(JSo"eM'"eri^)15:2074-2083(2000);Shore,E.M.等，，新^"潛蘭,學染KyV五"g/JMW)346:99-106(2002);Weinstein,L.S.等，箭類潛蘭度學染,吉(A^"g/JMW)325:1688-1695(1991))。為了檢驗篩選，我們選擇了12種靶基因(圖3)，包括GNAS(人GNAS復合基因座、轉錄變體2、Gsa亞基的同種型、NM—080426)、ADCY8(腺苷酸環化酶8，NM_001115)、ADK(腺苷激酶，NMJ)01123)、P2RY11(嘌呤能受體P2R、G-蛋白質偶聯的，11,NM_002566)、TBX3(T-盒3或尺乳綜合癥，NM—005996)、BIRC4(含有桿狀病毒IAP重復的4，NM—001167)、BCL212(BCL2-樣2,NM—004050)、SLC12A2(溶質載體家族12，成員2,NM001046)、KCNT1(鉀通道，亞家族T，成員1,XM—029962.2)、GBDR1(推定的神經膠質胚細胞瘤細胞分化-相關的，NMJ)16172)、DUSP6(雙特異性磷酸酶6,NM—001946)和MJD(神經系統亞速爾病或共濟失調蛋白3，NM—004993),以進一步表征它們在hMSC成骨分化中的功能。為了證實誘導的ALP活性源自骨-特異性同工酶ALPL(Weiss,M.J.等,夷房房家辨學腐學叛CProcA^"cadSc/83:7182-7186(1986》，利用ALPL特異性引物，對在siRNA轉染后第4天收集的hMSC樣品進行RT-PCR分析。如圖2b中所示，與受到最佳成骨誘導培養基(OS,細胞培養基中的0.05mM抗壞血酸2-磷酸酯，10mM糖磷酸酯和0.1地塞米松的混合物)處理的樣品相類似(Pittenger，M.F.等，辨學"c/e"c^284:143-147(1999)),與利用非特異性siRNAs(siCon)轉染的對照樣品相比，利用除siTBX3和siMJD外的擊中siRNAs轉染的樣品產生增加的ALPL轉錄物。為了進一步證實轉染的hMSC的成骨同一性，我們還檢驗了若干另外的早期(CBFA1、DLX5、Osterix/OSX)和一種晚期(骨-特異性涎蛋白或BSP)階段成骨標記的表達(Acampora，D.等，犮#0>ve/，we""126:3795-3809(1999);Ducy,P.等,潘應89:747-754(1997);Nakashima,K.等，潘應(Te〃J108:17-29(2002);Wang,D.等，(J^o"eM/ww7")14:893-903(1999))。除了在所有測試樣品中似乎不改變的DLX5夕卜，與siCon處理的樣品相比，在擊中siRNA和OS處理的樣品中的CBFA1、OSX和BSP受到不同的上調(圖2b)，這提示由不同擊中siRNA誘導的hMSC成骨特化進行到不同的階段。小鼠中骨細胞命運決定和成熟所必需的主要轉錄因子CBFA1/RUNX2(Ducy，P.等，潘應(Te〃J89:747-754(1997)),通常在hMSC中表達(圖2b)。為了檢驗擊中siRNA誘導的成骨細胞命運定型是否需要CBFA1的功能，每種擊中siRNA與CBFAl-特異性siRNA或siCon共-轉染在hMSC中，并檢驗ALP活性。與單獨擊中siRNA處理相比，利用siCon的共-處理不引起ALP活性的任何明顯改變，而與CBFA1siRNA的共-處理降低由擊中siRNA或成骨誘導培養基(OS)誘導的ALP活性的水平(圖2c),這提示hMSC中擊中siRNA誘導的成骨細胞命運定型也需要CBFA1的功能。為了證實誘導的ALPL表達不是由來自轉染擊中siRNA的脫靶(off-target)作用所引起的，對在siRNA轉染后36小時時制備的RNA樣品的相應siRNA耙基因進行RT-PCR。如與對照樣品相比較地，相應擊中siRNA轉染的hMSC中降低的耙基因轉錄水平證實了特異性(圖2d)。另外，在siRNA轉染后72小時觀察到耙基因的擊倒。骨細胞成熟伴隨著細胞外基質(ECM)的礦化(JohnBilezikian等，骨主激學嚴潘OV/"";p/^o/6o"e&o/og>0,巻l,第2版科學出版社)(2002))。為了檢驗由擊中siRNA誘導的hMSC成骨分化是否能夠進一步進入成熟階段，培養擊中siRNA處理的細胞20天。基于茜素紅染色，沒有檢測到ECM礦化，所述茜素紅染色檢測磷酸鈣沉積，即礦化ECM的主要組成，這指示由擊中siRNA引起的表達擊倒主要起誘導hMSC早期成骨特化的作用，且晚期階段的成骨細胞成熟可能需要另外的因子。由于OS處理的hMSC在2周內經歷成骨細胞成熟，所以我們測試通過擊中siRNAs(最初2-4天)及隨后OS(另外5-9天)的連續處理是否能夠促進該過程。如圖4中所示地，與對照處理細胞相比，所述用siADK和OS培養基連續處理hMSC，明顯增強茜素紅染色的強度。當在siRNA轉染后3天時開始OS處理并持續9天時，在這12種測試的擊中之中，6種(siADK、siGNAS、siP2RY11、siGBDRl、siSLC12a2和siKCNTl)顯著增強了茜素紅染色的強度，2種(siDUSP6和siBCL212)提供中度增強，2禾中(siBIRC4和siADCY8)提供弱增強，和2種(siTBX3和siMJD)沒有顯著作用(圖5a)。這些觀察與這樣的結論相一致，即10種有效擊中siRNA的靶基因不僅在hMSC成骨特化中，而且在骨細胞成熟中起抑制作用。兩種siRNA擊中，諸如siSLC12A2和siKCNTl的組合處理進一步增強成骨分化過程(圖6)。已經提示了hMSC的成骨分化和脂肪形成分化是兩個相反的過程，其中一個過程抑制另一個(Beresford，J.N.等，潘應矜學/雜,玄GCW/Scz102(Pt2):341-351(1992))。此外，在骨質疏松患者中，骨髓中脂肪細胞的數量增加,這意味著細胞命運傾向從成骨細胞譜系到脂肪細胞譜系的改變(Justesen,J.等，f激老年學C^ogm"fo/og^2:165-171(2001);Meunier,P.等，//^^蕃形,/辟賴關研秀rn/"CW/zc^^/W^W80:147-154(1971))。因此，我們通過與脂肪形成誘導混合物(100嗎/mlIBMX,1DEX和10|ig/ml胰島素)的組合處理，檢驗了我們的擊中siRNA對hMSC脂肪形成分化的作用。與先前的研究相一致地，除siGNAS夕卜，我們的擊中siRNAs以不同程度抑制hMSC的脂肪形成分化(圖5b)。在我們的篩選中，將GNAS確定為hMSC中的成骨細胞命運阻抑基因。主要GNAS基因產物，即G蛋白(x-亞對Gsa),使跨膜受體偶聯于腺苷酸環化酶，并且是受體-刺激的細胞內cAMP生成所必需的。在兩種以異位骨化為特征的病癥類型(進行性骨發育異常和奧爾布賴特遺傳骨營養不良)中發現了該基因中滅活的突變(Chan,I.等，游康實驗皮嚴諒學(T/z'w￡xpDe環ato〃29:77-80(2004);Eddy,M.C.等，骨礦砑^^^志(J5o"eM/"er15:2074-2083(2000);Shore,E.M.等，'新;^"搭蘭度學^^志(TVJMW)346:99-106(2002))，反之，在以骨纖維性發育異常為特征的具有麥-奧綜合癥的患者中發現該基因中活化的突變(Wdnstein，L.S.等，箭英潛蘭,學染,吉(W^g〃MW)325:1688-1695(1991)),這提示Gsa是成骨定型的關鍵陰性調節子。這與我們以及其他人的觀察相一致，即減少的GNAS表達開啟固SC中的成骨細胞命運(Lietman,S.A.等，游尿蕃形井辟賴關,秀OAo/7/eto/^J,231-238(2005))。一致地，我們的篩選不僅識別Gsct，還識別若干在cAMP生成密切涉及的蛋白質，其包括ADCY8(腺苷酸環化酶8)、ADK(腺苷激酶)和P2RY11(嘌呤能受體P2Y,G-蛋白質偶聯的，ll),這提示了hMSC中細胞內cAMP信號傳導和成骨分化之間的緊密連鎖。由于細胞內cAMP信號傳導中確實涉及全部靶基因，所以我們測試了對hMSC成骨分化上cAMP生成起相反功能的兩種化合物，即ADK抑制劑5-碘代殺結核菌素和ADCY活化劑毛喉素的作用(Cottam,H.B.等，,學,眾學染,吉r7Me^C/zewJ36:3424-3430(1993);deSouza，N.J.等，度學,究祭述a^//^/eW3:201-219(1983))。當與OS處理組合時，利用5-碘代殺結核菌素的處理模仿擊中siADK的作用，并顯著增強hMSC的成骨分化，而利用毛喉素的處理抑制該過程(圖7a)。此外，細胞可滲透的cAMP類似物，諸如8-CPT-cAMP或N6,2'-聯丁酰基-cAMP(DB-cAMP)與地塞米松的組合處理足以使hMSC分化為成熟脂肪細胞。而且，當與OS培養基組合時，8-CPT-cAMP能夠將細胞命運定型從成骨轉換到脂肪形成(圖7b和7c),這與先前的觀察相一致，即骨發生和脂肪形成彼此相互排斥。顯示出ATP是P2RY11受體的配體(Communi等，1997)。ATP處理抑制OS-誘導的hMSC骨發生，并以劑量依賴的方式，稍微增加經歷脂肪形成分化的細胞數量，這與這樣的觀點相一致，即P2RY11在hMSC中起成骨阻抑基因的作用。本觀察與這樣的結論相一致，即在hMSC中降低細胞內cAMP水平促進成骨特化，但抑制脂肪形成的細胞命運，且反之亦然。為了發現CREB(cAMP應答元件結合蛋白)，SPcAMP信號傳導通路的一般下游效應子是否參與介導cAMP信號控制的hMSC分化，我們在siP2RY11、siADK、siGNAS、siSLC12a2或siCon轉染后3天的細胞中檢查了CREB蛋白活性形式的表達水平。與siCon處理的或未處理的樣品相比，在這些擊中siRNAs或OS處理的樣品中，pCREB蛋白的水平增加(圖8a)，這提示hMSC成骨分化需要CREB活性。為了進一步檢驗CREB在骨發生和脂肪形成中的作用，將能夠與內源CRE增強子競爭結合蛋白質的合成的24-merCRE誘殺劑寡核苷酸轉染到hMSC中(Park,Y.G.等，生激化學/夯,吉a所o/C/7emJ274:1573-1580(1999))，然后對其進行成骨或脂44肪形成誘導培養基的處理。與24-merCRE錯配對照寡核苷酸相比，CRE誘殺劑不僅抑制細胞經歷脂肪形成分化，而且抑制成骨分化(圖8b),這提示骨發生和脂肪形成二者均需要CREB活性，并且在hMSC中，cAMP信號傳導對成骨分化的抑制作用能夠受到除CREB外的效應子的調控。雖然所述篩選揭示控制hMSC成骨分化的cAMP信號通路中涉及多參與者，但是組合的siRNA處理研究還提示不同的靶基因使用不同的機制來控制相同的成骨過程，其中之一是為了激活骨發生的陽性調節子。若干.蛋白質，包括BMP-2、PLZF、禾[]TAZ,在全能間充質前體細胞中顯示出促進成骨分化(Hong，J.H.等,搏學6Sc/e"ce力09:1074-1078(2005);Ikeda,R.等，f激眾學^^志(7所o/C72emJ280:8523-8530(2005);Katagiri,T.等，潘應浙f激學染,志aCe//5/o/J127:1755-1766(1994))。為了測試它們在我們的siRNA誘導的成骨分化中的作用，對這些基因進行了RT-PCR。雖然不同樣品中BMP-2和TAZ的表達水平沒有顯著變化，但是在siMJD或OS處理的樣品，而非其余擊中siRNA處理的樣品中，檢測到PLZF的表達(圖9a),這提示MJD通常在hMSC中抑制PLZF的表達。另夕卜，顯示MAPK信號傳導通路在OS處理的hMSC中已經被激活，且抑制這些通路抑制OS誘導的骨發生(圖9b)(Jaiswal,R.K.等，主激眾學染志aM/OzemJ275:9645-9652(2000))。DUSP6是雙特異性磷酸酶，已經顯示出其直接使ERKl/2或p38激酶去磷酸化(Muda,M.等，生激眾學^^吉所o/C/zemJ273:9323-9329(1998))。我們因此通過蛋白質印跡，在轉染后72小時，利用了針對所述蛋白質的磷酸化形式的抗體，檢査了siDUSP6處理的hMSC以及其他siRNA處理的樣品中的ERK1/2和p38活性狀態(圖9c)。siDUSP6處理的樣品中增高的活化p38而非pERK1/2水平提示DUSP6通常至少部分地通過抑制p38信號傳導通路活性，來抑制hMSC成骨分化。我們對解釋識別的阻抑基因成骨誘導作用的分子機制的探査與這樣的結論相一致，即不同的阻抑基因通過分離的通路起作用，從而抑制正常hMSC中的成骨分化。雖然為了清楚和理解的目的詳細描述了上述發明，但是對于閱讀本公開內容的本領域技術人員應該清楚的是，在不偏離本發明真實范圍的條件下，可以進行多種形式和細節的改變。例如，上述所有技術、方法、組合物、設備和系統能夠以不同的組合使用。將本申請中引用的所有公布、專利、專利申請、或其他文件作為整體引入作為參考，以獲得所有目的，其程度如同每篇單獨的公布、專利、專利申請、或其他文件單獨指出引入作為參考以獲得所有目的的程度相同。權利要求1.用于鑒別促進骨發生的試劑的方法，所述方法包括，(a)使多種試劑與選自表1的至少一種多肽相接觸；(b)測量至少一種所述多肽的活性；(c)選擇所述多種試劑中的至少一種，其中所選擇的試劑抑制至少一種所述多肽的活性；和(d)測量所選擇的試劑促進骨發生的能力，由此鑒別促進骨發生的試劑。2.權利要求1的方法，其中所述多肽在宿主細胞中表達。3.權利要求2的方法，其中所述測量步驟(b)包括測量所述至少一種多肽的表達。4.權利要求3的方法，其中測量所述表達包括測量轉錄水平。5.權利要求2的方法，其中所述細胞是哺乳動物細胞。6.權利要求1的方法，其中在體外執行所述測量步驟(d)。7.權利要求1的方法，其中在體內執行所述測量步驟(d)。8.用于在哺乳動物細胞中促進骨發生的方法，所述方法包括使所述細胞與siRNA相接觸，所述siRNA抑制選自表1的至少一種基因產物的表達。9.權利要求8的方法，其中所述細胞是干細胞。10.權利要求9的方法，其中所述干細胞是間充質干細胞。11.用于在哺乳動物細胞中促進骨發生的方法，所述方法包括使細胞與抑制選自表1的多肽的活性的試劑相接觸。12.權利要求ll的方法，其中所述細胞是干細胞。13.權利要求12的方法，其中所述干細胞是間充質干細胞。全文摘要本發明提供篩選這樣的試劑的方法，所述試劑抑制一種或多種負責抑制骨發生的多肽的活性或表達。本發明還提供在細胞中通過向該細胞施用試劑誘導骨發生的方法，所述試劑抑制一種或多種負責抑制骨發生的多肽。文檔編號A61K48/00GK101501221SQ200780029759公開日2009年8月5日申請日期2007年8月10日優先權日2006年8月11日發明者生丁,趙院香申請人:斯克里普斯研究所