專利名稱：：用于基因治療的修飾的因子viii和因子ix基因和載體的制作方法用于基因治療的修飾的因子VIII和因子IX基因和載體與相關申請的交叉參考本申請要求2006年6月19日提殳的美國臨時專利申請序號60/760,465、2006年9月1日提交的美國臨時專利申請序號60/824,338和2006年9月26日提交的美國臨時專利申請序號60/847,337的優先權；它們的內容在此以其全文引為參考。
背景技術：
：發明領域本發明涉及修飾的因子VIII(FVIII)和因子XI(FIX)基因、包含修飾基因的核酸載體、包含修飾基因的優化病毒衣殼，以及在FVIII和FIX缺陷例如A型血友病和B型血友病的治療中使用修飾基因的方法。相關技術討論血友病是血液不能充分凝結的血液疾病。當血友病患者受傷時，凝血不足導致出血過多。血友病是遺傳性凝血疾病，其特征為凝血不足和出血過多。幾種類型的遺傳性血友病以受影響的凝血因子區分。A型血友病由缺乏凝血因子VIII(FVIII)引起。B型血友病由缺乏凝血因子IX(FIX)引起。B型血友病是X連鎖的疾病，每30000個男性中大約有1人患有這種疾病。重型B型血友病(占B型血友病人群的大約60。/。)可能致命。關節和肌肉中的自發性出血可能導致永久性殘疾。基因治療已經被提議作為治療模式，用于在血友病患者中補充缺乏的凝血因子。但是，與基因治療的許多領域一樣，理論遠比成功有效的應用簡單。在以前設計適合治療人類的FVIII或FIX構建物的嘗試中，己經遇到了許多困難。例如，Manno等報道，在I期研究中向人類對象的肝臟以AAV2介導投送FIX，導致生物活性FIX水平的表達(Manno等，Blood,(2006),pp.)。Connelly等報道，用編碼人類FVIII的腺病毒載體治療FVIII缺陷小鼠，導致生物活性人類FVIII的表達(Connelly等，Blood,Vol.91，No.9(1998),pp.3273-3281)。Sarker等報道，使用AAV8血清型與FVIII的組合在小鼠模型中校正了血漿FVIII活性(Sarkar等，Blood,Vol.103,No.4(2004),pp.1253-1260)。但是，與基因治療的許多領域相同，理論遠比成功有效的實現簡單。實現基因治療技術的困難包括在使用病毒作為基因載體中遇到的難題。盡管因為病毒可用于轉導細胞，導致蛋白在體內表達，從而可有效用作基因載體，但是包被病毒粒子的蛋白可能激活身體的免疫系統。因此，對于有效表達足夠量靶蛋白以將所需病毒載體的劑量減少到可耐受水平的系統，存在著需求。發明簡述本發明提供了修飾的因子VIII(FVIII)和因子XI(FIX)基因、包含修飾基因的核酸載體、包含修飾基因的優化病毒衣殼、以及在FVIII和FIX缺陷例如A型血友病和B型血友病的治療中使用修飾基因的方法。一方面，本發明提供了在人類對象中治療血友病的優化FVIII或FIX基因，其中該優化基因已經被修飾，增加了CG序列并減少了順式基序。優選優化基因包含序列SEQIDNO:7、12或15。7另一方面，本發明提供了在人類對象中治療血友病的含有優化FVIII或FIX基因的嵌合病毒載體，其中優化基因已經被修飾，增加了CG序列并減少了順式基序。優選嵌合病毒載體包括旁側帶有AAVTRS例如SEQIDNO.2和SEQIDNO.9的SEQIDNO.7或其互補序列，其中SEQIDNO.2的序列位于其5'末端，SEQIDNO.9位于其3'末端。嵌合病毒載體可以包含SEQIDNO.1的核苷酸序列。另一方面，本發明提供了在對象中治療血友病的方法，該方法包括a.提供至少一個重組病毒載體，其含有用于包含修飾的FVIII或FIX基因的核苷酸序列；以及b.在使所述FVIII或FIX核苷酸序列以在對象中產生治療有效量FVIII或FIX水平進行表達的條件下，給對象施用該重組病毒載體。另一方面，本發明提供了用修飾的FVIII或FIX基因轉導肌細胞或肝細胞的方法，該方法包括將肝細胞與重組生物納米顆粒(BNP)病毒載體相接觸，該載體含有包含SEQIDNO.7序列的優化FIX基因，或包含SEQIDNO:12或15序列的優化FVIII基因。基因轉移在了解疾病狀態和為疾病狀態提供治療中有顯著的潛在應用。有許多遺傳疾病，其中缺陷的基因是已知的并已被克隆。總的來說，上述疾病狀態可歸為兩類缺陷狀態，通常是酶，一般以隱性方式遺傳；以及不平衡狀態，可能涉及調控或結構蛋白，典型以顯性方式遺傳。對于缺陷狀態的疾病來說，基因轉移可以用于將正常的基因帶入患病組織進行替代治療，以及使用反義突變產生疾病的動物模型。對于不平衡疾病狀態來說，基因轉移可以用于在模型系統中產生疾病狀態，然后可以使用它來致力于抵消疾病狀態。因此，本發明的方法允許治療遺傳疾病。在本文中使用時，通過部分或完全糾正引起疾病或使疾病更加嚴重的缺陷或不平衡，來治療疾病狀態。因此，本發明的另一方面提供了治療血友病的療法，包括基于施用優化FVin或FIX基因的編碼核苷酸序列的基因治療。另一方面，本發明提供了含有編碼優化FVIII或FIX基因或其片段的多核苷酸的表達載體。在一個實施方案中，表達載體是包含AAV2衣殼2.5的序列(SEQIDNO.17)的AVV病毒載體。另一方面，本發明提供了用編碼本發明的優化FVIII或FIX肽的多核苷酸感染的重組宿主細胞。另一方面，本發明考慮了制備優化FVIII或FIX肽或其片段的方法，包括a.用編碼FVIII或FIX肽或其片段的多核苷酸轉染細胞以產生轉化的宿主細胞；以及b.將轉化的宿主細胞維持在足以表達肽的生物學條件下。另一方面，本發明涉及本發明的優化FVIII或FIX肽或其片段在用于治療血友病的藥物中的應用。本發明還提供了藥物組合物，其含有用于在人類對象中治療血友病的優化FVIII或FIX基因并與可藥用的載體組合，其中優化基因已經被修飾，增加了CG序列并減少了順式基序。優化基因可以包含序列SEQIDNO:7、12或15。從下面的具體說明、附圖和權利要求書，本發明的其它特點和優點將更加顯見。附圖簡述圖1顯示了體外GFP轉導1x109vg(病毒基因組)HPMC530,000個細胞。圖2顯示了單鏈和雙鏈基因組的體外GFP劑量響應。圖3顯示了原代和人類原代骨骼肌細胞系的表達水平。圖4顯示了感染后24小時，1x109vg/滴度感染的APTTHPMC體外裂解物。圖5顯示了hFIX體外HPMC細胞裂解物表達。圖6顯示了R333Q模型感染后6周，針對ssBNP2.5vs.ssAAV2(6A(1,2和3))禾口dsBNP2.5vs.ssAAV2(6B(1，2和3))的FIX體內數據。圖7顯示了在C57Blk6中使用帶有FIX轉基因的ssAAV2、dsBNP-l.l和dsBNP2.5進行門靜脈給藥的結果。圖8顯示了優化hFIX的密碼子序列。圖9顯示了野生型vs.優化hFIX編碼序列的體外表達。圖10顯示了hFIX的表達以及Avigen病毒(4x1011vg/kg)與AAV2dshFIX和優化hFIX的比較。圖11顯示了hFIX的表達，比較了Avigen病毒(8x101Gvg/kg)與AAV2dshFIX和優化hFIX。圖12顯示了使用AAV1、AAV2和BNP-2.5的體外中和抗體滴度水平。圖13顯示了使用AAV1、AAV2和BNP-2.5的體內中和抗體滴度水平。圖14顯示了本發明的優選載體。圖15顯示了圖14的載體的序列(SEQIDNO1)，并顯示了粗斜體大寫字母左突變ITR(SEQIDNO:2);粗體小寫字母TTR啟動子(SEQIDNO:3);正常小寫字母填充序列(SEQIDNO:4);粗體下劃線小寫字母MVM內含子(SEQIDNO:5);正常小寫字母填充序列(SEQIDNO:6);粗斜體下劃線大寫字母優化hFIXcDNA(SEQIDNO:7);粗體小寫字母牛激素多聚A(SEQIDNO:8)和粗斜體大寫字母右ITR(SEQIDNO:9)。圖16顯示了相對于SEQIDNO:19(未優化)禾PISEQIDNO:12(優化)，歸于某種質量(quality)級別的序列密碼子的百分率。圖17顯示了SEQIDNO:12相對于未優化者(SEQIDNO:19)的密碼子質量加強。圖18顯示了GC含量從未優化時(SEQIDNO:19)的44%增加到優化后(SEQIDNO:12)的60%。圖19顯示了與SEQIDNO:15有關的密碼子質量。圖20顯示了SEQIDNO:19的密碼子質量圖。圖21顯示了修改的SEQIDNO:15的GC含量圖，其為62%。圖22顯示了修改的FVIII基因SEQIDNO:10的核苷酸序列，包括SEQIDNO:11、SEQIDNO:12(修改的FVIIIcDNA)禾卩SEQIDNO:13。圖23顯示了修改的FVIII基因SEQIDNO:14的核苷酸序列，包括SEQIDNO:15(修改的FVIIIcDNA)禾PSEQIDNO:16。圖24顯示了本發明的野生型FIX序列(SEQIDNO:18)(Blast中的質詢行)和優化序列(SEQIDNO:7)(Blast中的對象行)之間GC含量的比較。發明具體說明定義除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語都與本發明所屬
技術領域：
中普通專業人員通常理解的意義相同。本文使用的術語僅僅是出于描述具體實施方案的目的，并不打算限制本發明。在本發明的說明書和所附的權利要求書中使用的單數形式"a"、"an"和"the"旨在同樣包含復數形式，除非上下文明確表明不是。下列術語具有給定的意義"AAVCap"是指AAVCap蛋白，VP1、VP2和VP3及其類似物。"AAVRep"是指AAVRep蛋白及其類似物。"AAVTR"是指回文序列，包含大部分互補、對稱排列的序列，并包括天然AAVTRS的類似物及其類似物。"生物學有效的"對于病毒載體的量來說，是足以導致靶細胞中的感染(或轉導)和轉入基因表達的量。"順式基序"包括保守的序列，例如在基因組序列的末端處或附近發現并被識別用于啟動復制的序列；在內部位置可能用于轉錄起始或終止的隱蔽的啟動子或序列。"嵌合的"對于病毒衣殼或粒子來說，是指衣殼或粒子包含了來自不同細小病毒、優選為不同AAV血清型的序列，如Rabinowitz等在2002年12月10日授權的題為"重組細小病毒載體及其制備方法(Recombinantparvovirusvectorsandmethodofmaking)"的美國專禾U6,491,907所述，其公開內容在此以其全文引為參考。特別優選的嵌合病毒衣殼是AAV2.5衣殼，其具有的AAV2衣殼的序列帶有下列突變263Q—A;265插入T;705N—A;708V—A;以及716T—N。其中表達這樣的衣殼的核苷酸序列被定義為SEQIDNO:17。其它優選的嵌合病毒衣殼描述在共同待審的PCT申請No.PCT/US07/01668中，其公開內容在此以其全文引為參考。"旁側的"對于旁側帶有其它元件的序列來說，表明相對于序列來說，在上游和/或下游，即5'和/或3'，存在一個或多個旁側元件。術語"旁側的"不打算表明序列必需是緊鄰的。例如，在編碼轉基因的核酸和旁側元件之間可以存在間插序列。序列(例如轉基因)"旁側"帶有兩個其它元件(例如TR)，表明一個元件位于序列的5'，另一個位于序列的3';但是，在它們之間可以存在間插序列。"多核苷酸"是指由磷酸二酯鍵連接的核苷酸序列。本文中多核苷酸以5'到3'的方向表示。本發明的多核苷酸可以是脫氧核糖核酸(DNA)分子或核糖核酸(RNA)分子。當多核苷酸是DNA分子時，該分子可以是基因或cDNA分子。在本文中核苷酸堿基以單字母編碼標明腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、次黃嘌呤(I)和尿嘧啶(U)。本發明的多核苷酸可以使用本
技術領域：
的專業人員熟知的標準技術來制備。用病毒"轉導"細胞是指存在DNA或RNA從病毒粒子向細胞的轉移。細胞的"轉染"是指出于對細胞進行遺傳修飾的目的，將遺傳物質導入到細胞中。轉染可以通過本
技術領域：
已知的各種不同方法來完成，例如轉導或電穿孔。除非另有指明，"多肽"涵蓋了肽和蛋白。"轉基因"在廣義上使用是指摻入到病毒載體中的任何用于在靶細胞中表達的異源核苷酸序列，以及相關的表達控制序列例如啟動子。本
技術領域：
的專業人員會認識到表達控制序列可以根據在靶細胞中啟動轉基因表達的能力來選擇。轉基因的例子是編碼治療性多肽的核酸。"載體"是指含有將在體外或在體內被投送到宿主細胞中的多核苷酸的重組質粒或病毒。"重組體"是指不同于自然界中普遍發現的遺傳實體。當用于多核苷酸或基因時，它是指多核苷酸是克隆、限制和/或連接步驟以及導致產生不同于自然界中發現的多核苷酸的構建物的其它程序的各種不同組合的產物。"基本上同源"或"基本上相似"當指稱核酸或其片段時，表示當將適當的核苷酸插入或缺失片段與另一個核酸(或其互補鏈)進行最優比對時，在至少大約95到99%的序列中存在核苷酸序列同一性。13"重組病毒載體"是指含有一個或多個異源序列(即不是病毒來源的多核苷酸序列)的重組多核苷酸載體。在重組細小病毒載體的情況下，重組多核苷酸旁側帶有至少一個、優選兩個反向末端重復序列(ITR)。對于載體或病毒衣殼來說，"血清型"是由基于衣殼蛋白序列和衣殼結構的獨特的免疫學情況定義的。"肽"、"多肽"和"蛋白"可以互換使用，表示至少兩個氨基酸通過酰胺鍵共價連接的序列聚合物。"同源的"用于指稱肽時，是指兩個肽之間的氨基酸序列相似性。當這兩種肽中的氨基酸位置被同樣的氨基酸占據時，它們在該位置同源。因此，"基本上同源"是指氨基酸序列很大程度上、但不是完全同源，并且它保留了與它同源的序列的大部分或所有的活性。本文中使用的"基本上同源的"用在這里是指序列與參比肽至少50%—致、優選至少75%、更優選95%同源。其它的肽序列修飾也包括在內，例如本文公開的序列的氨基酸序列的少量改變、缺失、取代或衍生，只要肽的活性或功能與未修飾的肽基本相同即可。氨基酸的衍生物可以包括但不限于三氟亮氨酸、六氟亮氨酸、5,5,5-三氟異亮氨酸、4，4，4-三氟纈氨酸、對-氟苯丙氨酸、鄰-氟酪氨酸、間-氟酪氨酸、2,3-二氟酪氨酸、4-氟組氨酸、2-氟組氨酸、2，4-二氟組氨酸、氟代脯氨酸、二氟脯氨酸、4-羥基脯氨酸、硒代甲硫氨酸、碲代甲硫氨酸、硒代半胱氨酸、硒代色氨酸、4-氨基色氨酸、5-氨基色氨酸、5-羥基色氨酸、7-氮雜色氨酸、4-氟色氨酸、5-氟色氨酸、6-氟色氨酸、同型烯丙基甘氨酸、同型丙炔基甘氨酸、2丁炔基甘氨酸、順巴豆基甘氨酸、烯丙基甘氨酸、脫氫亮氨酸、脫氫脯氨酸、2-氨基-3-甲基-4-戊烯酸、疊氮基高丙氨酸、疊氮基丙氨酸、疊氮基正亮氨酸、對-乙炔基苯丙氨酸、對-疊氮基苯丙氨酸、對-溴苯丙氨酸、對-乙酰基苯丙氨酸和苯并呋喃基丙氨酸。重要的是，修飾的肽將保留與未修飾的肽相關的活性或功能，修飾的肽一14般將具有與未修飾序列的氨基酸序列"基本上同源的"氨基酸序列。本發明提供了編碼FVIII或FIX的修飾核酸。本發明還提供了核酸構建物，其包含編碼FVIII或FIX的修飾核酸作為其序列的一部分。例如，本發明包括的質粒和/或其它載體含有修飾的FVIII或FIX序列以及其它元件例如調控元件。此外，本發明提供了包裝的基因投送介質，例如包含有修飾的FVIII或FIX序列的病毒衣殼。本發明還包括通過將修飾的序列以及在細胞中啟動表達所需的元件投送到細胞中來表達FVIII或FIX的方法。本發明還提供了基因治療方法，其中修飾的FVin或FIX序列作為例如載體的組分和/或包裝成病毒基因投送載體的組分給對象對用。治療可以例如有效地在對象中增強凝血和/或治療對象中FVIII或FIX的缺乏。本發明的這些方面的每一方面將在后續的部分中進一步討論。用于表達FVIII或FIX的修飾的核酸本發明提供了編碼FVIII或FIX的修飾的序列。修飾的序列包括的天然FVIII或FIX序列含有一個或多個優化性修飾。優化性修飾的例子包括消除一個或多個順式作用基序并導入一個或多個Kozak序列。在一個實施方案中，一個或多個順式作用基序被消除，并導入了一個或多個Kozak序列。可以被消除的順式作用基序的例子包括內部TATA-盒，chi位點，核糖體進入位點，富含AT和/或富含GC的序列段，ARE、INS和/或CRS序列元件，重復序列和/或RNA二級結構，(隱蔽的)剪接供體和/或受體位點、分支點，以及Sail。優選，相對于野生型因子FVIII或FIX，提高GC含量，并除去一個或多個順式作用基序。GC含量優選比野生型基因高至少30%到90%。此外，密碼子適應指數優選>75、>80、〉85、>卯或>95。修飾的FVIII或FIX序列也可以包含旁側限制性位點，以便于亞克隆到表達載體中。本發明還包括編碼功能活性片段FIX的SEQIDNO7序列的片段。此外，本發明包括修飾版本的SEQIDNO:7，它編碼具有FIX凝血活性的FIX類似物。此外，本申請包括FVIII的修飾的序列，包含SEQIDNO:12和15。本發明包括的核酸載體含有修飾的FVIII或FIX序列以及各種不同的調控元件。可用于基因表達的調控元件的準確性質在生物體與生物體之間變化。一般來說，它們包括在目的細胞中指導RNA轉錄起始的啟動子。啟動子可以是組成型的或被調控的。組成型啟動子是導致可操作連接的基因基本上在所有時間都表達的啟動子。被調控的啟動子是可以被激活或失活的啟動子。被調控的啟動子包括可誘導啟動子，它們通常是"關閉的"但是可以被誘導"打開"，以及"可抑制的"啟動子，它們通常是"打開的"但是可以被"關閉"。已知有許多不同的調控物，包括溫度、激素、細胞因子、重金屬和調控蛋白。區別不是絕對的；組成型啟動子通常可以被調控到某種程度。在某些情況下，可以利用內源途徑來提供對轉基因表達的調控，例如使用當病理狀況改善時被自然下調的啟動子。適合的啟動子的例子包括腺病毒啟動子、例如腺病毒主要晚期啟動子，異源啟動子例如巨細胞病毒(CMV)啟動子，呼吸道合胞病毒啟動子，勞氏(Rous)肉瘤病毒(RSV)啟動子，白蛋白啟動子，誘導型啟動子例如小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子，金屬硫蛋白啟動子，熱休克啟動子，a-l-抗胰蛋白酶啟動子，乙肝表面抗原啟動子，轉鐵蛋白啟動子，載脂蛋白A-1啟動子，人類FVIII啟動子，以及人類FIX啟動子。啟動子可以是組織特異性啟動子，例如在肝臟細胞中有活性的小鼠白蛋白啟動子，以及運甲狀腺素蛋白啟動子(TTR)。包裝的修飾的FVIII或FIX序列修飾的FVIII或FIX序列也可以提供為包裝的病毒載體的組分。一般來說，包裝的病毒載體包括包裝在衣殼中的病毒載體。病毒載體和病毒衣殼將在隨后部分中討論。病毒載體按照本發明的方法產生的包裝的病毒載體的病毒載體組分包括至少一個修飾的FVIII或FIX序列，以及用于控制修飾的FVIII或FIX序列表達的相關表達控制序列。病毒載體可以包含足以能夠使其保持游離形式的順式作用功能，或通過包括將修飾的FVIII或FIX序列整合到靶細胞基因組中的機制。在優選實施方案中，病毒載體包含細小病毒基因組的一部分，例如刪除了rep和cap并替換成修飾的hFVIII或hFIX序列及其相關表達控制序列的AAV基因組。修飾的FVIII或FIX序列通常插入到一個或兩個(即旁側帶有的)適合病毒復制的AAVTRS或TR元件附近；Xiao等，JVirol71;2:941-948(1997),以代替病毒的rep和capORF。也可以包含其它適合促進修飾的hFVIII或hFIX序列在耙細胞中的組織特異性表達的調控序列。病毒載體可以是任何適合的核酸構建物，例如DNA或RNA構建物，可以是單鏈的、雙鏈的或雙鏈體。病毒衣殼包裝的病毒載體的病毒衣殼組分可以是細小病毒衣殼。AAVCap和嵌合衣殼是優選的。適合的細小病毒病毒衣殼組分的例子是來自細小病毒科的衣殼組分，例如自主細小病毒或依賴病毒。例如，病毒衣殼可以是AAV衣殼(例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVIO、AAVll或AAV12衣殼；本
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的專業人員將了解，可能有其它尚未鑒定的變異體能執行相同或相似功能)，或可以包含來自兩種或多種AAV衣殼的組分。完整的一套AAVCap蛋白包括VP1、VP2禾卩VP3。含有編碼AAVVP衣殼蛋白的核苷酸序列的ORF可以包含少于一整套AAVCap蛋白，或者也可以提供一整套AAVCap蛋白。一種或多種AAVCap蛋白可以是嵌合蛋白，包括來自兩種或多種病毒、優選為兩種或多種AAV的AAVCap氨基酸序列，如Rabinowitz等于2002年12月10日被授權的題為"重組細小病毒載體及其制備方法(Recombinantparvovirusvectorsandmethodofmaking)"的美國專利6,491,907中所述，其全部公開內容在此引為參考。例如，嵌合病毒衣殼可以包含AAV1Cap蛋白或亞基以及至少一個AAV2Cap或亞基。嵌合衣殼可以，例如，包含具有一個或多個B19Cap亞基的AAV衣殼，例如AAVCap蛋白或亞基可以被B19Cap蛋白或亞基代替。例如，在優選實施方案中，AAV衣殼的Vp3亞基可以被B19的Vp2亞基代替。包裝的病毒載體的生產本發明包括可以被培養以產生本發明的包裝的病毒載體的包裝細胞。本發明的包裝細胞一般包括具有異源的(1)病毒載體功能，(2)包裝功能，以及(3)輔助功能的細胞。這些組分功能的每一種將在后面部分中討論。病毒載體功能本發明的包裝細胞包含病毒載體功能以及包裝和載體功能。病毒載體功能通常包含一部分細小病毒基因組，例如AAV基因組，其中rep和cap被刪除并用修飾的FVIII或FIX序列及其相關表達控制序列代替。病毒載體功能包含充分的表達控制序列，導致用于包裝的病毒載體的復制。典型地，病毒載體包含一部分細小病毒基因組，例如AAV基因組，其中rep和cap被刪除并用轉基因及其相關表達控制序列代替。轉基因一般旁側帶有兩個AAVTRS，代替被刪除的病毒rep和capORF。包含了適合的表達控制序列，例如組織特異性啟動子和適合用于促進轉基因在靶細胞中組織特異性表達的其它調控序列。轉基因通常是可以表達產生治療性多肽或標記物多肽的核酸序列。病毒載體可以是任何適合的核酸構建物，例如DNA或RNA構建物，可以是單鏈的、雙鏈的或雙鏈體。病毒載體功能可以適當地提供為雙鏈體載體模板，如Samulski等的美國專利公布No.2004/0029106中所述(出于其講授關于雙鏈體載體，其全部公開內容在此引為參考)。雙鏈體載體是二聚的自身互補的(sc)多核苷酸(典型為DNA)。例如，可以選擇雙鏈體載體的DNA，以便由鏈內堿基配對形成雙鏈發夾結構。雙鏈體DNA載體的兩條鏈都可以包裝在病毒衣殼中。雙鏈體載體提供了與雙鏈DNA病毒載體相當的功能，并可以減少靶細胞合成與通常被病毒包裹的單鏈基因組互補的DNA的需要。在病毒載體中選用的TR(可解離的和不可解離的)優選為AAV序列，其中優選血清型l、2、3、4、5和6。可解離的AAVTRS不需具有野生型TR序列(例如，可以通過插入、缺失、截短或錯義突變來改變野生型序列)，只要TR介導所需的功能例如病毒包裝、整合和/或前病毒拯救等即可。TR可以是用作AAV反向末端重復的合成序列，例如Samulski等的美國專利No.5,478,745中描述的"雙D序列"，其全部公開內容以其全文引為參考。通常，但不是必需的，TR來自同樣的細小病毒，例如兩個TR序列都來自AAV2。包裝功能包括衣殼組分。衣殼組分優選來自細小病毒衣殼，例如AAV衣殼或嵌合AAV衣殼功能。適合的細小病毒病毒衣殼組分的例子是來自細小病毒科的衣殼組分，例如自主細小病毒或依賴病毒。例如，衣殼組分可以選自AAV衣殼，例如AAV1-AAV12，以及其它尚未被鑒定的新衣殼或來自非人類靈長動物來源的衣殼。衣殼組分可以包含來自兩個或多個AAV衣殼的組分。在更優選的實施方案中，一種或多種VP衣殼蛋白是嵌合蛋白，19包含來自兩種或多種病毒、優選為兩種或多種AAV的氨基酸序列，如Rabinowitz等在2002年12月10日授權的題為"重組細小病毒載體及其帝lj備方法(Recombinantparvovirusvectorsandmethodofmaking)"的美國專利6,491,907中所述，其全部公開內容在此以其全文引為參考。例如，嵌合病毒衣殼可以包含來自腺相關病毒(AAV)的衣殼區和來自B19病毒的至少一個衣殼區。嵌合衣殼可以，例如，包含具有一個或多個B19衣殼亞單位的AAV衣殼，例如AAV衣殼亞單位可以被B19衣殼亞單位代替。例如，在優選實施方案中，AAV衣殼的VPl、VP2或VP3亞單位可以被B19的VP1、VP2或VP3亞單位替換。在另一個例子中，嵌合衣殼可以包含2型AAV衣殼，其中2型VPl亞單位已經被來自1、3、4、5或6型AAV衣殼、優選3、4或5型衣殼的VP1亞單位替換。或者，嵌合的細小病毒具有2型AAV衣殼，其中2型VP2亞單位已經被來自1、3、4、5或6型AAV衣殼、優選3、4或5型衣殼的VP2亞單位替換。同樣地，優選的細小病毒中來自1、3、4、5或6型AAV(更優選3、4或5型)的VP3亞單位取代了2型AAV衣殼的VP3亞單位的嵌合。作為另一種可選方案，其中兩個2型AAV亞單位被來自不同血清型AAV(例如1、3、4、5或6型AAV)的亞單位取代的嵌合細小病毒是優選的。在本實施方案的示例性嵌合細小病毒中，2型AAV衣殼的VP1禾BVP2、或VP1和VP3、或VP2和VP3亞單位被不同血清型AAV(例如1、3、4、5或6型AAV)的相應亞單位取代。同樣地，在另一個優選實施方案中，嵌合細小病毒具有l、3、4、5或6型AAV衣殼(優選2、3或5型衣殼)，其中一個或兩個亞單位已經被來自不同血清型AAV的亞單位所取代，如上面對于2型AAV的描述。包裝的病毒載體一般包含修飾的FVIII或FIX序列和旁側帶有TR元件的表達控制序列，足以導致載體DNA的包裝以及隨后修飾的FVIII或FIX序列在轉導細胞中的表達。病毒載體的功能可以，例如，作為質粒或擴增子的組分提供給細胞。病毒載體功能可以在細胞系內存在于染色體外，和/或可以整合到細胞的染色體DNA中。將帶有病毒載體功能的核苷酸序列導入用于復制和包裝的細胞宿主中的任何方法都可以使用，包括但不限于電穿孔、憐酸鈣沉淀、微注射、陽離子或陰離子脂質體、以及脂質體與核定位信號的組合。在病毒載體功能通過用病毒載體轉染來提供的實施方案中，可以使用產生病毒感染的標準方法。包裝功能包裝功能包括病毒載體復制和包裝的基因。因此，例如，如果需要，包裝功能可以包括病毒基因表達、病毒載體復制、病毒載體從整合狀態的拯救、病毒基因表達、以及將病毒載體包裝到病毒粒子中所必需的功能。包裝功能可以使用遺傳構建物例如質粒或擴增子，與包裝細胞一起或分開提供。包裝功能可以在包裝細胞內存在于染色體外，但優選整合到細胞的染色體DNA中。例子包括編碼AAVRep和Cap蛋白的基因。輔助功能輔助功能包括建立包裝細胞的活性感染所需的輔助病毒元件，包裝細胞的活性感染是啟動病毒載體的包裝所需的。例子包括源自于腺病毒、桿狀病毒和/或皰疹病毒的、足以導致病毒載體包裝的功能。例如，腺病毒輔助功能典型包括腺病毒組分Ela、Elb、E2a、E4和VARNA。包裝功能可以通過用所需病毒感染包裝細胞來提供。包裝功能可以使用遺傳構建物例如質粒或擴增子，與包裝細胞一起或分開提供。包裝功能可以在包裝細胞內存在于染色體外，但優選整合到細胞的染色體DNA中。可以使用任何適合的輔助病毒功能。例如，當包裝細胞是昆蟲細胞時，桿狀病毒可以用作輔助病毒。在AAV包裝方法中，皰疹病毒也可以用作輔助病毒。編碼AAVRep蛋白的雜合皰疹病毒可以有利地促進可以更具規模的AAV載體生產計劃。將帶有輔助功能的核苷酸序列導入用于復制和包裝的細胞宿主的任何方法都可以使用，包括但不限于電穿孔、磷酸鈣沉淀、微注射、陽離子或陰離子脂質體、以及脂質體與核定位信號的組合。在輔助功能通過使用病毒載體轉染或使用輔助病毒感染來提供的實施方案中，可以使用產生病毒感染的標準方法。包裝細胞本
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已知的任何適合的允許細胞或包裝細胞都可用于生產包裝的病毒載體。優選哺乳動物細胞或昆蟲細胞。可用于在本發明的實踐中生產包裝細胞的細胞例子包括，例如，人類細胞系，例如VERO、WI38、MRC5、A549、293細胞、B-50或任何其它的HeLa細胞、HepG2、Saos-2、HuH7以及HT1080細胞系。優選用作包裝細胞的細胞系是昆蟲細胞系。允許AAV復制并可以在培養中維持的任何昆蟲細胞都可用于本發明。例子包括草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)例如Sf9或Sf21細胞系，果蠅屬物種(Drosophilaspp.)的細胞系，或蚊子的細胞系，例如白紋伊蚊(Aedesalbopictus)衍生的細胞系。優選的細胞系是草地夜蛾Sf9細胞系。下面的參考文獻出于它們講授使用昆蟲細胞表達異源多肽、將核酸導入這種細胞的方法、以及將這種細胞維持在培養中的方法的考慮而合并在此MethodsinMolecularBiology,《分子生物學方法》，Richard主編，HumanaPress,NJ(1995);O'Reilly等，BaculovirusExpressionVectors:ALaboratoryManual,《桿狀病毒表達載體實驗室手冊》，OxfordUniv.Press(1994);Samulski等，J.Vir.63:3822-8(1989);Kajigaya等，Pro"NatlAcad.Sci.USA88:4646-50(1991);Ruffing等，J.Vir.66:6922-30(1992);Kimbauer等，Vir.219:37-44(1996);Zhao等，Vir.272:382-93(2000);以及Samulski等，美國專利No.6,204,059。在生產過程中，包裝細胞一般包含一種或多種病毒載體功能以及輔助功能和包裝功能，足以導致病毒載體的復制和包裝。這些各種不同的功能可以使用遺傳構建物例如質粒或擴增子，與包裝細胞一起或分開提供，并且它們可以在包裝細胞內存在于染色體外，或整合到細胞的染色體中。可以提供其中已經引入了任何一種或多種所述功能的細胞，例如具有引入到染色體外或整合到細胞染色體DNA中的一種或多種載體功能的細胞系，具有引入到染色體外或整合到細胞染色體DNA中的一種或多種包裝功能的細胞系，或具有引入到染色體外或整合到細胞染色體DNA中的輔助功能的細胞系。治療方法修飾的FVIII或FIX基因可用于與FVIII或FIX相關疾病、例如A型或B型血友病的基因治療。由于FVIII或FIX基因的調控區和/或編碼序列中的一個或多個突變，造成FVin或FIX表達不合適，例如具有不正確的氨基酸序列、或在錯誤的組織中或在錯誤的時間表達、低表達或過表達，因此個體可能需要基因治療。修飾的FVin或FIX基因可用作基因療法，以在需要增強凝血的對象中增強凝血。本發明的載體的靶細胞是能夠表達具有FVIII或FIX活性的多肽的細胞，例如哺乳動物的肝臟系統的細胞、內皮細胞、以及其它具有適合的細胞機制進行前體加工以產生具有FVIII或FIX活性的蛋白的細胞。在一個實施方案中，細胞是在體外培養的正常細胞。靶細胞可以是，例如，人類細胞或其它哺乳動物的細胞，特別是非人類靈長動物或嚙齒目(小鼠、大鼠、兔和倉鼠)、食肉目(貓和狗)和偶蹄目(牛、豬、綿羊、山羊和馬)的哺乳動物。任何細胞類型都可以作為靶。在某些情況下，除了肌細胞之外的任何細胞類型都可以作為靶。在具體的實施方案中，本發明提供了在可藥用載體和/或其它醫藥用、藥劑、載體、佐劑、稀釋劑等中含有本發明載體的藥物組合物，所述載體包含FVIII或FIX的修飾基因。對于注射來說，載體通常是液體。對于其它給藥方法來說，載體可以是固體或液體。對于吸入給藥來說，載體將是可吸入的，并優選是固體或液體微粒的形式。對于注射介質來說，優選使用含有可用于注射溶液的添加劑例如穩定劑、鹽或鹽水和/或緩沖液的水。示例性的可藥用載體包括無菌無熱原的水和無菌無熱原的磷酸鹽緩沖液。生理可接受的載體包括可藥用載體。可藥用載體不是生物學或其它方面有害的載體，即材料可以施用于對象，而引起的有害生物學效應不會超過材料的有利生物學效應。藥物組合物可以用于，例如，細胞的離體(exvivo)轉染，或將病毒載體或細胞直接給對象施用。含有FVIII或FIX的修飾基因的重組病毒載體優選以生物學有效量施用于細胞。如果病毒載體在體內施用于細胞(例如按照下面的描述將病毒施用于對象)，則病毒載體的生物學有效量是足以導致轉基因在耙細胞中轉導和表達的量。用病毒載體轉導的細胞優選以"治療有效量"與藥物載體組合施用于對象。本
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的專業人員將會認識到，治療效果不必須是完全的或治愈性的，只要給對象提供某些益處即可。施用于對象的細胞劑量將根據對象的年齡、病癥和物種、細胞類型、細胞所表達的核酸、給藥方式等變化。通常，每劑施用至少大約102到108、優選大約103到108個細胞。優選細胞以治療有效量施用。本發明的另一方面是以含有修飾基因的載體體內治療對象的方法。將載體施用于需要它的人類對象或動物，可以通過本
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已知的任何施用病毒載體的方法。示例性的施用方式包括直腸、經粘膜、局部、經皮、吸入、腸胃外(例如靜脈內、皮下、真皮內、肌內和關節內)給藥等，以及組織或器官直接注射，可選為鞘內、直接肌內、心室內、靜脈內、腹膜內、鼻內或眼內注射。注射劑可以常規形式制備，作為液體溶液或懸浮液、適合在注射前溶解或懸浮在液體中的固體形式，或作為乳液。或者，人們可以以局部而不是全身性方式施用病毒，例如儲存或緩釋制劑。在其它優選實施方案中，含有修飾的FVIII或FIX基因的本發明載體通過肌內給藥，更優選通過肌肉注射或通過局部給藥。本文公開的載體可以通過任何適合的方法施用于對象的肺部，但是優選通過施用供對象吸入的含有本發明細小病毒載體的可吸入顆粒氣溶膠懸浮劑來給藥。可吸入顆粒可以是液體或固體。含有本發明細小病毒載體的液體顆粒的氣溶膠可以通過任何適合的方式產生，例如使用本
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的專業人員已知的壓力驅動的氣溶膠噴霧器或超聲波噴霧器。參見例如美國專利No.4,501,729。帶有修飾的FVIII或FIX基因的本發明病毒載體的劑量取決于給藥方式、待治療的疾病或病癥、個體對象的狀況、具體的病毒載體、以及要投送的基因，并且可以以常規方式確定。用于獲得治療效果的示例性劑量是病毒滴度為至少大約105、106、107、108、109、101Q、1011、1012、1013、1014、1015轉導單位或更高，優選大約108-1013轉導單位，更優選為1012轉導單位。修飾的FVIII或FIX基因可以作為有適合在耙細胞中表達的調控元件的DNA分子組分施用給藥。修飾的FVm或FIX基因可以作為病毒質粒、例如rAAV載體的組分給藥。病毒粒子可以作為病毒粒子單獨給藥，或者體內直接投送到門脈系統，或者離體治療，離體治療包括將載體病毒粒子體外施用于來自接受治療的動物的細胞，然后將轉導的細胞引回到供體中。實施例該嚙齒類動物可行性研究的結果，證實了雙鏈載體以及比使用AAV2的人類臨床實驗中確立的安全劑量低10到100倍的劑量進行的肝臟介導的FIX基因治療的優越性。AAV2和BNP2.5感染原代人類骨骼肌圖1顯示了使用包含AAV2的不同載體和具有SEQIDNO.17中顯示的序列的嵌合病毒載體BNP2.5體外GFP轉導lx109vgHPMC530,000個細胞。免疫熒光測試原代人類骨骼肌細胞的vWF/因子IX、平滑肌ot-肌動蛋白和橫紋肌肌球蛋白以確保純度(即分別為陰性、陰性和陽性)。只有對細菌、真菌、支原體、HIVDNA以及乙肝和丙肝DNA均為陰性的細胞才被考慮用于載體轉導。這些細胞在第二次傳代分離后在tmns-wdl組織培養條件中建立起來，以促進橫紋肌的良好分化。將60%到80%匯合的細胞單層用從每個細胞MOI為1到100/細胞(總共lx104)的漸增劑量和GFP報告轉基因進行感染(圖l)。圖2顯示了單鏈vs.雙鏈基因組的體外GFP劑量反應。隨時間監測細胞，并將與對照比較的陽性百分率制表。將這些GFP結果與作為陽性對照的在同樣條件下轉導的原代小鼠骨骼肌細胞進行比較。這里標出的陽性轉導(圖2)顯示出人類骨骼肌細胞允許病毒感染。從原代人類骨骼肌分泌載體表達的轉基因這些研究的關鍵是確定人類FIX轉基因是否能夠從原代人類骨骼肌分泌的能力。使用了兩種方法來確定在施用載體后人類FIX轉基因是否成功地從靶細胞分泌。ELISA用于確定FIX抗原的總量，活化部分凝血酶時間(APTT)用于確定功能活性。在轉化的組織培養細胞中，FIX峰表達被確定出現在載體轉導后24小時。每24小時取出細胞培養基并分析FIX，直到轉基因的表達達到平臺。對原代小鼠和人類原代骨骼肌細胞系上清液中的表達水平進行了比較(圖3)，并測量了轉基因的功能活性(圖4)。這些陽性結果支持了人類骨骼肌可以分泌載體衍生的FIX轉基因的結論。圖4顯示了在感染后24小時1x109vg/滴度感染的APTTHPMC體外裂解物。BNP2.5從原代人類骨骼肌表達高出2倍的分泌的FIX水平。圖5顯示了hFIX體外HPMC細胞裂解物表達。每24小時使用ELISA評估BNP2.5，檢測上述的載體轉導后人類骨骼肌的人類FIX轉基因的表達增加(圖5)。這些陽性結果顯示出人類骨骼肌可以分泌載體衍生的FIX轉基因，并且在人類和小鼠原代細胞中BNP2.5都比AAV2更有效。在血友病小鼠模型R333Q中AAV2vs.BNPdsFIX的轉基因表達水平和時程最近開發的B型血友病基因敲除小鼠模型(FIXKO小鼠)再現了人類B型血友病的出血表型，但是因為這些模型不產生FIX，它們不能再現人類顯性表型。此外，用表達FIX轉基因的載體治療這些小鼠通常導致發展出抗體，使得不可能進行長期效能研究。最近教堂山(ChapelHill)的北卡羅來納大學(UniversityofNorthCarolina)開發出的人類FIX小鼠模型R333Q-hFIX，產生了模擬在人類中觀察到的突變(錯義突變)的模型。這些動物表達mRNA轉錄物，并在整個發育過程中可檢測到的循環人類FIX，但是FIX活性低于1%。選擇R333Q突變是因為已經有數據報道了幾位患有嚴重B型血友病的患者表現出該突變。此外，這些CRM+患者具有接近正常的FIX抗原水平，它們的凝血活性通常低于1%。R333Q-hFIX小鼠在形態上與野生型小鼠沒有區別。如果不發生受傷，它們存活得很好，并每窩產仔4-8只，性別比例大約l:1。這些動物表現出與在人類中觀察到的相同的出血表型，使得它們成為研究B型血友病缺陷的基因治療方式的理想模型。此外，人類FIXR333Q基因表達為Ala148Thr二型現象中的丙氨酸形式。因為A-l抗體與148位殘基是蘇氨酸的FIX結合良好而與丙氨酸同種型結合弱，因此表達蘇氨酸同種型的載體容易被檢測出。本研究使用了8-10周齡的動物(圖6)，其中試驗了三種載體劑量。R333Q小鼠(11=5/組)和正常親代動物C57BL6肌內注射表達hFIX的AAV2禾t]BNP2.5ds(圖6)。在設計中加入了一組BNP2.5(ss)-FIX-CMV，以評估載體衣殼向性的重要性。按照Jin等，Blood2004中的描述，隨時間測量FIX蛋白表達水平和轉基因活性水平。在施用載體后每兩周的時間點進行測量，共進行6周。APTT分析被用于測定載體投送的轉基因的活性，并與對照進行比較。對亞組動物進行了Bethesda抑制分析，指出缺乏抗體形成。圖6顯示了ssBNP2.5vs.ssAAV2(圖6A(1,2和3))和dsBNP2.5vs.ssAAV2(圖6B(1,2和3))注射后6周，R333Q模型的FIX表達體內數據。測定肝臟轉導后BNPFIX的性能盡管這種可行性研究的最初主要焦點是確定BNP在骨骼肌中的轉導以用于FIX表達，但顯示AAV2在肝臟中轉導的類似的一期臨床研究已經產生了爭論性結果。AAV2載體在8xl0"到4xl()U/kg的劑量范圍內是安全的，但沒有治療水平的轉基因表達。FIX的治療水平可以在2xl()U/kg時獲得，但FIX轉基因表達是短暫的(4周)。盡管對于FIX蛋白在轉導的肝臟中短暫的表達水平還沒有得到正式的理解，但推測提示高載體劑量可能激起對轉導的肝臟細胞的免疫應答，這支持了下面的結論，即通過使用采用雙鏈載體模板的AAV載體，本發明提供的FIX基因轉移的安全劑量(101()或IO"劑量)同時也是有效的(10-15%的FIX水平)(圖7)。小鼠研究使用BNP在w/C57B16小鼠體內進行。這些實驗采用3個組，每組4只動物；測試帶有FIX轉基因的(ss)AAV2、(ds)BNP-l.l和(ds)BNP-2.5，通過門靜脈給藥施用于肝臟，并監測FIX水平四周以上。從這些實驗得出的數據指出的結論是(i)(ds)BNP比傳統的ssAAV2載體明顯更為有效；(ii)肝臟中載體轉導和FIX表達的效率明顯改善，超過肌肉(培養的原代人類肌原細胞和R333Q體內結果均如此)；以及(iii)這些新的試劑理想地適合用比肌肉介導的FIX基因轉移甚至更低的劑量來達到類似的蛋白表達水平。其它的肝臟數據(優化轉基因)C57B16小鼠中FIX可行性肝臟數據表明，施用到肝臟中的雙鏈基因轉移的安全和有效的劑量，在以前在患者中顯示為安全但不能表達足夠hFIX的載體水平下，是治療性的。為了進一步詳細闡述這一點，我們完成了另外的研究，其中我們開發并使用了轉基因密碼子優化hFIX。當將最優密碼子選擇的計算機程序用于"野生型"hFIX基因時，我們在編碼序列中觀察到了大量稀有密碼子(圖8)。此外，hFIX基因基因含有低GC含量(圖9)，該特點已知是促進mRNA轉換。此外，發現了幾個負性順式作用基序，它們在哺乳動物中可能阻礙表達。同樣地，合成了其中密碼子選擇已經被修改成更接近近似于哺乳動物的最優密碼子偏倚性的hFIX基因。根據計算機分析，我們除去了負性順式作用基序(例如剪接位點，不想要的多聚A信號等)，它們可能對蛋白表達有負面影響。此外，增加了GC含量以延長mRNA的半衰期(圖8)。密碼子選擇按照智人的偏倚性改編，產生了高的密碼子適應指數(CAI)值。在這些修改的基礎上，我們預測優化基因將允許在哺乳動物中更高和更穩定的表達速率。使用帶有優化vs.野生型的hFIX編碼序列的AAV2，我們在體外進行了并行的表達分析(圖9)。根據這些研究，顯然，當以同樣的劑量投送時，優化FIX基因比野生型編碼序列表達了明顯更多的蛋白產物/細胞。密碼子優化后，在C57BL6小鼠中進行了肝臟介導的AAV2臨床實驗載體與雙鏈和雙鏈+密碼子優化轉基因盒的體內載體表達的并行比較。在較早的臨床實驗中顯示的選用的劑量是亞治療性但安全的(4xl0g/kg)。8-10周齡的動物接受單次門靜脈注射(11=4/血清型/劑量)。當施用臨床實驗載體時，結果是臨床實驗的反映，AAV2載體在所有動物體內是亞治療性的。在同樣的載體劑量下，具有雙鏈盒的AAV2在注射后四周表達了治療水平的hFIX，并將這些水平維持過16周，而具有雙鏈的優化轉基因盒的AAV2，從第一周到16周都表達出治療水平，與臨床實驗載體相比hFIXng/ml水平高達70倍(圖10、11、在預先暴露于AAV的動物中對BNP2.5的免疫應答因為BNP2.5帶有大部分AAV2的衣殼骨架以及少量來自AAV1的氨基酸，因此進行了研究以確定該嵌合載體的免疫情況是與親本供體AAV2相同、介于AAV1和AAV2之間、還是截然不同。如果嵌合載體表現出與親本載體不同的免疫情況，這可能表明在預先暴露于AAV1或AAV2的患者中施用載體沒有限制BNP載體轉導的速度。如果數據表明BNP具有與親本載體相同的免疫情況，那么有可能與文獻中確立的研究相同，預先暴露于野生型AAV將對BNP有影響。這些實驗在體外和體內進行。在體外實驗中，C57B16動物被預先暴露于AAV1、AAV2或BNP2.5載體。肌內注射后4周，收集血清，將1ml含有10%FBS的DMEM中密度為lxl()5個細胞/孔的293細胞接種到24孔板中。細胞在37。C培養2-3小時，使其與孔粘附。除去培養基，然后加入lxl(^個腺病毒dl309粒子，終體積為200nl/L。將細胞在37。C繼續溫育1小時，然后清洗兩次。將AAV-GFP載體(lx108個粒子)與用PBS連續稀釋的人類血清在4°C溫育2小時，總體積為25^1(12.5^1連續稀釋的血清樣品加上12.5^1含有lxl()S個粒子的AAV/GFP載體)。將混合物加入到細胞中，總體積為200^1，并在37°C溫育過夜。在熒光顯微鏡下對表達GFP的細胞計數。計算無血清樣品的抑制百分數作為參比。使用最高稀釋度計算中和抗體滴度(圖12)，GFP表達細胞的百分率比沒有血清的對照低50°/。。體內實驗使用同樣的已經用AAV1、AAV2和BNP2.5致敏的C57B16小鼠來進行。4周后，小鼠用BNP載體肌肉內注射進行激惹，所述載體帶有Luc報告基因并帶有圖14中顯示的具有圖15提出的序列的載體，并使用實時成像進行分析(圖13)。在未接觸過抗原的動物中使用同樣劑量的BNP作為對照實驗。結果在施用劑量為lxl()Hvg/kg的優化載體后6周后，表達水平表明了FIX表達從組織培養到體內的相對翻譯。rAAV2提供了基線并測量最低的FIX表達。BNP2.5(ss)和BNP2.5(ds)都顯示出了超過rAAV2的增加，其中單鏈BNP2.5測量到FIX的3-6倍增加，雙鏈BNP2.5導致循環FIX的8-12倍的增加(圖6)。這里描述的工作顯示出含有FIX基因的BNP雙鏈"BNP(ds)"載體可以轉導鼠和牛的橫紋肌和肝細胞，導致FIX基因表達和蛋白分泌到外周血中。開發了修飾的密碼子FVIII(hFVin)序列和旁側序列(分別為SEQIDNO:12和15，圖22和23)，使用計算機程序合成了其中密碼子選擇已經被修改成更接近近似于哺乳動物的最優密碼子偏倚性的hFIX基因，包括了GC含量以及順式作用基序的優化。根據計算機分析，除去了負性順式作用元件(例如剪接位點，不想要的多聚A信號等)，它們可能對蛋白表達有負面影響。此外，增加了GC含量以延長mRNA半衰期。密碼子選擇按照智人的偏倚性改編，產生了高的密碼子適應指數(CAI)值。在這些修改的基礎上，修飾的基因可能允許在哺乳動物細胞、特別是人類細胞或人類來源的細胞中更高和更穩定的表達速度。對于SEQIDNO:10來說，圖16的柱形圖顯示了序列密碼子的百分數，它們屬于某個質量級別中。在所需表達系統中給定氨基酸的最常用密碼子的質量值被設定為100，剩余的密碼子相應分級(也參見Sharp,P.M.,Li,W.H.,NucleicAcidsRes.15(3),1987)。圖17顯示了急劇增加的密碼子質量。圖18顯示了GC含量從44。/。(野生型基因SEQIDNO:19)增加到66%用于優化(SEQIDNO.12)。修飾的基序包括下列:<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>對于SEQIDNO:14來說，圖19顯示了序列密碼子的百分數，它們屬于某個質量級別。密碼子適應指數是0.96。圖21顯示了密碼子質量圖。圖21顯示了GC含量圖；GC含量為62。/。。野生型基因以高頻率使用稀有密碼子，GC含量相當低，這便于mRNA的快速轉換。優化是成功的不存在可能對表達有負面影響的負性順式作用位點(例如剪接位點，多聚A信號等)。GC含量增加以延長mRNA的半衰期并改進載體包裝的效率。密碼子選擇按照智人的偏倚性改編，產生了高CAP值(0.98)。因此，優化基因將允許在智人或其它哺乳動物細胞中高而穩定的表達速率。為了證實這種增加的表達速率，在C57BL6小鼠中進行了肝臟介導的AAV2臨床實驗載體vs.雙鏈和雙鏈+密碼子修改的轉基因盒(包括SEQIDNO:12或15)的載體表達的并行比較。選擇的劑量是已經顯示出是亞治療但安全的劑量(4xl011vg/kg)。8-10周齡的動物將接受單次門靜脈注射"=4/血清型/劑量)。這些實驗在體外和體內進行。在體外實驗中，C57B16動物被預先暴露于AAV1、AAV2、BNP2.5載體、或任何其它適合的細小病毒載體。肌內注射后4周，收集血清，將1ml含有10%FBS的DMEM中密度為lxl()S個細胞/孔的293細胞接種到24孔板中。細胞在37°C培養2-3小時，使其與孔附著。除去培養基，然后加入lxl(^個腺病毒d1309粒子，終體積為200pl/L。將細胞在37。C繼續溫育1小時，然后清洗兩次。將AAV-GFP載體(lxl0S個粒子)與用PBS連續稀釋的人類血清在4°C溫育2小時，總體積為25^11(12.5nl連續稀釋的血清樣品加上12.5^1含有lxl()S個粒子的AAV/GFP載體)。將混合物加入到細胞中，總體積為20(Hd，并在37。C溫育過夜。在熒光顯微鏡下對GFP表達細胞計數。計算無血清樣品的抑制百分數作為對照。使用最高稀釋度計算中和性抗體滴度，其中GFP表達細胞的百分率比沒有血清的對照低50%。體內實驗使用已經用AAV1、AAV2、BNP2.5或任何其它適合的細小病毒載體致敏的同樣的C57B16小鼠來進行。4周后，將小鼠用帶有Luc報告基因的BNP載體肌內注射進行激惹，并使用實時成像進行分析。在未接觸過抗原的動物中使用同樣劑量的BNP作為對照實驗。所有在本文中提到的出版物、專利申請、專利和其它參考文獻以其全文引為參考。權利要求1.用于在人類對象中治療血友病的優化基因，其中所述優化基因已經被修飾，相對于野生型基因增加CG序列并減少順式基序，其中優化基因選自FVIII和FIX。2.權利要求1的優化基因，其中所述基因是FVIII，并具有SEQIDNO:12或15的核苷酸序列。3.權利要求1的優化基因，其中所述基因是FIX，并具有SEQIDNO:7的核苷酸序列。4.權利要求1的優化基因，其中CG序列相對于野生型基因增加至少40%。5.權利要求1的優化基因，其中所述優化基因選自具有SEQIDNO:12或15的核苷酸序列或其互補序列的FVin，以及具有SEQIDNO:7的核苷酸序列或其互補序列的FIX。6.權利要求5的優化基因，其包含在病毒載體中。7.權利要求6的優化基因，其中所述病毒載體是嵌合病毒載體，含有選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVIO、AAV11和AAV12衣殼的衣殼組分。8.權利要求7的優化基因，其中所述嵌合病毒載體包含SEQIDNO:17或其互補序列。9.權利要求5的優化基因，其中所述優化基因旁側帶有AAVTRs。10.權利要求6的優化基因，其中所述病毒載體包含SEQIDNO.1的核苷酸序列。11.在對象中治療血友病的方法，所述方法包括提供至少一種含有優化FVIII或FIX基因的編碼核苷酸序列的重組病毒載體，其中優化基因已經被修飾，相對于野生型基因增加CG序列并減少順式基序；以及在使優化FVIII或FIX核苷酸序列的表達水平在對象中產生治療有效量的FVIII或FIX的條件下，給所述對象施用重組病毒載體。12.權利要求ll的方法，其中所述基因是FVIII，并具有SEQIDNO:12或15的核苷酸序列。13.權利要求11的方法，其中所述基因是FIX，并具有SEQIDNO:7的核苷酸序列。14.權利要求11的方法，其中CG序列相對于野生型基因增加至少40%。15.權利要求ll的方法，其中優化基因選自具有SEQIDNO:12或15的核苷酸序列或其互補序列的FVIII，以及具有SEQIDNO:7的核苷酸序列或其互補序列的FIX。16.權利要求15的方法，其中重組病毒載體是嵌合病毒載體。17.權利要求16的方法，其中所述嵌合病毒載體含有選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12衣殼的衣殼組分。18.權利要求17的方法，其中所述嵌合病毒載體包含SEQIDNO:17或其互補序列。19.權利要求15的方法，其中優化基因旁側帶有AAVTRs。20.權利要求16的方法，其中重組病毒載體包含SEQIDNO.1的核苷酸序列。21.治療血友病的基因療法，包括施用編碼優化FVIII或FIX基因的核苷酸序列，其中優化FVIII或FIX基因已經被修飾，相對于野生型基因增加CG序列并減少順式基序。22.權利要求21的基因療法，其中所述基因是FVin，并具有SEQIDNO:12或15的核苷酸序列。23.權利要求21的基因療法，其中所述基因是FIX，并具有SEQIDNO:7的核苷酸序列。24.權利要求21的基因療法，其中CG序列相對于野生型基因增加至少40%。25.權利要求21的基因療法，其中優化基因選自具有SEQIDNO:12或15的核苷酸序列或其互補序列的FVIII，以及具有SEQIDNO:7的核苷酸序列或其互補序列的FIX。26.權利要求25的基因療法，其包含在病毒載體中。27.權利要求26的基因療法，其中所述病毒載體是嵌合病毒載體，含有選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVIO、AAV11禾nAAV12衣殼的衣殼組分。28.權利要求27的基因療法，其中所述嵌合病毒載體包含SEQIDNO:17或其互補序列。29.權利要求25的基因療法，其中優化基因旁側帶有AAVTRs。30.權利要求26的基因療法，其中所述病毒載體包含SEQIDNO.1的核苷酸序列。31.表達優化FVin或FIX肽或其片段的方法，包括用編碼優化FVIII或FIX肽或其片段的多核苷酸轉染細胞以產生轉化的宿主細胞，其中編碼優化FVIII或FIX基因的多核苷酸已經被修飾，相對于野生型基因增加CG序列并減少順式基序；以及將轉化的宿主細胞維持在足以表達所述肽的生物學條件下。32.權利要求31的方法，其中編碼優化FVIII肽的多核苷酸具有SEQIDNO:12或15的核苷酸序列。33.權利要求31的方法，其中編碼優化FIX肽的多核苷酸具有SEQIDNO:7的核苷酸序列。34.權利要求31的方法，其中CG序列相對于野生型多核苷酸增加至少40%。35.權利要求31的方法，其中所述細胞是肝細胞或肌細胞。36.藥物組合物，其含有下列物質的混合物含有SEQIDNO.7、12、15的序列或其互補序列的分離或純化的核酸；以及可藥用載體。全文摘要本發明涉及用于包含在嵌合病毒載體中的修飾和優化因子VIII或因子IX核酸。使用這種核酸可用于血友病的治療。文檔編號A61K31/70GK101511373SQ200780029324公開日2009年8月19日申請日期2007年6月19日優先權日2006年6月19日發明者理查德·J·薩姆爾斯基申請人:阿斯克肋匹奧生物制藥公司