專利名稱：通過調(diào)節(jié)巨蛋白活性治療眼病的方法和組合物的制作方法
交叉引用
本申請要求于2006年6月22日提交的序列號60/805,586的美國臨時專利申請的利益，其全部以參閱的方式引入。
背景技術(shù)：
脊椎動物的視網(wǎng)膜包含兩種類型的感光細(xì)胞-視桿和視錐細(xì)胞。視桿細(xì)胞專門用于低光條件下的視覺。視錐細(xì)胞敏感性弱，提供非常高的時空分辨率的視覺，并提供色彩感受。在日光條件下，所述視桿細(xì)胞的響應(yīng)是飽和的而視覺完全通過視錐細(xì)胞介導(dǎo)。兩種細(xì)胞類型均包含稱作外節(jié)的包括堆疊膜盤的結(jié)構(gòu)。視覺換能反應(yīng)發(fā)生在這些盤的表面上。視覺中的第一步是由視蛋白-色素分子(視紫紅質(zhì))吸收光子(其涉及從11-順式到全反式的生色團異構(gòu)化)。在光敏感性恢復(fù)之前，所產(chǎn)生的全反式視黃醛必須在視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)(靠近視網(wǎng)膜的單層細(xì)胞)中發(fā)生的多酶過程中被轉(zhuǎn)化還原成11-順式-視黃醛。
目前，對于眼病治療的選擇是有限的，尤其對于涉及視網(wǎng)膜和/或黃斑的眼病。
發(fā)明內(nèi)容
此處描述的是用于治療哺乳動物眼中的眼病的方法和組合物，包括給與哺乳動物有效量的調(diào)節(jié)哺乳動物眼中視網(wǎng)膜和/或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的LDL受體基因家族成員活性的藥物。
在一個實施方式中，眼中視網(wǎng)膜和/或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的LDL受體基因家族成員為巨蛋白(megalin)、巨蛋白相關(guān)蛋白、LRP或LRP相關(guān)蛋白。在另一實施方式中，眼中視網(wǎng)膜和/或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的LDL受體基因家族成員為巨蛋白或巨蛋白相關(guān)蛋白。在進一步的實施方式中，眼中視網(wǎng)膜和/或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的LDL受體基因家族成員為巨蛋白。在進一步的實施方式中，眼中視網(wǎng)膜和/或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的LDL受體基因家族成員為LRP或LRP相關(guān)蛋白。在進一步的實施方式中，眼中視網(wǎng)膜和/或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的LDL受體基因家族成員為LRP。在一個實施方式中，眼中視網(wǎng)膜和/或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的LDL受體基因家族成員為巨蛋白相關(guān)蛋白。在進一步的實施方式中，眼中視網(wǎng)膜和/或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的LDL受體基因家族成員為LRP相關(guān)蛋白。在另一實施方式中，眼中視網(wǎng)膜和/或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的LDL受體基因家族成員為包括圖3中列出的肽序列的蛋白質(zhì)。
在一個實施方式中，哺乳動物眼中視網(wǎng)膜和/或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的LDL受體基因家族成員為類維生素A結(jié)合蛋白受體。在另一實施方式中，哺乳動物眼中視網(wǎng)膜和/或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的LDL受體基因家族成員為RBP和/或IRBP受體。在另一實施方式中，哺乳動物眼中視網(wǎng)膜和/或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的LDL受體基因家族成員為STRA6或STRA6相關(guān)蛋白。在另一實施方式中，哺乳動物眼中視網(wǎng)膜和/或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的LDL受體基因家族成員為STRA6。在另一實施方式中，哺乳動物眼中視網(wǎng)膜和/或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的LDL受體基因家族成員為STRA6相關(guān)蛋白。
LDL受體基因家族成員存在于眼中的RPE細(xì)胞的基膜和頂膜上。在某些實施方式中，RPE細(xì)胞基膜上的受體與眼中RPE細(xì)胞頂膜上的受體不同。在某些實施方式中，RPE細(xì)胞基膜上的受體與RPE細(xì)胞頂膜上的受體相同。在某些實施方式中，藥物調(diào)節(jié)眼中RPE細(xì)胞基膜上的LDL受體基因家族成員的活性。在某些實施方式中，藥物調(diào)節(jié)眼中RPE細(xì)胞頂膜上的LDL受體基因家族成員的活性。在某些實施方式中，藥物調(diào)節(jié)RPE細(xì)胞基膜上的LDL受體基因家族成員的活性而不調(diào)節(jié)RPE細(xì)胞頂膜上的LDL受體基因家族成員的活性。在某些實施方式中，藥物調(diào)節(jié)RPE細(xì)胞基膜上的LDL受體基因家族成員的活性并調(diào)節(jié)RPE細(xì)胞頂膜上的LDL受體基因家族成員的活性。
在某些實施方式中，所述LDL受體基因家族成員的活性是所述LDL受體基因家族成員與維生素結(jié)合蛋白、脂蛋白、免疫和應(yīng)激相關(guān)蛋白、類固醇激素結(jié)合蛋白、激素及前體、肽、酶和酶抑制劑、白蛋白、乳鐵蛋白、血紅蛋白、氣味結(jié)合蛋白、甲狀腺素運載蛋白、藥物和毒素、RAP、鈣(Ca2+)或細(xì)胞色素C的結(jié)合。
在某些實施方式中，所述LDL受體基因家族成員的活性是所述LDL受體基因家族成員與維生素結(jié)合蛋白、載體蛋白、脂蛋白、免疫和應(yīng)激相關(guān)蛋白、類固醇激素結(jié)合蛋白、激素及前體、肽、酶和酶抑制劑、白蛋白、乳鐵蛋白、血紅蛋白、氣味結(jié)合蛋白、甲狀腺素運載蛋白；藥物和毒素、RAP、鈣(Ca2+)或細(xì)胞色素C的結(jié)合。
在某些實施方式中，所述LDL受體基因家族成員的活性是所述LDL受體基因家族成員與維生素結(jié)合蛋白、脂蛋白、免疫和應(yīng)激相關(guān)蛋白、類固醇激素結(jié)合蛋白、激素及前體、肽、酶和酶抑制劑、白蛋白、乳鐵蛋白、血紅蛋白、氣味結(jié)合蛋白、甲狀腺素運載蛋白、多元(polybasic)藥物和毒素、RAP、鈣(Ca2+)或細(xì)胞色素C的結(jié)合。
在一個實施方式中，所述LDL受體基因家族成員的活性是所述LDL受體基因家族成員與視黃醇、視黃醛、視黃醇-RBP復(fù)合體、視黃醇-RBP-TTR復(fù)合體、光感受器間類維生素A結(jié)合蛋白(IRBP)、視黃醇-IRBP復(fù)合體、視黃醛-IRBP復(fù)合體、轉(zhuǎn)鈷銨素-維生素B12、轉(zhuǎn)鈷銨素-維生素B12結(jié)合蛋白、維生素D結(jié)合蛋白、載脂蛋白B、載脂蛋白E、載脂蛋白J/叢生蛋白、載脂蛋白H；免疫球蛋白輕鏈、PAP-1、β2-微球蛋白；性激素結(jié)合蛋白-雌激素、雄激素結(jié)合蛋白-雄激素；甲狀旁腺激素、胰島素、表皮生長因子、促乳素、甲狀腺球蛋白、纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)、尿激酶-PAI-1、tPA-PAI-1、前尿激酶、脂蛋白脂肪酶、血纖維蛋白溶酶原、β-淀粉酶、β1-微球蛋白、溶菌酶；白蛋白、乳鐵蛋白、血紅蛋白、氣味結(jié)合蛋白、甲狀腺素運載蛋白；氨基糖苷類、多粘菌素B、抑肽酶、天花粉蛋白、慶大霉素；RAP、Ca2+或細(xì)胞色素C的結(jié)合。
在一個實施方式中，所述LDL受體基因家族成員的活性是所述LDL受體基因家族成員與藥物和毒素的結(jié)合。在一個實施方式中，所述LDL受體基因家族成員的活性是所述LDL受體基因家族成員與多元藥物和毒素的結(jié)合。在另一實施方式中，所述LDL受體基因家族成員的活性是所述LDL受體基因家族成員與陽離子藥物和毒素的結(jié)合。在另一實施方式中，所述LDL受體基因家族成員的活性是所述LDL受體基因家族成員與陽離子胺藥物和毒素的結(jié)合。在一個實施方式中，所述LDL受體基因家族成員的活性是所述LDL受體基因家族成員與抗菌藥、抗精神病藥、抗抑郁藥、抗心律失常藥(antiarrythmics)、抗心絞痛藥、減食欲藥或降低膽固醇的藥物的結(jié)合。
在一個實施方式中，所述LDL受體基因家族成員的活性是所述LDL受體基因家族成員與氨基糖苷類的結(jié)合。在另一實施方式中，所述LDL受體基因家族成員的活性是所述LDL受體基因家族成員與阿貝卡星(arbekacin)、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、對氨基水楊酸(paramycin)、核糖霉素、利維霉素、丁胺卡那霉素、地貝卡星、布他卡星(butakacin)、妥布拉霉素、鏈霉素、二氫鏈霉素(dihydrostroptomycin)、西索米星、威達米星(verdamicin)、奈替米星或布替卡星的結(jié)合。在另一實施方式中，所述LDL受體基因家族成員的活性是所述LDL受體基因家族成員與阿貝卡星、慶大霉素或卡那霉素的結(jié)合。在另一實施方式中，所述LDL受體基因家族成員的活性是所述LDL受體基因家族成員與慶大霉素的結(jié)合。
在另一實施方式中，所述LDL受體基因家族成員的活性是所述LDL受體基因家族成員與抗瘧藥、抗生素藥、抗結(jié)核藥、抗真菌藥、CNS藥物、心血管藥物、抗腫瘤藥、皮膚病藥物、消炎藥、免疫調(diào)節(jié)藥、口服避孕藥、激素、去鐵胺、煙酸、華法林或擬交感神經(jīng)藥的結(jié)合。
在另一實施方式中，所述LDL受體基因家族成員的活性是所述LDL受體基因家族成員與氯喹、奎寧、氨基糖苷類、稀疏霉素、氯碘羥喹、乙胺丁醇、咪康唑、吩噻嗪、氯丙嗪、阿米替林、麥角酰二乙胺、硝苯地平、乙胺碘呋酮、5-氟尿嘧啶、他莫昔芬、卡氮芥、苯丁酸氮芥、順鉑、米托坦、氮芥、亞硝基脲、長春堿、長春新堿、阿霉素、依曲替酯、角黃素、異維甲酸、皮質(zhì)激素類、布洛芬、吲哚美辛、保泰松、泰洛倫(抗病毒的)α干擾素、口服避孕藥、克羅米酚、去鐵胺、煙酸、華法林、腎上腺素異戊酯、苯腎上腺素或腎上腺素的結(jié)合。
在另一實施方式中，所述LDL受體基因家族成員的活性是所述LDL受體基因家族成員與維生素結(jié)合蛋白的結(jié)合。在另一實施方式中，所述LDL受體基因家族成員的活性是所述LDL受體基因家族成員與類維生素A結(jié)合蛋白的結(jié)合。在進一步的實施方式中，所述LDL受體基因家族成員的活性是所述LDL受體基因家族成員與視黃醇、RBP、視黃醇-RBP復(fù)合體、視黃醇-RBP-TTR復(fù)合體、IRBP或視黃醇-IRBP復(fù)合體的結(jié)合。在進一步的實施方式中，所述LDL受體基因家族成員的活性是所述LDL受體基因家族成員與視黃醇、視黃醇-RBP復(fù)合體或視黃醇-RBP-TTR復(fù)合體的結(jié)合。在進一步的實施方式中，所述LDL受體基因家族成員的活性是所述LDL受體基因家族成員與IRBP或視黃醇-IRBP復(fù)合體的結(jié)合。在進一步的實施方式中，所述LDL受體基因家族成員的活性是所述LDL受體基因家族成員與IRBP、視黃醇-IRBP復(fù)合體或視黃醛-IRBP復(fù)合體的結(jié)合。
在一個實施方式中，所述LDL受體基因家族成員的活性是維生素結(jié)合蛋白、脂蛋白、免疫和應(yīng)激相關(guān)蛋白、類固醇激素結(jié)合蛋白、激素及前體、肽、酶和酶抑制劑、白蛋白、乳鐵蛋白、血紅蛋白、氣味結(jié)合蛋白、甲狀腺素運載蛋白；藥物和毒素、RAP、鈣(Ca2+)或細(xì)胞色素C的轉(zhuǎn)胞吞作用(trancytosis)。
在一個實施方式中，所述LDL受體基因家族成員的活性是維生素結(jié)合蛋白、脂蛋白、免疫和應(yīng)激相關(guān)蛋白、類固醇激素結(jié)合蛋白、激素及前體、肽、酶和酶抑制劑、白蛋白、乳鐵蛋白、血紅蛋白、氣味結(jié)合蛋白、甲狀腺素運載蛋白；多元藥物和毒素、RAP、鈣(Ca2+)或細(xì)胞色素C的轉(zhuǎn)胞吞作用。
在另一實施方式中，所述LDL受體基因家族成員的活性是視黃醇、視黃醇-RBP復(fù)合體、視黃醇-RBP-TTR復(fù)合體、光感受器間類維生素A結(jié)合蛋白(IRBP)、視黃醇-IRBP復(fù)合體、轉(zhuǎn)鈷銨素-維生素B12、轉(zhuǎn)鈷銨素-維生素B12結(jié)合蛋白、維生素D結(jié)合蛋白、載脂蛋白B、載脂蛋白E、載脂蛋白J/叢生蛋白、載脂蛋白H；免疫球蛋白輕鏈、PAP-I、β2-微球蛋白；性激素結(jié)合蛋白-雌激素、雄激素結(jié)合蛋白-雄激素；甲狀旁腺激素、胰島素、表皮生長因子、促乳素、甲狀腺球蛋白；纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)、尿激酶-PAI-1、tPA-PAI-1、前尿激酶、脂蛋白脂肪酶、血纖維蛋白溶酶原、β-淀粉酶、β1-微球蛋白、溶菌酶；白蛋白、乳鐵蛋白、血紅蛋白、氣味結(jié)合蛋白、甲狀腺素運載蛋白；氨基糖苷類、多粘菌素B、抑肽酶、天花粉蛋白、慶大霉素；RAP、Ca2+或細(xì)胞色素C的轉(zhuǎn)胞吞作用。
在一個實施方式中，所述LDL受體基因家族成員的活性是藥物和毒素的轉(zhuǎn)胞吞作用。在一個實施方式中，所述LDL受體基因家族成員的活性是多元藥物和毒素的轉(zhuǎn)胞吞作用。在另一實施方式中，所述LDL受體基因家族成員的活性是陽離子藥物和毒素的轉(zhuǎn)胞吞作用。在另一實施方式中，所述LDL受體基因家族成員的活性是陽離子胺藥物和毒素的轉(zhuǎn)胞吞作用。在一個實施方式中，所述LDL受體基因家族成員的活性是抗菌藥、抗精神病藥、抗抑郁藥、抗心律失常藥、抗心絞痛藥、減食欲藥或降低膽固醇的藥物的轉(zhuǎn)胞吞作用。
在一個實施方式中，所述LDL受體基因家族成員的活性是氨基糖苷類的轉(zhuǎn)胞吞作用。在另一實施方式中，所述LDL受體基因家族成員的活性是阿貝卡星、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、對氨基水楊酸、核糖霉素、利維霉素、丁胺卡那霉素、地貝卡星、布他卡星、妥布拉霉素、鏈霉素、二氫鏈霉素、西索米星、威達米星、奈替米星或布替卡星的轉(zhuǎn)胞吞作用。在另一實施方式中，所述LDL受體基因家族成員的活性是阿貝卡星、慶大霉素或卡那霉素的轉(zhuǎn)胞吞作用。在另一實施方式中，所述LDL受體基因家族成員的活性是慶大霉素的轉(zhuǎn)胞吞作用。
在另一實施方式中，所述LDL受體基因家族成員的活性是抗瘧藥、抗生素藥、抗結(jié)核藥、抗真菌藥、CNS藥物、心血管藥物、抗腫瘤藥、皮膚病藥物、消炎藥、免疫調(diào)節(jié)藥、口服避孕藥、激素、去鐵胺、煙酸、華法林或擬交感神經(jīng)藥的轉(zhuǎn)胞吞作用。在另一實施方式中，所述LDL受體基因家族成員的活性是抗生素藥的轉(zhuǎn)胞吞作用。
在另一實施方式中，所述LDL受體基因家族成員的活性是氯喹、奎寧、氨基糖苷類、稀疏霉素、氯碘羥喹、乙胺丁醇、咪康唑、吩噻嗪、氯丙嗪、阿米替林、麥角酰二乙胺、硝苯地平、乙胺碘呋酮、5-氟尿嘧啶、他莫昔芬、卡氮芥、苯丁酸氮芥、順鉑、米托坦、氮芥、亞硝基脲、長春堿、長春新堿、阿霉素、依曲替酯、角黃素、異維甲酸、皮質(zhì)激素類、布洛芬、吲哚美辛、保泰松、泰洛倫(抗病毒的)α干擾素、口服避孕藥、克羅米酚、去鐵胺、煙酸、華法林、腎上腺素異戊酯、苯腎上腺素或腎上腺素的轉(zhuǎn)胞吞作用。
在一個實施方式中，所述LDL受體基因家族成員的活性是視黃醇、視黃醇-RBP復(fù)合體、視黃醇-RBP-TTR復(fù)合體或視黃醇-IRBP復(fù)合體的轉(zhuǎn)胞吞作用。
在一個實施方式中，所述轉(zhuǎn)胞吞作用為胞吐作用。在另一實施方式中，所述轉(zhuǎn)胞吞作用為胞吞作用。
在另一實施方式中，所述LDL受體基因家族成員的活性是視黃醇、視黃醇-RBP復(fù)合體、視黃醇-RBP-TTR復(fù)合體或視黃醇-IRBP復(fù)合體通過至少一個視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的上皮的轉(zhuǎn)運。
在一個實施方式中，所述藥物增加所述LDL受體基因家族成員的活性。在另一實施方式中，所述藥物降低所述LDL受體基因家族成員的活性。
在一個實施方式中，所述藥物結(jié)合視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞基膜上的LDL受體基因家族成員。在另一實施方式中，所述藥物結(jié)合視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞頂膜上的LDL受體基因家族成員。
在一個實施方式中，所述藥物結(jié)合視黃醇結(jié)合蛋白。在另一實施方式中，所述藥物結(jié)合甲狀腺素運載蛋白。在另一實施方式中，所述藥物結(jié)合光感受器間類維生素A結(jié)合蛋白(IRBP)。
在一個實施方式中，所述藥物調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的表達。在其它實施方式中，所述藥物減少視網(wǎng)膜和/或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的表達。在其它實施方式中，所述藥物增加視網(wǎng)膜和/或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的表達。
在一個實施方式中，所述藥物選自抗體、多肽、核酸、多核酸、聚合物、受體相關(guān)蛋白(RAP)(一類陪伴蛋白，其特別設(shè)計用于協(xié)助胞吞受體的生物合成和胞內(nèi)運輸)或其片段、低分子量有機化合物、維生素結(jié)合蛋白、脂蛋白、免疫和應(yīng)激相關(guān)蛋白、類固醇激素結(jié)合蛋白、激素及前體、肽、酶和酶抑制劑、白蛋白、乳鐵蛋白、血紅蛋白、氣味結(jié)合蛋白、甲狀腺素運載蛋白；多元藥物和毒素、RAP、鈣(Ca2+)、鈣清除劑、還原劑和細(xì)胞色素C。在一個實施方式中，所述藥物選自抗體、多肽、核酸、多核酸、聚合物、受體相關(guān)蛋白(RAP)或其片段、低分子量有機化合物、維生素結(jié)合蛋白、脂蛋白、免疫和應(yīng)激相關(guān)蛋白、類固醇激素結(jié)合蛋白、激素及前體、肽、酶和酶抑制劑、白蛋白、乳鐵蛋白、血紅蛋白、氣味結(jié)合蛋白、甲狀腺素運載蛋白；藥物和毒素、RAP、鈣(Ca2+)、鈣清除劑、還原劑和細(xì)胞色素C。在另一實施方式中，所述藥物為抗體、多肽、核酸、多核酸、聚合物、受體相關(guān)蛋白(RAP)或其片段、低分子量有機化合物、視黃醇、視黃醇-RBP復(fù)合體、視黃醇-RBP-TTR復(fù)合體、光感受器間類維生素A結(jié)合蛋白(IRBP)、視黃醇-IRBP復(fù)合體、轉(zhuǎn)鈷銨素-維生素B12、轉(zhuǎn)鈷銨素-維生素B12結(jié)合蛋白、維生素D結(jié)合蛋白、載脂蛋白B、載脂蛋白E、載脂蛋白J/叢生蛋白、載脂蛋白H；免疫球蛋白輕鏈、PAP-I、β2-微球蛋白、性激素結(jié)合蛋白-雌激素、雄激素結(jié)合蛋白-雄激素；甲狀旁腺激素、胰島素、表皮生長因子、促乳素、甲狀腺球蛋白；纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-I)、尿激酶-PAI-1、tPA-PAI-1、前尿激酶、脂蛋白脂肪酶、血纖維蛋白溶酶原、β-淀粉酶、β1-微球蛋白、溶菌酶；白蛋白、乳鐵蛋白、血紅蛋白、氣味結(jié)合蛋白、甲狀腺素運載蛋白；氨基糖苷類、多粘菌素B、抑肽酶、天花粉蛋白、慶大霉素；RAP、RAP片段、Ca2+、鈣清除劑、還原劑或細(xì)胞色素C。
在一個實施方式中，所述藥物為抗體。在另一實施方式中，所述藥物為多肽。在另一實施方式中，所述藥物為核酸。在另一實施方式中，所述藥物為多核酸。在另一實施方式中，所述藥物為聚合物。在另一實施方式中，所述藥物為氨基糖苷或其衍生物。在另一實施方式中，所述藥物為RAP或其片段。在進一步的實施方式中，所述藥物為低分子量有機化合物。
在另一實施方式中，所述藥物為LDL受體基因家族成員的域。在另一實施方式中，所述藥物為巨蛋白的域。在另一實施方式中，所述藥物為類維生素A結(jié)合蛋白的片段。在另一實施方式中，所述藥物為巨蛋白的片段。
在一個實施方式中，哺乳動物全身給與有效量的所述藥物。在另一實施方式中，經(jīng)口給與哺乳動物有效量的所述藥物。在另一實施方式中，靜脈內(nèi)給與哺乳動物有效量的所述藥物。在進一步的實施方式中，經(jīng)眼給與哺乳動物有效量的所述藥物。在進一步的實施方式中，通過離子電滲給與有效量的所述藥物。在另一實施方式中，通過注射給與哺乳動物有效量的所述藥物。
在一個實施方式中，所述哺乳動物是人。
在另一實施方式中，一種治療哺乳動物眼睛的眼病的方法，包括給與該哺乳動物有效量的調(diào)節(jié)哺乳動物眼中視網(wǎng)膜和/或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的LDL受體基因家族成員的活性的藥物，該方法包括多次給與有效量的藥物。在另一實施方式中，多次給藥之間的時間為至少一個星期。在另一實施方式中，多次給藥之間的時間為至少一天。在進一步的實施方式中，以日為基礎(chǔ)給與哺乳動物所述化合物。
在一個實施方式中，所述方法進一步包括給與至少一種附加的藥物，該藥物選自一氧化氮生成誘導(dǎo)劑、抗炎藥、生理學(xué)上可接受的抗氧化劑、生理學(xué)上可接受的無機物(mineral)、帶負(fù)電荷的磷脂、類胡蘿卜素、他汀類藥物、抗血管生成藥物、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑、13-順式視黃酸或具有通式(A)結(jié)構(gòu)的化合物
通式(A) 其中， X1選自NR2、O、S和CHR2； R1為(CHR2)x-L1-R3，其中， x為0、1、2或3，L1為單鍵或-C(O)-； R2為選自H、(C1-C4)烷基、F、(C1-C4)氟代烷基、(C1-C4)烷氧基、-C(O)OH、-C(O)-NH2、-(C1-C4)烷基胺、-C(O)-(C1-C4)烷基、-C(O)-(C1-C4)氟代烷基、-C(O)-(C1-C4)烷基胺和-C(O)-(C1-C4)烷氧基的結(jié)構(gòu)，和 R3為H或任選地被1-3個獨立選擇的取代基取代的選自(C2-C7)鏈烯基、(C2-C7)炔基、芳基、(C3-C7)環(huán)烷基、(C5-C7)環(huán)鏈烯基和雜環(huán)的結(jié)構(gòu)。
在一個實施方式中，通式(A)的化合物的條件為當(dāng)x為0且L1為單鍵時R3不為H；或其活性代謝物、或其藥學(xué)上可接受的前藥或溶劑合物。在一個實施方式中，所述附加的藥物為一氧化氮生成誘導(dǎo)劑。在一個實施方式中，所述一氧化氮生成誘導(dǎo)劑選自瓜氨酸、鳥氨酸、亞硝基化的L-精氨酸、亞硝?；腖-精氨酸、亞硝基化N-羥基-L-精氨酸、亞硝酰化的N-羥基-L-精氨酸、亞硝基化的L-高精氨酸和亞硝?；腖-高精氨酸。
在一個實施方式中，所述附加的藥物為抗炎劑。在另一實施方式中，所述附加的藥物為選自非甾體抗炎藥、脂肪氧合酶抑制劑、潑尼松、地塞米松和環(huán)氧合酶抑制劑的抗炎藥。
在一個實施方式中，所述附加的藥物為至少一種生理學(xué)上可接受的抗氧化劑。在另一實施方式中，所述附加的藥物為生理學(xué)上可接受的選自維生素C、維生素E、β-胡蘿卜素、輔酶Q和4-羥基-2，2，6，6-四甲基哌啶(tetramethylpiperadine)-N-氧基的抗氧化劑。
在一個實施方式中，所述附加的藥物為至少一種生理學(xué)上可接受的無機物。在另一實施方式中，所述附加的藥物為生理學(xué)上可接受的選自鋅(II)化合物、Cu(II)化合物和硒(II)化合物的無機物。
在一個實施方式中，所述附加的藥物為帶負(fù)電荷的磷脂。在另一實施方式中，所述帶負(fù)電荷的磷脂為磷脂酰甘油。
在另一實施方式中，所述附加的藥物為類胡蘿卜素。在另一實施方式中，所述附加的藥物為選自葉黃素和玉米黃素的類胡蘿卜素。
在另一實施方式中，所述附加的藥物為他汀類藥物。在另一實施方式中，所述附加的藥物為選自羅蘇伐他汀(rosuvastatin)、匹伐他汀(pitivastatin)、斯伐他汀、普伐他汀、西立伐他汀、美伐他汀、velostatin、氟伐他汀、康百汀(compactin)、洛伐他汀、達伐他汀、氟伐他汀(fluindostatin)、阿托伐他汀、阿托伐他汀鈣和二氫康百汀的他汀類藥物。
在一個實施方式中，所述附加的藥物為抗血管生成藥物。在一個實施方式中，所述附加的藥物為選自Rhufab V2、色氨酰-tRNA合成酶、抗VEGF聚乙二醇化適體、角鯊胺、乙酸阿奈可他(anecortaveacetate)、考布他汀(Combretastatin)A4前藥、MacugenTM、米非司酮、subtenon丙炎松、玻璃體內(nèi)的晶狀丙炎松、AG3340、氟輕松和VEGF-Trap的抗血管生成藥物。哌加他尼(Pegaptanib)鈉注射液是FDA批準(zhǔn)的用于治療濕性AMD的抗-VEGF抑制劑，且以商品名MacugenTM出售。
在另一實施方式中，所述附加的藥物為基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑。在另一實施方式中，所述附加的藥物為選自金屬蛋白酶的組織抑制劑、α2-巨球蛋白、四環(huán)素、異羥肟酸鹽(hydroxamate)、螯合劑、合成的MMP片段、琥珀酰巰嘌呤、膦酰胺鹽(phosphonamidate)和羥氨酸(hydroxaminic acid)的基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑。
在一個實施方式中，所述附加的藥物為13-順-視黃酸。
在一個實施方式中，所述附加的藥物具有通式(A)的結(jié)構(gòu)
通式(A) 其中， X1選自NR2、O、S或CHR2； R1為(CHR2)x-L1-R3，其中， x為0、1、2或3，L1為單鍵或-C(O)-； R2為選自H、(C1-C4)烷基、F、(C1-C4)氟代烷基、(C1-C4)烷氧基、-C(O)OH、-C(O)-NH2、-(C1-C4)烷基胺、-C(O)-(C1-C4)烷基、-C(O)-(C1-C4)氟代烷基、-C(O)-(C1-C4)烷基胺和-C(O)-(C1-C4)烷氧基的結(jié)構(gòu)，和 R3為H或任選地被1-3個獨立選擇的取代基取代的選自(C2-C7)鏈烯基、(C2-C7)炔基、芳基、(C3-C7)環(huán)烷基、(C5-C7)環(huán)鏈烯基和雜環(huán)的結(jié)構(gòu)。
在另一實施方式中，通式(A)的化合物的條件為當(dāng)x為0且L1為單鍵時R3不為H；或其活性代謝物、或其藥學(xué)上可接受的前藥或溶劑合物。在另一實施方式中，X1為NR2，其中R2為H或(C1-C4)烷基。在另一實施方式中，x為0。在進一步的實施方式中，x為1且L1為-C(O)-。在另一實施方式中，R3為任選地取代的芳基。在再另一實施方式中，R3為任選地取代的雜芳基。在進一步的實施方式中，X1為NH且R3為任選地取代的芳基。在進一步的實施方式中，所述芳基具有一個取代基。在再進一步的實施方式中，所述取代基為選自鹵素、OH、O(C1-C4)烷基、NH(C1-C4)烷基、O(C1-C4)氟代烷基和N[(C1-C4)烷基]2的結(jié)構(gòu)。在進一步的實施方式中，所述取代基為OH。在另一實施方式中，所述芳基為苯基。
在一個實施方式中，所述附加的藥物為
或其活性代謝物、或其藥學(xué)上可接受的前藥或溶劑合物。
在另一實施方式中，所述附加的藥物為4-羥基苯基維甲酰胺(retinamide)、4-甲氧基苯基維甲酰胺；或其代謝物、或藥學(xué)上可接受的前藥或溶劑合物。
在進一步的實施方式中，兩種或多種藥物同時施用。在進一步的實施方式中，兩種或多種藥物單獨分別施用。在某些實施方式中，兩種或多種藥物以同一藥物組合物施用。在某些實施方式中，兩種或多種藥物以獨立的藥物組合物施用。在某些實施方式中，此處描述的方法包括預(yù)先施用所述附加的藥物。在某些實施方式中，此處描述的方法包括隨后施用所述附加的藥物。在某些實施方式中，此處描述的方法包括預(yù)先和隨后施用所述附加的藥物。
在另一實施方式中，所述方法進一步包括給與哺乳動物選自體外血液分離(rheopheresis)、局限性視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)位、光動力學(xué)療法、玻璃疣激光治療、黃斑裂孔手術(shù)、黃斑轉(zhuǎn)位手術(shù)、Phi-Motion、質(zhì)子束療法、視網(wǎng)膜剝離和玻璃體手術(shù)、鞏膜扣帶術(shù)、黃斑下手術(shù)、經(jīng)瞳孔溫?zé)岑煼ā⒐庀到y(tǒng)I療法、微電流刺激、RNA干擾、給與眼睛藥物(例如碘化二乙氧膦酰硫膽堿或二乙氧膦酰硫膽堿或碳酸酐酶抑制劑)、微芯片植入、干細(xì)胞療法、基因替代療法、核酶基因療法、光感受器/視網(wǎng)膜細(xì)胞移植、激光凝固術(shù)和針灸的治療。
在一個實施方式中，所述方法進一步包括監(jiān)測哺乳動物眼中玻璃疣的形成。在進一步的實施方式中，所述方法進一步包括通過自發(fā)熒光測量哺乳動物眼中的脂褐素的水平。在進一步的實施方式中，所述方法進一步包括測量哺乳動物眼中的視敏度。在另一實施方式中，所述方法包括對哺乳動物眼睛進行視野檢查。在一個實施方式中，所述視野檢查為視野測驗。
在另一實施方式中，所述方法進一步包括測量哺乳動物眼中的N-亞視黃基-磷脂酰乙醇胺、二氫-N-亞視黃基-N-視黃基-磷脂酰乙醇胺、N-亞視黃基-N-視黃基-磷脂酰乙醇胺、二氫-N-亞視黃基-N-視黃基-乙醇胺和/或N-亞視黃基-磷脂酰乙醇胺的自發(fā)熒光。
在一個實施方式中，所述眼病為黃斑變性。在另一實施方式中，所述黃斑變性為少年性黃斑變性。在另一實施方式中，所述少年性黃斑變性為Stargardt病。在另一實施方式中，所述黃斑變性為干性年齡相關(guān)性黃斑變性。在再另一實施方式中，所述黃斑變性是錐-桿營養(yǎng)不良。
在一個實施方式中，所述眼病為與藥物相關(guān)的或藥物誘發(fā)的視網(wǎng)膜病變。
在一個實施方式中，人體為Stargardt病的突變ABCA4等位基因的攜帶者或具有突變ELOV4基因。
在另一實施方式中，所述方法包括測定是否所述哺乳動物是突變ABCA4等位基因的攜帶者或具有Stargardt病的突變ELOV4基因。
在一個實施方式中，給與所述藥物保護哺乳動物的眼睛免受光誘發(fā)的傷害。
在另一實施方式中，所述眼病為地圖樣萎縮的擴散和/或光感受器退化。
在另一實施方式中，此處描述的方法包括視網(wǎng)膜變性的附加治療。
在另一實施方式中，所述人體具有選自Stargardt病、退行性視網(wǎng)膜色素變性、退行性錐-桿營養(yǎng)不良、干性年齡相關(guān)性黃斑變性、滲出性年齡相關(guān)性黃斑變性、錐-桿營養(yǎng)不良、視網(wǎng)膜色素變性、基于脂褐素的視網(wǎng)膜變性、光感受器退化和地圖樣萎縮的眼病或性狀。
在一個實施方式中，此處描述的方法進一步包括測量哺乳動物的閱讀速度和/或閱讀敏銳度。在另一實施方式中，此處描述的方法進一步包括測量哺乳動物眼中盲點的數(shù)目和/或大小。在再另一實施方式中，此處描述的方法進一步包括測量哺乳動物眼中地圖樣萎縮損傷的大小和/或數(shù)目。
在一個實施方式中，眼中視網(wǎng)膜和/或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的LDL受體基因家族成員的活性是從視網(wǎng)膜色素上皮除去脂褐素。在另一實施方式中，巨蛋白的活性是從視網(wǎng)膜色素上皮除去脂褐素。在進一步的實施方式中，所述藥物加強從視網(wǎng)膜色素上皮除去脂褐素。
在另一實施方式中，此處描述的是包含有效量的調(diào)節(jié)哺乳動物眼中視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的LDL受體基因家族成員活性的藥物和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。在另一實施方式中，此處描述的是包含有效量的調(diào)節(jié)哺乳動物眼中視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的巨蛋白活性的藥物和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。在進一步的實施方式中，所述藥物組合物包含適合眼睛給藥的藥學(xué)上可接受的載體。
通過下述詳細(xì)的描述，此處描述的方法和組合物的其它目的、特征和優(yōu)點會變得明顯。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是，所述的詳細(xì)描述和具體的實施例盡管給出了特定的實施方式)，但僅是通過示例的方式給出，因此從這些詳細(xì)的描述中，在本發(fā)明的實質(zhì)和范圍內(nèi)的各種改變和修飾對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說會變得很清楚。
此處引用的所有文獻，包括專利、專利申請和公開文獻，全部以參閱的方式全文引入。
附圖簡要說明
圖1顯示LDL受體基因家族的代表性成員。
圖2顯示人體和大鼠眼組織中的LDL受體，巨蛋白，的檢測。(A)產(chǎn)生的抗純化巨蛋白(來自大鼠腎臟)的抗體用于檢測由大鼠和人體的組織制備的提取物中的巨蛋白-免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)。由大鼠腎臟制備的蛋白提取物用作該項研究的陽性對照。免疫印跡分析顯示出大鼠腎臟中的適當(dāng)分子大小帶(大鼠K，6μg，1道)及大鼠視網(wǎng)膜(Ret，60μg，2道)、大鼠RPE(46μg，3道)和人RPE(20μg，4道)中相同分子大小的相應(yīng)的帶。同時以二聚物(Mr～670kDa)和單體(Mr～335kDa)形式存在的甲狀腺球蛋白用作分子大小標(biāo)準(zhǔn)(size standard)。(B)通過RT-PCR分析測定大鼠RPE和視網(wǎng)膜中巨蛋白的相對表達。為了排除組織污染的可能性，分析大鼠RPE和視網(wǎng)膜的兩個獨立的標(biāo)本。在各標(biāo)本中，分析4個樣品(每個樣品使用1-2μg的總RNA)。數(shù)據(jù)顯示RPE中巨蛋白的表達高于視網(wǎng)膜中約15倍。
圖3顯示通過N-糖苷酶F(PNGase F)進行處理，眼睛巨蛋白的分子大小的減小。已知巨蛋白被重度糖基化。使用PNGase F處理巨蛋白顯示隨著關(guān)聯(lián)的葡聚糖從蛋白質(zhì)上除去，蛋白質(zhì)大小減小。用PNGase F處理大鼠眼杯組織的樣品(在圖面A中以“+”表示)。對照藥品未處理(在圖面A中以“-”表示)。用抗-巨蛋白IgG探測樣品。大鼠腎臟組織用作對照。數(shù)據(jù)顯示PNGase F處理之后，巨蛋白的分子大小減小。處理和未處理樣品的帶經(jīng)限制性蛋白水解，然后進行肽測序。所述兩個樣品的肽圖譜(peptide profile)相同(圖面B)。其中一個肽的MS/MS分析顯示巨蛋白獨特的序列(圖面C)。
圖4顯示大鼠RPE中巨蛋白-免疫反應(yīng)性蛋白的肽測序。圖3中鑒定的巨蛋白-免疫反應(yīng)性蛋白從丙烯酰胺凝膠分離并通過胰蛋白酶處理進行限制性蛋白水解。得到的肽通過液相色譜分離并在電噴射質(zhì)譜儀上通過碰撞誘導(dǎo)解離進行分析。測序的肽確認(rèn)該蛋白為低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白2，也稱作巨蛋白(登記號NM 030827.1，GI13562118)。
圖5顯示用于確定巨蛋白的細(xì)胞定位(cytolocalization)，以及在受體阻斷實驗中用于確定巨蛋白和其它脂蛋白受體在攝取全類維生素A結(jié)合蛋白中的作用的人RPE細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。圖面A中顯示的是用于培養(yǎng)人RPE細(xì)胞的裝置的示意圖。將RPE細(xì)胞接種在滲透性的、含層粘連蛋白的膜上，該膜位于圓筒狀容器的底部。該容器頂部的開口允許通過頂端的介質(zhì)接近RPE細(xì)胞單層的上表面。將該裝置置于更大的圓筒狀容器中，其通過底部介質(zhì)使得能夠接近RPE的下表面。通過電子顯微鏡進行分析揭示以該方式培養(yǎng)的RPE細(xì)胞顯示頂端正確地極化形成頂室(apical chamber)(圖面B)。
圖6顯示人RPE中巨蛋白的細(xì)胞定位。顯示的是人RPE培養(yǎng)物中巨蛋白免疫反應(yīng)的en face共焦影像。巨蛋白免疫反應(yīng)表現(xiàn)為綠色熒光。圖面顯示在頂端RPE細(xì)胞表面(上左)開始并在基面(下右)結(jié)束的連續(xù)1μm的截面。染色的圖案表明了巨蛋白的頂端側(cè)面定位。Z-軸分布的重建證實了主要頂端側(cè)面定位(底部圖面)。在基面觀察到非常少的巨蛋白。
圖7顯示人RPE中巨蛋白介導(dǎo)的RBP-視黃醇的攝取。RPE細(xì)胞基本從血液循環(huán)攝取RBP-視黃醇。此外，也已知RPE細(xì)胞合成RBP并通過細(xì)胞的頂極分泌RBP。進行抗體阻斷實驗以測定在這些過程中巨蛋白是否起作用。將巨蛋白特異性抗體加入到RPE細(xì)胞培養(yǎng)物的頂室中。對照樣品接受相等濃度的免疫前兔IgG?？贵w處理期(4℃2小時)之后，將RBP-視黃醇(10μM)加入到頂端(圖面A和B)或基部(圖面C和D)介質(zhì)任一中。通過細(xì)胞內(nèi)全反式視黃酯(atRE)和全反式視黃醇(atROL)的HPLC定量評價RBP-視黃醇攝取的程度。洗脫峰的UV-可見光譜分析確認(rèn)atRE和atROL的識別(圖面A的插圖)。從頂端介質(zhì)攝取RBP-視黃醇比從基部介質(zhì)攝取的高約3.5倍(比較圖面E中的黑色和紅色棒)。用巨蛋白特異性抗體預(yù)處理RPE細(xì)胞同時抑制頂端(圖面B)和基部(圖面D)的RBP-視黃醇的攝取(圖面E，分別為40％和60％的抑制率)。這些數(shù)據(jù)暗示巨蛋白參與RPE細(xì)胞中RBP-視黃醇的攝取。
圖8顯示通過低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP)和巨蛋白的光感受器間類維生素A結(jié)合蛋白(IRBP)的攝取。LRP(Mr～585kDa)重鏈的特異性抗體用于探測人RPE的表達。免疫細(xì)胞化學(xué)研究表明LRP表達主要在RPE細(xì)胞的頂端表面(圖面A)。免疫印跡分析證明LRP和巨蛋白抗體彼此不發(fā)生交叉反應(yīng)(圖面B)。巨蛋白和LRP的底端定位(分別見圖6和8)利于測定是否這些蛋白可以在IRBP-視黃醇的攝取中起作用。在頂端應(yīng)用IRBP-視黃醇(10μM)之前，用免疫前兔IgG(圖面C)、巨蛋白IgG(圖面D)或LRP IgG(圖面E)任一種對RPE細(xì)胞培養(yǎng)物在4℃預(yù)處理2小時。通過細(xì)胞內(nèi)全反式視黃酯(atRE)的HPLC定量來評價IRBP-視黃醇攝取的程度，這通過uv-可見光譜分析(圖面C的插圖)得到確認(rèn)。數(shù)據(jù)顯示巨蛋白和LRP IgG都顯著抑制IRBP-視黃醇(圖面F，分別為30％和40％的抑制率)。
圖9顯示人RPE中受體相關(guān)蛋白(RAP)的細(xì)胞定位。RAP是約39-kDa的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)駐留蛋白，其起到LDL受體家族的數(shù)個成員(包括巨蛋白)的分子伴侶的作用。使用抗人RAP的抗體探測試人RPE培養(yǎng)物中其它LDL受體的表達。從頂端RPE細(xì)胞表面(上左)到基部表面(下右)的系列截面顯示了在RPE的所有表面上的RAP免疫反應(yīng)性(綠色熒光)。通過RPE細(xì)胞單層的剖面顯示出在RPE質(zhì)膜上的強烈RAP免疫反應(yīng)性。RAP定位于ER中(注意RPE細(xì)胞內(nèi)部的免疫反應(yīng))；因此，基部RAP免疫反應(yīng)性的發(fā)現(xiàn)表明在基部RPE表面上存在RAP相關(guān)LDL受體。
圖10顯示RPE中新的低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白的鑒定和肽測序。同時表現(xiàn)出與巨蛋白的交叉反應(yīng)的抗人RAP抗體用于探測大鼠RPE中額外的LDL受體的表達。免疫印跡顯示大鼠RPE中的兩種蛋白(圖面A，2道)。較高分子量蛋白與巨蛋白一致(與大鼠腎臟中的巨蛋白相比，1道)。較低分子量蛋白(圖面A中的紅色星號)用于肽測序以得到它的身份。全掃描質(zhì)譜法檢測在裂解質(zhì)譜儀中分離的肽(MH+＝1650)(圖面B)。由該肽產(chǎn)生的Y-和B-離子系列產(chǎn)生在LDL家族成員間高度保守的序列(FWTD，圖面C)的序列。YWTD和FWTD基序發(fā)現(xiàn)是LDL受體中的多個串聯(lián)重復(fù)序列且被預(yù)測形成這些蛋白的β-螺旋結(jié)構(gòu)。巨蛋白的拓?fù)鋱D作為實例提供(圖面D)。結(jié)果表明從摘錄的蛋白數(shù)據(jù)庫對整個MS/MS譜進行篩選確認(rèn)所切斷的蛋白為低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白2同種型，具有370kDa的質(zhì)量(登記號XM130308.3)。使用抗人RAP的抗體進行的免疫細(xì)胞化學(xué)分析用于確定人RPE中巨蛋白同種型的細(xì)胞定位。數(shù)據(jù)顯示出主要為基底側(cè)(basolateral)定位(在圖面E中通過箭頭表示)。圖面E中倒置的三角形表明巨蛋白在RPE的頂極表達。
圖11顯示通過RAP抑制人RPE中RBP-視黃醇的基底攝取。從循環(huán)系統(tǒng)攝取RBP-視黃醇發(fā)生在RPE的基底面。揭示了在基底RPE質(zhì)膜上的RAP相關(guān)LDL受體的細(xì)胞定位研究利于確定是否這些受體可以在RBP-視黃醇的基底攝取中起作用。通過結(jié)合這些受體上存在的配體結(jié)合區(qū)域，RAP充當(dāng)LDL受體的侶伴蛋白。因此，RAP也能用作配體結(jié)合拮抗劑。將RAP加入到RPE細(xì)胞培養(yǎng)物的基室中。對照樣品接受相等濃度的免疫前兔IgG。抗體處理期(于4℃2小時)之后，將RBP-視黃醇(10μM)加入到基部介質(zhì)中。通過細(xì)胞內(nèi)全反式視黃酯(atRE)和(atROL)的HPLC定量評價RBP-視黃醇攝取的程度。洗脫峰的UV-可見光譜分析確認(rèn)atRE和atROL的身份(圖面A中的插圖)。用免疫前IgG處理的RPE細(xì)胞顯示atROL強烈攝取和酯化(圖面A)。相反，用RAP預(yù)處理的RPE細(xì)胞(圖面B)顯示RBP-視黃醇的攝取顯著降低。定量數(shù)據(jù)顯示RAP對RBP-視黃醇攝取的抑制率為47％(圖面C)。
圖12顯示具有不同血清RBP-視黃醇水平的小鼠眼杯中巨蛋白的蛋白質(zhì)水平。LDL受體的功能是將RBP-視黃醇攝取到RPE中。RBP敲除小鼠和MPR處理小鼠具有較低的血清RBP-視黃醇水平。通過免疫印跡檢測來自這些小鼠的眼杯組織中的巨蛋白表達。小鼠眼杯的膜片段由野生型小鼠(WT)、RBP敲除小鼠(RBP-/-)、無ABCR(abcr-f-)和MPR處理小鼠(MPR)制備。檢測到兩個免疫反應(yīng)帶(在圖中通過白色箭頭示出)。數(shù)據(jù)顯示與年齡匹配的野生型和abcr敲除小鼠相比，RBP敲除小鼠和MPR處理小鼠中的兩者的蛋白表達降低。
圖13顯示RBP-和IRBP-視黃醇攝取進入人RPE。全RBP和IRBP用熒光探針(Alexa Fluor 488)共價標(biāo)記。將標(biāo)記的蛋白質(zhì)(RBP*和IRBP*)加入到RPE細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的基部(RBP*)或頂端(IRBP*)區(qū)室任一中。在37℃溫育1小時之后，將介質(zhì)移去，將所述細(xì)胞大量洗滌并通過熒光顯微法分析組織樣品。數(shù)據(jù)顯示明確的RBP*和IRBP*攝取進入RPE細(xì)胞中，這表示存在胞吞機制。
圖14顯示RAP抑制基部攝取RBP-視黃醇和頂端攝取IRBP-視黃醇。在用LDL受體拮抗劑，RAP，處理之前(分別為圖面A和B)和之后(分別為圖面D和E)監(jiān)測RPE細(xì)胞攝取IRBP*和RBP*。RAP處理完全抑制基部攝取RBP*和頂端攝取IRBP*。這些數(shù)據(jù)表明攝取過程是通過LDL受體介導(dǎo)的。為了確保視黃醇也被吸收進入RPE細(xì)胞，將所述細(xì)胞洗滌、收集并通過HPLC分析類維生素A的含量。視黃醇攝取到RPE細(xì)胞中引起導(dǎo)致視黃酯形成的快速酯化。視黃酯的定量顯示RPE細(xì)胞確實納入視黃醇并將它酯化成視黃酯(圖面C)。如通過視黃酯含量(圖面F)測定的，RAP預(yù)處理引起視黃醇攝取降低約50％。
圖15顯示視黃醇從IRBP-視黃醇轉(zhuǎn)移到CRBP比從IRBP-視黃醇轉(zhuǎn)移到CRBP的速率更快。與RBP-視黃醇相比，從IRBP-視黃醇攝取視黃醇的速率更高(見圖14，圖面C)表明視黃醇從IRBP-視黃醇轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)視黃醇受體(細(xì)胞視黃醇結(jié)合蛋白(CRBP))可能以更快的速率進行。為了說明這種可能性，我們用等摩爾濃度的CRBP(10μM)溫育IRBP-視黃醇或RBP-視黃醇，并使用標(biāo)準(zhǔn)的CRBP-視黃醇作為參照譜監(jiān)測譜移。CRBP-視黃醇的激發(fā)光譜(圖面A和B中的陰影線)與IRBP視黃醇(圖面A中的紅色跡線)或RBP-視黃醇(圖面B中的綠色跡線)的激發(fā)光譜明顯不同。在37℃溫育1分鐘后，在IRBP-視黃醇的激發(fā)光譜中出現(xiàn)了明顯譜移，表示視黃醇從IRBP轉(zhuǎn)移到CRBP。相反，即使與CRBP一起溫育2小時之后，在RBP-視黃醇的激發(fā)光譜中也沒有觀察到譜移。
圖16顯示攝取RBP-視黃醇和IRBP-視黃醇的假定模型。從基部RPE攝取RBP-視黃醇并隨后與CRBP相連需要RBP蛋白通過溶酶體途徑的降解。相反，由于視黃醇從IRBP直接轉(zhuǎn)移到CRBP，視黃醇從IRBP視黃醇與CRBP關(guān)聯(lián)可以在蛋白降解之前進行。
具體實施例方式 脊椎動物視覺的兩種基本過程支持光感受在感光細(xì)胞內(nèi)將光信號轉(zhuǎn)化成化學(xué)變化，以及涉及視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)的再生過程。視色素發(fā)色團的異構(gòu)化(11-順視黃醛到全反式視黃醛)觸發(fā)一系列反應(yīng)，統(tǒng)稱作光轉(zhuǎn)化(phototransduction)，在恢復(fù)光敏感性之前，得到的全反式視黃醛必須從視蛋白脫輔蛋白質(zhì)分離并異構(gòu)化成11-順式視黃醛。光解產(chǎn)物(全反式視黃醛)在光感受器中首先被還原為全反式視黃醇，然后在稱為視覺循環(huán)的酶過程中，在RPE中轉(zhuǎn)化還原成11-順視黃醛(Rando，R.R.The Biochemistry of the Visual Cycle.Chem.Rev.101，1881-1896，2001)。光感受器通過視網(wǎng)膜下間隙與RPE的頂端表面分離，視網(wǎng)膜下間隙包含稱為光感受器間基質(zhì)(IPM)的特殊的細(xì)胞外物質(zhì)。在視覺循環(huán)中，IPM介導(dǎo)光感受器和RPE之間的關(guān)鍵相互作用，包括粘附、吞噬作用、外節(jié)穩(wěn)定、營養(yǎng)交換、發(fā)育和維生素A運輸。
維生素A在血液中循環(huán)并以全反式視黃醇的形式進入眼睛。這種形式通過視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞的基膜從循環(huán)系統(tǒng)中攝取，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞通過酶作用將全反式視黃醇轉(zhuǎn)化成全反式視黃酯。RPE包含將全反式視黃醇酯轉(zhuǎn)化成11-順式視黃醛必需的酶機構(gòu)。后一種類維生素A從RPE輸送到視網(wǎng)膜中的光感受器外節(jié)(POS)，在其中它與視蛋白聯(lián)合形成視紫紅質(zhì)。
RPE和光感受器之間發(fā)生的重要相互作用是在視覺循環(huán)中類維生素A的交換。光感受器間類維生素A結(jié)合蛋白(IRBP)(光感受器分泌糖蛋白)通過在IPM中溶解類維生素A、通過靶向輸送全反式視黃醇到RPE、通過促進11-順式視黃醛從RPE釋放以及通過將其靶向輸送到外節(jié)參與視覺循環(huán)。IRBP是分子量約140kDa的糖蛋白，氨基酸序列和cDNA是已知的。RPE和IPM之間類維生素A的運輸是通過受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)胞吞作用介導(dǎo)的。IRBP和/或IRBP-視黃醇復(fù)合體和/或IRBP-視黃醛復(fù)合體結(jié)合在RPE細(xì)胞的頂膜上的受體蛋白，例如，舉例來說，LDL受體基因家族成員。在某些實施方式中，結(jié)合IRBP和/或IRBP-視黃醇復(fù)合體和/或IRBP-視黃醛復(fù)合體的LDL受體基因家族成員為例如巨蛋白或巨蛋白相關(guān)蛋白。
RPE形成視網(wǎng)膜-血液屏障的部分，并且也支持感光細(xì)胞的功能。所述RPE細(xì)胞層充當(dāng)光感受器的載體進行如營養(yǎng)物和廢物運輸?shù)墓δ埽约巴淌闪鞒龅腜OS并在RPE細(xì)胞的(酸性)溶酶體器官中降解/處理吞噬的POS。然而，該過程被視網(wǎng)膜的強氧化環(huán)境擾亂，并引起內(nèi)溶酶體(intralysosomal)形成和脂褐素、過氧化類脂類和蛋白殘基的復(fù)合聚合物的聚積。RPE中氧化事件與如年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)的疾病狀態(tài)相關(guān)。
AMD的發(fā)病與RPE中和RPE周圍的復(fù)合物和毒性生化物質(zhì)(毒素)及RPE中的脂褐素的聚積有關(guān)。眼中這些視網(wǎng)膜毒性化合物的聚積是AMD的病因?qū)W中最重要的已知危險因素之一。在至少某些形式的黃斑變性中，RPE中脂褐素的聚積部分地由于用過的視桿細(xì)胞外節(jié)的吞噬作用。視網(wǎng)膜毒性化合物在視桿光感受器外節(jié)的盤中形成。在盤中視網(wǎng)膜毒性化合物進入到RPE中，在這里它們進一步損害POS的吞噬作用并導(dǎo)致RPE的凋亡。包括白天視覺必需的視錐細(xì)胞的感光細(xì)胞失去RPE支持并死亡。
在桿體外節(jié)的盤中形成的一種視網(wǎng)膜毒性化合物是N-亞視黃基-N-視黃基乙醇胺(A2E)，其是視網(wǎng)膜毒性脂褐素的重要組分。A2E通常在盤中形成，但是量少到即使吞噬也不會損害RPE的功能。然而，在某些病理學(xué)狀況下，當(dāng)外節(jié)被吞噬時，大量的A2E在盤中聚積以致RPE“中毒”。通過提高內(nèi)溶酶體pH，A2E在體外已表現(xiàn)出損害RPE細(xì)胞的溶酶體降解功能。
A2E由全反式視黃醛(視桿細(xì)胞視覺循環(huán)的一種中間產(chǎn)物)生成。在正常的視覺循環(huán)中，全反式視黃醛在視桿外節(jié)盤的內(nèi)部生成。全反式視黃醛可與磷脂酰乙醇胺(PE)(盤膜的組分)反應(yīng)形成N-亞視黃基-PE。Rim蛋白(RmP)(位于視桿外節(jié)盤的膜中的ATP-結(jié)合盒運載體)然后將全反式視黃醛和/或N-亞視黃基-PE運送到所述盤的外面并進入視桿外節(jié)胞質(zhì)中。那里的環(huán)境有利于N-亞視黃基-PE的水解。在視桿胞質(zhì)中，全反式視黃醛被還原成全反式視黃醇。然后全反式視黃醇穿過視桿外節(jié)質(zhì)膜進入到細(xì)胞外間隙并被RPE細(xì)胞吸收。通過一系列的反應(yīng)，全反式視黃醇轉(zhuǎn)化成11-順式-視黃醛，其返回到光感受器并繼續(xù)參與在視覺循環(huán)中。
RmP中的缺損可能通過阻止全反式視黃醛從盤中除去而干擾視覺循環(huán)。在稱作Stargardt’s病的隱性形式的黃斑變性中，編碼RmP的基因，abcr發(fā)生突變，而運載體是沒有功能的。結(jié)果，在盤中全反式視黃醛和/或N-亞視黃基-PE被截留。然后N-亞視黃基-PE可與另一全反式視黃醛分子反應(yīng)形成A2E。如上所述，甚至在正常狀態(tài)下也形成一些A2E；然而，當(dāng)其前體由于缺陷運載體的原因而在盤內(nèi)聚積時，它的產(chǎn)量會顯著增加，而因此可能導(dǎo)致黃斑變性。
其他形式的黃斑變性也可以是由導(dǎo)致脂褐素聚積的病理學(xué)原因引起的。Stargardt’s病的顯性形式(已知為染色體6關(guān)聯(lián)的常染色體顯性黃斑營養(yǎng)不良)是通過編碼非常長的長鏈脂肪酸-4(ELOV4)的延長的基因發(fā)生突變導(dǎo)致的。
形成光感受器外節(jié)的高度組織的膜盤需要脂蛋白、膽固醇和磷脂。RPE可能涉及視網(wǎng)膜中這些類脂、脂蛋白和膽固醇的動態(tài)平衡。RPE具有攝取脂蛋白和類脂的受體蛋白)例如LDL受體基因家族成員)，以及損壞的/過氧化的脂蛋白和類脂，例如，在維生素E缺乏過程中在RPE和主動脈的內(nèi)皮中聚積或在動脈粥樣化形成過程中在巨噬細(xì)胞中聚積的(Hayes等，Retinal Pigment Epithelium Possesses BothLDL and Scavenger Receptor Activity.IOVS，vol.30，no.2，225-232，1989)。攝取過氧化的脂蛋白可能加重和/或加速正常RPE功能的破壞并促成AMD致病。氧化的低密度脂蛋白已顯示出對RPE細(xì)胞中光感受器外節(jié)的吞噬作用的抑制(Gordiyenko等，RPE cells InternalizeLow-Density Lipoprotein(LDL)and Oxidixed LDL(oxLDL)in LargeQuantities in vitro and in vivo.IOVS，vol.45，no.8，2822-2829，2004)。在體內(nèi)，RPE能夠納入LDL并聚積LDL沉積。也已顯示血漿LDL，以及氧化的LDL，在運載例如，舉例來說，維生素E的其他分子的同時，也能非常有效地進入RPE中。LDL也已顯示為A2E進入RPE溶酶體的運輸工具(Schutt等，IOVS，vol.41，no.8，2303-2308，2000)。氧化脂蛋白的細(xì)胞內(nèi)攝作用也可以通過例如，舉例來說，LDL受體基因家族成員的受體蛋白識別和結(jié)合在氧化的脂蛋白分子表面上的氧化磷脂而發(fā)生。在一個實施方式中，治療哺乳動物眼睛的眼病的方法和組合物包括給與哺乳動物有效量的調(diào)節(jié)哺乳動物眼中視網(wǎng)膜和/或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的LDL受體基因家族成員活性的藥物，其中所述LDL受體基因家族成員的活性是脂蛋白和/或氧化的脂蛋白的攝取。
在2005年6月10日提交的美國專利申請No.11/150,641、2005年8月17日提交的PCT專利申請No.US 2005/29455、2005年10月25日提交的美國專利申請No.11/258,504、2005年12月8日提交的美國專利申請No.11/296,909和2005年11月4日提交的美國專利申請No.11/267,395中提供了關(guān)于脊椎動物眼睛的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)、視紫紅質(zhì)再生的視覺循環(huán)以及A2E-環(huán)氧乙烷的生物發(fā)生的進一步信息，這些專利文獻的內(nèi)容全部以參閱的方式引入。
黃斑或視網(wǎng)膜變性和營養(yǎng)不良 黃斑變性(也稱作視網(wǎng)膜變性)是涉及黃斑(視網(wǎng)膜中心部分)退化的眼病。約85％～90％黃斑變性病例為“干”(萎縮的或非新生血管)型。在干性黃斑變性中，視網(wǎng)膜的退化與黃斑下面的小的黃色沉積物(已知為玻璃疣)的形成有關(guān)；此外，RPE中脂褐素的聚積導(dǎo)致光感受器退化和地圖樣萎縮。該現(xiàn)象導(dǎo)致黃斑的薄化和干燥(dry out)。給與哺乳動物至少一種調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員活性的藥物，例如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑，能夠減少哺乳動物眼中光感受器退化和/或地圖樣萎縮的形成或限制其擴散。
在＂濕性＂黃斑變性中，新的血管形成(即，新生血管形成)以改善到視網(wǎng)膜組織(尤其是黃斑的下方)負(fù)責(zé)我們的敏感的中心視覺的視網(wǎng)膜一部分的血液供給。新生血管很容易被損壞并有時發(fā)生破裂，導(dǎo)致出血并損傷周圍組織。雖然在所有的黃斑變性案例中，濕性黃斑變性僅僅占約10％，但是它造成約90％的與黃斑變性有關(guān)的失明。稱作血管內(nèi)皮生長因子或VEGF的生長促進蛋白以觸發(fā)眼中的這一異常的血管生長為目標(biāo)。這一發(fā)現(xiàn)已經(jīng)引起對抑制或阻斷VEGF的實驗性藥物的積極研究。研究顯示抗VEGF劑可用于阻斷和抑制異常的血管生長。這些抗VEGF劑阻止或抑制VEGF刺激，因此具有較少的血管生長。這些抗VEGF劑也可以成功地抗血管發(fā)生或阻斷VEGF的能力以誘導(dǎo)視網(wǎng)膜下方的血管生長以及血管泄露。給與哺乳動物至少一種調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員活性的藥物，例如，舉例來說，巨蛋白-調(diào)節(jié)劑，能夠減少哺乳動物眼中濕性年齡相關(guān)性黃斑變性的形成或限制其擴散。同樣，調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員活性的藥物，例如，舉例來說，巨蛋白-調(diào)節(jié)劑，能夠用于治療哺乳動物眼睛黃斑下方脈絡(luò)膜血管新生和異常血管的形成。
Stargardt病為在兒童時期發(fā)病表現(xiàn)為退行性形式的黃斑變性黃斑營養(yǎng)不良。人Rim蛋白(RmP)的ABCA4基因的突變造成Stargardt病。在組織學(xué)上，Stargardt病與RPE細(xì)胞中脂褐素色素顆粒的沉積有關(guān)。雖然AMD中ABCA4突變的流行性仍不確定，但是在退行性視網(wǎng)膜色素變性、退行性錐-桿營養(yǎng)不良以及非滲出性年齡相關(guān)性黃斑變性也涉及到ABCA4的突變。與Stargardt病相似，這些疾病與延遲的視桿暗適應(yīng)有關(guān)。RPE細(xì)胞中的脂褐素沉積在AMD和一些視網(wǎng)膜色素變性的案例中也可明顯看到。此外，常染色體顯性型的Stargardt病是由ELOV4基因的突變引起的。
此外，有通常稱為早發(fā)或青少年黃斑變性的幾種類型的影響兒童、親少年或成人的黃斑變性。這些類型中許多是遺傳的且被看作是黃斑營養(yǎng)不良而非變性。黃斑營養(yǎng)不良的一些實例包括錐-視營養(yǎng)不良、角膜營養(yǎng)不良、Fuch′s營養(yǎng)不良、Sorsby′s黃斑營養(yǎng)不良、Best病和青少年性視網(wǎng)膜劈裂癥，以及Stargardt病。
眼組織中的視黃醇吸收 類維生素A(維生素A及其類似物)是維持許多重要的生理過程所需要的，包括正常再生、正常免疫、正常生長和細(xì)胞分化，以及正常的視力。身體中存在的所有類維生素A必須從日常飲食中獲取。食用富含維生素A的食物后，膳食中的類維生素A(修飾為視黃酯)與其它膳食脂類一起被包裹在乳糜微粒中并儲存在肝星形細(xì)胞中。
為了滿足身體對于類維生素A的需要，肝向循環(huán)系統(tǒng)中分泌結(jié)合到21kDa蛋白質(zhì)上的視黃醇，視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)。人們發(fā)現(xiàn)視黃醇-RBP以1:1的摩爾比與55kDa的蛋白(甲狀腺素運載蛋白(TTR))復(fù)合。在視黃醇-RBP全蛋白可以被運送到肝外靶組織(例如眼睛)之前，它必須與甲狀腺素運載蛋白(TTR)結(jié)合(Zanotti和Bemi，Vitam.Horm.，69271-95(2004))。正是該次級復(fù)合體允許視黃醇在循環(huán)系統(tǒng)中保持更長的時間。與TTR聯(lián)合有助于RBP從肝細(xì)胞釋放，并防止RBP的腎小球濾過和腎分解代謝。
甲狀腺素運載蛋白缺陷的小鼠品系是可以存活和繁殖的，然而顯示出血清視黃醇、視黃醇結(jié)合蛋白和甲狀腺激素水平的顯著抑制，證實了甲狀腺素運載蛋白在維持這些代謝產(chǎn)物在循環(huán)血漿中的正常水平中的作用(Episkopou等，Proc Natl Acad Sci USA，1993，90，2375-2379)。此外，腎臟對甲狀腺素運載蛋白的重吸收通過脂蛋白受體巨蛋白介導(dǎo)(Sousa等，J Biol Chem，2000，275，38176-38181)。該重吸收充當(dāng)防止尿中激素?fù)p失的手段。
巨蛋白(也稱為gp330)為LDL受體基因家族的成員，且位于近端小管細(xì)胞的內(nèi)吞路徑中。巨蛋白為600kDa(以它的糖基化形式)的膜結(jié)合的內(nèi)吞蛋白質(zhì)(endocytic protein)，其起到從腎小管液吸收蛋白的清道夫受體的作用(Christensen等，J.Am.Soc.Nephrol.102224-2236，1999)。在以高親和力結(jié)合巨蛋白的配體中有維生素載體蛋白，例如，舉例來說，類維生素A結(jié)合蛋白，如，舉例來說，視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)和光感受器間類維生素A結(jié)合蛋白(IRBP)。在近端小管細(xì)胞的內(nèi)吞路徑中，巨蛋白是最豐富的胞吞受體蛋白，且負(fù)責(zé)從腎小球的超濾液胞吞攝取包括RBP的蛋白。
視黃醇-RBP-TTR復(fù)合體被運送到靶組織，在這里視黃醇被吸收并用于各種不同的細(xì)胞過程。視黃醇通過RBP-TTR復(fù)合體經(jīng)過循環(huán)系統(tǒng)運送到細(xì)胞是細(xì)胞和組織獲取視黃醇的主要途徑。不像身體中的其他組織，眼睛吸收膳食視黃醇的能力非常差。眼睛必須依賴于結(jié)合到RBP上的視黃醇作為它獲取正常視色素形成需要的類維生素A的主要手段(Vogel等，Biochemistry，2002，41，15360-15368)。
視黃醇結(jié)合蛋白(RBP) 視黃醇結(jié)合蛋白(或RBP)為單多肽鏈，分子量約21kDa。RBP已被克隆并測序，而且測定了它的氨基酸序列(Colantuni等，Nuc.AcidsRes.，117769-7776(1983))。RBP的三維結(jié)構(gòu)顯示出設(shè)計為結(jié)合并保護脂溶性維生素視黃醇的特殊的疏水口袋。在血漿中，約95％的血漿RBP與甲狀腺素運載蛋白(TTR)以1:1的摩爾比聯(lián)合，其中基本上所有的血漿維生素A與RBP結(jié)合。TTR為完全清楚的由四個相同亞基組成的分子量為54,980的血漿蛋白。完全的三維結(jié)構(gòu)(通過X-射線衍射闡明)顯示出四面體排列的主要的β折疊片(Blake等，J.Mol.Biol.，121339-356(1978))。TTR與RBP-視黃醇的復(fù)合被認(rèn)為減少了腎小球濾過視黃醇，由此增加血漿中視黃醇和RBP的半衰期約3倍。
通過RBP與靶細(xì)胞上的細(xì)胞受體(例如，舉例來說，LDL受體基因家族成員)的結(jié)合發(fā)生視黃醇從它的復(fù)合視黃醇-RBP-TTR形式攝取進入例如視網(wǎng)膜和RPE細(xì)胞的細(xì)胞中。在一些實施方式中，所述LDL受體基因家族成員是巨蛋白或巨蛋白相關(guān)蛋白。在一些實施方式中，所述LDL受體基因家族成員是巨蛋白。這一相互作用導(dǎo)致RBP-受體復(fù)合體的胞吞作用并隨后從復(fù)合體釋放出視黃醇，或視黃醇與細(xì)胞視黃醇結(jié)合蛋白(CRBP)結(jié)合，并隨后由細(xì)胞釋放apoRBP進入血漿。其他途徑預(yù)計為視黃醇進入細(xì)胞的替代機制，包括視黃醇單獨攝取進入細(xì)胞。參見Blomhoff(1994)的綜述。
在腎臟中，通過BIAcore實驗已顯示出RBP與純化的巨蛋白結(jié)合，且在巨蛋白缺陷小鼠的尿中發(fā)現(xiàn)了視黃醇(retinod)結(jié)合蛋白和視黃醇，但在對照小鼠中不存在(Christensen EI.等J.Am.Soc.Nephrol.10685-695，1999)。通過免疫細(xì)胞化學(xué)方法在對照小鼠的近端小管中發(fā)現(xiàn)了內(nèi)源性RBP，但在巨蛋白敲除的小鼠中卻不存在。其它組織(例如，舉例來說，視網(wǎng)膜和RPE)也表達巨蛋白或巨蛋白相關(guān)蛋白，且能夠結(jié)合RBP并納入RBP。
由于視覺循環(huán)類維生素A(全反式視黃醛)-A2E的前體的過量生成，在黃斑或視網(wǎng)膜變性或營養(yǎng)不良(包括年齡相關(guān)性黃斑變性和Stargardt病)中形成A2E(脂褐素的主要熒光團)。因此，減少視網(wǎng)膜和RPE中維生素A、11-順式視黃醛和全反式視黃醛的量對于降低A2E和脂褐素的積累和治療年齡相關(guān)性黃斑變性是有利的。
降低血清視黃醇水平是預(yù)想的治療眼睛病癥的一個途徑。治療眼睛病癥的另一途徑是調(diào)節(jié)視黃醇進入眼組織的攝取。在一個途徑中，使用藥物調(diào)節(jié)在視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中表達的LDL受體基因家族成員的活性，從而阻止視黃醇、視黃醇-RBP和/或視黃醇-RBP-TTR復(fù)合體與所述受體結(jié)合，由此抑制類維生素A進入RPE和/或視網(wǎng)膜中。
在另一個途徑中，使用藥物調(diào)節(jié)在視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中表達的LDL受體基因家族成員的活性，從而阻止視黃醇、視黃醇-RBP、視黃醇-RBP-TTR和/或視黃醇-IRBP復(fù)合體與所述受體結(jié)合。抑制視黃醇、視黃醇-RBP、視黃醇-RBP-TTR和/或視黃醇-IRBP復(fù)合體與視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的結(jié)合可以破壞視覺循環(huán)。視覺循環(huán)的破壞可能減少特定眼病中視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中存在的毒性化學(xué)物質(zhì)的量或積聚。
此處確認(rèn)的是屬于視網(wǎng)膜和視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞中的LDL受體基因家族的受體蛋白。在一個實施方式中，所述屬于LDL受體基因家族的受體蛋白為類維生素A結(jié)合蛋白受體。在一些實施方式中，所述受體蛋白為巨蛋白。在一些實施方式中，所述受體蛋白為巨蛋白相關(guān)蛋白。在一些實施方式中，所述受體蛋白為LRP。在一些實施方式中，所述受體蛋白為LRP相關(guān)蛋白。在一些實施方式中，所述受體蛋白為STRA6或STRA6相關(guān)蛋白。在一些實施方式中，所述受體蛋白為STRA6。在一些實施方式中，所述受體蛋白為STRA6相關(guān)蛋白。STRA6已被確認(rèn)為視黃醇結(jié)合蛋白的膜受體，且證據(jù)表明STRA6可以介導(dǎo)維生素A的細(xì)胞攝取。關(guān)于STRA6的其它信息可以在美國專利No.7,173,115，Kawaguchi R.等，2007，Science 315820-25和Blaner W.2007，Cell Metabolism5164-66中找到，其全部以參閱的方式引入。關(guān)于STRA6相關(guān)蛋白的其它信息可以在專利申請US2007/0128188、US 2003/0021788和US 2002/0156252中找到，其全部以參閱的方式引入。
此處提供的是通過拮抗、激動和/或調(diào)節(jié)屬于LDL受體基因家族的視網(wǎng)膜和RPE細(xì)胞中轉(zhuǎn)胞吞受體的活性來預(yù)防、治療或治愈視力缺陷的方法。在某些情況下，RPE基膜上的屬于LDL受體基因家族的受體被LDL受體基因家族結(jié)合劑拮抗，由此阻止RBP-視黃醇、RBP-視黃醇-TTR或視黃醇進入RPE的結(jié)合和攝取。在其它情況下，RPE頂膜上的屬于LDL受體基因家族的受體被LDL受體基因家族結(jié)合劑拮抗，由此阻止視黃醇、視黃醛、IRBP-視黃醇、IRBP-視黃醛或IRBP進入或離開RPE細(xì)胞的結(jié)合和轉(zhuǎn)胞吞作用。
藥品和毒素的毒性作用 許多種眼科病癥或狀況是藥品和毒素處理的結(jié)果。例如在眼科中頻繁使用如氨基糖苷類的抗生素來治療或預(yù)防細(xì)菌感染。已知這些抗生素是耳毒性的、腎毒性的及視網(wǎng)膜毒性的(D’Amico等，RetinalToxicity of Intravitreal Gentamicin Invest.Ophthalm.Vis.Sci.25564-572，1984；Campochiaro等Arch.Ophthalmol.113(3)262-263，1995；Grizzard，Arch Ophthalmol.112(1)48-53，1994)。氨基糖苷類(例如，舉例來說，阿貝卡星、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、對氨基水楊酸、核糖霉素、利維霉素、丁胺卡那霉素、地貝卡星、布他卡星、妥布拉霉素、鏈霉素、二氫鏈霉素、西索米星、威達米星、奈替米星和布替卡星)已顯示在眼組織中聚積和/或在眼中產(chǎn)生毒性作用。在一個實施方式中，藥物阻止抗生素與視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中的LDL受體基因家族成員結(jié)合。在另一實施方式中，此處提供的藥物阻止抗生素通過視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中的LDL受體基因家族成員的結(jié)合和轉(zhuǎn)胞吞作用。
眼睛的其他病癥與顯示眼睛毒性的藥品有關(guān)。某些治療藥物在眼的視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中聚積。在某些情況下，治療藥物在例如，舉例來說，眼的視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞的眼組織中代謝。充滿細(xì)胞色素P450和髓過氧物酶的視網(wǎng)膜可以用于激活外源物為氧化物，導(dǎo)致眼損傷。這些激活的物質(zhì)可以直接形成視網(wǎng)膜加合物或者可以減小眼睛的還原型谷胱甘肽的濃度(Toler，Exp.Biol.Med.229607-615，2004)。在一個實施方式中，對治療藥物與視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員結(jié)合的抑制降低了與使用所述治療藥物有關(guān)的眼睛毒性。在另一實施方式中，治療藥物通過視網(wǎng)膜和RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的結(jié)合和轉(zhuǎn)胞吞作用被此處描述的藥物抑制。
視網(wǎng)膜病變分為兩大類，簡單或非增殖性視網(wǎng)膜病和增殖性視網(wǎng)膜病。簡單視網(wǎng)膜病變包括通過血管壁凸出、通過眼中出血、通過稱作棉絮狀滲出物的小團死亡視網(wǎng)膜細(xì)胞和通過封閉的血管確認(rèn)的缺損。這種形式的視網(wǎng)膜病變被認(rèn)為是輕微的。增殖性的或嚴(yán)重的視網(wǎng)膜病變形式包括通過新生血管、通過眼睛內(nèi)形成的瘢痕組織、通過嚴(yán)重?fù)p傷的封閉血管和通過視網(wǎng)膜脫離滋養(yǎng)它的血管網(wǎng)(視網(wǎng)膜剝離)確認(rèn)的缺損。
許多種治療藥物誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜效應(yīng)可以在醫(yī)學(xué)治療的過程中觀察到(LeBlanc等Regu latory Toxicology and Pharmacology 28，124-132，1998)。許多種類的治療藥物在眼內(nèi)顯示出一些毒性效應(yīng)。已顯示出某些藥物誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜效應(yīng)的藥品包括 -抗瘧藥，例如，舉例來說，氯喹、奎寧； -抗生素，例如，舉例來說，氨基糖苷類、稀疏霉素、氯碘羥喹； -抗結(jié)核藥，例如，舉例來說，乙胺丁醇； -抗真菌藥，例如，舉例來說，咪康唑； -CNS藥物，例如，舉例來說，吩噻嗪類，例如，舉例來說，氯丙嗪、阿米替林、麥角酰二乙胺； -心血管藥物，例如，舉例來說，硝苯地平、乙胺碘呋酮； -抗腫瘤藥，例如，舉例來說，5-氟尿嘧啶、他莫昔芬、卡氮芥、苯丁酸氮芥、順鉑、米托坦、氮芥、亞硝基脲、長春堿、長春新堿、阿霉素； -皮膚病藥物，例如，舉例來說，阿維A酯、斑蝥素、異維A酸； -消炎藥，例如，舉例來說，皮質(zhì)激素、布洛芬、吲哚美辛、保泰松； -免疫調(diào)節(jié)藥，例如，舉例來說，泰洛倫(抗病毒的)α干擾素； -口服避孕藥 -激素類，例如，舉例來說，克羅米酚； -其他，例如，舉例來說，去鐵胺、煙酸、華法林； -擬交感神經(jīng)藥，例如，舉例來說，腎上腺素異戊酯、苯福林，腎上腺素。
所述RPE與毛細(xì)血管壁共同構(gòu)成血-視網(wǎng)膜屏障。治療藥物通過受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)胞吞作用進入眼中的視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞。在一些實施方式中，治療藥物結(jié)合眼中視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員并發(fā)生受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)胞吞作用。此處提供的是治療和/或預(yù)防治療藥物引起的視網(wǎng)膜毒副作用的方法和組合物。在一個實施方式中，通過LDL受體基因家族結(jié)合劑，例如，舉例來說，巨蛋白結(jié)合劑，抑制顯示眼睛毒性的治療藥物與視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的結(jié)合。在另一實施方式中，使用LDL受體基因家族結(jié)合劑拮抗視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中的LDL受體基因家族成員，由此阻止治療藥物結(jié)合和攝取進入視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞。在一個實施方式中，所述治療藥物為抗生素藥物。在另一實施方式中，所述治療藥物為氨基糖苷類。在一些實施方式中，視網(wǎng)膜毒性治療藥物結(jié)合脂蛋白或例如，舉例來說，白蛋白或乳鐵蛋白的載體蛋白。載體蛋白或脂蛋白與視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中的LDL受體基因家族成員的結(jié)合提供視網(wǎng)膜毒性的治療藥物進入視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞的另一方式。在一個實施方式中，LDL受體基因家族結(jié)合劑拮抗視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中的LDL受體基因家族成員，由此阻止載體蛋白或脂蛋白結(jié)合和攝取進入視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞。
LDL受體基因家族 個體蛋白可以具有一個或多個不連續(xù)的單體結(jié)構(gòu)域。這些蛋白通常稱作嵌合蛋白。例如低密度脂蛋白(LDL)受體基因家族成員包含四個主要的結(jié)構(gòu)域富含半胱氨酸的A-域重復(fù)序列、表皮生長因子前體樣重復(fù)序列、跨膜域和胞質(zhì)域。LDL受體基因家族包括低密度脂蛋白(LDL)受體、極低密度脂蛋白受體(VLDL-R)、載脂蛋白E受體2、LDL受體相關(guān)蛋白(LRP)和巨蛋白。家族成員具有下述特性1)細(xì)胞表面表達；2)包括A-域重復(fù)序列的細(xì)胞外配體結(jié)合；3)配體結(jié)合需要鈣；4)識別受體相關(guān)蛋白和載脂蛋白(apo)E；5)包含YWTD重復(fù)序列的表皮生長因子(EGF)前體同源域；6)單跨膜域；和7)各種不同配體的受體介導(dǎo)的胞吞作用。見Hussain等，The MammalianLow-Density Lipoprotein Receptor Family，(1999)Annu.Rev.Nutr.19141-72。還有，所述成員結(jié)合數(shù)種結(jié)構(gòu)不同的配體。
低密度脂蛋白(LDL)受體基因家族的蛋白(Neels，J.G.等，F(xiàn)ibrinolysis Proteolysis 12，219-240，1998)是具有相似結(jié)構(gòu)并在它們的胞外域結(jié)合不同范圍的蛋白質(zhì)配體一組相關(guān)的嵌合型跨膜受體。與任何LDL受體基因家族成員結(jié)合的配體通過經(jīng)典的胞吞作用被納入(Chen等，J.Biol.Chem.265，3116-3123，1990)。在人體中，已知的LDL受體基因家族蛋白的組包括，例如LDL受體(Russell，D.等，Cell 37，577-585，1984)、LDL受體相關(guān)蛋白(LRP)(Herz，J.等，EMBOJ.7，4119-4127，1988；Kristensen，T.等，F(xiàn)EBS Lett.276，151-155，1990)、極低密度脂蛋白受體(VLDLR)(Webb，J.C.等Hum.Mol.Genet.3，531-537，1994)、apoE受體2(apoER2)(Kim等J.Biol.Chem.271，8373-8380，1996)、巨蛋白/gp330/LRP2(Hjalm，G.等Eur.J.Biochem.239，132-137，1996)、LRP6(Brown等Biochem.Biophys.Res.Commun.248，879-888，1998)和LRP7(Hey，P.J.等，Gene(Amst.)216，103-111，1998；Dong，Y.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.251，784790，1998)。見圖1。
所述LDL受體基因家族成員是一族單次穿膜的I型蛋白質(zhì)，其通過胞吞途徑介導(dǎo)各種蛋白質(zhì)裝載攝取進入細(xì)胞(Krieger，M.和Herz，J.Structures and functions of multilig and lipoproteinreceptorsmacrophage scavenger receptors and LDL receptor-related protein(LRP).Annu.Rev.Biochem.63，601-637，1994)。各個受體結(jié)合許多不同的裝載蛋白，且連續(xù)循環(huán)到細(xì)胞表面和離開細(xì)胞表面。某些配體可以結(jié)合不同的LDL受體基因家族成員。某些配體可以僅結(jié)合一種LDL受體基因家族成員。在一些實施方式中，某些LDL受體基因家族成員可以結(jié)合相同的配體。在其他實施方式中，僅一種LDL受體基因家族成員可以結(jié)合特定的配體。在其他實施方式中，在不同組織類型中表達的LDL受體基因家族成員結(jié)合相同的配體。在其他實施方式中，在不同組織類型中表達的LDL受體基因家族成員不結(jié)合相同的配體。在一些實施方式中，在細(xì)胞的不同部分表達的LDL受體基因家族成員結(jié)合相同的配體。在其他實施方式中，在細(xì)胞的不同部分表達的LDL受體基因家族成員結(jié)合相同的配體。在一些實施方式中，在RPE細(xì)胞基膜上存在的LDL受體基因家族成員結(jié)合到也與RPE細(xì)胞頂膜上存在的LDL受體基因家族成員結(jié)合的相同的配體上。在一些實施方式中，在RPE細(xì)胞基膜上存在的LDL受體基因家族成員不結(jié)合也與RPE細(xì)胞頂膜上存在的LDL受體基因家族成員結(jié)合的相同的配體。
LDL受體基因家族成員的特征是具有5個共同結(jié)構(gòu)基序 -a)配體結(jié)合(補體)型富含半胱氨酸的重復(fù)序列； -b)表皮生長因子(EGF)受體樣富含半胱氨酸的重復(fù)序列； -c)酪氨酸-色氨酸-蘇氨酸-天門冬氨酸(YWTD)域； -d)單跨膜段；和 -e)包含1-3NPxY基序的胞質(zhì)尾。
氨基端區(qū)域包含配基結(jié)合型重復(fù)序列，為特征是具有三個內(nèi)二硫鍵的約40個氨基酸的鏈，形成2和11個單重復(fù)序列的簇。這些受體的配體的大部分與這些配體結(jié)合域相互作用。多樣配體結(jié)合域的存在導(dǎo)致配體與受體結(jié)合的不同模式。在一些LDL受體基因家族成員中，具有用于不同配體的多樣的、獨立的結(jié)合位點。對于一些配體，在受體上僅僅存在單個的高親和力結(jié)合位點。在一些情況下，兩種或多種具有不同結(jié)合位點的不同配體可以同時結(jié)合受體。在一些情況下，受體蛋白可以以高親和力結(jié)合很多結(jié)構(gòu)上顯著不同的配體，這是由于在受體蛋白中存在多重配體結(jié)合型重復(fù)序列、各個重復(fù)序列獨特的輪廓表面和電荷分布以及配體和受體兩者之間的多重相互作用。一些配體能夠識別這些重復(fù)序列在序列式樣上的不同組合，而其他配體表現(xiàn)出識別來自分離的簇的重復(fù)序列。已有報道RAP占用受體蛋白巨蛋白上的兩個結(jié)合位點(Beeg，EJ.Br.J.Clin.Pharmacol.39，597-603，1995)，然而每一巨蛋白蛋白質(zhì)結(jié)合約60-100個分子的低分子量有機化合物慶大霉素(Schmitz，C.J.Biol.Chem.227，618-622，2002)。
配體結(jié)合(補體)型富含半胱氨酸的重復(fù)包含許多能夠結(jié)合陽離子配體的帶負(fù)電荷殘基(參見，例如US 2003/0202974，以參閱方式引入)。在一些實施方式中，結(jié)合陽離子配體是通過與受體蛋白的離子相互作用實現(xiàn)的。
配體結(jié)合域伴隨半胱氨酸豐富的表皮生長因子(EGF)前體型重復(fù)，通過半胱氨酸缺乏的間隔區(qū)域分開。所述間隔區(qū)域包含負(fù)責(zé)配體在吞飲泡區(qū)室(endosomal compartment)內(nèi)pH依賴性釋放的YWTD基序。EGF前體型重復(fù)序列側(cè)臨的YWTD基序稱作EGF前體同源域。在LRP和gp330中，EGF前體同源域伴隨另一配體結(jié)合域或間隔區(qū)。
與它們的胞外域相反，除了特征為共有序列NpxY(其表示四氨基酸基序天冬酰胺-脯氨酸-X-酪氨酸；其中，X代表任意氨基酸)的短的氨基酸基序外，不同受體的胞質(zhì)尾共有非常少序列相似性，共有序列NpxY介導(dǎo)胞吞之前有被小窩(coated pit)中的LDL受體成簇(Willnow T.E.等Nature Cell Biology，vol1，E157-E162，1999)。
一些LDL受體基因家族成員，例如LDL受體和VLDL受體，包含緊靠單跨膜段的胞外空間的O-連接的糖域。
LDL受體基因家族成員已被測序，例如，舉例來說 LRP(LDL受體相關(guān)蛋白；α-2-巨球蛋白受體) cDNAX13916NM_002332 基因AH003324 LRP2(巨蛋白；gp330；gp600) cDNAU33837 基因NT_002176 載脂蛋白E受體2(ApoE受體2；LRP8) cDNAD50678 基因SEG_D86389S 極低密度脂蛋白受體(VLDL受體) cDNAD16493 基因SEG_HUMVLDLR LRP1B cDNANM_018557 MGEF-7 cDNAAB011540 LDL受體 細(xì)胞使用LDL受體通過低密度脂蛋白(LDL)的胞吞作用從血液中吸收膽固醇。結(jié)合它們的配體之后，LDL受體在質(zhì)膜的有被小窩內(nèi)成簇。接著形成胞吞小泡形成并納入，在溶酶體中胞吞的脂蛋白水解并將脂類釋放到細(xì)胞質(zhì)中(Brown等A receptor-mediated pathway forcholesterol homeostasis.Science.232，34-47(1986))。通過介導(dǎo)包含載脂蛋白B和/或載脂蛋白E(apoE)的脂蛋白的細(xì)胞納入，LDL受體在膽固醇動態(tài)平衡中起關(guān)鍵的作用。LDL受體具有包含將該受體定向到網(wǎng)格蛋白被覆小窩的NPxY序列(Asn-Pro-x-Tyr，其中x代表任意氨基酸)的50個殘基的胞質(zhì)域。細(xì)胞外部分包含O-連接的糖域和兩簇富含半胱氨酸的重復(fù)序列。緊靠O-連接的糖域的第一個富含半胱氨酸的簇具有與表皮生長因子樣重復(fù)序列的同源性，表皮生長因子樣重復(fù)序列由5個復(fù)本的重復(fù)序列分隔，每個復(fù)本包含共同的四肽，酪氨酸-色氨酸-蘇氨酸-天門冬氨酸(YWTD)。表皮生長因子同源性對LDL受體發(fā)生酸依賴的構(gòu)象變化以釋放吞飲泡(endosome)中的配體是必需的，從而允許未被占據(jù)的受體循環(huán)回到細(xì)胞表面。第二個富含半胱氨酸的簇包含7個補體樣重復(fù)序列，其負(fù)責(zé)配體載脂蛋白B和E的結(jié)合。
LDL受體相關(guān)蛋白(LRP) LDL受體相關(guān)蛋白(LRP)比LDL受體基因家族的其他成員大但是結(jié)構(gòu)上類似(Herz等J.Clin.Invest.108779-784，2001；Willnow等Nature Cell Biology，vol.1，E157-E162，1999；Kreiger等Structures andfunctions of multiligand lipoprotein receptorsmacrophagescavengerreceptors and LDL receptor-related protein(LRP).Annu.Rev.Biochem.63601-637(1994))。LRP合成為600kDa的前體(LRP600)，其被分割生成氨基端的515kDa片段(LRP515)和羧基端的85kDa片段(LRP85)。LRP515包含(harbor)所有已知的配體結(jié)合位點且保持與LRP85(其包含膜錨固點和胞質(zhì)域)非共價鍵結(jié)合。
此處使用的“LRP”指的是其cDNA編碼序列與cDNAX13916NM_002332(基因AH003324)具有至少75％的核苷酸同一性的蛋白。
此處使用的“LRP相關(guān)蛋白”指的是屬于LDL受體基因家族且具有與LRP的超過50％的同源性的蛋白，或與抗-LRP抗體(特異性抗體)高度特異性地反應(yīng)的蛋白。
然而，LDL受體表現(xiàn)為只在脂蛋白代謝中起作用，LRP和其他該家族的成員顯示出具有其他顯著不同的功能。LRP的許多功能中，已顯示出通過LRP的胞吞活動在肝臟中吸收乳糜微粒。其他的LRP結(jié)合配體包括 -蛋白酶類及抑制劑復(fù)合體例如，舉例來說，α2M-蛋白酶復(fù)合體、妊娠區(qū)帶蛋白質(zhì)(PZP)-蛋白酶復(fù)合體、t-PA、u-PA、t-PA:PAI-1、u-PA:PAI-1、uPA:蛋白酶連接蛋白1、組織因子途徑抑制劑、彈性酶-α1-抗胰蛋白酶、α1-抗胰蛋白酶、C1抑制劑； -脂蛋白例如，舉例來說，apo E、apo E-富集的β-VLDL、脂蛋白脂肪酶、脂蛋白脂肪酶富集的VLDL、脂蛋白脂肪酶富集的β-VLDL、肝脂酶； -血液凝結(jié)或血液凝固劑例如，舉例來說，凝血因子IXa、凝血因子VIIIa、凝血因子VIIa/TFPI、抗凝血酶III、THPI、肝素輔因子II； -侶伴蛋白，例如，舉例來說，HSP-96、RAP； -基質(zhì)蛋白例如，舉例來說，凝血栓蛋白-1、凝血栓蛋白-2； -其他分子例如，舉例來說，假單胞菌外毒素A、乳鐵蛋白、RAP、α2-巨球蛋白(macroglubulin)、乳糜微粒殘留物、補體C3、鞘脂(spingolipid)激活蛋白(SAP)、鼻病毒、HIV-Tat蛋白、MMP-13、MMP-9、激素促甲狀腺激素、輔因子鈷銨素和溶酶體蛋白鞘脂激活蛋白(saposin)；RBP和iRBP。
巨蛋白 巨蛋白也稱為gp330或LRP2，其糖基化的形式為600-kDa的細(xì)胞表面蛋白，其在包括腎臟近端小管、內(nèi)耳的耳蝸和眼的睫狀體上皮的許多人體上皮細(xì)胞表面上表達(Christensen等Essential Role ofMegalin in Renal Proximal Tubule for Vitamin Homeostasis.J.Am.Soc.Nephrol.102224-2236，1999)。如這里所示的，至少巨蛋白或至少一種巨蛋白相關(guān)蛋白也在眼的視網(wǎng)膜和RPE細(xì)胞中表達。
從大鼠和人的巨蛋白中推導(dǎo)出的cDNA序列編碼約600kDa的蛋白，其顯示出LDL受體基因家族胞吞受體的所有標(biāo)志。巨蛋白是具有單跨膜域的1型細(xì)胞表面轉(zhuǎn)胞吞受體。巨蛋白屬于低密度脂蛋白(LDL)受體基因家族。巨蛋白是具有單跨膜域、短的胞質(zhì)尾和延伸到細(xì)胞外間隙的大的氨基端部分的1型細(xì)胞表面胞吞受體。所述氨基端區(qū)域包含配體結(jié)合(補體)型富含半胱氨酸的重復(fù)序列，重復(fù)序列為約40個氨基酸的鏈，各以3個內(nèi)部二硫鍵為特征。這些重復(fù)序列構(gòu)成配體結(jié)合位點，且已證明數(shù)個配體結(jié)合配體結(jié)合重復(fù)序列第二簇中的相同或密切相關(guān)的位點(Orlando RA.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 942368-2373，1997)。此外，巨蛋白包含富含半胱氨酸的表皮生長因子(EGF)前體型重復(fù)序列，其被半胱氨酸缺乏的間隔區(qū)域分隔。所述間隔區(qū)域包含負(fù)責(zé)吞飲泡區(qū)室中配體的pH依賴性釋放的YWTD基序。巨蛋白的胞質(zhì)尾攜帶指引受體進入有被小窩的3個復(fù)本的NPxY基序。巨蛋白不包含O-連接的糖域，其在例如，舉例來說，LDL受體和VLDL受體的一些基因家族受體中發(fā)現(xiàn)。
巨蛋白的細(xì)胞外部分和LRP類似于LDL受體域的多個復(fù)本。巨蛋白和其他家族成員之間全氨基酸序列的同一性在30和50％之間變化。
所述巨蛋白受體的序列顯示為 -cDNAU33837 -基因NT_002176 人的巨蛋白基因位于染色體2q24-q31上(Korenberg JR.等Genomics 2288-93，1994)。
與主要作用是介導(dǎo)負(fù)載膽固醇的脂蛋白的細(xì)胞攝取的LDL受體不同，巨蛋白、LRP和其他LDL受體基因家族成員以高親和力結(jié)合和/或識別多種結(jié)構(gòu)顯著不同的配體。巨蛋白已顯示出起到主要參與蛋白質(zhì)、脂溶性維生素和類固醇激素攝取進入表達受體的組織的混合(promiscuous)清道夫受體。巨蛋白結(jié)合配體包括不同蛋白和化學(xué)物質(zhì)的很長的清單。
巨蛋白結(jié)合配體包括 -維生素結(jié)合蛋白，其包括，例如轉(zhuǎn)鈷胺素-維生素B12、維生素D結(jié)合蛋白、視黃醇結(jié)合蛋白、光感受器間類維生素A結(jié)合蛋白； -脂蛋白，其包括，例如載脂蛋白B、載脂蛋白E、載脂蛋白J/叢生蛋白、載脂蛋白H/β2-糖蛋白-I； -免疫和應(yīng)激相關(guān)蛋白，其包括，例如免疫球蛋白輕鏈、PAP-1、β2-微球蛋白； -類固醇激素結(jié)合蛋白，其包括，例如性激素結(jié)合蛋白-雌激素、雄激素結(jié)合蛋白-雄激素； -激素類和前體，其包括，例如甲狀旁腺激素、胰島素、表皮生長因子、促乳素、甲狀腺球蛋白； -酶和酶抑制劑，其包括，例如PAI-1、PAI-1-尿激酶、PAI-1-tPA、前尿激酶、脂蛋白脂肪酶、血纖維蛋白溶酶原、β-淀粉酶、β1-微球蛋白、溶菌酶、抑肽酶； -其他載體蛋白，其包括，例如白蛋白、乳鐵蛋白、血紅蛋白、氣味結(jié)合蛋白、甲狀腺素運載蛋白； -低分子量的肽和激素，其包括，例如PTH、胰島素、β2-微球蛋白、表皮生長因子、促乳素、溶菌酶、細(xì)胞色素C； -藥品和毒素，其包括，例如氨基糖苷類、慶大霉素、多粘菌素B、抑肽酶、天花粉蛋白； -抗體，其包括，例如抗巨蛋白抗體、兔抗大鼠巨蛋白抗體、兔免疫前IgG； -其他配體包括，例如RAP、Ca2+、細(xì)胞色素C、視黃醇、視黃醛、EDTA、甲狀腺球蛋白、血纖維蛋白溶酶原、白蛋白、乳鐵蛋白。
巨蛋白與它的配體通過受體的胞外域相互作用。結(jié)合的發(fā)生或通過復(fù)雜的蛋白-蛋白相互作用(如果所述配體是蛋白質(zhì))，或通過帶正電荷物質(zhì)與補體型重復(fù)序列中的帶負(fù)電荷氨基酸的隊列的簡單離子相互作用(如果所述配體是化合物)。脂溶性維生素和類固醇激素與巨蛋白的結(jié)合是間接的并通過所述受體與血漿中運輸這些物質(zhì)的特異性載體蛋白(例如，舉例來說，視黃醇結(jié)合蛋白或光感受器間類維生素A結(jié)合蛋白)的相互作用介導(dǎo)。
此處使用的“巨蛋白”指的是在哺乳動物的視網(wǎng)膜或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中表達的蛋白，它的cDNA序列編碼具有與Korenberg，J.R.等(Genomics.1994 Jul1；22(1)88-93，1994)披露的基因登錄號U04441、Hjalm，G.等(Eur J Biochem.239(1)132-7，1996))披露的基因登錄號U33837的人巨蛋白cDNA序列或Saito等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，919725-9729，1994)披露的基因登錄號L34049的大鼠巨蛋白cDNA序列至少75％的核苷酸同一性。
此處使用的“巨蛋白相關(guān)蛋白”指的是屬于LDL受體基因家族且具有與巨蛋白超過50％的同源性的蛋白；或與抗-巨蛋白抗體(特異性抗體)高度特異性地反應(yīng)的蛋白。
“巨蛋白結(jié)合配體”意思是(1)與巨蛋白結(jié)合的物質(zhì)，(2)通過由巨蛋白介導(dǎo)的機制，通過胞吞進入到細(xì)胞中的物質(zhì)或(3)自身與(1)或(2)定義中描述的物質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)。
術(shù)語“內(nèi)源性巨蛋白結(jié)合配體”意思是哺乳動物體內(nèi)起源或生成的巨蛋白結(jié)合配體。
“核苷酸同一性”意思是相對于另一個核苷酸序列(如，人巨蛋白的核苷酸序列)計算的某核苷酸序列的序列對比。具體地，該術(shù)語指的是使用標(biāo)準(zhǔn)化算法對比的至少兩個核苷酸序列之間的殘基匹配的百分?jǐn)?shù)。為了使得序列之間的對比最佳，這種算法可以以標(biāo)準(zhǔn)化的和可重現(xiàn)的方式在比較的序列中插入間隙(gap)，由此達到更加有意的比較。核苷酸序列之間的百分同一性優(yōu)選使用引入到MEGALIGNTM序列對比程序的版本5中的CLUSTAL W算法的默認(rèn)參數(shù)測定。該程序是分子生物分析程序LASERGENETM套件(DNASTAR，Madison Wis.)的一部分。CLUSTAL W描述在Thompson 1994中。
“核苷酸序列”和“多核苷酸”指的是DNA或RNA，不論是單鏈或雙鏈形式。術(shù)語“互補的核苷酸序列”指的是根據(jù)鳥嘌呤核苷(guanidinenucleotide)(G)與胞嘧啶核苷(C)以及腺嘌呤核苷(A)與胸腺嘧啶核苷(T)的配對，退火(結(jié)合)另一個核苷酸序列的核苷酸序列，除了在RNA中T被尿嘧啶核苷(U)替代從而U與A結(jié)合外。
LDL受體基因家族的成員在不同的組織類型中表達。LDL受體基因家族成員在視網(wǎng)膜和RPE細(xì)胞中，以及在腎臟中表達。巨蛋白在眼中的視網(wǎng)膜和RPE細(xì)胞中，以及腎臟中表達。
Cubilin Cubilin是在一些組織類型中與巨蛋白共同定位的460kDa膜結(jié)合蛋白，可以在巨蛋白介導(dǎo)納入cubilin結(jié)合配體到細(xì)胞中之前，通過扣合(sequester)細(xì)胞表面上的配體以幫助胞吞過程。配體可以結(jié)合cubilin，以及直接結(jié)合巨蛋白。然而Cubilin顯示出其自身不能介導(dǎo)胞吞作用，但是巨蛋白能夠與cubilin物理結(jié)合并介導(dǎo)其細(xì)胞納入作用。
Cubilm的序列顯示為 -cDNAXM_011904 -基因NT_008682(人類染色體10工作框架序列片 段(working draft sequence segment)) 受體相關(guān)蛋白(RAP) LRP、巨蛋白和LDL受體基因家族的其它成員的正常處理需要存在RAP(39kDa的蛋白)(Bu，G.等，J.Biol.Chem.271，22218-22224，1996；Strickland，D.K.等，J.Biol.Chem.266，13364-13369，1991)。RAP顯示出由三個同源域組成(Bu，G.等，EMBO J.14，2269-2280，1995；Ellgaard，L.等，Eur.J.Biochem.244，544-551，1997；Rall，S.C.等，J.Biol.Chem.273，24152-24157，1998；Medved，L.V.等，J.Biol.Chem.274，717-727，1999.)，其中，域1顯示由三螺旋束組成(Nielsen，P.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94，7521-7525，1997)。RAP與所有的LDL受體基因家族成員相互作用且是所有受體/配體相互作用的通用拮抗劑。RAP域1和3(RAPd3)均是結(jié)合受體的(Warshawsky，I.等J.Biol.Chem.268，22046-22054，1993)，但是僅域3就足以模擬細(xì)胞中RAP的伴侶蛋白樣功能(Obermoeller，L.M.等，J.Biol.Chem.272，10761-10768，1997；Savonen，R.等，J.Biol.Chem.274，25877-25882，1999.)。RAP域2是cAMP依賴的蛋白激酶的底物(Petersen，C.M.等，EMBO J.15，4165-4173，1996)，但是與RAP域1和3相比，對于LRP和巨蛋白僅具有非常低的親和力(Tauris，J.等，F(xiàn)EBS Lett.429，27-30，1998.)。人RAP的自主性區(qū)域(autonomous region)包括域1(氨基酸位置18-112)、域2(氨基酸位置113-218)和域3(氨基酸位置219-323)。
RAP已證明具有顯示于XM003315，基因AH006949中的序列。RAP高親和性地結(jié)合LRP(KD＝4nM)并拮抗該受體的配體結(jié)合性能，從而阻止它介導(dǎo)配體的細(xì)胞納入作用(Williams等A novelmechanism for controlling the activity of α2-macroglobulin receptor/lowdensity lipoprotein receptor-related protein.Multiple regulatory sites for39-kDa receptor-associated protein.J.Biol.Chem.267，9035-9040，1992)。LRP包含多個配體結(jié)合位點，各獨立地由RAP進行調(diào)節(jié)。RAP也高度親和地結(jié)合gp330(KD＝8nM)(Kounnas等The 39kDareceptor-associated protein interacts with two members of the low densitylipoprotein receptor family，α2-macroglobulin receptor and glycoproteingp330.J.Biol.Chem.267，21162-21166，1992)和VLDL受體(KD＝0.7nM)(Battey等The 39kDa receptor-associated protein regulates ligandbinding by the very low density lipoprotein receptor.J.Biol.Chem.269，23268-23273，1994)，但是對LDL受體具有較低的親和力(KD＝500nM)，且也拮抗這些受體的配體結(jié)合性能。外源加入RAP或者RAP的過度表達均會抑制LDL受體基因家族成員的活性(Willnow等Inhibition of chylomicron remnant uptake by gene transfer of a receptoranatagonist.Science，264，1471-1474，1994)。同時參見圖10，其表明外源性RAP抑制RPE細(xì)胞中RBP-視黃醇的攝取。
可以分離實現(xiàn)受體結(jié)合和抑制的最小功能域而由此也作為LDL受體基因家族成員的拮抗劑的RAP最小域，例如肽。在一個實施方式中，源自RAP的物質(zhì)是包括具有至多104個氨基酸，優(yōu)選20～60個氨基酸的最小功能域的肽。尤其是，它們是最小的功能性蛋白域。這些肽具有至多104個氨基酸，優(yōu)選20～60個氨基酸。優(yōu)選的域是RAP的氨基酸位置219-323。另一個優(yōu)選的域是RAP的氨基酸位置18-112。
基因敲除研究表明缺少RAP的細(xì)胞表現(xiàn)出LDL受體基因家族成員的表達的減少，推測是因為RAP阻止新合成的配體與LDL受體基因家族成員的過早結(jié)合以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中受體的沉淀。在具有誘導(dǎo)的RAP基因缺損的小鼠模型(敲除的小鼠)中，治療藥物的攝取與不具有RAP基因缺損的小鼠模型相比減少高達50％(Willnow等Proc.Natl.Acad.Sci.924537-4541，1995)。在一個實施方式中，此處提出一種評價視網(wǎng)膜和RPE中的LDL受體基因家族成員是否負(fù)責(zé)配體和/或藥物的細(xì)胞攝取的方法，其包括 -給與RAP基因缺損小鼠(敲除的小鼠)配體或藥物； -給與野生型小鼠(不具有RAP基因缺損)配體或藥物； -測定動物模型和對照動物的視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中配體或藥物的量。
在該模型中，可以對通過LDL受體基因家族成員完成的配體或藥物攝取進入視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞的過程的作用進行定量。與RAP充分的小鼠相比，RAP基因缺損的小鼠中配體或藥物的細(xì)胞內(nèi)聚集量顯示是否細(xì)胞內(nèi)聚集的機制是通過LDL受體基因家族成員介導(dǎo)的或通過某種其它機制。
上述實驗也可以通過使用具有誘導(dǎo)的巨蛋白基因缺陷的小鼠模型(敲除小鼠；Nykjaer等Cell，96，507-515)進行。在這些動物模型中，也可測試巨蛋白或其他受體介導(dǎo)的或非受體依賴的過程對配體或藥物攝取進入視網(wǎng)膜和RPE細(xì)胞的作用。與具有充分巨蛋白的對照相比，配體或藥物的細(xì)胞內(nèi)聚積的量表明是否細(xì)胞內(nèi)聚積的機制是通過巨蛋白結(jié)合或某種其他機制。
在一些實施方式中，所述配體是視黃醇、RBP-視黃醇復(fù)合體或RBP-視黃醇-TTR復(fù)合體。在一些實施方式中，所述配體是IRBP、IRBP-視黃醇或IRBP-視黃醛。在一些實施方式中，所述配體是藥物或毒素。在另一實施方式中，所述配體是抗生素。在另一實施方式中，所述配體是氨基糖苷。
在一些實施方式中，在診斷、預(yù)防或治療與視網(wǎng)膜和RPE細(xì)胞相關(guān)的疾病和狀態(tài)中，此處設(shè)想的藥物能夠與RAP或RAP多肽結(jié)合，參見，例如US 20060029609，其以參閱的方式引入。
化學(xué)和生物化學(xué)術(shù)語 除非另外定義，此處使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與要求保護的主題所屬的領(lǐng)域中的技術(shù)人員通常地理解的含義相同。除非另外說明，此處使用的所要求的術(shù)語和化學(xué)術(shù)語如在2005年6月10提交的美國專利申請No.11/150,641中所定義，為此目的其全部內(nèi)容以參閱的方式引入此處。除非另外說明，此處整個公開內(nèi)容涉及的所有專利、專利申請、公開的申請和公開出版物、Genbank序列、網(wǎng)站和其他公開的材料其全部內(nèi)容以參閱的方式引入。在此處的術(shù)語有多個定義的情況下，以本節(jié)中的定義為主。在引用URL或其他的標(biāo)識符或地址的情況下，應(yīng)當(dāng)理解的是，這些標(biāo)識符可能發(fā)生改變且互聯(lián)網(wǎng)上的特定信息可能出現(xiàn)和消失，但是通過搜索互聯(lián)網(wǎng)可以得到等效的信息。對其的引用是證明這些信息可獲得和公共傳播。
應(yīng)當(dāng)理解的是，前面的一般性描述和下列的詳細(xì)描述僅是示例性和說明性的，而且不限制要求保護的主題。在該申請中，除非另有特殊說明，單數(shù)形式的使用包括多數(shù)。在該申請中，除非另有說明，“或”的使用表示“和/或”。此外，使用術(shù)語“包括(including)”以及其他形式，例如“包括(include)”和“被包括(included)”是非限制性的。
此處使用的章節(jié)標(biāo)題僅為了組織目的，而不構(gòu)成對描述的主題的限制。本申請中引用的所有文件或文件的部分(包括但不限于專利、專利申請、文章、書籍、手冊和論文)為各種目的以參閱的方式全部明確地引入。
術(shù)語“保護基”指的是封閉某些或全部反應(yīng)結(jié)構(gòu)并防止這些基團參與化學(xué)反應(yīng)直到保護基被除去的化學(xué)結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，各保護基通過不同的方式移除。在完全不同的反應(yīng)條件下被切割的保護基實現(xiàn)差異移除的要求。保護基可以通過酸、堿和氫解除去。例如三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、乙縮醛和叔丁基二甲基甲硅烷基的基團對酸敏感，且可以用于在Cbz基團(可以通過氫解移去)和Fmoc基團(對堿敏感)保護的氨基存在下，保護羧基和羥基反應(yīng)結(jié)構(gòu)。在以如叔丁基氨基甲酸酯的酸敏感基團或?qū)λ岷蛪A穩(wěn)定但水解可移除的氨基甲酸酯封閉的氨基存在的情況下，羧酸和羥基反應(yīng)結(jié)構(gòu)可用堿敏感基團(例如，但不限于甲基、乙基和乙酰基)封閉。
羧酸和羥基反應(yīng)結(jié)構(gòu)也可以用例如芐基的可水解除去的保護基封閉，而能夠與酸氫鍵結(jié)合的胺基可以使用例如Fmoc的堿敏感基團封閉。羧酸反應(yīng)結(jié)構(gòu)可以通過如此處作為舉例的轉(zhuǎn)化成簡單的酯衍生物而被保護，或者它們可以用例如2，4-二甲氧基芐基的可氧化除去的保護基封閉，而同時存在的氨基可以使用氟化物敏感的甲硅烷基氨基甲酸酯封閉。
烯丙基封閉基可以用在酸和堿保護基存在的情況下，因為前者是穩(wěn)定的且隨后能夠通過金屬或π-酸催化劑除去。例如，在酸敏感的叔丁基氨基甲酸酯或堿敏感的乙酸胺保護基存在的情況下，烯丙基封閉的羧酸可以用Pd0催化反應(yīng)脫保護。再另一形式的保護基是連接有化合物或中間體的樹脂。只要殘基連接到樹脂，則其官能團被封閉且不能反應(yīng)。一旦從樹脂上釋放，則所述官能團可用于反應(yīng)。
通常，封閉/保護基可以選自
其它的保護基描述在Greene和Wuts，Protective Groups in OrganicSynthesis，第三版，John Wiley & Sons，New York，NY，1999，其全部以參閱的方式引入此處。
術(shù)語“任選地取代”表示所指基團可以被一個或多個分別和獨立地選自烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、雜脂環(huán)基、羥基、烷氧基、芳氧基、巰基、烷硫基、芳硫基、氰基、鹵素、羰?；?、硫羰基、異氰基、氰硫基、異氰硫基、硝基、全鹵代烷基、全氟烷基、甲硅烷基和氨基(包括單和二取代的氨基)，及其受保護的衍生物的另外的基團取代。可以形成上述取代基的保護衍生物的保護基對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的，且可以在例如上述的Greene和Wuts的參考文獻中找到。
此處提出的化合物可以具有一個或多個手性中心，且各中心可以R或S構(gòu)型存在。此處提出的化合物包括所有的非對映體、對映體和差向異構(gòu)體形式，及其適合的混合物。如果需要，可以通過本領(lǐng)域已知的方法(例如通過手性色譜柱拆分立體異構(gòu)體)得到立體異構(gòu)體。
此處描述的方法和制劑包括使用調(diào)節(jié)LDL受體基因家族成員活性藥物(例如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑)的N-氧化物、晶體形式(也是已知的多晶型物)或藥學(xué)上可接受的鹽，以及具有相同類型活性的這些化合物的活性代謝物。在某些情況下，化合物可以作為互變異構(gòu)體存在。所有的互變異構(gòu)體包含在此處提出的化合物的范圍之內(nèi)。此外，此處描述的調(diào)節(jié)LDL受體基因家族成員的藥物可以與藥學(xué)上可接受的溶劑(例如水、醇等)一起以非溶劑合物和溶劑合物的形式存在。此處提出的化合物的溶劑合物的形式也被認(rèn)為在此披露。
如此處使用的，出現(xiàn)在此處顯示的不同氨基酸序列中的基酸根據(jù)它們眾所周知的三個字母或一個字母縮寫識別。出現(xiàn)在不同DNA片段中核苷酸使用本領(lǐng)域常規(guī)使用的標(biāo)準(zhǔn)的單字母標(biāo)識指定(見表1)。
如此處使用的，氨基酸殘基指的是多肽在其肽鍵處化學(xué)消化(水解)形成的氨基酸。在某些實施方式中，此處描述的氨基酸殘基是處于“L”型同分異構(gòu)形式。只要期望的功能特性被多肽保持，“D”型同分異構(gòu)形式的殘基可被任意“L”型氨基酸殘基取代。NH2指的是多肽的氨基端存在的游離的氨基。COOH指的是多肽的羧基端存在的游離的羧基。與在J.Biol.Chem.，2433552 59(1969)中描述和在37C.F.R.§§1.821-1.822中采用的標(biāo)準(zhǔn)的多肽名稱保持一致，氨基酸殘基的縮寫示于下表中。
表1 對應(yīng)表
應(yīng)該說明的是此處通過化學(xué)式表示的所有氨基酸殘基序列具有從左到右沿氨基端到羧基端的常規(guī)方向的定向。此外，短語＂氨基酸殘基＂廣義地定義為包括列于對應(yīng)表中的氨基酸及修飾的和稀有的氨基酸，例如在37C.F.R.§§1.821-1.822(以參閱方式引入此處)中涉及的氨基酸。另外，應(yīng)當(dāng)說明的是氨基酸殘基序列開始和結(jié)束處的短線表示與一個或多個氨基酸殘基的另一序列的肽鍵或與例如NH2的氨基端基團或與例如COOH的羧基端基團的肽鍵。
在肽或蛋白質(zhì)中，氨基酸的適合的保守取代對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，且通常在不改變得到的分子的生物活性的條件下進行。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認(rèn)識到一般而言，多肽的非關(guān)鍵區(qū)中的單氨基酸取代基本上不改變生物活性(參見，例如Watson等Molecular Biologyof the Gene，4th Edition，1987，The Benjamin/Cummings Pub.co.，p.224)。
這種取代可根據(jù)下述表2中描述的進行。
表2 其它的取代也是允許的，且可以經(jīng)驗或與按照已知的保守取代地確定。
此處使用的術(shù)語“選擇性結(jié)合化合物”指的是有選擇地結(jié)合一個或多個靶受體的任何部分的物質(zhì)。
此處使用的術(shù)語“選擇性結(jié)合”指的是選擇性結(jié)合物質(zhì)以比它結(jié)合到非靶受體更大的親和力結(jié)合到靶受體的能力。在某些實施方式中，特異性結(jié)合指的是以比非靶點的親和力高至少10、50、100、250、500、1000或更多倍的親和力與靶點結(jié)合。
此處使用的術(shù)語“靶受體”指的是能夠被選擇性結(jié)合化合物結(jié)合的受體或受體的部分。在特定實施方式中，靶受體為LDL受體基因家族成員。在某些實施方式中，靶受體為類維生素A結(jié)合蛋白受體。在一些實施方式中，類維生素A結(jié)合蛋白受體為LDL受體基因家族成員。
此處使用的“藥物”指的是能夠與LDL受體基因家族成員相互作用，由此調(diào)節(jié)該受體蛋白的活性的任何物質(zhì)。
此處使用的術(shù)語“調(diào)節(jié)劑”指的是能夠改變分子活性的化合物。例如，與缺少該調(diào)節(jié)劑的活性強度相比，調(diào)節(jié)劑能夠引起分子(例如，舉例來說，LDL受體基因家族成員)特定活性的強度增加或降低。在特定實施方式中，調(diào)節(jié)劑為抑制劑，其降低分子的一種或多種活性的強度。在特定實施方式中，抑制劑完全抑制分子的一種或多種活性。在特定實施方式中，調(diào)節(jié)劑為激活劑，其增加分子的至少一種活性的強度。在特定實施方式中，調(diào)節(jié)劑的存在引起在缺少該調(diào)節(jié)劑時不會出現(xiàn)的活性。
當(dāng)與適合的對照比較時，調(diào)節(jié)目標(biāo)多肽(例如LDL受體基因家族成員)的生物活性的藥物增加或降低活性至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％、至少約50％、至少約100％、或者至少約2倍、至少約5倍或至少約10倍或更多。
術(shù)語“配體”指的是結(jié)合另一分子(例如，舉例來說，LDL受體基因家族成員)上的特定位點的任何分子。
術(shù)語“內(nèi)源性配體”或“內(nèi)源性結(jié)合配體”意指在哺乳動物體內(nèi)起源或產(chǎn)生的配體。
術(shù)語“調(diào)節(jié)”包括與適合的對照比較，所測量的活性增加或降低、興奮、抑制或阻斷。
細(xì)胞中“調(diào)節(jié)核酸表達水平”的藥物是與缺少該藥物的對照相比，在細(xì)胞與候選藥物接觸后，引起mRNA和/或多肽的水平(即，量)至少約1.25倍、至少約1.5倍、至少約2倍、至少約5倍、至少約10倍或更多的增加或降低的藥物。
與視網(wǎng)膜和RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員結(jié)合的藥物一般比天然存在的配體(例如，舉例來說，類維生素A結(jié)合蛋白)具有對受體蛋白更大的親和力。該藥物對視網(wǎng)膜和RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員具有比類維生素A結(jié)合蛋白至少高2倍的親和力。在另一實施方式中，該藥物對視網(wǎng)膜和RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員具有比類維生素A結(jié)合蛋白至少高5倍的親和力。在另一實施方式中，該藥物對視網(wǎng)膜和RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員具有比類維生素A結(jié)合蛋白至少高10倍的親和力。對受體的親和力通過本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)方法測定。
此處使用的“類維生素A結(jié)合蛋白”指的是能夠結(jié)合類維生素A的任何載體蛋白。除非特別指明為特定的類維生素A結(jié)合蛋白，類維生素A結(jié)合蛋白包括例如，視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)、間質(zhì)(interstitial)類維生素A結(jié)合蛋白(IRBP)、視黃醛結(jié)合蛋白(RALBP)、細(xì)胞視黃醇結(jié)合蛋白(CRBP)以及細(xì)胞視黃醛結(jié)合蛋白(CRALBP)。
此處使用的“光感受器間類維生素A結(jié)合蛋白”和“間質(zhì)視黃醇結(jié)合蛋白”可互換使用并指的是相同的蛋白質(zhì)。
此處使用的術(shù)語“受體介導(dǎo)的活性”指的是由配體和受體的結(jié)合直接或間接地引起的任何生物活性。
此處使用的術(shù)語“激動劑”指的是其存在引起與天然的受體配體存在所引起的生物活性相同的受體生物活性的化合物。
此處使用的術(shù)語“部分激動劑”指的是其存在引起與天然的受體配體存在所引起的類型相同，但是強度更低的受體生物活性的化合物。
此處使用的術(shù)語“拮抗劑”指的是其存在引起受體生物活性強度降低的化合物。在特定實施方式中，拮抗劑的存在會完全抑制受體的生物活性。
此處使用的IC50指的是在測量反應(yīng)的測定方法中，特定的測試化合物達到最大效應(yīng)(例如調(diào)節(jié)雄激素受體活性)的50％抑制率時的量、濃度或劑量。
此處使用的EC50指的是特定測試化合物引起由該特定測試化合物誘導(dǎo)、刺激或強化的特定反應(yīng)的最大表現(xiàn)的50％的劑量依賴反應(yīng)時的劑量、濃度或量。
此處可替換使用的術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”指的是任意長度的聚合形式的氨基酸，其可以包括天然存在的氨基酸、編碼的和非編碼的氨基酸、化學(xué)或生物化學(xué)修飾的、衍生化的或設(shè)計氨基酸、氨基酸類似物、肽擬似物和縮肽，及具有修飾的、環(huán)狀的、雙環(huán)的、縮環(huán)的(depsicyclic)或縮雙環(huán)的(depsibicyclic)肽骨架的肽。該術(shù)語也包括結(jié)合蛋白、融合蛋白(包括，但不限于GST融合蛋白、具有異源氨基酸序列的融合蛋白、具有異源和同源前導(dǎo)序列的融合蛋白、具有或不具有N末端蛋氨酸殘基的融合蛋白、聚乙二醇化的蛋白和免疫標(biāo)記蛋白)。在該術(shù)語中也包括天然存在的蛋白的變體，其中該變體與天然存在的蛋白質(zhì)同源性的或基本上與天然存在的蛋白類似，以及相應(yīng)的來自不同物種的同系物。與主體多肽相比，多肽序列的變異包括插入、增加、缺失或置換。該術(shù)語也包括肽適體。
此處使用的術(shù)語“組織選擇性的”指的是藥物在一個組織中以比它在另一個組織中調(diào)節(jié)生物活性更高或更低的水平調(diào)節(jié)生物活性的能力。不同組織中的生物活性可以相同或不同。不同組織中的生物活性可以通過相同類型的靶受體介導(dǎo)。例如，在特定實施方式中，組織選擇性的化合物可以一個組織中調(diào)節(jié)與LDL受體基因家族成員有關(guān)的生物活性，而不能調(diào)節(jié)另一組織類型中與LDL受體基因家族成員有關(guān)的生物活性(或調(diào)節(jié)到更低的水平)。
“活性片段”是具有天然存在的分子的結(jié)構(gòu)的、調(diào)控的或生物化學(xué)的功能或具有與代謝或生理過程相關(guān)或關(guān)聯(lián)的任何功能的片段。例如，當(dāng)片段參與到下一個分子與另一分子的相互作用時，當(dāng)它在緩解疾病狀態(tài)中有治療價值時，或當(dāng)它在防止或降低疾病發(fā)生上具有預(yù)防價值時，或當(dāng)它誘導(dǎo)對分子的免疫反應(yīng)時，片段顯示活性?；钚远嚯钠伟@示活性類似于(但不是必須相同)此處給出的多肽活性的片段。所述活性可以包括改善期望的活性或降低不期望的活性。
核酸分子的“表達”指的是將信息轉(zhuǎn)化成基因產(chǎn)物。基因產(chǎn)物可以是基因的直接轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反義RNA、核酶、結(jié)構(gòu)RNA或任何其它類型的RNA)或通過mRNA的翻譯生成的蛋白質(zhì)?；虍a(chǎn)物也包括例如通過如加帽、多腺苷化、甲基化和編輯的過程修飾的RNA，以及通過例如甲基化、乙?；⒘姿峄?、泛素化、ADP-核糖基化、myristilation和糖基化修飾的蛋白。
為了本公開的目的，“基因”包括編碼基因產(chǎn)物的DNA區(qū)域，以及調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物產(chǎn)生的所有DNA區(qū)域，無論這些調(diào)節(jié)序列是否靠近編碼和/或轉(zhuǎn)錄的序列。因此，基因包括，但是不必然限于啟動子序列、終止子、例如核糖體結(jié)合位點和內(nèi)部核糖體進入位點的翻譯調(diào)節(jié)序列、增強子、靜息子(silencer)、隔離子、邊界元件、復(fù)制起點、基質(zhì)附著位點和基因座控區(qū)。
術(shù)語“抗體”指的是通過能夠識別和結(jié)合特異性抗原的免疫系統(tǒng)生成的蛋白。抗體以及制造抗體的方法在本領(lǐng)域是公知的。
此處使用的術(shù)語“抗體”包括多克隆和單克隆抗體制劑，以及包括雜交抗體、轉(zhuǎn)化抗體、嵌合抗體和人源化抗體的制劑，以及雜種(嵌合)抗體分子；F(ab′)2和F(ab)片段；Fv分子(非共價雜二聚體；單鏈Fv分子(sFv)；二聚和三聚的抗體片段構(gòu)成物；小分子抗體(minibodies)；人源化抗體分子；以及從這些分子得到的任何功能性片段，其中這些片段保持特異性結(jié)合。
“抗原”是激發(fā)免疫反應(yīng)的物質(zhì)。
“表位”是抗體結(jié)合的抗原分子的位點。
“激動抗體(agonist antibody)”是模擬、增強、刺激或活化與激動劑相互作用的分子的功能的抗體。
“拮抗抗體”是競爭、抑制或干擾與拮抗劑相互作用的分子的活性的抗體。例如拮抗抗體可以結(jié)合受體而不誘發(fā)活性反應(yīng)。
“抗原結(jié)合片段(Fab片段)”是二硫化連接的異源二聚體，其各個鏈包含一個免疫球蛋白恒定區(qū)(C)域和一個可變區(qū)(V)域；V域的并列形成抗原結(jié)合位點。完整的免疫球蛋白分子的兩個Fab片段與它的兩個臂對應(yīng)，其通常包含與重鏈的V和C域配對的輕鏈區(qū)域。
“可結(jié)晶片段的片段(Fc片段)”是與效應(yīng)分子和細(xì)胞相互作用的抗體分子的部分。它包括免疫球蛋白重鏈的羧基端部分。重鏈同種型之間的功能差異主要位于Fc片段。
抗體的“恒定區(qū)”是它的效應(yīng)區(qū)，且決定抗體的功能分類。重鏈或輕鏈的恒定區(qū)位于羧基端或其附近。
抗體的“可變區(qū)”是結(jié)合抗原的區(qū)域；它提供抗體特異性。重鏈或輕鏈的可變區(qū)位于氨基端或其附近?！癡H”片段包含重鏈的可變區(qū)；“VL”片段包含輕鏈的可變區(qū)。
“免疫球蛋白”是抗體分子。
“重鏈”是結(jié)合形成免疫球蛋白分子的兩類多肽鏈中較大的。重鏈的種類決定免疫球蛋白(例如IgG、IgA、IgE、IgD或IgM)的種類。
“輕鏈”是結(jié)合形成免疫球蛋白分子的兩類多肽鏈中較小的?；谒鼈兊暮愣▍^(qū)中的結(jié)構(gòu)差異，輕鏈一般分為兩類κ和λ。
“互補決定區(qū)(cdr)”是提供抗原特異性的抗體三維結(jié)構(gòu)。
“框架片段”是包含相對不變序列且位于高變區(qū)之間的可變域的區(qū)域?？蚣軈^(qū)為高變區(qū)提供蛋白支架。
“人源化的”抗體是主要地包含人免疫球蛋白序列的抗體。該術(shù)語一般用于指經(jīng)修飾引入人序列的部分的非人類免疫球蛋白，且可以包括含有人免疫球蛋白整個序列的人抗體。
“單鏈抗體”是僅包括由肽連接到輕鏈的V域上的重鏈V域的Fab片段。
“多克隆抗體”為不同特異性的抗體的混合物，如在對各種不同抗原或表位進行免疫的動物的血清中。
“單克隆抗體”為具有同質(zhì)抗體群的抗體組合物。該術(shù)語對抗體的物種或來源沒有限制，對其制備的方式也沒有限制。該術(shù)語包括全免疫球蛋白和免疫球蛋白片段。
制備多克隆和單克隆抗體的方法在本領(lǐng)域是已知的。多克隆抗體抗體通過使用關(guān)注的抗原(例如用編碼抗原的基因轉(zhuǎn)化的干細(xì)胞)免疫適合的動物(例如小鼠、大鼠、兔、綿羊或山羊)產(chǎn)生。為了提高免疫原性，所述抗原可在免疫前連接到載體上。適合的載體通常是大的、代謝慢的大分子，例如蛋白、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物、脂聚集體(例如小油滴或脂質(zhì)體)，以及無活性的病毒顆粒。這些載體對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是公知的。此外，為了提高其免疫原性，所述抗原可以與細(xì)菌類毒素(例如白喉、破傷風(fēng)、霍亂等的類毒素)偶聯(lián)。
在抗體結(jié)合的上下文中的術(shù)語“特異性結(jié)合”指的是抗體和特異性多肽以高親抗原性和/或高親和力結(jié)合，或更準(zhǔn)確地說，與特異性多肽的表位結(jié)合?？贵w結(jié)合多肽上的這一表位比相同的抗體結(jié)合任何其他的表位(尤其是與目標(biāo)多肽關(guān)聯(lián)的或相同樣品中的分子上存在的其他表位)相比更加強。例如當(dāng)抗體比結(jié)合其它表位更強地結(jié)合一個表位時，調(diào)整結(jié)合條件可以導(dǎo)致抗體幾乎專門地結(jié)合到特異性表位而不與相同多肽上的任何其它表位結(jié)合，且不與任何其它的不包含該位點的多肽結(jié)合。特異性結(jié)合到目標(biāo)多肽的抗體能夠以弱的(但仍可以檢測的)水平(例如相對于目的多肽顯示的結(jié)合10％或更少的結(jié)合率)結(jié)合其它多肽。這各弱的結(jié)合或者背景結(jié)合很容易與特異性抗體結(jié)合目標(biāo)多肽區(qū)別，例如通過使用合適的對照。通常，本發(fā)明抗體以10-7M或更大(例如，10-8M、10-9M、10-10M、10-11M等)的結(jié)合親和力結(jié)合特異性多肽。
“疾病”是有機體的病態(tài)的、異常的和/或有害的狀態(tài)。該術(shù)語包括狀態(tài)、癥狀和病癥。
此處使用的“治療(treatment)”、“治療(treating)”等指的是獲得期望的藥理和/或生理效果，包括哺乳動物(包括人)的病理狀態(tài)或病癥的任何處理。效果以完全地或部分地防止病癥或癥狀的預(yù)防性效果，和/或部分或完全治愈病癥和/或病癥導(dǎo)致的副效應(yīng)的治療性效果。也就是說，“治療”包括(1)在可能容易產(chǎn)生病癥但尚未診斷出具有該病癥的主體中預(yù)防病癥發(fā)生或復(fù)發(fā)；(2)抑制病癥，例如阻止它的發(fā)展；(3)例如通過恢復(fù)或修復(fù)失去的、缺少的或有缺陷的功能、或刺激不足的過程來停止或終止病癥或至少與其有關(guān)的癥狀，以使宿主不再遭受病癥或其癥狀帶來的痛苦，例如引起病癥或其癥狀的退化；或者(4)緩解、減輕或改善病癥或與其有關(guān)的癥狀，其中改善使用寬泛的意思，指至少降低參數(shù)的幅度。
此處使用的“片段”意為僅由完整的全長蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)的一部分組成的多肽，例如蛋白質(zhì)域。所述片段可以包括天然多肽的C-末端缺失、N-末端缺失和/或內(nèi)部缺失。蛋白質(zhì)的片段一般包含全長分子的至少約5-10個連續(xù)的氨基酸殘基，優(yōu)選全長分子的至少約15-25個連續(xù)氨基酸殘基，且更優(yōu)選全長分子的至少約20-50個或更多的連續(xù)氨基酸殘基，或者5個氨基酸和全長序列之間的任何整體。
如上述指明的，“生物學(xué)活性”體，或者具有“生物學(xué)活性”的個體是具有天然存在的分子的結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)或生物化學(xué)功能的或任何與代謝或生理過程相關(guān)的或關(guān)聯(lián)的功能的個體。生物活性多肽片段是顯示出類似于(但不必需相同)全長多肽的活性的片段。所述生物活性可以包括改善期望的活性或降低不期望的活性。例如，當(dāng)個體參與與另一分子的分子相互作用時，或者當(dāng)它具有減輕疾病狀態(tài)的治療價值時，或當(dāng)它具有誘導(dǎo)對分子的免疫反應(yīng)的預(yù)防價值時，或當(dāng)它具有確定分子存在的診斷價值時，個體顯示為具有生物活性。生物活性多肽或其片段包括可以參與生物反應(yīng)(例如作為與其它轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合以引發(fā)轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子)，或作為用作表位或免疫原以刺激例如生成抗體的免疫反應(yīng)，或可以運送分子進入或離開細(xì)胞，或能夠進行例如聚合或核酸酶活性的催化活動，或可以通過結(jié)合受體、蛋白或核酸以活化酶或底物而參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的多肽或片段。
“分離的”、“純化的”或“基本上分離的”多肽或“基本上純的形式”、“基本上純化的形式”、“基本上純凈”或“分離”的多肽是基本上沒有與其天然關(guān)聯(lián)的物質(zhì)或者不包括目標(biāo)多肽的序列或片段的其它多肽序列的多肽。基本上沒有的意思是少于約90％、少于約80％、少于約70％、少于約60％或少于約50％的組合物是由分離的多肽以外的物質(zhì)組成。其中至少約99％的全部大分子是分離的多肽，所述多肽為至少約99％的純度，且所述組合物包含少于約1％的污染物。這些分離的多肽可以是重組多肽，修飾、標(biāo)記和融合的多肽，以及化學(xué)合成的多肽，其從起源或操作上不與它們天然關(guān)聯(lián)的物質(zhì)的全部或部分關(guān)聯(lián)，而與它們天然連接的分子以外的分子連接，或不會天然發(fā)生。
此處提供的檢測方法可以是定性的或定量的。因此，此處使用的術(shù)語“檢測”、“鑒別”、“測定”等，指的是定性和定量測定，以及包括“測量”。例如，檢測方法包括檢測生物樣品中多核苷酸或多肽的存在和/或水平的方法，和檢測樣品中多核苷酸或多肽的生物活性的存在和/或水平的方法。
如此處使用的“生物樣品”包括例如血液、血清、血漿、尿、腦脊液、眼淚、唾液、淋巴、透析液、灌胃液、精液和其它生物來源的流體樣品或組織的生物流體。它包括細(xì)胞或由其衍生的細(xì)胞和其后代，包括培養(yǎng)物中的細(xì)胞、細(xì)胞上清液和細(xì)胞溶解產(chǎn)物。它包括器官或組織培養(yǎng)衍生的流體、組織生檢樣品、腫瘤生檢樣品、糞便樣品和生理組織中提取的流體。包括從固體組織、組織切片和細(xì)胞溶解產(chǎn)物分離的細(xì)胞。該定義也包括獲得之后以任何方式處理的樣品，例如通過用試劑處理、增溶或富集例如多核苷酸或多肽的特定成分。該術(shù)語也包括生物樣品的衍生物和部分。生物樣品可用于診斷或監(jiān)測分析。
此處使用的術(shù)語“核酸”指的是單鏈的和/或雙鏈多核苷酸，例如脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，以及RNA或DNA的類似物或衍生物。核酸分子是核苷酸的線性聚合物，通過3′，5′磷酸二酯鍵連接。在DNA(脫氧核糖核酸)中，糖基為脫氧核糖且核苷的堿基是腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶。RNA(核糖核酸)以核糖作為糖且尿嘧啶代替胸腺嘧啶。在術(shù)語“核酸”中也包括例如肽核酸(PNA)、硫代磷酸酯DNA，以及其它的這類類似物和衍生物或其組合的核酸類似物。
此處使用的術(shù)語“多核苷酸”指的是包含至少兩個連接的核苷酸或核苷酸衍生物的寡聚物或聚合物，包括脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)和包含例如核苷酸類似物或磷酸二酯鍵以外的“主鏈”鍵(例如磷酸三酯鍵、氨基磷酸酯鍵、甲基膦酸二酯鍵、磷酸硫酯鍵(phophorothioate bond)、硫酯鍵或肽鍵(肽核酸))的DNA或RNA衍生物。雖然本領(lǐng)域人員可以認(rèn)識到寡核苷酸(例如PCR引物)通常長度少于約50～100個核苷酸，但是此處使用的術(shù)語“寡核苷酸”基本上與“多核苷酸”同義。
多核苷酸也可以包含一個或多個對切割具有相對抵抗力的鍵，例如可以包括通過肽核酸鍵連接的核苷酸以及至少一個通過磷酸二酯鍵等連接的在3′末端的核苷酸的嵌合寡核苷酸引物，且能夠通過聚合酶延伸。肽核酸序列可以使用公知的方法制備(參見，例如，Weiler等(1997)Nucleic acids Res.252792-2799)。
多核苷酸可以是大的核酸分子的一部分，例如基因的部分，其包含多態(tài)性區(qū)域，或者染色體基因外區(qū)域的部分，例如部分核苷酸重復(fù)序列區(qū)域(例如短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)位點、可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)位點、微衛(wèi)星位點或小衛(wèi)星位點。多核苷酸也可以是單鏈或雙鏈，包括例如DNA-RNA雜交體，或者可以是三鏈或四鏈。當(dāng)所述多核苷酸為雙鏈DNA時，它可以是A、B、L或Z構(gòu)型，且單個多核苷酸可以包含這些構(gòu)型的組合。
此處使用的DNA或核酸同系物指的是包含預(yù)選的保守核苷酸序列(例如編碼治療多肽序列)的核酸。術(shù)語“基本同源”意思是與其具有至少80％、至少90％或至少95％的同源性或更少的同源性或同一性百分率和保守的生物活性或功能。
術(shù)語“同源性”和“同一性”經(jīng)常交換使用。關(guān)于這一點，例如通過使用GAP計算機程序比較序列信息可以確定同源性或同一性百分比。所述GAP程序使用Needleman和Wunsch的對齊方法(J.Mol.Bio l.48443(1970)，其由Smith和Waterman修正(Adv.Appl.Math.2482(1981)。簡要地說，所述GAP程序?qū)⑾嗨菩远x為相似的對齊標(biāo)志(例如核苷酸或氨基酸)的數(shù)目除以兩個序列中較短者的標(biāo)志的總數(shù)。GAP程序的缺省參數(shù)可以包括(1)一元比較矩陣(包含1為相同和0為不相同的值)和Gnbskov和Burgess，Nucl.Acids Res.146745(1986)的加權(quán)比較矩陣，其由Schwartz和Dayhoff編輯，ATLAS OF PROTEINSEQUENCE AND STRUCTURE，National Biomedical ResearchFoundation，pp.353 358(1979)描述；(2)各間隙3.0的罰項(penalty)和各間隙中每個符號的額外0.10的罰項；以及(3)末端間隙沒有罰項。
任何兩個核酸分子是否具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％＂相同＂的核苷酸序列可以使用已知的計算機算法測定，例如“FASTA”程序，使用例如Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444(1988)中的缺省參數(shù)?？蛇x擇地，國家生物技術(shù)情報中心(National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫的BLAST功能可用于測定同一性。
通常，序列對齊以便獲得最高階的匹配?！巴恍浴北旧砭哂斜绢I(lǐng)域公認(rèn)的意思且可以使用公開的技術(shù)計算(參見，例如ComputationalMolecular Biology，Lesk，A.M.編輯，Oxford University Press，New York，1988；BiocomputingInformatics and Genome Proj ects，Smith，D.W.編輯，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of SequenceData，Part I，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.編輯，Humana Press，NewJersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.編輯，M Stockton Press，New York，1991)。盡管存在許多測量兩個多核苷酸或多肽序列之間同一性的方法，術(shù)語“同一性”已被技術(shù)人員公知(Carillo，H.& Lipton，D.，SIAM J Applied Math 481073(1988))。通常用于測定兩個序列之間同一性或相似性的方法包括，但不限于在Guide to Huge Computers，Martin J.Bishop編輯，AcademicPress，San Diego，1994，和Carillo，H.& Lipton，D.，SIAM J AppliedMath 481073(1988)中披露的那些方法。測定同一性或相似性的方法編篡在計算機程序中。測定兩個序列之間同一性或相似性的計算機程序方法包括，但不限于GCG程序包(Devereux，J.等，Nucleic AcidsResearch 12(I)387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul，S.F.等，J.Molec.Biol.215403(1990))。
因此，此處使用的術(shù)語“同一性”表示測試和基準(zhǔn)多肽或多核苷酸之間的比較。例如測試多肽可被定義為具有與基準(zhǔn)多肽90％或更多相同的任何多肽。
此處使用的術(shù)語至少“90％相同”指的是相對于基準(zhǔn)多肽具有90～99.99的同一性百分比。90％或更高水平的同一性預(yù)示這樣的事實假定為了示例目的，比較100個氨基酸的長度的測試和基準(zhǔn)多肽。在測試的多肽中，不超過10％的氨基酸(例如，100個中有10個)與基準(zhǔn)多肽的氨基酸不同?？梢栽跍y試和基準(zhǔn)多核苷酸之間進行類似的比較。這些差異可能代表隨機分布在氨基酸序列整個長度上的點突變，或者它們簇集在一個或多個改變長度直到最大允許量(例如10/100)的氨基酸差異的位置(約90％同一性)。差異定義為核酸或氨基酸取代或缺失。
術(shù)語基本上相同的或基本上同源的或相似如相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解的變化，且通常意指至少60％或70％，優(yōu)選意指至少80％、85％，或更優(yōu)選至少90％，而且最優(yōu)選至少95％的同一性。
此處使用的基本上純的意指充分同質(zhì)而表現(xiàn)為沒有通過本領(lǐng)域技術(shù)人員用于評價這一純度的標(biāo)準(zhǔn)分析方法(例如薄層色譜法(TLC)、凝膠電泳、高效液相色譜法(HPLC)和質(zhì)譜法(MS))容易檢測到的雜質(zhì)，或者充分地純從而進一步純化將不能可覺察地改變該物質(zhì)的物理和化學(xué)性質(zhì)(例如酶學(xué)和生物活性)。純化化合物以產(chǎn)生基本化學(xué)純的化合物的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的。然而，基本化學(xué)純化合物可以是立體異構(gòu)體的混合物。在此情況下，進一步純化可能增加化合物的特異性活性。
調(diào)節(jié)LDL受體基因家族成員活性的特定藥物的合成 調(diào)節(jié)LDL受體基因家族成員(例如，類維生素A結(jié)合蛋白受體)活性的藥物的合成可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)合成技術(shù)或使用本領(lǐng)域已知的方法結(jié)合此處描述的方法進行。參見，例如美國專利申請公開2004/0102650和Um，S.J.等，Chem.Pharm.Bull.，52501-506(2004)。此外，調(diào)節(jié)LDL受體基因家族成員活性的幾種藥物可以從不同的供應(yīng)商購買。作為進一步的指導(dǎo)，也可以使用下述的合成方法。
在一些實施方式中，LDL受體基因家族成員結(jié)合相似的配體。在一些實施方式中，在不同組織或細(xì)胞中表達的LDL受體基因家族成員能夠結(jié)合相同的配體或藥物。在一些實施方式中，與視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞以外的組織或細(xì)胞中的LDL受體基因家族成員相互作用的藥物也能夠與視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中的LDL受體基因家族成員相互作用。能夠與LDL受體基因家族成員相互作用的藥物是本領(lǐng)域已知的和此處設(shè)想的。例如US 2003/0202974、WO 06/037335、WO03/080103、US 2004/0198705、WO 04/084876、US 2006/0029609、US 2005/0026823、US 2005/0100986、US 2005/0089932、US2005/0042227、US 2004/0204357、US 2004/0198705、US 2004/0049010、US 2003/0202974、US 2003/0181660、US 2003/0082640、US2003/0157561和US 2003/0077672(所有以參閱的方式引入)。
所述調(diào)節(jié)眼中視網(wǎng)膜和/或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的LDL受體基因家族成員活性的藥物優(yōu)選通過此處列出的方法鑒別。例如，所述藥物可以是抗體、多肽、核酸、多核酸、聚合物、內(nèi)源性結(jié)合配體、低分子量有機化合物、Ca2+清除劑、還原劑以及這些藥物任意的片段和衍生物。
在一個實施方式中，所述藥物競爭性抑制視黃醇與視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)或視黃醇與光感受器間類維生素A結(jié)合蛋白(IRBP)的結(jié)合或復(fù)合。例如這種化合物可以是特異性地與視黃醇化合物或與視黃醇結(jié)合蛋白或與光感受器間類維生素A結(jié)合蛋白以空間抑制與視黃醇化合物或與視黃醇結(jié)合蛋白或與光感受器間類維生素A結(jié)合蛋白的進一步結(jié)合的方式相互反應(yīng)的化合物(參見，例如美國專利申請No.2006/0094063，其以參閱的方式引入)。
在另一實施方式中，所述藥物競爭性抑制類維生素A結(jié)合蛋白或光感受器間類維生素A結(jié)合蛋白與視網(wǎng)膜和/或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中的LDL受體家族成員結(jié)合。例如，這種藥物可以是與維生素A結(jié)合蛋白或光感受器間類維生素A結(jié)合蛋白或與視網(wǎng)膜和/或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中的LDL受體基因家族成員以空間抑制類維生素A結(jié)合蛋白或光感受器間類維生素A結(jié)合蛋白與視網(wǎng)膜和/或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中的LDL受體家族成員的結(jié)合或進一步的結(jié)合的方式特異性地相互作用的化合物。
在再另一實施方式中，所述藥物競爭性抑制類維生素A結(jié)合蛋白與視網(wǎng)膜和/或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的輔助受體(co-receptor)的結(jié)合。
在另一實施方式中，所述藥物通過阻斷受體蛋白上的足夠量的結(jié)合位點和/或阻斷類維生素A結(jié)合蛋白，抑制類維生素A結(jié)合蛋白與LDL受體基因家族成員的結(jié)合，以便它維持正常的治療效果而不抑制視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中受體蛋白的結(jié)合。在一些實施方式中，所述藥物能夠結(jié)合足夠量的視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中受體蛋白上的結(jié)合位點，由此抑制類維生素A結(jié)合蛋白與視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中受體蛋白的結(jié)合。在一些實施方式中，所述藥物能夠結(jié)合視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中的受體蛋白并因此抑制類維生素A結(jié)合蛋白與受體蛋白的結(jié)合。在一些實施方式中，所述藥物能夠結(jié)合類維生素A結(jié)合蛋白，由此阻止其結(jié)合視網(wǎng)膜和RPE細(xì)胞中的受體蛋白。
在另一實施方式中，所述藥物競爭性抑制治療藥物與視網(wǎng)膜和/或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的結(jié)合。在另一實施方式中，所述藥物競爭性抑制抗生素藥物與視網(wǎng)膜和/或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的結(jié)合。在另一實施方式中，所述藥物競爭性抑制氨基糖苷類藥物與視網(wǎng)膜和/或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的結(jié)合。
在再進一步的實施方式中，所述藥物增加視網(wǎng)膜和/或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中類維生素A的攝取。在進一步的實施方式中，所述藥物增加RBP或IRBP與LDL受體基因家族成員結(jié)合。
在另一實施方式中，所述藥物阻止視黃醇、RBP、RBP-視黃醇復(fù)合體、IRBP、IRBP-視黃醇、TTR或RBP-視黃醇-TTR與視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的結(jié)合。在另一實施方式中，所述藥物抑制視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中類維生素A的攝取。
在另一實施方式中，所述藥物阻止視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中治療藥物的攝取。在另一實施方式中，所述藥物阻止視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中抗生素藥物的攝取。在另一實施方式中，所述藥物阻止視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中氨基糖苷類藥物的攝取。在另一實施方式中，所述藥物阻止視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中慶大霉素的攝取。
在再另一實施方式中，所述藥物有改變視網(wǎng)膜和/或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的表達的能力。例如，在正常表達這種LDL受體基因家族成員的細(xì)胞中，所述藥物可以降低LDL受體基因家族成員的表達，或可選擇地，所述藥物可以增加細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的表達。例如，MPR已知降低血清中視黃醇和RBP的水平。用MPR對小鼠進行長期處理可以導(dǎo)致負(fù)責(zé)RBP的轉(zhuǎn)胞吞的RPE中確認(rèn)的LDL受體基因家族蛋白的表達降低，由此建立RPE中LDL受體基因家族蛋白與血清RBP-視黃醇之間的關(guān)系。
其他的改變LDL受體基因家族成員表達的方法在本領(lǐng)域是已知的。例如核酸序列可用于改變LDL受體基因家族成員的表達。參見，例如US 2004/0198705，0176～0186段和WO2005/070965。
此外，所述藥物有改變細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的輔助受體的表達的能力。例如，所述藥物可以降低正常表達這種LDL受體基因家族成員的細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的輔助受體的表達，或可選擇地，所述藥物可以增加細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的輔助受體的表達。
此處設(shè)想的藥物可以選自天然存在的和合成的化合物的庫，其隨機地測試對結(jié)合的改變。
多肽和蛋白 在一個實施方式中，所述藥物是多肽。例如，該多肽可以選自RBP結(jié)合蛋白受體域及其片段、RBP結(jié)合蛋白輔助受體域及其片段、結(jié)合LDL受體基因元件的內(nèi)源性配體、修飾的類維生素A結(jié)合蛋白及其片段、類維生素A結(jié)合蛋白的片段、LDL受體基因家族拮抗劑，例如受體相關(guān)蛋白(RAP)，以及這些多肽的任何功能性同系物。
在一個實施方式中，所述藥物是能結(jié)合類維生素A結(jié)合蛋白的LDL受體基因家族成員的域。優(yōu)選地，所述LDL受體基因家族成員的域能夠結(jié)合例如RBP或IRBP的類維生素A結(jié)合蛋白。在一個實施方式中，所述域是巨蛋白域。在一個實施方式中，所述域是LRP域。
已顯示LRP的補體型重復(fù)序列(complement type repeat)能夠結(jié)合稱為RAP的蛋白。更具體地，LRP的簇11的8個補體型重復(fù)序列的每一個能夠結(jié)合RAP，除了重復(fù)序列8之外(其與其它重復(fù)序列的差別在于它缺少帶負(fù)電荷的氨基酸)(Andersen等，2000，J.Biol.Chem.27521017-21024)。
因此，優(yōu)選所述LDL受體基因家族成員的域包括至少一個補體型重復(fù)序列，更優(yōu)選地至少兩個補體型重復(fù)序列。設(shè)想LDL受體基因家族的其它域，例如LDL受體基因家族的域包括，例如2個補體型重復(fù)序列、3個補體型重復(fù)序列、4個補體型重復(fù)序列、5個補體型重復(fù)序列、6個補體型重復(fù)序列、7個補體型重復(fù)序列、8個補體型重復(fù)序列、9個補體型重復(fù)序列、10個補體型重復(fù)序列、11個補體型重復(fù)序列或超過11個補體型重復(fù)序列。在優(yōu)選的實施方式中，LDL受體基因家族成員的域包括2個補體型重復(fù)序列。對于LDL受體基因家族成員的特定域，參見，例如US 2004/0198705，0143-0164段。
在另一實施方式中，所述多肽是類維生素A結(jié)合蛋白的片段。優(yōu)選地，這種片段能夠與視網(wǎng)膜和RPE細(xì)胞中的LDL受體基因家族成員聯(lián)合。此外，這種類維生素A結(jié)合蛋白的片段不能結(jié)合或聯(lián)合類維生素A(例如，舉例來說，視黃醇)。在此情況下，類維生素A結(jié)合蛋白的片段可以結(jié)合視網(wǎng)膜和RPE細(xì)胞中的LDL受體基因家族成員，并因此抑制視黃醇-RBP復(fù)合體或視黃醇-RBP-TTR復(fù)合體與所述LDL受體基因家族成員的結(jié)合。
在一個實施方式中，所述藥物是可以與能與類維生素A結(jié)合蛋白結(jié)合的視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員聯(lián)合的RAP片段。
在另一實施方式中，所述藥物為LDL受體基因家族任意成員的內(nèi)源性配體。LDL受體基因家族成員已知分享共同的內(nèi)源性配體(見上述)。LDL受體基因家族成員(例如LRP和巨蛋白)的內(nèi)源性配體的實例在上面已給出。
在一個實施方式中，所述多肽是輕鏈(Klassen等Light Chains area Ligand for Megalin.J.Appl.Physiol.98257-263，2005)。
在一個實施方式中，所述多肽為視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的拮抗劑。多肽可以對其調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的活性的能力進行篩選。在一個實施方式中，多肽可以對其抑制類維生素A攝取進入RPE細(xì)胞的能力進行篩選。在另一實施方式中，多肽可以對其抑制IRBP-視黃醇和/或RBP-視黃醇攝取進入RPE細(xì)胞的能力進行篩選。在另一實施方式中，多肽可以對其抑制治療藥物攝取進入視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞的能力進行篩選。在另一實施方式中，多肽可以對其使其能夠抑制治抗生素藥物(例如，舉例來說，氨基糖苷類藥物)攝取進入視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞的能力進行篩選。
核酸 在一個實施方式中，所述藥物為核酸序列。優(yōu)選地，這種核酸序列潛在地改變視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的表達。在一個實施方式中，所述LDL受體基因家族成員是類維生素A結(jié)合蛋白受體。
在一個實施方式中，核酸序列包括編碼視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中存在的LDL受體基因家族成員的反義RNA或小干擾RNA(smallinterfering RNA)(siRNA)的DNA序列，或者所述核酸序列是視網(wǎng)膜和RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的反義RNA。其同系物也在本公開的范圍之內(nèi)。在一些實施方式中，所述LDL受體基因家族成員是類維生素A結(jié)合蛋白。
此外，所述核酸序列可以包括抗原核酸序列，其能夠與編碼視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的基因雜交，并由此抑制所述基因的轉(zhuǎn)錄。所述抗原核酸序列也能夠與所述基因的任意部分雜交，例如與所述基因的啟動子和/或與內(nèi)含子和/或與外顯子雜交。所述抗原核酸序列可以是任何種類的核酸，例如DNA、RNA、LNA或PNA或siRNA。
此處使用的術(shù)語“反義RNA”意為包括從視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的非編碼DNA鏈轉(zhuǎn)錄的RNA序列，或者能夠在嚴(yán)格條件下雜交LDL受體基因家族成員mRNA的RNA序列或其片段。
如果所述核酸序列是編碼視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的反義RNA的DNA序列或其同系物，這種核苷酸序列優(yōu)選可操作地連接指引此處公開的特殊實施方式的細(xì)胞中所述DNA序列的轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。
在另一實施方式中，所述核酸序列包括編碼視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的序列或其同系物或其片段。這種核酸序列優(yōu)選可操作地連接指引本發(fā)明的特殊實施方式的細(xì)胞中所述DNA序列的轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。
許多種指引DNA序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的，并且這種序列應(yīng)根據(jù)個別情況下的特殊需要進行選擇。例如，這種序列可以是原核，真核或病毒源的啟動子序列和增強子序列，或者它們可以是合成序列。
所述核酸序列可以包含在載體中且本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的載體均可以使用。載體能夠輸送核酸分子進入宿主細(xì)胞。這種載體包含非天然發(fā)現(xiàn)鄰近視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員核酸序列的核酸序列。
載體是可以用于將DNA序列從一個有機體轉(zhuǎn)移到另一個有機體的質(zhì)粒。載體為可復(fù)制結(jié)構(gòu)，其可以是任何核酸(包括DNA、RNA、LNA和PNA)。一旦被轉(zhuǎn)化到合適的宿主中，載體進行復(fù)制并且不依賴宿主的基因組而發(fā)揮作用，或者在某些情況下可以整合到基因組中。
通常，載體為病毒衍生的載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒衍生的載體、噬菌體、質(zhì)粒、粘粒、可整合的DNA片段(即，通過重組可整合進入宿主基因組)、細(xì)菌或真核細(xì)胞。
低分子量有機化合物 在某些實施方式中，所述調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中的LDL受體基因家族成員活性的藥物為低分子量有機化合物。在某些實施方式中，所述低分子量有機化合物具有正電荷。在某些實施方式中，所述低分子量有機化合物具有多于1個的正電荷。在某些實施方式中，所述低分子量有機化合物具有2個正電荷。在某些實施方式中，所述低分子量有機化合物具有3個正電荷。在某些實施方式中，所述低分子量有機化合物具有4個正電荷。在某些實施方式中，所述低分子量有機化合物具有5個正電荷。在某些實施方式中，所述低分子量有機化合物具1、2、3、4或多于4個的正電荷。通過選擇具有正電荷的低分子量有機化合物，有可能阻斷受體蛋白上足夠數(shù)目的結(jié)合位點。已知LDL受體基因家族成員中的結(jié)合位點包含能夠與陽離子物質(zhì)相互作用的陰離子氨基酸殘基(見上)。
在某些實施方式中，此處提供的所述低分子量化合物具有氨基。在某些實施方式中，所述低分子量化合物具有2個氨基。在某些實施方式中，所述低分子量化合物具有多于1個的氨基。在某些實施方式中，所述低分子量化合物具有能夠接受質(zhì)子的功能(基團)。在某些實施方式中，所述低分子量化合物具有多于1個能夠接受質(zhì)子的功能(基團)。在某些實施方式中，所述低分子量化合物具有多于1個能夠接受多于1個的質(zhì)子的功能(基團)。適合的能夠接受質(zhì)子的功能團為氨基。
在某些實施方式中，所述低分子量有機化合物具有通式(I)的結(jié)構(gòu)
通式(I) 其中，L為鍵、芳基、包含0-3個N原子的雜芳基、C3-C8碳環(huán)烷基(carbocycloalkyl)、包含0-3個N原子的C3-C8雜環(huán)烷基，其中所述芳基、雜芳基、碳環(huán)烷基或雜環(huán)烷基任選地被下述基團取代O(氧)、OH、苯基、鹵化物、C1-C4烷基、C2-C4烯基、C2-C4炔基、雜芳基、芳基-(C1-C4烷基)、雜芳基-(C1-C4烷基)、雜環(huán)烷基-(C1-C4烷基)、環(huán)烷基烷基、O-(C1-C4烷基)、O(COR10)、-CO2H、-CO2R10、-C(O)R10、-CON(R10)2、-NHC(O)R10、-C(OH)(R10)2、四唑基、-C(O)NHSO2R10、-CHOHCF3、-COCF3、-SO2NHC(O)R10或-N(R10)2，其中各R10獨立地為H或選自低級烷基、低級氟代烷基、低級烯基、低級炔基、C3-C6環(huán)烷基、苯基或芐基的任選取代基團； R1和R2各自獨立地選自鍵和C1-C10烷基，其中所述C1-C10烷基任選地被選自下述基團的取代基取代至少一次O、OH、苯基、胺(NH2)、亞胺(NH)、鹵素、烷基、烯基或炔基、取代的低級烷基、取代的低級烯基或炔基、芳基、雜環(huán)基(heterocyclyl)、雜芳基、芳基-(C1-C4)-烷基、雜芳基-(C1-C4)-烷基、雜環(huán)基-(C1-C4)-烷基、環(huán)烷基烷基、環(huán)烷基、烷氧基、羧基、三氟甲基、氰基、氨基或硝基，其中所述C1-C10烷基中的任意碳原子任選地被氧、氮、硫或硅替代； R3、R4、R5和R6單獨地選自氫、OH、三氟甲基、C(NH)NH2、氰基、氨基、硝基、選自烷基、雜烷基、烯基、炔基、苯基、芐基、芳基、雜環(huán)烷基、雜芳基、芳基-(C1-C4)-烷基、雜芳基-(C1-C4)-烷基、雜環(huán)基-(C1-C4)-烷基、環(huán)烷基烷基、環(huán)烷基的任選取代的基團，其中所述任選取代的基團具有選自下述基團的取代基H、O(氧)、OH、苯基、亞胺(NH)、鹵素、C1-C4烷基、C2-C4烯基或C2-C4炔基、芳基、雜環(huán)基、雜芳基、芳基-(C1-C4)-烷基、雜芳基-(C1-C4)-烷基、雜環(huán)基-(C1-C4)-烷基、環(huán)烷基烷基、環(huán)烷基、烷氧基、羧基、三氟甲基、氰基、氨基和/或硝基；或者 R3、R4、R5和R6中的一個或多個為連接到L上的鍵；或者 R3、R4、R5和R6中的一個或多個與R1、R2、R3、R4、R5、R6中的另一個連接和/或與L連接，由此形成環(huán)； 其中N′和N＂任選地具有另外的連接基團，由此形成季銨鹽；和 其藥學(xué)上可接受的鹽、藥學(xué)上可接受的N-氧化物、藥學(xué)活性代謝物、藥學(xué)上可接受的前藥和藥學(xué)上可接受的溶劑合物。
在某些實施方式中，N′和N＂被至少4個原子分隔。
在某些實施方式中，L選自環(huán)戊基、呋喃、噻吩基、吡咯、咪唑、噁唑、吡咯烷、四氫呋喃和四氫噻吩。在某些實施方式中，L為呋喃或吡咯。在某些實施方式中，L為四氫呋喃。在某些實施方式中，L選自吡啶、嘧啶、四氫吡喃、哌啶、哌嗪、環(huán)己基和苯基。在某些實施方式中，L為環(huán)己基或苯基。在某些實施方式中，L為鍵。
在某些實施方式中，所述低分子量有機化合物具有通式(II)的結(jié)構(gòu)
通式(II)， 其中 各R9獨立地選自H、OH、O-(C1-C4烷基)、O(COR10)、鹵化物、C1-C4烷基、(C1-C4烷基)-氨基、-N(R10)2和芳基；以及 其它變量為此處所描述的。
在某些實施方式中，所述低分子量有機化合物具有通式(III)的結(jié)構(gòu)
通式(III)， 其中 各R9獨立地選自H、OH、O-(C1-C4烷基)、O(COR10)、鹵化物、C1-C4烷基、(C1-C4烷基)-氨基、-N(R10)2和芳基；以及 其它變量為此處所描述的。
在某些實施方式中，所述低分子量有機化合物具有通式(IV)的結(jié)構(gòu)
通式(IV)， 其中 各n獨立地為0、1、2或3；以及 變量為此處上面所描述的。
在某些實施方式中，所述低分子量有機化合物具有通式(V)的結(jié)構(gòu)
通式(V)； 其中 R12為H或
各n獨立地為0、1、2或3；以及 其它變量為此處所描述的。
在某些實施方式中，各n為1。
在某些實施方式中，所述低分子量有機化合物選自1，2-二氨基乙烷、1，3-二氨基丙烷、1，4-二氨基丁烷、1，5-二氨基戊烷、1，6-二氨基己烷、1，7-二氨基庚烷、1，8-二氨基辛烷、3-甲氨基-1-(4-甲基哌嗪)-丙-2-醇、4-哌嗪苯胺、1-(3-氯苯基)哌嗪二氫氯化物、哌嗪-2-酮鹽酸、2-[4-(2-氨乙基)-哌嗪-1-基]-乙胺、哌嗪(pierazine)、2，4-二氨基-6-苯基-1，3，5-三嗪、3，5-二氨基-1，2，4-三唑、丙二酰胺(melonamide)、精氨酸HCl、哌啶、2，5-哌嗪二酮、無水哌嗪、哌嗪-2-酮HCl和1-(2-嘧啶基)哌嗪二氫氯化物；及其藥學(xué)上可接受的鹽。
在某些實施方式中，所述低分子量有機化合物選自2-[4-(2-氨乙基)哌嗪-1-基]-乙胺、3-甲氨基-1-(4-甲基哌嗪)-丙-2-醇和哌嗪。
在某些實施方式中，所述低分子量有機化合物為哌嗪。
在某些實施方式中，所述低分子量有機化合物選自1，2-二氨基乙烷、1，3-二氨基丙烷、1，4-二氨基丁烷、1，5-二氨基戊烷、1，6-二氨基己烷、1，7-二氨基庚烷和1，8-二氨基辛烷。
在某些實施方式中，所述低分子量有機化合物選自1，2-二氨基乙烷、1，4-二氨基丁烷、1，5-二氨基戊烷、1，6-二氨基己烷和1，7-二氨基庚烷。
在某些實施方式中，所述低分子量有機化合物為1，6-二氨基己烷。
在一個實施方式中，所述藥物選自4，4′-二氨基二環(huán)己基甲烷
、反式-1，4-二氨基環(huán)己烷
1，3-二(氨甲基)-環(huán)己烷
1，4-二(氨甲基)-環(huán)己烷
對苯二甲基二胺
間苯二甲基二胺
1-(吡啶-4-基)-哌嗪
1-[4-((哌啶-1-基)甲基)苯甲基]哌啶
2，3，5，6-四甲基-1，4-苯二甲基二胺，二氫氯化物
2，5-二甲基-1，4-苯二甲基二胺，二氫氯化物
α，α′-(二甲基氨基)-對二甲苯，二氫溴化物
α，α′-(三甲基銨)-2，5-二甲基-對二甲苯，二氯化物
(Sigma/aldrich S111333)、N-(4-胍基甲基-苯基)-胍
3-氨甲基苯甲脒，二氫氯化物
4-(氨甲基)苯甲脒二氫氯化物
4-氨甲基-2，3，5，6-四氯-芐胺，二氫氯化物
4-氨甲基-2，3，5，6-四氟-芐胺，二氫氯化物
2，6-二烯丙基-1，2，3，5，6，7-六氫吡咯[3，4-f]異吲哚，二氫氯化物
2-(4-氨甲基-苯基)-乙胺，二氫氯化物
1，4-(二脒基)苯，二氫氯化物
2-(4-(2-氨乙基)苯基)乙胺，二氫氯化物
3-(4-甲基哌嗪-1-基)-1-丙胺
2-氨基-1-(4-(氨甲基)苯基)乙醇，二氫氯化物
1，4-二(2-氨基-1-羥乙基)苯，二氫氯化物
2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙胺，三氫氯化物
4-(4-甲基哌嗪-1-基)-1-丁胺，三氫氯化物
2-(哌嗪-1-基)乙胺，三氫氯化物
3-(哌嗪-1-基)-1-丙胺，三氫氯化物
3-(4，4-二甲基哌嗪-1-基)-1-丙胺
1-(2-氨基乙基)哌啶-4-胺，三氫氯化物
1-(3-氨基丙基)哌啶-4-胺，三氫氯化物
2-(哌啶-4-基)乙胺，二氫氯化物
3-(哌啶-4-基)-1-丙胺，二氫氯化物
(2R，3S，4S，5R)-2，5-二(氨甲基)-四氫呋喃-3，4-二醇，二氫氯化物
(2R，3S，4S，5R)-2，5-二(胍基甲基)-四氫呋喃-3，4-二醇，二氫氯化物
(2R，3S，4S，5R)-2，5-二(2-氨基乙基)-四氫呋喃-3，4-二醇，二氫氯化物
(2R，3S，4S，5R)-2，5-二(2-胍基乙基)四氫呋喃-3，4-二醇，二氫氯化物
4-(哌啶-4-基)哌啶二氫氯化物
(2R，3S，4S，5R)-2-(2-氨基乙基)-5-(氨甲基)-四氫呋喃-3，4-二醇二氫氯化物
(2S，3S，4R，5S，6S)-5-氨基-2-(氨甲基)-6-甲氧基-四氫-2H-吡喃-3，4-二醇，二氫氯化物
(2R，3S，4R，5R，6S)-5-氨基-2-(2-氨基乙基)-6-甲氧基-四氫-2H-吡喃-3，4-二醇，二氫氯化物
(2R，3R，4R，5R)-1，6-二氨基己烷-2，3，4，5-四醇，二氫氯化物
(2S，3R，4R，5R)-1，6-二氨基己烷-2，3，4，5-四醇，二氫氯化物
和(2S，3R，4S，5R)-1，6-二氨基己烷-2，3，4，5-四醇，二氫氯化物
在另一實施方式中，所述藥物選自4，4′-二氨基二環(huán)己基甲烷
反式-1，4-二氨基環(huán)己烷
二(氨甲基)-環(huán)己烷
1，4-二(氨甲基)-環(huán)己烷
對苯二甲基二胺
間苯二甲基二胺
1-[4-((哌啶-1-基)甲基)芐基]哌啶
2，3，5，6-四甲基-1，4-苯二甲基二胺，二氫氯化物
2，5-二甲基-1，4-苯二甲基二胺，二氫氯化物
α，α′-(二甲基氨基)-對二甲苯，二氫溴酸鹽
α，α′-(三甲基銨)-2，5-二甲基-對二甲苯，二氯化物
N-(4-胍基甲基-苯基)-胍
3-氨甲基苯甲脒，二氫氯化物
4-(氨甲基)苯甲脒，二氫氯化物
4-氨甲基-2，3，5，6-四氯-芐胺，二氫氯化物
4-氨甲基-2，3，5，6-四氟-芐胺，二氫氯化物
2-(4-氨甲基-苯基)-乙胺，二氫氯化物
1，4-(二脒基)苯，二氫氯化物
2-(4-(2-氨乙基)苯基)乙胺，二氫氯化物
2-氨基-1-(4-(氨甲基)苯基)乙醇，二氫氯化物
1，4-二(2-氨基-1-羥乙基)苯，二氫氯化物
和
在一個實施方式中，所述藥物選自反式-1，4-二氨基環(huán)己烷
1，3-二(氨甲基)-環(huán)己烷
1，4-二(氨甲基)-環(huán)己烷
對苯二甲基二胺
間苯二甲基二胺
2，5-二甲基-1，4-苯二甲基二胺，二氫氯化物
α，α′-(二甲基氨基)-對二甲苯，二氫溴酸鹽
α，α′-(三甲基銨)-2，5-二甲基-對二甲苯，二氯化物
N-(4-胍基甲基-苯基)-胍
3-氨甲基苯甲脒，二氫氯化物
4-(氨甲基)苯甲脒二氫氯化物
2-(4-氨甲基-苯基)-乙胺，二氫氯化物
2-(4-(2-氨乙基)苯基)乙胺，二氫氯化物
和1，4-二(2-氨基-1-羥乙基)苯，二氫氯化物
在一個實施方式中，所述藥物選自(2R，3S，4S，5R)-2，5-二(氨甲基)-四氫呋喃-3，4-二醇，二氫氯化物
(2R，3S，4S，5R)-2，5-二(胍基甲基)-四氫呋喃-3，4-二醇，二氫氯化物
(2R，3S，4S，5R)-2，5-二(2-氨基乙基)-四氫呋喃-3，4-二醇，二氫氯化物
(2R，3S，4S，5R)-2，5-二(2-胍基乙基)四氫呋喃-3，4-二醇，二氫氯化物
(2R，3S，4S，5R)-2-(2-氨基乙基)-5-(氨甲基)-四氫呋喃-3，4-二醇二氫氯化物
(2S，3S，4R，5S，6S)-5-氨基-2-(氨甲基)-6-甲氧基-四氫-2H-吡喃-3，4-二醇，二氫氯化物
和(2R，3S，4R，5R，6S)-5-氨基-2-(2-氨基乙基)-6-甲氧基-四氫-2H-吡喃-3，4-二醇，二氫氯化物
在一個實施方式中，所述藥物是(2R，3S，4S，5R)-2，5-二(氨甲基)-四氫呋喃-3，4-二醇，二氫氯化物
在一個實施方式中，所述藥物選自
和2，6-二烯丙基-1，2，3，5，6，7-六氫吡咯[3，4-f]異吲哚，二氫氯化物
在一個實施方式中，所述藥物選自1-(吡啶-4-基)-哌嗪
3-(4-甲基哌嗪-1-基)-1-丙胺
2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙胺，三氫氯化物
4-(4-甲基哌嗪-1-基)-1-丁胺，三氫氯化物
2-(哌嗪-1-基)乙胺，三氫氯化物
3-(哌嗪-1-基)-1-丙胺，三氫氯化物
3-(4，4-二甲基哌嗪-1-基)-1-丙胺
1-(2-氨基乙基)哌啶-4-胺，三氫氯化物
1-(3-氨基丙基)哌啶-4-胺，三氫氯化物
2-(哌啶-4-基)乙胺，二氫氯化物
3-(哌啶-4-基)-1-丙胺，二氫氯化物
和4-(哌啶-4-基)哌啶二氫氯化物
在一個實施方式中，所述藥物選自3-(4-甲基哌嗪-1-基)-1-丙胺
4-(4-甲基哌嗪-1-基)-1-丁胺，三氫氯化物
3-(4，4-二甲基哌嗪-1-基)-1-丙胺
2-(哌啶-4-基)乙胺，二氫氯化物
和4-(哌啶-4-基)哌啶二氫氯化物
在一個實施方式中，所述藥物選自(2R，3R，4R，5R)-1，6-二氨基己烷-2，3，4，5-四醇，二氫氯化物
(2S，3R，4R，5R)-1，6-二氨基己烷-2，3，4，5-四醇，二氫氯化物
和(2S，3R，4S，5R)-1，6-二氨基己烷-2，3，4，5-四醇，二氫氯化物
在另一實施方式中，所述藥物選自反式-1，4-二氨基環(huán)己烷、1，3-二(氨甲基)-環(huán)己烷、1，4-二(氨甲基)-環(huán)己烷、對苯二甲基二胺、間苯二甲基二胺、1-(4-(吡啶-4-基)-哌嗪、2，5-二甲基-1，4-苯二甲基二胺二氫氯化物、α，α′-(二甲基氨基)-對二甲苯二氫溴化物和
(Sigma/aldrich S111333)。
在一個實施方式中，所述化合物選自反式-1，4-二氨基環(huán)己烷、1，3-二(氨甲基)-環(huán)己烷、1，4-二(氨甲基)-環(huán)己烷、對苯二甲基二胺、間苯二甲基二胺、2，5-二甲基-1，4-苯二甲基二胺二氫氯化物、α，α′-(二甲基氨基)-對二甲苯二氫溴化物。
在另一實施方式中，所述化合物選自反式-1，4-二氨基環(huán)己烷、對苯二甲基二胺、間苯二甲基二胺、2，5-二甲基-1，4-苯二甲基-二胺二氫氯化物、1-(吡啶-4-基)-哌嗪、α，α′-(二甲基氨基)-對二甲苯二氫溴化物。
在另一實施方式中，所述化合物選自對苯二甲基二胺、1-(吡啶-4-基)-哌嗪、α，α′-(二甲基氨基)-對二甲苯二氫溴化物。
在另一實施方式中，所述化合物選自反式對苯二甲基二胺和α，α′-(二甲基氨基)-對二甲苯二氫溴化物。
在一個實施方式中，所述低分子量有機化合物抑制類維生素A攝取進入RPE細(xì)胞。在另一實施方式中，所述低分子量有機化合物抑制RBP-視黃醇和/或IRBP-視黃醇攝取進入RPE細(xì)胞。在另一實施方式中，所述低分子量有機化合物抑制視網(wǎng)膜毒性的治療藥物攝取進入RPE細(xì)胞。
氨基糖苷類的衍生物 在另一實施方式中，調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員活性的藥物是氨基糖苷類的衍生物。氨基糖苷類已顯示結(jié)合LDL受體基因家族成員。參見，例如WO 2004/084876。氨基糖苷類的衍生物已顯示具有作為LDL受體基因家族成員的拮抗劑的潛能。參見，例如WO 2004/084876。在一個實施方式中，所述藥物是慶大霉素、多粘霉素B、抑肽酶、天花粉蛋白、丁胺卡那霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、巴龍霉素、鏈霉素、妥布拉霉素或阿泊拉霉素的衍生物。在一個實施方式中，所述藥物是慶大霉素、多粘霉素B、抑肽酶或天花粉蛋白的衍生物。在另一實施方式中，所述藥物是慶大霉素的衍生物。在另一實施方式中，所述藥物是選自Garoseamine、脫氧鏈霉胺(purposamine和2-脫氧鏈霉胺的慶大霉素衍生物。
Ca2+清除劑 已知LDL受體家族成員結(jié)合Ca2+，其被認(rèn)為有助于受體穩(wěn)定并維持受體處于它的天然構(gòu)象，該天然構(gòu)象對于特定配體與受體的結(jié)合是關(guān)鍵的(Andersen等J.Biol.Chem.Vol 275，no.28，21017-21024，2000)。特定蛋白配體，例如，舉例來說，RBP、IRBP和RAP結(jié)合天然構(gòu)象的受體蛋白。在一些實施方式中，所述藥物是用于調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員活性的Ca2+清除劑。在一些實施方式中，Ca2+清除劑降低所述受體蛋白的穩(wěn)定性。在一些實施方式中，Ca2+清除劑是EDTA。在一些實施方式中，所述Ca2+清除劑添加第二種藥物。
二硫化物還原劑 在所述LDL受體基因家族成員中存在的配體結(jié)合(補體)型富含半胱氨酸的重復(fù)序列含有多個二硫鍵，其造成受體蛋白的三維結(jié)構(gòu)(Andersen等J.Biol.Chem.Vol 275，no.28，21017-21024，2000)。僅當(dāng)所述受體蛋白處于它的天然形式時，特定蛋白配體，例如，舉例來說，RBP和IRBP識別并結(jié)合LDL受體基因家族成員。二硫鍵的還原破壞了所述受體蛋白的天然構(gòu)象并明顯抑制蛋白配體的結(jié)合(參見例如US2003/0202974)。在一個實施方式中，所述藥物是還原劑。在另一實施方式中，所述藥物還原受體蛋白中的二硫基。
聚合物 在一些實施方式中，所述藥物是聚合物。在一些實施方式中，所述聚合物具有至少一個正電荷。在一些實施方式中，所述聚合物具有多于一個的正電荷。在一個實施方式中，所述聚合物是聚賴氨酸。在另一實施方式中，所述聚合物是聚賴氨酸的衍生物。此處設(shè)想的其它聚合物包括在WO 2004/084876和WO 2006/037335中披露的那些聚合物。也設(shè)想此處公開的任何肽或蛋白質(zhì)的聚合物。
抗體 在一些實施方式中，此處用于調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中的LDL受體基因家族成員活性的藥物為抗體。此處描述了特異性地識別視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中的LDL受體基因家族成員的抗體以及制備抗體的方法。抗體可以通過商業(yè)零售商處獲得，例如，舉例來說，F(xiàn)itzgerald Industries International，Inc.(Concord，MA)、Santa CruzTechnologies(Santa Cruz，CA)、Oxford Biomedical Research(Oxford，MI)。可選擇地，對視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中的LDL受體基因家族成員特異性抗體通過本領(lǐng)域已知的方法獲得。
用于生產(chǎn)合適的抗體的免疫原包括在視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中表達的LDL受體基因家族的完整成員或其片段和衍生物，或者在視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞的表面上表達的LDL受體基因家族成員。免疫原包括一個LDL受體基因家族成員的全部或部分，其中這些氨基酸包含在天然靶蛋白上發(fā)現(xiàn)的翻譯后修飾，例如糖基化。包含蛋白質(zhì)胞外域的免疫原以本領(lǐng)域已知的各種方法制備，例如使用常規(guī)的重組方法表達克隆的基因，或從腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液(supematants)中分離等。免疫原也可以在體內(nèi)由編碼引入到宿主動物體內(nèi)的免疫原肽的多核苷酸進行表達。
此處設(shè)想的抗體分子包括免疫球蛋白分子，其典型地由重鏈和輕鏈組成，各鏈具有顯示與其它免疫球蛋白分子的相似性的恒定區(qū)和傳達對特定抗原的特異性的可變區(qū)?；谥劓満愣▍^(qū)中的抗原決定簇，大部分免疫球蛋白可以被分類，例如IgG、IgM、IgA、IgE和IgD；每一類在免疫反應(yīng)中起不同的作用。
與合適的對照相比，抗體可用于調(diào)節(jié)生物活性，從而增加或降低測定活性的刺激、抑制或阻斷。
抗體調(diào)節(jié)劑包括特異性地結(jié)合視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員并激活受體蛋白的抗體，例如啟動信號傳導(dǎo)的受體配體結(jié)合；特異性地結(jié)合LDL受體基因家族成員并抑制另一分子與多肽的結(jié)合，由此阻止信號傳導(dǎo)途徑激活的抗體；結(jié)合LDL受體基因家族成員以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的抗體；以及結(jié)合LDL受體基因家族成員以調(diào)節(jié)翻譯的抗體。當(dāng)與合適的對照相比時，調(diào)節(jié)LDL受體基因家族成員活性或其多核苷酸的抗體，增加或降低至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％、至少約50％、至少約100％或至少約2倍、至少約5倍、或至少約10倍或更高的活性或結(jié)合。在一個實施方式中，抗體特異性地干擾視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的活性。更具體地，所述抗體特異性地結(jié)合視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的胞外域。
在一個實施方式中，所述藥物是內(nèi)抗體(intrabody)。所述內(nèi)抗體是設(shè)計為特異性結(jié)合和滅活細(xì)胞內(nèi)靶分子的細(xì)胞內(nèi)表達的單鏈抗體分子。內(nèi)抗體已在細(xì)胞測定和整個有機體中使用(Chen等，Hum.GeneTher.5595(1994)；Hassanzadeh等，F(xiàn)EBS Lett.43775(1998)。可誘導(dǎo)表達載體可以用與屬于視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中表達的LDL受體基因家族的蛋白受體進行特異性反應(yīng)的內(nèi)抗體構(gòu)成。這些載體可以引入到宿主細(xì)胞和模型有機體中。
在一個實施方式中，所述藥物是“人工”抗體，例如在體外制備并選擇的抗體和抗體片段。在一些實施方式中，如上所述，這些抗體出現(xiàn)在噬菌體或其它病毒顆粒的表面上。在其他實施方式中，人工抗體以具有病毒或噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白(包括，但不限于M13基因III蛋白)的融合蛋白存在。制備這些人工抗體的方法在本領(lǐng)域是公知的(美國專利Nos.5,516,637、5,223,409、5,658,727、5,667,988、5,498,538、5,403,484、5,571,698和5,625,033)。例如在與選擇的抗原結(jié)合的噬菌體的基礎(chǔ)上選擇的人工抗體，可以融合到用于治療的免疫球蛋白的Fc片段，如在例如US 5,116,964或WO 99/61630中所述?？贵w可用于直接或間接地調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物活性。主體抗體可以調(diào)節(jié)與其具有初級相互作用的靶細(xì)胞的活性，或者可以通過發(fā)揮繼發(fā)效應(yīng)(即當(dāng)初級靶點與其它細(xì)胞相互作用或聯(lián)系時)調(diào)節(jié)其它細(xì)胞的活性。此處提供的抗體可以給與哺乳動物，尤其是人體中達到治療和/或診斷目的。
在一個實施方式中，所述藥物是抗體。在另一實施方式中，所述抗體是人的或人源化抗體。在另一實施方式中，所述抗體是多克隆抗體、單克隆抗體、單鏈抗體、激動抗體、拮抗抗體、中和抗體或其活性片段。在一個實施方式中，所述抗體的活性片段是特異性結(jié)合抗原或表位的片段。在一個實施方式中，所述活性片段是抗原結(jié)合片段、Fc片段、cdr片段、VH片段、VL片段或框架片段。在一個實施方式中，所述抗體包括選自免疫球蛋白的可變區(qū)、免疫球蛋白的恒定區(qū)、免疫球蛋白的重鏈、免疫球蛋白的輕鏈和免疫球蛋白的抗原結(jié)合區(qū)域的至少一個域。在一個實施方式中，所述抗體包括免疫球蛋白的至少一個輕鏈。
肽適體 用于調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中的LDL受體基因家族成員活性的另一適合的藥物為肽適體。肽適體是充當(dāng)?shù)鞍坠δ茱@性抑制劑的肽或小的多肽。肽適體特異性結(jié)合靶蛋白，從而阻斷它們的功能(Kolonin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9514266(1998))。由于肽適體的高度選擇的性質(zhì)，它們不僅用于定向于特定的蛋白質(zhì)，而且定向于給定的蛋白的特定功能(例如，信號功能)。進一步，肽適體可以通過使用調(diào)節(jié)表達的時間、空間或誘導(dǎo)的方式的啟動子以受控的形式表達。肽適體作用顯著，因此，它們可用以分析不能獲得功能缺失的突變的蛋白。
以高親和力和特異性結(jié)合靶蛋白的肽適體可以通過本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)分離。通過酵母菌雙雜交篩選可以從隨機的肽文庫中分離肽適體(Xu等，Proc.Nati.Acad.Sci.USA 9412473(1997))。它們也可以從噬菌體文庫(Hoogenboom等，Immunotechnology 41(1998))或化學(xué)方法產(chǎn)生的肽/文庫中分離。
LDL受體基因家族成員的內(nèi)源性結(jié)合配體 如上所述，術(shù)語“內(nèi)源性結(jié)合配體”意為包括結(jié)合LDL受體基因家族成員(包括巨蛋白和巨蛋白樣蛋白)的內(nèi)源性初級物質(zhì)，以及當(dāng)初級結(jié)合物質(zhì)結(jié)合LDL受體基因家族成員時與LDL受體基因家族成員的初級結(jié)合配體結(jié)合的次級內(nèi)源性物質(zhì)。基于本說明，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，檢測的和測定的特定內(nèi)源性結(jié)合配體取決于許多因素，包括例如當(dāng)攝取進入視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中時配體易被檢測的能力。已知存在許多種巨蛋白結(jié)合配體，包括例如上面所列的那些(也參見，Chistensen，I.L.和Willnow，T.E.J.Am.Soc.Nephrol.10，2224-2236，1999)。此處提供的優(yōu)選內(nèi)源性巨蛋白結(jié)合配體包括類維生素A結(jié)合蛋白和光感受器間類維生素A結(jié)合蛋白。另外的內(nèi)源性巨蛋白結(jié)合配體可以通過在Christensen等(1992)，Chistensen，I.L.和Willnow，T.E.(1999)J.Am.Soc.Nephro l.10，2224-2236、Cui，S.等(1996)Am.J.Physiol.271，F(xiàn)900-F907、Gburek，J.等(2002)J.Am.Soc.Nephrol.13，423-430、Hilpert等(1999)，J.Biol.Chem.274，5620-5625、Kanalas，J.J和Makker，S.P.(1991)J.Biol.Chem.266，10825-10829、Kounnas，M.Z.等(1992)J.Biol.Chem.267，21162-21166、Kounnas，M.Z.等(1993)J.Biol.Chem.268，14176-14181、Kounnas，M.Z.等(1995)J.Biol.Chem.270，13070-13075、Moestrup，S.K.等(1993)J.Biol.Chem.268，16564-16570、Moestrup，S.K.等(1995)J.Clin.Invest.96，1404-1413、Moestrup，S.K.等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93，8612-8617、Moestrup，S.K.等(1998)J.Clin.Invest.102，902-909、Nykjaer，A.等(1999)Cell 96，507-515、Orlando，R.A.等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，6698-6702、Orlando，R.A.等(1998)J.Am.Soc.Nephrol.9，1759-1766、Stefansson，S.等(1995-A)J.Cell Sci.108，2361-2368、Stefansson，S.等(1995-B)J.Biol.Chem.270，19417-19421、Wilnow，T.E.等(1992)J.Biol.Chem.267，26172-26180、Wilnow，T.E.等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，8460-8464和Zheng，G.等(1998)Endocrinology 139，1462-1465中描述的一種或多種方法鑒定。
基于本說明，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，內(nèi)源性巨蛋白結(jié)合配體的檢測和定量方法可以包括許多可用的分析工具中的任一種。例如，這種方法可以包括使用HPLC、NMR或使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)免疫分析方法。這種免疫分析包括，但不限于使用如RIA、ELISA、“三明治”免疫分析、免疫放射分析、凝膠擴散沉淀反應(yīng)、免疫擴散分析、原位免疫分析(使用，例如膠體金、酶或放射性同位素標(biāo)記)、蛋白質(zhì)印跡、二維凝膠分析、沉淀反應(yīng)、免疫熒光分析、蛋白A分析和免疫電泳分析的技術(shù)的競爭性和非競爭性分析系統(tǒng)。
配體結(jié)合區(qū)域的鑒定 所述LDL受體基因家族中的補體型配體結(jié)合重復(fù)序列負(fù)責(zé)識別配體(Herz等，LRPa multifunctional scavenger and signaling receptor.The Journal of Clinical Investigation，vol 108，no.6，pp779-784，2001)。此處鑒定的LDL受體基因家族的配體識別性質(zhì)可以通過本領(lǐng)域已知方法實現(xiàn)。簡要地和僅舉例來說，使用下述方法實現(xiàn)負(fù)責(zé)結(jié)合多種配體的區(qū)域的鑒定。經(jīng)鑒定的受體的“小受體(minireceptor)”可通過融合配體結(jié)合重復(fù)序列的各種不同簇和受體的膜跨和胞質(zhì)域，并測量它們介導(dǎo)隨后在細(xì)胞內(nèi)表達的配體的細(xì)胞納入作用的能力而制備(Willnow等，Molecular dissection of ligand binding sites on the lowdensity lipoportein receptor related protein.J.Biol.Chem.26915827-15832，1994)。另一種途徑可能涉及測試代表受體中各簇的可溶性重組受體片段在體外結(jié)合各種不同配體的能力(Springer，TA.An extracellular beta-propellar module predicted in lipoprotein andscavenger receptors，tyrosine kinases，epidermal growth factor precursor，and extra cellular matrix components.J.Mol.Biol.283837-862，1998)。
以高親和力結(jié)合多種結(jié)構(gòu)上截然不同的配體是由于受體中存在多個配體結(jié)合型重復(fù)序列，由于各重復(fù)序列具有獨特的輪廓表面和電荷分布，以及由于配體和受體兩者之間的多重相互作用。某些配體可以識別連續(xù)模式中的不同重復(fù)序列，而其它配體表現(xiàn)為識別分離簇的重復(fù)序列(Herz等，LRPa multifunctional scavenger and signalingreceptor.The Journal of Clinical Investigation，vol 108，no.6，pp779-784，2001)。
分析 測定是否藥物結(jié)合視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員和/或調(diào)節(jié)其活性的方法在本領(lǐng)域是已知的。例如，本領(lǐng)域中描述的測定法包括列于下述文獻中的那些US 2003/0202974、WO06/037335、WO 03/080103、US 2004/0198705、WO 04/084876、US2006/0029609、US 2005/0026823、US 2005/0100986、US 2005/0089932、US 2005/0042227、US 2004/0204357、US 2004/0198705、US2004/0049010、US 2003/0202974、US 2003/0181660、US 2003/0082640、US 2003/0157561、US 2003/0077672、Chistensen等(1999)J.Am.Soc.Nephrol.10，2224-2236、Cui，S.等(1996)Am.J.Physiol.271，F(xiàn)900-F907、Gburek，J.等(2002)J.Am.Soc.Nephrol.13，423-430、Hilpert等(1999)，J.Biol.Chem.274，5620-5625、Kanalas，J.J.和Makker，S.P.(1991)J.Biol.Chem.266，10825-10829、Kounnas，M.Z.等(1992)J.Biol.Chem.267，21162-21166、Kounnas，M.Z.等(1993)J.Biol.Chem.268，14176-14181、Kounnas，M.Z.等(1995)J.Biol.Chem.270，13070-13075、Moestrup，S.K.等(1993)J.Biol.Chem.268，16564-16570、Moestrup，S.K.等(1995)J.Clin.Invest.96，1404-1413、Moestrup，S.K.等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，8612-8617、Moestrup，S.K.等(1998)J.Clin.Invest.102，902-909、Nykjaer，A.等(1999)Cell 96，507-515、Orlando，R.A.等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，6698-6702、Orlando，R.A.等(1998)J.Am.Soc.Nephrol.9，1759-1766、Stefansson，S.等(1995-A)J.Cell Sci.108，2361-2368、Stefansson，S.等(1995-B)J.Biol.Chem.270，19417-19421、Wilnow，T.E.等(1992)J.Biol.Chem.267，26172-26180、Wilnow，T.E.等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，8460-8464和Zheng，G.等(1998)Endocrinology 139，1462-1465。
與視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員相互作用(即，結(jié)合和/或調(diào)節(jié)其活性)的藥物的鑒定可以使用任何已知的方法檢測。適合的方法包括酵母雙雜交系統(tǒng)(Zhu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9413，063(1997)；Fields等，Nature 340245(1989)；U.S.Pat.No.5,283,173；Chien等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 889578(1991)、哺乳動物細(xì)胞雙雜交方法、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)分析、生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(BRET)分析、熒光猝滅分析、熒光各向異性分析(Jameson等，Methods Enzymol.246283(1995))、免疫分析和涉及可檢測的標(biāo)記蛋白與固定蛋白結(jié)合的分析。
檢測生物樣品中LDL受體基因家族成員的存在和生物活性的方法是已知的。使用的分析法應(yīng)當(dāng)適合特定LDL受體基因家族成員的生物活性。因此，例如當(dāng)所述生物活性是結(jié)合次級大分子時，所述分析使用公知的分析方法適當(dāng)?shù)貦z測蛋白-蛋白結(jié)合、蛋白-DNA結(jié)合、蛋白-碳水化合物結(jié)合或蛋白-脂類結(jié)合。當(dāng)所述生物活性是信號傳導(dǎo)(例如信號從細(xì)胞外傳遞到細(xì)胞內(nèi))或運送時，使用的適當(dāng)?shù)姆治龇?，例如測量細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、測定膜導(dǎo)電性變化或測定細(xì)胞內(nèi)鉀離子濃度。
此處提供不是使用特異性抗體檢測生物樣品中屬于LDL受體基因家族的正?；虍惓ｎ惥S生素A結(jié)合蛋白受體的存在或測定其水平的方法。該方法通常包括將樣品與特異性抗體接觸并檢測抗體和樣品分子之間的結(jié)合。當(dāng)與合適的對照比較時，特異性抗體的結(jié)合是樣品中存在關(guān)注的LDL受體基因家族成員的指標(biāo)。
多種檢測特異性抗體-抗原相互作用的方法在本領(lǐng)域是已知的，例如標(biāo)準(zhǔn)免疫組織學(xué)方法、免疫沉淀作用、酶免疫分析法和放射免疫分析法。簡要地說，將抗體加入到細(xì)胞樣品中，并培養(yǎng)充足的時間以使其結(jié)合表位，通常為至少約10分鐘。所述抗體可以用放射性同位素、酶、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑或其它用于直接檢測的標(biāo)記來進行標(biāo)記?？蛇x擇地，可以使用特異性結(jié)合對，包括例如如上所述可檢測地標(biāo)記的第二相抗體或試劑。這些試劑和它們的使用方法在本領(lǐng)域是公知的。
鑒定調(diào)節(jié)LDL受體基因家族成員生物活性的藥物的方法是已知的。該方法通常包括使測試藥物與含有例如LDL受體基因家族成員的目標(biāo)多肽接觸，并分析LDL受體基因家族目標(biāo)成員在測試藥物存在下的生物活性。與適合的對照(例如在不存在測試藥物的情況下包含LDL受體基因家族目標(biāo)成員的樣品)的活性相比，所分析的生物活性的增加或降低是該物質(zhì)調(diào)節(jié)目標(biāo)多肽生物活性的指標(biāo)。可以任何能夠提供必需的相互作用的順序加入組分的混合物。
鑒定能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的核酸表達水平的藥物，尤其是生物活性藥物的方法是已知的。該方法包括將需要測試的候選藥物與包含編碼LDL受體基因家族成員的核酸的細(xì)胞合并，并測定藥物對LDL受體基因家族成員表達的影響。
降低視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員生物活性的藥物可用于治療與該分子生物活性有關(guān)的狀況或病癥。例如，調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的表達可用于治療眼科病癥。視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員表達水平的降低可以比正常表達LDL受體基因家族成員的視網(wǎng)膜和RPE細(xì)胞減少攝取視黃醇、視黃醇-RBP和/或視黃醇-RBP-TTR的量。視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員表達水平的降低可以比正常表達LDL受體基因家族成員的視網(wǎng)膜和RPE細(xì)胞降低攝取的治療藥物(即，產(chǎn)生不期望的眼睛毒性副作用的藥物)的量。視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員表達水平的降低可以比正常表達LDL受體基因家族成員的視網(wǎng)膜和RPE細(xì)胞降低攝取的抗生素(例如，舉例來說，氨基糖苷類)的量。
可選擇地，某些實施方式可以檢測增加生物活性的藥物。
在一個實施方式中，用RBP-視黃醇和/或IRBP-視黃醇以及此處給出的藥物處理RPE細(xì)胞。一段時間之后，分離細(xì)胞并測定視黃醇含量(包括RBP和IRBP含量)。與對照(用RBP-視黃醇和/或IRBP-視黃醇但沒有此處給出的藥物進行處理的RPE細(xì)胞)相比，在RPE細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的視黃醇的量提供藥物對受體介導(dǎo)活性的效應(yīng)(即，對受體介導(dǎo)的RBP-視黃醇或IRBP-視黃醇轉(zhuǎn)胞吞作用的抑制)的指標(biāo)。
在另一實施方式中，RPE細(xì)胞用治療藥物(例如，舉例來說，抗生物藥物和此處提出的藥物)處理。所述治療藥物造成眼組織(例如，舉例來說，視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞)的毒性效應(yīng)。一段時間之后，分離細(xì)胞并測定治療藥物的含量。與對照(用治療藥物而沒有此處給出的藥物處理的視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞)相比，在視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的治療藥物的量提供了藥物對受體介導(dǎo)活性的效應(yīng)(即，對治療藥物的受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)胞吞作用的抑制)的指標(biāo)。
增加視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員生物活性的藥物可用于治療與該生物活性缺失有關(guān)的眼睛狀況。例如，增加LDL受體基因家族成員生物活性導(dǎo)致視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中轉(zhuǎn)胞吞作用增加，而由此增加所述細(xì)胞中的類維生素A的濃度或阻止所述細(xì)胞中類維生素A和/或毒性化學(xué)物質(zhì)的聚積。
通過上述方法可以篩選許多種不同的候選藥物。如上所述，候選藥物涵蓋很多的化學(xué)分類。
候選藥物可從包括合成或天然的化合物文庫的大量來源獲得。很多方法可用于大量的有機化合物和生物分子的隨機和定向的合成，包括隨機寡核苷酸和寡肽的表達。例如通過酵母雙雜交篩選(Xu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9412473(1997)、噬菌體文庫(Hoogenboom等，Immunotechnology 41(1998)或化學(xué)方法產(chǎn)生的文庫獲得的隨機肽文庫。
可選擇地，細(xì)菌、真菌、植物和動物提取物形式的天然化合物文庫是可用的或很容易制備，包括用目標(biāo)多肽或其片度，或用編碼的多核苷酸對動物進行免疫產(chǎn)生的抗體。此外，天然或合成的文庫和化合物容易通過常規(guī)的化學(xué)、物理和生物手段進行修飾，且可用于制備組合文庫。進一步，已知的藥理物質(zhì)可以經(jīng)過定向的或隨機的化學(xué)修飾，例如酰化、烷基化、酯化和脒化(amidification)等以制備結(jié)構(gòu)類似物。
在一個實施方式中，評價是否藥物正在調(diào)節(jié)LDL受體基因家族成員活性的方法可使用動物模型實現(xiàn)。
藥物組合物 另一個方面是包含調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員活性的藥物(例如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑)以及藥學(xué)上可接受的稀釋劑、賦形劑或載體的藥物組合物。
另一個方面是包含巨蛋白調(diào)節(jié)劑和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、賦形劑或載體的藥物組合物。
術(shù)語“藥物組合物”指的是調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員活性的藥物(例如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑)與例如載體、穩(wěn)定劑、稀釋劑、分散劑、懸浮劑、增稠劑和/或賦形劑的其它化學(xué)組分的混合物。所述藥物組合物有助于將化合物施用于有機體。給與化合物的多種技術(shù)存在于現(xiàn)有技術(shù)中，包括，但不限于靜脈內(nèi)、口腔、氣溶膠、腸胃外、眼睛、肺和局部給藥。
術(shù)語“載體”指的是促進化合物合并進入細(xì)胞或組織的相對無毒的化合物或試劑。
術(shù)語“稀釋劑”指的是用于在遞送前稀釋目的化合物的化合物。由于它們能提供更加穩(wěn)定的環(huán)境，因而稀釋劑可用于穩(wěn)定化合物。在本領(lǐng)域中，溶解在緩沖溶液(其也可以提供pH控制或維持)中的鹽用作稀釋劑，包括，但不限于磷酸鹽緩沖鹽水。
術(shù)語“生理學(xué)上可接受的”指的是不會消除化合物的生物活性或性能的且是無毒的物質(zhì)，例如載體或稀釋劑。
術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”指的是不會對所施用的有機體引起明顯刺激且不會消除化合物的生物活性和性能的化合物形式。藥學(xué)上可接受的鹽可以通過將調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的藥物(例如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑)與例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸等的酸反應(yīng)得到。藥學(xué)上可接受的鹽也可以通過將調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的藥物(例如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑)與堿反應(yīng)得到，從而形成例如銨鹽、如鈉鹽或鉀鹽的堿金屬鹽、如鈣鹽或鎂鹽的堿土金屬鹽的鹽，與例如二環(huán)己胺、N-甲基-D-葡萄糖胺、三(羥甲基)甲胺的有機堿的鹽，以及與例如精氨酸、賴氨酸等的氨基酸的鹽，或通過領(lǐng)域已知的其它方法得到。
此處披露的化合物的“代謝物”是在該化合物代謝時形成的該化合物的衍生物。術(shù)語“活性代謝物”指的是當(dāng)化合物代謝時形成的化合物的生物活性衍生物。術(shù)語“代謝”指的是特定物質(zhì)被有機體改變的過程的總和(包括，但不限于水解反應(yīng)和酶催化的反應(yīng))。因此，酶可以對化合物產(chǎn)生特定的結(jié)構(gòu)改變。例如，細(xì)胞色素P450催化多種氧化和還原反應(yīng)，而二磷酸尿苷葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶催化活化的葡糖醛酸分子轉(zhuǎn)移到芳香醇、脂肪醇、羧酸、胺和游離巰基上。關(guān)于代謝的進一步信息可以從The Pharmacological Basis of Therapeutics，9th Edition，McGraw-Hill(1996)中獲得。
此處披露的化合物的代謝物可以通過將化合物施用于宿主并分析宿主的組織樣品，或通過在體外用肝細(xì)胞溫育化合物并分析得到的化合物進行鑒定。這兩種方法在本領(lǐng)域已公知。
“前藥”指的是在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成母體藥物的物質(zhì)。前藥經(jīng)常是有用的，因為在某些情況下它們可以比母體藥物更加容易施用。例如，它們可以通過口服施用而為可生物利用的，而母體藥物卻不是。在藥物組合物中，所述前藥可以比母體藥物相比具有更高的溶解性。前藥的實例(非限制性的)是調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的藥物(例如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑)，其以酯(“前藥”)施用以利于跨過其中水溶性對移動性有害的細(xì)胞膜，但一旦進入其中水溶性有益的細(xì)胞內(nèi)部，然后前藥水解代謝為羧酸(活性體)。前藥的進一步實例可以是結(jié)合酸基的短肽(聚氨基酸)，其中肽被代謝以展示活性結(jié)構(gòu)。
此處描述的調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員活性的藥物可以本身施用于病人，或以其中它們與其他活性成分(如在聯(lián)合治療中)或適合載體或賦形劑混合的藥物組合物的形式給與。本申請的化合物的制劑和施用的技術(shù)可以在“RemingtonThe Scienceand Practice of Pharmacy，”第20版(2000)中找到。
給藥途徑 合適的給藥途徑可以包括，例如口服、經(jīng)直腸、經(jīng)黏膜、經(jīng)皮、肺、眼、或腸給藥；腸胃外給藥包括肌肉內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、髓內(nèi)注射，以及鞘內(nèi)、直接心室內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或眼內(nèi)注射。
可選擇地，可以局部地而非以全身的方式施用所述化合物，例如通常以長效或緩釋制劑通過將化合物直接注射到器官中。此外，也可采用靶向給藥系統(tǒng)施用藥品，例如用器官特異性抗體包被的脂質(zhì)體。脂質(zhì)體將定向到該器官并被器官選擇性地吸收。此外，藥物還可以以速釋劑型的形式、控釋劑型(extended release formulation)的形式或中等釋放劑型(intermediate release formulation)的形式提供。
組合物/制劑 包含可調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的藥物(例如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑)的組合物可采用本身已知的方式制備，例如通過常規(guī)的混和、溶解、制粒、制糖衣、磨粉、乳化、裝膠囊、嵌入或壓縮過程制備。
藥物組合物可以使用一種或多種生理學(xué)上可接受的載體以常規(guī)方式配制，該載體包括可促進活性化合物加工成制劑的賦形劑和輔劑。合適的劑型取決于選擇的給藥途徑?？梢允褂煤线m的和上面本領(lǐng)域所理解的(例如Remington’s Pharmaceutical Sciences中的)任何公知的技術(shù)、載體和賦形劑。
調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的藥物(例如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑)可以采用包括眼睛局部給藥的所有方式的各種方式施用。此外，調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的藥物(例如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑)可全身(例如口服或靜脈)給藥。調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的藥物(例如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑)可局部地施用于眼睛，且可制備成各種可局部給藥的眼藥組合物，例如溶液、混懸液、凝膠或藥膏。因此，“眼睛給藥”包括，但不局限于眼內(nèi)注射、視網(wǎng)膜下注射、玻璃體內(nèi)注射、眼周給藥、結(jié)膜下注射、眼球后注射、前房內(nèi)注射(包括進入前眼房或玻璃體房)、sub-Tenon’s注射或埋植、眼用溶液、眼用混懸液、眼用軟膏、眼埋植劑和眼用嵌入劑、眼內(nèi)溶液、離子電滲的應(yīng)用、外科灌洗液的引入和棉塞(僅舉例來說，插入穹隆的飽和棉拭子)。
眼睛給予組合物通常導(dǎo)致藥物與角膜直接接觸，由此至少有一部分給與的藥物通過角膜。通常，所述組合物在眼部的有效停留時間為約2～約24小時，更典型的約4～約24小時，且最典型的約6～約24小時。
含有調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的組合物(例如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑)可直觀地采用液體形式，其中藥物存在于溶液、混懸液或兩者中。典型地，當(dāng)組合物以溶液或混懸液給藥時，第一部分的藥物存在于溶液中且第二部分的藥物以顆粒的形式存在于液體基質(zhì)的混懸液中。在一些實施方式中，液體組合物可以包括凝膠制劑。在其它的實施方式中，液體組合物是水性的?？蛇x擇地，組合物可采用軟膏劑的形式。
有用的組合物可以是水溶液、混懸液或溶液/混懸液，其可以滴眼劑的形式存在。期望的劑量可以通過滴入眼睛的已知數(shù)目的液滴給與。例如，對于25μl的滴體積，施用1～6滴將遞送25～150μl的組合物。水性組合物典型地包含約0.01％～約50％，更典型地約0.1％～約20％，仍更典型地約0.2％～約10％，最典型地約0.5％～約5％重量/體積的調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員活性的藥物，例如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑。
典型地，水性組合物具有眼睛可以接受的pH值和滲透壓?！把劬山邮艿摹睂τ谥苿⒔M合物或組分而言通常意味著對治療的眼睛或其功能，或者對治療的受試者的總體健康沒有持久的不利影響。例如微小的刺激或“針刺”感的一些短暫的影響在眼部局部給藥是常見，且與所討論的“眼部可接受的”制劑、組合物或組分相容的。
可用的水性混懸液也可以包含一種或多種聚合物作為懸浮劑。可用的聚合物包括如纖維質(zhì)聚合物(例如羥丙基甲基纖維素)的水溶性聚合物，和如交聯(lián)的含羧基聚合物的水不溶性聚合物?？捎玫慕M合物也可以包含眼部可接受的粘膜粘性聚合物，選自例如羧甲基纖維素、卡波姆(丙烯酸聚合物)、聚(甲基甲基丙烯酸酯)、聚丙烯酰胺、聚卡波非、丙烯酸/丙烯酸丁酯共聚物、海藻酸鈉和葡聚糖。
可用的組合物也可包含眼部可接受的增溶劑，以幫助調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的藥物(如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑)的溶解。術(shù)語“增溶劑”通常包括可導(dǎo)致藥物的膠束溶液或真溶液形成的試劑。特定的眼部可接受非離子表面活性劑，例如聚山梨醇酯80可用作增溶劑，以及眼部可接受的乙二醇、聚乙二醇(如聚乙二醇400)和乙二醇醚。
可用的組合物也可包含一種或多種眼部可接受的pH調(diào)節(jié)劑或緩沖劑，包括如乙酸、硼酸、檸檬酸、乳酸、磷酸和鹽酸的酸；如氫氧化鈉、磷酸鈉、硼酸鈉、檸檬酸鈉、乙酸鈉、乳酸鈉和三羥甲基氨基甲烷的堿；以及如檸檬酸/葡萄糖、碳酸氫鹽和氯化銨的緩沖物質(zhì)。這些酸、堿和緩沖物質(zhì)以維持組合物的pH在眼部可接受的范圍之內(nèi)所需的量包含在組合物中。
可用的組合物也可以包含使所述組合物的滲透壓到眼睛可以接受的范圍內(nèi)所需的量的一種或多種眼睛可以接受的鹽。這些鹽包括具有鈉、鉀或銨陽離子和氯、檸檬酸、抗壞血酸、硼酸、磷酸、碳酸氫根、硫酸、硫代硫酸或亞硫酸陰離子的鹽；適合的鹽包括氯化鈉、氯化鉀、硫代硫酸鈉、亞硫酸氫鈉和硫酸銨。
其他可用的組合物也可以包括一種或多種眼睛可以接受的防腐劑以抑制微生物活性。適合的防腐劑包括例如硝酸苯汞(merfen)和硫柳汞的含汞的物質(zhì)、穩(wěn)定的二氧化氯和季胺類化合物，例如苯扎氯銨、溴化十六烷基三甲基銨和氯化十六烷基吡啶。
其他可用的組合物可以包括一種或多種眼睛可以接受的表面活性劑以提高物理穩(wěn)定性或用于其他目的。適合的非離子型表面活性劑包括聚氧乙烯脂肪酸甘油酯和植物油(例如聚氧乙烯(60)氫化蓖麻油)；以及聚氧乙烯烷基醚和烷基苯基醚(例如辛苯聚醇10、辛苯聚醇40)。
如果需要，其他可用的組合物可以包括一種或多種抗氧化劑以提高化學(xué)穩(wěn)定性。適合的抗氧化劑包括(僅舉例來說)抗壞血酸和焦亞硫酸鈉。
水性混懸液組合物可以包裝在單劑量非可重封閉的容器中。可選擇地，可以使用多劑量可重封閉的容器，在此情況下，在組合物中通常包括防腐劑。
所述眼藥組合物也可以采用固體物的形式，其能夠插入到眼睛和眼皮之間或結(jié)膜囊內(nèi)，其在此處釋放藥物。釋放是向沖洗角膜表面的淚液或直接向角膜本身，固體物一般密切接觸角膜。適合以此模式植入眼內(nèi)的固體物通常主要由聚合物組成且可以是可生物降解的或非生物降解的。
對于靜脈注射，所述調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的藥物(例如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑)可以配制成水溶液，優(yōu)選在生理相容的緩沖液中，例如Hank′s溶液、林格溶液或生理鹽水緩沖液。對于經(jīng)黏膜給藥，在制劑中使用對需穿過的屏障適合的滲透劑。這些滲透劑一般在本領(lǐng)域是已知的。對于其他腸胃外注射劑，適合的制劑可以包括水性或非水性溶液，優(yōu)選使用生理學(xué)相容的緩沖液或賦形劑。這些賦形劑一般在本領(lǐng)域是已知的。
對于口服給藥，所述調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的藥物(例如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑)可以通過組合活性化合物和本領(lǐng)域公知的藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑容易地配制。這些載體能夠使此處描述的藥物配制成片劑、散劑、丸劑、錠劑、膠囊劑、液劑、凝膠劑、糖漿劑、酏劑、膏劑、混懸劑等以用于治療的患者口服消化。口服使用的藥物制劑可以通過將一種或多種固體賦形劑與此處描述的一種或多種藥物混合，任選地研磨得到的混合物，并將混合物加工成顆粒(如果需要的話在加入適合的輔助劑之后)，從而得到片劑或錠劑片心。適合的賦形劑尤其是填充劑，例如糖(包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇)；纖維素制劑，例如舉例來說，玉米淀粉、小麥淀粉、大米淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、西黃蓍膠、甲基纖維素、維晶纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉；或其他，例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP或聚維酮)或磷酸鈣。如果需要，可以加入崩解劑，例如交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或海藻酸或其鹽，例如海藻酸鈉。
錠劑片心具有適合的包衣。為此目的，可以使用濃縮的糖溶液，其可以任選地包含阿拉伯膠、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝膠、聚乙二醇和/或二氧化鈦、漆溶液，以及適合的有機溶劑或溶劑混合物?？梢韵蚱瑒┗蝈V劑包衣加入染料或顏料以進行識別或者表示不同的活性化合物劑量的組合。
可以口服使用的藥物制劑包括明膠制成的壓合(push-fit)的膠囊，以及明膠和例如甘油或山梨糖醇的增塑劑制成的軟的、密封的膠囊。所述壓合的膠囊可以在與填充劑(如乳糖)、粘合劑(如淀粉)和/或潤滑劑(如滑石或硬脂酸鎂)及任選的穩(wěn)定劑的混合物中包含活性成分。在軟膠囊中，所述活性化合物可以溶解或懸浮在例如脂肪油、液狀石蠟或液體聚乙二醇的適合的液體中。此外，可以加入穩(wěn)定劑?？诜o藥的所有制劑應(yīng)當(dāng)為適合該給藥方式的劑量。
對于含服或舌下給藥，所述組合物可以采用以常規(guī)方式配制的片劑、糖錠或凝膠劑的形式。
給與調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的藥物(例如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑)的另一種可用的劑型采用透皮給藥裝置(“貼劑”)。這種透皮貼劑可用于以可控的量提供本發(fā)明化合物的連續(xù)或非連續(xù)的灌注。用于遞送藥物的透皮貼劑的構(gòu)成和使用在本領(lǐng)域是公知的。參見，例如美國專利5,023,252。這些貼劑可以構(gòu)成為用于連續(xù)、脈沖或根據(jù)需要遞送藥物。再進一步地，藥物的透皮遞送可以通過離子電滲貼劑等實現(xiàn)。透皮貼劑可以提供化合物的受控的輸送。吸收速率可以通過使用速率控制膜或通過將化合物嵌入聚合物基質(zhì)或凝膠中放緩。相反地，吸收促進劑可用于增加吸收。適合于經(jīng)皮給藥的劑型可以表現(xiàn)為不連續(xù)的貼片且可以是親脂的乳劑或溶解和/或分散在聚合物或粘合劑中的緩沖的水性溶液。透皮貼劑可以置于患者身體的不同部位上，包括眼睛上。
可用于眼睛給與調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員活性的藥物(例如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑)的另外的離子電滲裝置為由Optis France S.A.創(chuàng)造并擁有專利權(quán)的Eyegate涂藥器，以及Iomed，Inc開發(fā)的OcuphorTM Ocular離子電滲系統(tǒng)。
對于通過吸入給藥，所述調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員活性的藥物(例如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑)方便地以加壓包裝形成的氣霧劑或者噴霧器的形式使用例如二氯二氟甲烷、三氯氟代甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他適合氣體遞送。就加壓氣溶膠而言，劑量單位可以通過提供定量遞送的確定。為了在吸入劑和吸入器中使用，例如明膠的囊和筒可以配制成包含化合物和例如乳糖或淀粉的適合的基粉的粉末混合物。
所述化合物可以配制成用于通過注射(例如單次快速注射或連續(xù)灌注)的腸胃外給藥。注射的制劑可以以加入防腐劑的單位劑型(例如安瓿或多劑量容器)存在。所述組合物可以采用如在油性或水性的介質(zhì)中的混懸液、溶液或乳液的形式，且可以包含例如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑的配方劑。
腸胃外給藥的藥物劑型包括水溶性形式的活性化合物水溶液。此外，活性化合物的混懸液也可制備成適合的油性注射混懸液。適合的親脂性溶劑或介質(zhì)包括例如芝麻油的脂肪油，或例如油酸乙酯或甘油三酯的合成脂肪酸酯，或脂質(zhì)體。水性注射混懸液可以包含增加混懸液粘度的物質(zhì)，例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或葡聚糖。任選地，所述混懸液也可以包含適合的穩(wěn)定劑或增加化合物的溶解度的物質(zhì)以使其制備成高濃度溶液。
可選擇地，所述活性成分可以是使用之前用適合的介質(zhì)(如滅菌無熱原水)配制的粉末形式。
所述化合物也可以配制成的直腸組合物，如直腸凝膠劑、直腸泡沫劑、直腸氣霧劑、栓劑或例如包含常規(guī)的栓劑基質(zhì)(如可可豆脂或其他甘油酯)的保留灌腸劑。所述組合物也可以配制成陰道或尿道組合物，包括陰道或尿道栓(探條)、藥用衛(wèi)生栓和陰道片劑。
除了之前描述的劑型，所述化合物也可以配制成長效制劑。這些長效制劑可以通過植入(例如皮下或肌內(nèi))或通過肌內(nèi)注射給與。因此，例如所述化合物可以用適合的聚合或疏水材料(例如可接受的油中的乳液)或離子交換樹脂配制，或作為微溶衍生物，例如微溶鹽。
可注射的長效形式可以通過在生物可降解聚合物中形成調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員活性的藥物(例如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑)的微囊化基質(zhì)(也稱為微囊基質(zhì))而制備。根據(jù)藥物與聚合物的比率以及使用的特定聚合物的性能，可以控制藥物釋放的速率。長效的可注射制劑也可以通過將藥物包封到脂質(zhì)體或微乳液中制備。僅舉例來說，后部近鞏膜長效制劑(posteriorjuxtascleral depot)可以用作調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的藥物(例如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑)的給藥模式。鞏膜是薄的無血管層，由圍繞大部分脊椎動物眼睛的高度有序的膠原網(wǎng)絡(luò)組成。由于鞏膜是無血管的，因此它能用作天然的儲藏所，從這里注射的物質(zhì)不能快速的從眼睛移開或清除。用于將化合物施用到眼睛的鞏膜層中的劑型可以是通過適合注射進入鞏膜層的具有小直徑的插管注射應(yīng)用到鞏膜中的任何形式。可注射應(yīng)用的形式的實例為溶液、混懸液或膠體懸浮液。
可選擇地，可以使用用于疏水藥物化合物的其他遞送系統(tǒng)。脂質(zhì)體和乳劑是疏水藥物遞送介質(zhì)或載體的公知實例。也可以使用例如N-甲基吡咯烷酮的特定有機溶劑，雖然通常以更大的毒性為代價。此外，所述化合物可以使用緩釋系統(tǒng)遞送，例如包含治療藥物的固體疏水聚合物的半透性基質(zhì)。各種不同的緩釋物質(zhì)已被確定且為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。根據(jù)它們的化學(xué)特性，緩釋膠囊可以釋放化合物幾個星期到100天以上。根據(jù)治療劑的化學(xué)特性和生物穩(wěn)定性，可以使用用于蛋白穩(wěn)定的其它策略。
抗氧化劑、金屬螯合劑、包含硫醇的化合物和其他一般穩(wěn)定劑可能對此處描述的所有劑型是有利的。該穩(wěn)定劑的實例包括，但不限于(a)約0.5％～約2％w/v甘油，(b)約0.1％～約1％w/v甲硫氨酸，(c)約0.1％～約2％w/v硫代甘油，(d)約1mM～約10mM EDTA，(e)約0.01％～約2％w/v抗壞血酸，(f)0.003％～約0.02％w/v聚山梨酯80，(g)0.001％～約0.05％w/v聚山梨酯20，(h)精氨酸，(i)肝素，(j)硫酸葡聚糖，(k)環(huán)糊精，(l)戊聚糖多聚硫和其他類肝素，(m)例如鎂和鋅的二價陽離子；或(n)上述的組合。
許多藥物可以提供作為具有藥學(xué)上相容的反離子的鹽。藥學(xué)上相容的鹽可以與許多酸形成，包括，但不限于鹽酸、硫酸、醋酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸等。鹽比其相應(yīng)的游離酸或堿的形式在水或其他質(zhì)子性溶劑溶解更好。
檢測熒光化合物的診斷方法 為了啟動快速的治療介入，視網(wǎng)膜疾病(例如，舉例來說，黃斑變性和/或黃斑營養(yǎng)不良)的早期診斷是重要的。檢測和/或測量眼組織中存在的熒光化合物的方法在美國專利公開2006/0099714中提供，其以參閱的方式引入。此處提供的是檢測眼組織中毒性熒光化合物(例如，舉例來說，氧化的磷脂和氧化的脂肪酸)的技術(shù)和方法。
磷脂和脂肪酸在視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中大量發(fā)現(xiàn)，且對于RPE和視網(wǎng)膜細(xì)胞的正常功能是必要的。視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中毒性化合物的存在和蓄積是例如，舉例來說，黃斑變性和/或黃斑營養(yǎng)不良的眼病的基礎(chǔ)。為了啟動迅速的治療介入，眼組織中這些毒性化合物的早期檢測是重要的。RPE和/或視網(wǎng)膜細(xì)胞中氧化的磷脂和脂肪酸的存在與眼病相關(guān)。視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中，磷脂和脂肪酸可能發(fā)生光誘導(dǎo)的和/或化學(xué)誘導(dǎo)的氧化。被氧化的磷脂和被氧化的脂肪酸為熒光化合物，其能夠通過熒光光譜法檢測。檢測眼組織中熒光化合物的方法出現(xiàn)在美國專利公開2006/0099714中，其以參閱的方式引入。
被氧化的磷脂和被氧化的脂肪酸具有與其他的視網(wǎng)膜毒性化合物(例如，舉例來說，N-亞視黃基-磷脂酰乙醇胺、二氫-N-亞視黃基-N-視黃基-磷脂酰乙醇胺、N-亞視黃基-N-視黃基-磷脂酰乙醇胺、二氫-N-亞視黃基-N-視黃基-乙醇胺和N-亞視黃基-磷脂酰乙醇胺)不同的熒光發(fā)射譜。
在一個實施方式中，此處提供的是用于早期診斷例如，舉例來說，黃斑變性和/或黃斑營養(yǎng)不良的視網(wǎng)膜疾病的方法，其包括測量眼組織中被氧化的磷脂(包括被氧化的磷脂酰絲氨酸)和被氧化的脂肪酸(包括二十二碳六烯酸)的存在和/或量。
在一個實施方式中，此處提供的是測定樣品中被氧化的磷脂和/或脂肪酸存在的方法。在某些實施方式中，樣品中被氧化的磷脂和/或脂肪酸的存在通過用具有300～400nm之間的波長的光照射樣品，并測量樣品400～500nm之間熒光發(fā)射而測定。
磷脂和脂肪酸被RPE細(xì)胞緩慢地攝取。但是，被氧化的磷脂和被氧化的脂肪酸以約10倍于未氧化的磷脂和脂肪酸的速率攝取。被氧化的磷脂和被氧化的脂肪酸通過受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)胞吞作用被RPE細(xì)胞吸收。在一個實施方式中，被氧化的磷脂和被氧化的脂肪酸通過LDL受體基因家族成員被RPE細(xì)胞吸收。
治療方法，劑量以及聯(lián)合治療 術(shù)語“哺乳動物”意思是包括人的所有哺乳動物。哺乳動物包括(僅舉例來說)人、非人類的靈長類、牛、狗、貓、山羊、綿羊、豬、大鼠、小鼠和兔。
此處使用的術(shù)語“有效量”指的是在給與的化合物的量將在某種程度上緩解所治療的疾病、狀態(tài)或病癥的一種或多種癥狀。
為了預(yù)防和/或治療處理可以給與包含此處描述的化合物的組合物。術(shù)語“治療”用于指預(yù)防和/或治療處理。在治療應(yīng)用中，所述組合物以足夠治愈或至少部分地阻止疾病、病癥或狀態(tài)的癥狀的量給與已經(jīng)患有疾病、狀態(tài)或病癥的患者。這一用途有效的量將取決于疾病、病癥或狀態(tài)的嚴(yán)重程度和病程、先前的治療、患者的健康狀況和對藥物的反應(yīng)，以及治療醫(yī)生的判斷。通過例行試驗(例如，劑量梯度臨床試驗)來確定該治療有效量在本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)被認(rèn)為是公知的。
在預(yù)防應(yīng)用中，將包含此處描述的調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的藥物(例如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑)的組合物給與對特定疾病、病癥或狀態(tài)敏感的或在其他方面具有這些風(fēng)險的患者。這一量定義為“預(yù)防有效量或劑量”。在此應(yīng)用中，準(zhǔn)確量也取決于患者的健康狀況、體重等。通過例行試驗(例如，劑量梯度臨床試驗)來確定該預(yù)防有效量在本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)被認(rèn)為是公知的。
術(shù)語“提高”或“增強”意思是增加或延長期望效應(yīng)的效力或持續(xù)時間。因此，關(guān)于提高治療藥物的效應(yīng)，術(shù)語“增強”指的是在效力或持續(xù)時間上增加或延長其他治療藥物對系統(tǒng)的效應(yīng)的能力。此處使用的“增強有效量”指的是足以提高另一治療藥物在期望的系統(tǒng)中的效應(yīng)的量。當(dāng)給患者使用時，對于此用途的有效量將取決于疾病、病癥或狀態(tài)的嚴(yán)重程度和病程、先前的治療、患者的健康狀況和對藥物的反應(yīng)，以及治療醫(yī)生的判斷。
在患者的狀態(tài)沒有改善的情況下，為了改善或在其他方面控制或限制患者疾病或狀態(tài)的癥狀，可以根據(jù)醫(yī)生的決定長期給與所述化合物，也就是說，使用更長的時間周期，包括在患者的整個生命持續(xù)時間內(nèi)。
在患者的狀況確實改善的情況下，根據(jù)醫(yī)生的決定，可以繼續(xù)給與化合物或暫時中止給與化合物一段時間(即，“休藥期”)。
一旦患者的狀況發(fā)生改善，如果需要的話，給與維持劑量的藥物。隨后，給藥的劑量或頻率，或者兩者，可以隨著癥狀的變化減少維持疾病、病癥或狀況的改善的水平。然而，在出現(xiàn)任何癥狀的復(fù)發(fā)時，患者可能需要長期的間歇治療。
給與的藥物的量根據(jù)例如特定化合物、疾病狀態(tài)和它的嚴(yán)重程度、需要治療的患者或宿主的身份(例如，重量)的因素而變化，但是仍然可以根據(jù)該病例的特定環(huán)境(包括，例如給與的具體藥物、給藥途徑、治療的狀態(tài)以及治療的患者或宿主)，以本領(lǐng)域已知的方式例行的確定。但是，一般而言，成人治療使用的劑量典型地在0.02-5000mg/天的范圍內(nèi)，優(yōu)選1-1500mg/天。期望的劑量可以方便地以單次劑量給與或同時(或在短時間內(nèi))或以適合的時間間隔給與的分開的劑量給與，例如每天兩個、三個、四個或更多個分劑量。
在特定情況下，可以適當(dāng)與另一治療藥物組合給與此處描述的至少一種調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的藥物(例如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑)(或藥學(xué)上可接受的鹽、酯、酰胺、前藥或溶劑合物)。僅舉例來說，如果患者接受此處所述的一種化合物時出現(xiàn)的一種副作用是炎癥，那么，可以與最初的治療藥物適當(dāng)?shù)芈?lián)用抗炎藥?；蛘?，僅舉例來說，此處描述的一種調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的藥物(例如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑)的治療效果可以通過給與輔劑(即，輔劑本身可能僅具有最小的治療效果，但是聯(lián)合另一治療藥物，對于患者的整體治療效果得到提高)而提高。或者，僅舉例來說，通過給與此處描述的一種調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的藥物(例如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑)與另一種也具有治療益處的治療藥物(其也包括治療方案)，可以增加患者得到的益處。僅舉例來說，在涉及給與此處描述的一種調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的藥物(例如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑)的黃斑變性的治療中，可以通過也向患者提供其他治療藥物或其它黃斑變性療法而提高治療效果。無論如何，與治療的疾病、病癥或狀態(tài)無關(guān)，患者得到的整體益處可以是兩種治療藥物的簡單累加或者患者可以得到協(xié)同的益處。
可能的聯(lián)合治療的具體的、非限制性的實例包括使用至少一種調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的藥物(例如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑)和一氧化氮(NO)誘導(dǎo)劑、他汀類(statins)藥物、帶負(fù)電荷的磷脂、抗氧化劑、無機物、抗炎藥、抗血管生成藥、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑、類葫蘿卜素、13-順式-視黃酸或具有通式(A)結(jié)構(gòu)的化合物
通式(A) 其中， X1選自由NR2、O、S和CHR2組成的組中； R1為(CHR2)x-L1-R3，其中， x為0、1、2或3，L1為單鍵或-C(O)-； R2為選自H、(C1-C4)烷基、F、(C1-C4)氟代烷基、(C1-C4)烷氧基、-C(O)OH、-C(O)-NH2、-(C1-C4)烷基胺、-C(O)-(C1-C4)烷基、-C(O)-(C1-C4)氟代烷基、-C(O)-(C1-C4)烷基胺和-C(O)-(C1-C4)烷氧基的結(jié)構(gòu)，和 R3為H或任選地被1-3個獨立選擇的取代基取代的選自(C2-C7)鏈烯基、(C2-C7)炔基、芳基、(C3-C7)環(huán)烷基、(C5-C7)環(huán)鏈烯基和雜環(huán)的結(jié)構(gòu)。
在幾種情況下，適合的組合藥物可能落入多個范疇(僅舉例來說，葉黃素是抗氧化劑和類胡蘿卜素)。進一步地，所述調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的藥物(例如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑)也可以與包括給病人提供益處的其他藥物(僅舉例來說，環(huán)孢菌素A)一起給與。
此外，所述調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的藥物(例如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑)也可以與為患者提供額外或協(xié)同的益處的過程一起使用，包括(僅舉例來說)使用體外血液分離(也稱為膜差別過濾)、使用可植入的微型望遠鏡，玻璃疣激光凝固術(shù)和微刺激治療。
已證實使用抗氧劑對黃斑變性和營養(yǎng)不良的患者有益，參見例如Arch.Ophthalmol.，1191417-36(2001)、Sparrow等，J.Bio l.Chem.，27818207-13(2003)?？梢耘c調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中的LDL受體基因家族成員的藥物(例如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑)聯(lián)合使用的適合的抗氧劑的實例包括維生素C、維生素E、β-胡蘿卜素及其他的類胡蘿卜素、輔酶Q、4-羥基-2，2，6，6-四甲基哌啶-N-烴氧基(也稱為Tempol)、葉黃素、丁基化羥基甲苯、白藜蘆醇、水溶性維生素E(trolox)類似物(PNU-83836-E)和越桔提取物。
也已證實使用特定無機物質(zhì)對黃斑變性和營養(yǎng)不良的患者有益，參見Arch.Ophthalmol.，1191417-36(2001)?？梢耘c至少一種調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞的LDL受體基因家族成員的藥物(例如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑)聯(lián)合使用的適合的無機物質(zhì)的實例包括含銅無機物，如氧化銅(僅為舉例)；含鋅無機物，如氧化鋅(僅為舉例)和含硒的化合物。
也已證實使用特定帶負(fù)電荷的磷脂對黃斑變性和營養(yǎng)不良的患者有益，見Shaban & Richter，Biol.Chem.，383537-45(2002)、Shaban等，Exp.Eye Res.，7599-108(2002)?？梢耘c至少一種調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的藥物(例如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑)聯(lián)合使用的適合的帶負(fù)電荷的磷脂的實例包括心磷脂，磷脂酰甘油。當(dāng)與巨蛋白調(diào)節(jié)劑聯(lián)合使用時，帶正電荷的和/或中性的磷脂也可能對黃斑變性和營養(yǎng)不良的患者有益。
特定類胡蘿卜素的使用與感光細(xì)胞中必要的光防護維持相關(guān)。類胡蘿卜素是天然存在的屬于萜類化合物組的黃到紅的色素的，其可以在植物、藻類、細(xì)菌以及例如鳥類和甲殼類的某些動物中找到。類胡蘿卜素為一大類分子，其中已鑒定了600多種天然存在的類胡蘿卜素。類胡蘿卜素包括碳?xì)浠衔?胡蘿卜素)及其氧化的、醇衍生物(胡蘿卜醇)。它們包括actinioerythrol、蝦青素、角黃素、辣椒紅素、辣椒玉紅素、β-8′-apo-胡蘿卜素醛(apo-胡蘿卜素醛)、β-12′-apo-胡蘿卜素醛、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、“胡蘿卜素”(α-和β-胡蘿卜素的混合物)、γ-胡蘿卜素、β-玉米黃質(zhì)(cyrptoxanthin)、葉黃素、番茄紅素、violerythrin、玉米黃素及其含羥基或羧基成員的酯類。許多天然產(chǎn)生的類胡蘿卜素以順式或反式異構(gòu)體形式存在，而合成的化合物經(jīng)常是外消旋混合物。
在人體內(nèi)，視網(wǎng)膜選擇性地聚積主要兩種類胡蘿卜素玉米黃素和葉黃素。這兩種類胡蘿卜素被認(rèn)為有助于保護視網(wǎng)膜，因為它們是強抗氧劑并且吸收藍光。用鵪鶉進行的研究確認(rèn)，用缺乏類胡蘿卜素的飼料喂養(yǎng)的組顯示視網(wǎng)膜具有低濃度的玉米黃素并且遭受了嚴(yán)重的光損害，這可由非常大量的感光細(xì)胞的凋亡證明，而具有高玉米黃素濃度的組則損害很小。用于與至少一種調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的藥物(例如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑)聯(lián)合使用的適合的類胡蘿卜素的實例包括葉黃素和玉米黃素，以及上述的任何一種類胡蘿卜素。
適當(dāng)?shù)囊谎趸T導(dǎo)劑包括刺激內(nèi)源性NO或升高體內(nèi)內(nèi)源性內(nèi)皮衍生舒張因子(EDRF)水平的化合物，或者是一氧化氮合酶的底物。此類化合物包括，例如L-精氨酸、L-高精氨酸和N-羥基-L-精氨酸，包括其亞硝基化和亞硝酰化的類似物(例如亞硝基化L-精氨酸、亞硝?；疞-精氨酸、亞硝基化N-羥基-L-精氨酸、亞硝?；疦-羥基-L-精氨酸、亞硝基化L-高精氨酸和亞硝酰化L-高精氨酸)、L-精氨酸的前體和/或其生理上可接受的鹽，包括例如瓜氨酸、鳥氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸、含有至少一個此類氨基酸的多肽、精氨酸酶抑制劑(如N-羥基-L-精氨酸和2(S)-氨基-6-氧化硼己酸)和一氧化氮合酶底物、細(xì)胞因子、腺苷、緩激肽、鈣網(wǎng)織蛋白、比沙可啶和酚酞。EDRF是由內(nèi)皮分泌的血管舒張因子，已被鑒定為一氧化氮或其緊密相關(guān)的衍生物(Palmer等，Nature，327524-526(1987)；Ignarro等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，849265-9269(1987))。
他汀類藥物用作降血脂劑和/或適合的一氧化氮誘導(dǎo)劑。此外，已證實他汀的使用和黃斑變性的發(fā)生和發(fā)展延遲之間的關(guān)系。G.McGwin等，British Journal of Ophthalmology，871121-25(2003)。因此，當(dāng)與巨蛋白調(diào)節(jié)劑聯(lián)合給藥時，他汀類藥物可以對眼病(如黃斑變性和營養(yǎng)不良，及視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良)患者有益。合適的他汀類藥物包括(僅舉例)羅蘇伐他汀、匹伐他汀、斯伐他汀、普伐他汀、西立伐他汀、美伐他汀、velostatin、氟伐地汀、康百汀、洛伐他汀、達伐他汀、氟伐地汀(fluindostatin)、阿托伐他汀、阿托伐他汀鈣(其為阿托伐他汀的半鈣鹽)和二氫康百汀。
與調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的藥物(例如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑)聯(lián)合使用的合適的抗炎劑包括(僅舉例)阿司匹林和其他的水楊酸鹽、色甘酸、萘多羅米、茶堿、齊留通、扎魯司特、孟魯司特、普侖司特、吲哚美辛和脂氧合酶抑制劑；非甾體抗炎藥(NSAID)(如布洛芬和萘普生)；潑尼松、地塞米松、環(huán)氧合酶抑制劑(即，COX-1和/或COX-2抑制劑，如NaproxenTM或CelebrexTM)；他汀類(僅舉例來說，羅蘇伐他汀、匹伐他汀、斯伐他汀、普伐他汀、西立伐他汀、美伐他汀、velostatin、氟伐地汀、康百汀、洛伐他汀、達伐他汀、氟伐他汀(fluindostatin)、阿托伐他汀，阿托伐他汀鈣(其是阿伐他汀的半鈣鹽)和二氫康百汀)；以及分離的類固醇。
為了治療與黃斑或視網(wǎng)膜變性相關(guān)的眼的狀況或癥狀，適合的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)抑制劑也可以與調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的藥物(例如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑)聯(lián)合給予。已知MMPs水解細(xì)胞外基質(zhì)的大部分成分。這些蛋白酶在許多例如正常組織再生、胚胎形成、創(chuàng)傷愈合和血管生成的生物學(xué)過程中起重要作用。然而，在包括黃斑變性的許多疾病狀態(tài)中觀察到MMP的過度表達。許多MMPs已被鑒定，它們中的大部分為多域的鋅內(nèi)肽酶。已知有許多金屬蛋白酶抑制劑(參見例如Whittaker M.等對MMP抑制劑的綜述，Chemical Reviews 99(9)2735-2776(1999))。MMP抑制劑的代表性實例包括金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)(如TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3或TIMP-4)、α2-巨球蛋白、四環(huán)素類(如四環(huán)素、米諾環(huán)素和強力霉素)、異羥肟酸鹽(如BATIMASTAT、MARIMISTAT和TROCADE)、螯合劑(如EDTA、半胱氨酸、乙酰半胱氨酸、D-青霉胺和金鹽)、合成的MMP片段、琥珀酰巰嘌呤、膦酰胺鹽和羥氨酸。可以與調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的藥物(例如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑)聯(lián)合使用的MMP抑制劑的實例包括(僅舉例來說)任何上述的抑制劑。
使用抗血管生成或抗VEGF藥物已顯示對黃斑變性和營養(yǎng)不良的患者有益?？梢耘c至少一種調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的藥物(例如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑)聯(lián)合使用的適合的抗血管生成或抗VEGF藥物包括Rhufab V2(LucentisTM)、色氨酰-tRNA合成酶(TrpRS)、Eye001(抗VEGF聚乙二醇化適體)、角鯊胺，RetaaneTM 15mg(貯藏混懸液的乙酸阿奈可他，Alcon，Inc)、考布他汀A4前藥(CA4P)、MacugenTM、MifeprexTM(米非司酮-ru486)、subtenon丙炎松、玻璃體內(nèi)的晶狀丙炎松、普啉司他(AG3340-合成的基質(zhì)金屬酶抑制劑，輝瑞)、氟輕松(包括氟輕松眼內(nèi)植入片，Bausch&Lomb/Control Delivery Systems)、VEGFR抑制劑(Sugen)和VEGF-Trap(Regeneron/Aventis)。
已用于緩解視力損害的其他藥物治療可以與至少一種調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的藥物(例如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑)組合使用。此類治療包括，但不局限于藥物，例如使用非熱激光的VisudyneTM、PKC 412、Endovion(NeuroSearch A/S)、神經(jīng)營養(yǎng)因子(包括，僅舉例來說，膠質(zhì)細(xì)胞衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子和睫狀節(jié)神經(jīng)細(xì)胞營養(yǎng)因子)、地爾硫卓(diatazem)、多佐胺、Phototrop、9-順式-視黃醛、包括碘化磷酰硫膽堿或二乙氧膦酰硫膽堿或碳酸酐酶抑制劑的眼藥物治療(包括回聲治療)、AE-941(AEterna Laboratories，Inc)、Sirna-027(Sirna Therapeutics，Inc)、哌加他尼鈉(pegaptanib)(NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences)、神經(jīng)營養(yǎng)因子(包括，僅舉例來說，NT-4/5，Genentech)、Cand5(Acuity Pharmaceuticals)、蘭尼單抗(ranibizumab)(Genentech)、INS-37217(Inspire Pharmaceuticals)、整聯(lián)蛋白拮抗劑(包括那些來自Jerini AG和Abbott Laboratories的)、EG-3306(Ark Therapeutics Ltd)、BDM E(BioDiem Ltd)、沙利度胺(例如，由EntreMed，Inc使用的)、心營養(yǎng)素(cardiotrophin)-1(Genentech)、2-甲氧雌二醇(Allergan/Oculex)、DL-8234(Toray Industries)、NTC-200(Neurotech)、四硫鉬酸鹽(University of Michigan)、LYN-002(LynkeusBiotech)、微藻(microalgal)化合物(Aquasearch/Albany，MeraPharmaceuticals)、D-9120(Celltech Group plc)，ATX-S10(HamamatsuPhotonics)、TGF-β2(Genzyme/Celtrix)、酪氨酸激酶抑制劑(Allergan，SUGEN，輝瑞)、NX-278-L(NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences)、Opt-24(OPTIS France SA)、視網(wǎng)膜細(xì)胞神經(jīng)節(jié)神經(jīng)保護劑(CogentNeurosciences)、N-硝基吡唑衍生物(Texas A&M University System)、KP-102(Krenitsky Pharmaceuticals)和環(huán)孢素A。參見美國專利申請公開No.20040092435。
在任何情況下，多種治療藥物(其中一種是如這里描述的調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的藥物的一種，例如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑)可以任意順序或甚至同時給與。如果同時給與，多種治療藥物可以單一的、統(tǒng)一的形式或者以多種形式(僅舉例來說，或為單一的藥丸或兩個獨立的藥丸)提供。一種治療藥物可以以多種劑量給與，或兩種都以多劑量給與。如果不同時給藥，多劑量間的時間安排可以在零周以上到四周以下的時間內(nèi)變化。此外，組合的方法、組合物和制劑不局限于僅使用兩種藥物；我們可以預(yù)見使用多種治療的組合。僅舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑可與至少一種抗氧劑和至少一種帶負(fù)電荷的磷脂一起提供；或調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的藥物(例如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑)可與至少一種抗氧化劑和至少一種一氧化氮產(chǎn)生的誘導(dǎo)劑一起提供；或調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的藥物(例如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑)可與至少一種一氧化氮產(chǎn)生的誘導(dǎo)劑和至少一種帶負(fù)電荷的磷脂一起提供；等等。
此外，調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或RPE細(xì)胞中LDL受體基因家族成員的藥物(例如，舉例來說，巨蛋白調(diào)節(jié)劑)也可與能對患者提供附加的或協(xié)同的益處的過程組合使用。已知的、已建議的或被認(rèn)為能緩解視力損害的過程包括，但不局限于“局限性視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)位”、光動力學(xué)療法(包括，僅舉例來說，受體靶向的PDT，Bristol-Myers Squibb，Co；注射PDT的卟吩姆鈉；維替泊芬，QLT Inc；具PDT的羅培泊芬，MiraventMedical Technologies；具PDT的他拉泊芬鈉，Nippon Petroleum；莫特沙芬镥，Pharmacychcs，Inc、反義寡核苷酸(包括，僅舉例來說，Novagali Pharma SA和ISIS-13650，Isis Pharmaceuticals測試的產(chǎn)品)、激光凝固術(shù)、玻璃疣激光治療、黃斑裂孔手術(shù)、黃斑轉(zhuǎn)位手術(shù)、可植入的微型望遠鏡、Phi-Motion血管造影術(shù)(也稱為微激光治療和滋養(yǎng)血管治療(Feeder Vessel Treatment))、質(zhì)子束療法、微刺激療法、視網(wǎng)膜剝離和玻璃體手術(shù)、鞏膜扣帶術(shù)、黃斑下手術(shù)、經(jīng)瞳孔溫?zé)岑煼?、光系統(tǒng)I療法、使用RNA干擾(RNAi)、體外血液分離(也稱為膜差異濾過和Rheotherapy)、微芯片植入、干細(xì)胞療法、基因替代療法、核酶基因療法(包括缺氧反應(yīng)元件的基因療法，Oxford Biomedica；Lentipak，Genetix；PDEF基因療法，GenVec)、光感受器/視網(wǎng)膜細(xì)胞移植(包括可移植的視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞，Diacrin，Inc.；視網(wǎng)膜細(xì)胞移植，Cell Genesys，Inc.)和針灸。
可用于使個體受益的進一步的組合包括使用遺傳測試以確定是否該個體是已知與特定眼睛狀態(tài)有關(guān)的突變基因的攜帶者。僅舉例來說，人ABCA4基因缺陷被認(rèn)為與五個顯著不同的視網(wǎng)膜表型有關(guān)，包括Stargardt病、錐-桿營養(yǎng)不良、年齡相關(guān)性黃斑變性和視網(wǎng)膜色素變性。此外，常染色體顯性型Stargardt病是由ELOV4基因的突變引起的。見Karan等，Proc.Natl.Acad.Sci.(2005)。具有這些突變的任一種的患者可期望從這里所描述的方法中獲得治療和/或預(yù)防的益處。
說明性實施例 RPE培養(yǎng)-從死后的組織中收集人RPE細(xì)胞，并接種在含添加劑的無鈣最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基(EMEM；Sigma Chemical，St.Louis，MO)中直到駐留的細(xì)胞增殖、達到融合，并釋放到培養(yǎng)基中。收集未附著的細(xì)胞并接種在具有涂布小鼠層黏連蛋白(Collaborative Research，Bedford，MA)的聚碳酸酯濾器(Millipore，Bedford，MA，USA)的插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿(Millicell)箱中。培養(yǎng)皿箱保持在多孔板中，其使得頂端和基部介質(zhì)區(qū)室分開。
試劑-MEM培養(yǎng)基w/Earle′s鹽和谷酰胺來自Cellgro(Herndon，VA)。兔、抗大鼠巨蛋白由Dr.Michele Marino(University of Pisa，Italy)贈予。兔、抗人gp330從Fitzgerald Industries International，Inc(Concord，MA)獲得。兔免疫前IgG從Santa Cruz Technologies(Santa Cruz，CA)獲得，以及受體相關(guān)蛋白(RAP)從Oxford Biomedical Research(Oxford，MI)獲得。人視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)在E.coli中表達。蛋白通過離子交換和尺寸排阻色譜純化，接著在視黃醇(Sigma，St Louis，Mo.)的存在下變性并重折疊。牛間質(zhì)性視黃醇結(jié)合蛋白(IRBP)從冷凍的牛視網(wǎng)膜制得。簡而言之，將冷凍的視網(wǎng)膜置于等滲的緩沖液中并于4℃輕搖過夜。通過離心從勻漿中移走可溶蛋白，以及通過連續(xù)ConA瓊脂糖和離子交換色譜，從上清液純化IRBP。SDS-PAGE用于檢查RBP和IRBP。
免疫細(xì)胞化學(xué)-對于共聚焦顯微鏡，濾器上的RPE培養(yǎng)物用4％的多聚甲醛固定，用乙醇連續(xù)脫水并嵌埋在Epon中。在某些情況下，固定后細(xì)胞在-20℃用甲醇透化處理5分鐘。使用Leica激光掃描共焦顯微鏡(TCS-SP2，Leica，Exton，PA)分析切片。收集一系列1μm x-y(en face)切片。各個染色的RPE細(xì)胞培養(yǎng)物的x-y圖像代表整個光學(xué)截面(堆疊的所有圖像的總和)的三維投影。顯微圖用AdobePhotoshop 5.5構(gòu)成。Bar＝40μm。所用抗體如上所述。二抗包括羊抗小鼠和兔Alexa 488和Alexa 594(Molecular Probes，Eugene，OR)。
巨蛋白介導(dǎo)的人RPE細(xì)胞中視黃醇結(jié)合蛋白和間質(zhì)類維生素A蛋白的攝取—將巨蛋白特異性抗體(0.2μg/ml)或RAP(0.5μg/ml)加入到RPE細(xì)胞培養(yǎng)物的基部或頂端區(qū)室中，并將樣品在4℃培養(yǎng)2小時。將RBP-視黃醇(30μM)或IRBP-視黃醇(10μM)加入到適當(dāng)?shù)膮^(qū)室，重新在37℃下培養(yǎng)1小時。培養(yǎng)后，從兩個區(qū)室移出介質(zhì)并輕輕倒出。從濾器載體上移走RPE細(xì)胞并按下述方法進行操作。
組織制備和提取—將250微升含5mM EDTA的PBS(pH7.2)加入到頂端區(qū)室并用于將細(xì)胞攪拌離開濾器插入物。細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入到1.5ml的離心管中且所述細(xì)胞以14,000×g離心5分鐘。棄去上清液，用另外的100μl PBS洗滌細(xì)胞沉淀物。在第二次離心后，將RPE細(xì)胞沉淀物懸浮在50μl的ddH2O中。然后細(xì)胞膜用100μl MeOH和10μl 1MNH2OH處理。樣品在室溫下溫育5分鐘。將類維生素A提取到300μl二氯甲烷(CH2Cl2)中。混和并離心(14,000×g，1min)后，移出上層(有機相)并輕輕倒出。水(下層)相再用300μl等份的CH2Cl2重提取兩次。混和有機相并在氮氣流下?lián)]干溶劑。樣品殘留物用210μl己烷再懸浮用于HPLC分析。
HPLC—類維生素A提取物用Agilent 1100系列高效液相色譜儀(HPLC)進行分析。色譜儀配有光電二極管陣列檢測器，使用硅膠柱(Agilent Zorbax Rx-Sil 4.6mm×250mm，Agilent，Palo Alto，CA)，正己烷中的二氧雜環(huán)己烷梯度洗脫，流速2mL/min。
從全組織中制備富含巨蛋白的膜—采用蔗糖密度離心法從腎臟、視網(wǎng)膜和RPE-視杯(RPE加脈絡(luò)膜和鞏膜)樣品中分離膜組分。剝離后，組織樣品置于含0.25M蔗糖的緩沖液(pH7.5)中勻漿。勻漿以27,000×g離心20min。棄去上清液部分，所得沉淀(P1)在含0.5％CHAPS的緩沖液中勻漿。重復(fù)離心得到不溶性沉淀物(將其棄去)和CHAPS可溶性蛋白部分(CS)。CS部分作為所有免疫印跡試驗的蛋白源。這部分也用于脫糖基化(de-glysosylation)研究中(每μg蛋白用1單位內(nèi)切糖苷酶F處理)以檢測糖類的去除對電泳泳動度的影響。在一些試驗中，P1再懸浮于1％三硝基甲苯中以最佳地免疫沉淀巨蛋白免疫反應(yīng)蛋白。
肽測序—從SDS-PAGE凝膠切割出巨蛋白免疫反應(yīng)蛋白并置于硅化Eppendorf管中。凝膠樣品用200μl脫色液(Sigma)脫色。脫色后，將凝膠片干燥并加入5單位的PNGase F(Sigma)，接著于37℃溫育30分鐘。加入水以覆蓋凝膠片并于37℃重新溫育12-16小時。棄去培養(yǎng)液，凝膠片用水洗滌并于室溫下進行聲處理。取出凝膠片在真空中干燥。加入胰蛋白酶(04μg，Sigma)，樣品在37℃溫育30分鐘。溫育后，向凝膠樣品中加入50μl胰蛋白酶反應(yīng)緩沖液(Sigma)，在37℃重新溫育12-16小時。溫育后，將反應(yīng)液緩慢倒出，加入50μl肽提取液(Sigma)以洗脫肽。37℃溫育30分鐘并間歇的劇烈攪拌之后，將含肽溶液移出并和傾倒出的反應(yīng)液混合。通過真空揮發(fā)使樣品體積減少到約10μl。在下文描述的與電噴霧離子化質(zhì)譜儀(ESI-LC/MS)偶聯(lián)的毛細(xì)管液相色譜儀上通過質(zhì)譜方法分析以該方式制得的樣品。
ESI-LC/MS—使用Agilent 1100系列毛細(xì)管液相色譜儀進行色譜分離。采用Zorbax 300SB-C18柱(0.5×250mm)通過反相色譜法分離肽。含0.2％乙酸和0.005％七氟丁酸的乙腈梯度以5μl/min的速率泵送通過柱。柱溫保持在50℃。柱洗脫物被送入在線電噴霧離子化質(zhì)譜儀(LCQ Deca XP plus，Thermo，San Jose，CA)。ESI源設(shè)定為下述參數(shù)噴射電壓＝4.04kV，毛細(xì)管電壓＝42.34V，毛細(xì)管溫度＝275.20℃，管透鏡(tube lens)＝20V。氦裂解能量在25-30％之間變化以最佳地裂解肽片段。
免疫印跡分析—用于免疫印跡分析的蛋白樣品再懸浮于SDS加樣緩沖液中。這些樣品在3-8％Tris-醋酸鹽凝膠(Invitrogen，Carlsbad，CA)上進行電泳，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在溶解于Tris-緩沖鹽(TBST)的0.1％ Tween 20中，用5％乳液(milk)封閉膜，然后與適合的一抗于4℃溫育12-16小時。用于蛋白質(zhì)印跡的抗體包括兔抗大鼠巨蛋白多克隆抗體(5μg/ml)以及兔抗人RAP多克隆抗血清(1:500稀釋)。用TBST將膜洗滌4次后，將膜與辣根過氧化酶偶聯(lián)的山羊抗兔IgG(1:100,000稀釋)一起溫育。將膜洗滌4次，用ChemiGlow WestSubstrate(Alpha Innotech，San Leandro，CA)顯影，然后用發(fā)光成像儀(FluorChemfrom Alpha Innotech)顯像。
ABCA4敲除小鼠。ABCA4編碼rim蛋白(RmP)，其是視錐和視桿光感受器外節(jié)盤中的ATP-結(jié)合盒(ABC)運載體。運載的RmP底物尚不清楚。abca4基因的敲除突變產(chǎn)生的小鼠(見Weng等，Cell，9813-23(1999))用于RmP功能研究及用于體內(nèi)篩選候選物質(zhì)的效應(yīng)。這些動物顯示了復(fù)雜的眼睛表型(i)緩慢的光感受器退化，(ii)曝光后視錐敏感性恢復(fù)延遲，(iii)光漂白后光感受器外節(jié)中atRAL提高和atROL降低，(iv)外節(jié)中磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)構(gòu)性升高，和(v)RPE細(xì)胞中脂褐素蓄積。見Weng等，Cell，9813-23(1999)。
在處理和未處理的野生型和abca4-/-小鼠中，可以通過兩種技術(shù)監(jiān)測光感受器退化的速率。一種是在不同時間用ERG分析法研究小鼠，并已采用在臨床診斷過程中。見Weng等，Cell，9813-23(1999)。電極置于麻醉小鼠的角膜表面，記錄來自視網(wǎng)膜的對閃光的電響應(yīng)。光誘導(dǎo)的光感受器超極化產(chǎn)生的α-波的振幅是光感受器退化的靈敏指標(biāo)。見Kedzierski等，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，38498-509(1997)。ERG對活體動物的進行。因此在時程研究中，可對同一小鼠反復(fù)地進行分析。定量光感受器退化的決定性的技術(shù)是視網(wǎng)膜切片的組織學(xué)分析。各時間點保留在視網(wǎng)膜中的光感受器的數(shù)量可通過計數(shù)外核層中光感受器胞核的行數(shù)確定。
組織提取。眼睛樣品于1ml PBS(pH7.2)中在冰上解凍，并用Duall玻璃-玻璃勻漿器手動勻漿。加入1ml氯仿/甲醇(2:1，v/v)后進一步勻漿樣品。將樣品轉(zhuǎn)移到硅酸硼管中并將脂類提取到4ml氯仿中。有機提取物用3ml PBS(pH7.2)洗滌，然后樣品以3,000×g速度離心10分鐘。將氯仿相慢慢倒出，水相再用4ml氯仿萃取。離心后，將氯仿相合并，且將樣品取出在氮氣下干燥。樣品殘留物用100μl己烷再懸浮并通過下述的HPLC進行分析。
HPLC分析。采用配有熒光和二極管陣列檢測器的Agilent 1100系列液相色譜儀在Agilent Zorbax Rx-SiI柱(5μm，4.6 X 250mm)上完成層析分離。流動相(己烷/2-丙醇/乙醇/25mM KH2PO4，pH7.0/乙酸；485/376/100/50/0.275，v/v)以1ml/min輸送。通過對比保留時間和可靠標(biāo)準(zhǔn)的吸收光譜進行樣品峰的鑒定。數(shù)據(jù)表示為從熒光檢測器獲得的峰值熒光(L.U.)。
下面的實施例提供測試巨蛋白調(diào)節(jié)劑有效性和安全性的示例性的方法。這些實施例僅為示例性目的而提供，而不限制此處提供的權(quán)利要求的范圍。
實施例1巨蛋白調(diào)節(jié)劑對A2E聚積的影響 將巨蛋白調(diào)節(jié)劑給與試驗組小鼠，單獨DMSO給與對照組小鼠后，測定A2E的聚積。試驗組每天在10-25μl DMSO中給與2.5-20 mg/kg的巨蛋白調(diào)節(jié)劑。如果最高劑量50mg/kg未觀察到效果，則試驗更高的劑量。對照組注射給予10-25μl的單獨DMSO。采用腹腔(i.p.)注射給與小鼠測試或?qū)φ瘴镔|(zhì)，采用多種試驗期限但不超過1個月。
為測定abca4-/-小鼠RPE中的A2E聚積，每天通過i.p.注射給與2個月齡的abca4-/-小鼠2.5-20mg/kg的巨蛋白調(diào)節(jié)劑。1個月后，將試驗組和對照組小鼠處死，并用HPLC測定RPE中A2E的水平。此外，可以采用UV/可見分光光度計監(jiān)測N-亞視黃基-磷脂酰乙醇胺、二氫-N-亞視黃基-N-視黃基-磷脂酰乙醇胺、N-亞視黃基-N-視黃基-磷脂酰乙醇胺、二氫-N-亞視黃基-N-視黃基-乙醇胺和/或N-亞視黃基-磷脂酰乙醇胺的自發(fā)熒光和吸收光譜。
實施例2巨蛋白調(diào)節(jié)劑對脂褐素聚積的影響 將巨蛋白調(diào)節(jié)劑給與試驗組小鼠，單獨DMSO給與對照組小鼠后，測定脂褐素的聚積。試驗組每天在10-25μl DMSO中給與2.5-20mg/kg的巨蛋白調(diào)節(jié)劑。如果50mg/kg的最高劑量未觀察到效果，則試驗更高的劑量。對照組注射給予10-25μl的單獨DMSO。采用i.p.注射給與小鼠測試或?qū)φ瘴镔|(zhì)，采用多種試驗期限但不超過1個月。可選擇地，小鼠可以被植入其以0.25μl/hr的速率遞送測試或?qū)φ瘴镔|(zhì)的泵，采用多種試驗期限但不超過1個月。
通過電子或熒光顯微鏡檢測眼睛，以測定巨蛋白調(diào)節(jié)劑在處理和未處理的abca4-/-小鼠中對脂褐素形成的影響。
實施例3巨蛋白調(diào)節(jié)劑對視桿細(xì)胞死亡或視桿功能損害的影響 將巨蛋白調(diào)節(jié)劑給與試驗組小鼠，單獨的DMSO給與對照組小鼠后，測定巨蛋白調(diào)節(jié)劑對視桿細(xì)胞死亡或視桿功能損害的影響。試驗組每天在10-25μl DMSO中給與2.5-20mg/kg的巨蛋白調(diào)節(jié)劑。如果50mg/kg的最高劑量未觀察到效果，則試驗更高的劑量。對照組單獨注射給予10-25μl DMSO。在各種不同的試驗時期內(nèi)(但不超過1個月)采用i.p.注射給與小鼠試驗或?qū)φ瘴镔|(zhì)?？蛇x擇地，小鼠可以被植入以0.25μl/hr的速率遞送試驗或?qū)φ瘴镔|(zhì)的泵，可采用各種不同試驗期限但不超過1個月。
通過監(jiān)測ERG記錄和進行視網(wǎng)膜組織學(xué)分析，分析每天給與2.5-20mg/kg巨蛋白調(diào)節(jié)劑約8周的小鼠以得到巨蛋白調(diào)節(jié)劑對視桿細(xì)胞死亡或視桿功能損害的影響。
實施例4測試對光損害的保護 下面的研究采自Sieving，P.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，981835-40(2001)。為進行慢性曝光研究，將Sprague-Dawley雄性7周齡白化大鼠以5lux白色熒光按12:12h亮/暗循環(huán)飼養(yǎng)。每日3次通過i.p.注射給予慢性組大鼠0.18ml DMSO中的20-50mg/kg的巨蛋白調(diào)節(jié)劑8周。對照組i.p.注射接受0.18ml DMSO。最后注射兩天后處死大鼠。如果50mg/kg的最高劑量未觀察到效果，則試驗更高的劑量。
對于急性曝光研究，大鼠整夜進行暗適應(yīng)，然后在暗紅光中單次i.p.注射0.18ml DMSO中的巨蛋白調(diào)節(jié)劑20-50mg/kg，并在黑暗中保持1h，然后暴露于漂白光中，然后進行ERG測定。
無痛殺死大鼠并摘除眼球。在兩個半球上每200μm測量外核層厚度和視桿外節(jié)(ROS)長度的柱細(xì)胞計數(shù)，并將該數(shù)值平均得到整個視網(wǎng)膜的細(xì)胞變化值。記錄慢性組大鼠處理4周和8周時的ERG。在急性組鼠中，使用對視錐無影響的刺激通過暗適應(yīng)ERG追蹤對漂白光的視桿恢復(fù)。視錐恢復(fù)用適光的ERG追蹤。在ERG之前，動物在暗紅光中準(zhǔn)備并麻醉。瞳孔擴張并通過使用金線角膜環(huán)同時從兩只眼睛記錄ERG。
實施例5包括巨蛋白調(diào)節(jié)劑和芬維A胺的聯(lián)合治療 小鼠和/或大鼠以實施例1-4中描述的方式進行試驗，但是具有附加的兩個配置(arms)。在一個附加的配置中，使用每天5mg/kg到每天50mg/kg的增加劑量的芬維A胺處理小鼠和/或大鼠的組。在第二個附加的配置中，使用每天20mg/kg的巨蛋白調(diào)節(jié)劑和每天5mg/kg到每天50mg/kg的增加劑量的芬維A胺聯(lián)合處理小鼠和/或大鼠的組。聯(lián)合治療的益處按照實施例1-4描述的進行測定。
實施例6巨蛋白調(diào)節(jié)劑對RPE細(xì)胞中視黃醇和RBP水平的影響。
小鼠和/或大鼠以實施例1-4中描述的方式進行試驗，但是通過HPLC分析測定RPE細(xì)胞中視黃醇(或視黃酯)和RBP的水平。本試驗測定所研究的藥物引起的調(diào)節(jié)活性的量。試驗組和對照組之間RPE細(xì)胞中視黃醇和RBP細(xì)胞水平的直接比較質(zhì)量提供了負(fù)責(zé)抑制視黃醇、視黃醇-RBP或視黃醇-RBP-TTR與在RPE細(xì)胞中表達的LDL受體基因家族成員的結(jié)合和攝取的藥物的直接關(guān)系。
根據(jù)本公開，此處披露和要求保護的所有方法可以進行和完成而不需要過多的實驗。對本領(lǐng)域的技術(shù)人員明顯的是可以對本方法和在這里描述的方法的步驟或步驟的順序進行各種改變而不脫離本發(fā)明的概念、實質(zhì)和范圍。更具體地說，明顯的是化學(xué)上和生理學(xué)上相關(guān)的特定藥物可以替代此處描述的藥物，而可以達到相同或相似的結(jié)果。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的所有這些的類似的替換和改進應(yīng)認(rèn)為是在附加的權(quán)利要求限定的發(fā)明的實質(zhì)，范圍和概念之內(nèi)。
權(quán)利要求
1、一種治療哺乳動物眼睛的眼病的方法，該方法包括，
給與該哺乳動物有效量的調(diào)節(jié)哺乳動物眼中視網(wǎng)膜和/或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的LDL受體基因家族成員活性的藥物。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述LDL受體基因家族成員為巨蛋白或巨蛋白相關(guān)蛋白。
3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述LDL受體基因家族成員為類維生素A結(jié)合蛋白受體。
4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述LDL受體基因家族成員的活性是所述LDL受體基因家族成員與選自維生素結(jié)合蛋白、脂蛋白、免疫和應(yīng)激相關(guān)蛋白、類固醇激素結(jié)合蛋白、激素及前體、肽、酶和酶抑制劑、白蛋白、乳鐵蛋白、血紅蛋白、氣味結(jié)合蛋白、甲狀腺素運載蛋白；多元藥物和毒素、RAP、鈣(Ca2+)和細(xì)胞色素C的第二藥物的結(jié)合。
5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述LDL受體基因家族成員的活性是所述LDL受體基因家族成員與選自視黃醇、視黃醇-RBP復(fù)合體、視黃醇-RBP-TTR復(fù)合體、光感受器間類維生素A結(jié)合蛋白(IRBP)、視黃醇-IRBP復(fù)合體、轉(zhuǎn)鈷銨素-維生素B12、轉(zhuǎn)鈷銨素-維生素B12結(jié)合蛋白、維生素D結(jié)合蛋白、載脂蛋白B、載脂蛋白E、載脂蛋白J/叢生蛋白、載脂蛋白H；免疫球蛋白輕鏈、PAP-I、β2-微球蛋白；性激素結(jié)合蛋白-雌激素、雄激素結(jié)合蛋白-雄激素；甲狀旁腺激素、胰島素、表皮生長因子、促乳素、甲狀腺球蛋白、纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)、尿激酶-PAI-1、tPA-PAI-1、前尿激酶、脂蛋白脂肪酶、血纖維蛋白溶酶原、β-淀粉酶、β1-微球蛋白、溶菌酶；白蛋白、乳鐵蛋白、血紅蛋白、氣味結(jié)合蛋白、甲狀腺素運載蛋白、氨基糖苷類、多粘菌素B、抑肽酶、天花粉蛋白、慶大霉素；RAP、Ca2+和細(xì)胞色素C的第二藥物的結(jié)合。
6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述LDL受體基因家族成員的活性是所述LDL受體基因家族成員與視黃醇、視黃醇-RBP復(fù)合體或視黃醇-RBP-TTR復(fù)合體的結(jié)合。
7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述LDL受體基因家族成員的活性是所述LDL受體基因家族成員與類維生素A結(jié)合蛋白的結(jié)合。
8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述LDL受體基因家族成員的活性是選自維生素結(jié)合蛋白、脂蛋白、免疫和應(yīng)激相關(guān)蛋白、類固醇激素結(jié)合蛋白、激素及前體、肽、酶和酶抑制劑、白蛋白、乳鐵蛋白、血紅蛋白、氣味結(jié)合蛋白、甲狀腺素運載蛋白；多元藥物和毒素、RAP、鈣(Ca2+)和細(xì)胞色素C的第二藥物的轉(zhuǎn)胞吞作用。
9、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述LDL受體基因家族成員的活性是選自視黃醇、視黃醇-RBP復(fù)合體、視黃醇-RBP-TTR復(fù)合體、光感受器間類維生素A結(jié)合蛋白(IRBR)、視黃醇-IRBP復(fù)合體、轉(zhuǎn)鈷銨素-維生素B12、轉(zhuǎn)鈷銨素-維生素B12結(jié)合蛋白、維生素D結(jié)合蛋白、載脂蛋白B、載脂蛋白E、載脂蛋白J/叢生蛋白、載脂蛋白H；免疫球蛋白輕鏈、PAP-1、β2-微球蛋白；性激素結(jié)合蛋白-雌激素、雄激素結(jié)合蛋白-雄激素；甲狀旁腺激素、胰島素、表皮生長因子、促乳素、甲狀腺球蛋白、纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)、尿激酶-PAI-1、tPA-PAI-1、前尿激酶、脂蛋白脂肪酶、血纖維蛋白溶酶原、β-淀粉酶、β1-微球蛋白、溶菌酶；白蛋白、乳鐵蛋白、血紅蛋白、氣味結(jié)合蛋白、甲狀腺素運載蛋白；氨基糖苷類、多粘菌素B、抑肽酶、天花粉蛋白、慶大霉素；RAP、Ca2+和細(xì)胞色素C的第二藥物的轉(zhuǎn)胞吞作用。
10、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述藥物結(jié)合視黃醇結(jié)合蛋白。
11、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述藥物結(jié)合甲狀腺素運載蛋白。
12、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述藥物結(jié)合光感受器間類維生素A結(jié)合蛋白(IRBP)。
13、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述藥物調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和/或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中所述LDL受體基因家族成員的表達。
14、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述藥物選自抗體、多肽、核酸、多核酸、聚合物、受體相關(guān)蛋白(RAP)或其片段、低分子量有機化合物、維生素結(jié)合蛋白、脂蛋白、免疫和應(yīng)激相關(guān)蛋白、類固醇激素結(jié)合蛋白、激素及前體、肽、酶和酶抑制劑、白蛋白、乳鐵蛋白、血紅蛋白、氣味結(jié)合蛋白、甲狀腺素運載蛋白；多元藥物和毒素、RAP、鈣(Ca2+)、鈣清除劑、還原劑和細(xì)胞色素C。
15、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述藥物選自抗體、多肽、核酸、多核酸、聚合物、受體相關(guān)蛋白(RAP)或其片段、低分子量有機化合物、視黃醇、視黃醇-RBP復(fù)合體、視黃醇-RBP-TTR復(fù)合體、光感受器間類維生素A結(jié)合蛋白(IRBR)、視黃醇-IRBP復(fù)合體、轉(zhuǎn)鈷銨素-維生素B12、轉(zhuǎn)鈷銨素-維生素B12結(jié)合蛋白、維生素D結(jié)合蛋白、載脂蛋白B、載脂蛋白E、載脂蛋白J/叢生蛋白、載脂蛋白H；免疫球蛋白輕鏈、PAP-1、β2-微球蛋白；性激素結(jié)合蛋白-雌激素、雄激素結(jié)合蛋白-雄激素；甲狀旁腺激素、胰島素、表皮生長因子、促乳素、甲狀腺球蛋白；纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)、尿激酶-PAI-1、tPA-PAI-1、前尿激酶、脂蛋白脂肪酶、血纖維蛋白溶酶原、β-淀粉酶、β1-微球蛋白、溶菌酶；白蛋白、乳鐵蛋白、血紅蛋白、氣味結(jié)合蛋白、甲狀腺素運載蛋白；氨基糖苷類、多粘菌素B、抑肽酶、天花粉蛋白、慶大霉素；RAP、RAP片段、Ca2+、鈣清除劑、還原劑和細(xì)胞色素C。
16、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進一步包括重復(fù)給與有效量的所述藥物。
17、根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，給藥之間的至少一段時間為至少一個星期。
18、根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，給藥之間至少一段時間為至少一天。
19、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進一步包括給與至少一種附加的藥物，該附加的藥物選自一氧化氮生成誘導(dǎo)劑、抗炎劑、生理學(xué)上可接受的抗氧化劑、生理學(xué)上可接受的無機物、帶負(fù)電荷的磷脂、類胡蘿卜素、他汀類藥物、抗血管生成藥物、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑、13-順式-視黃酸或具有通式(A)結(jié)構(gòu)的化合物
通式(A)
其中，
X1選自NR2、O、S或CHR2，
R1為(CHR2)x-L1-R3，其中，
x為0、1、2或3；L1為單鍵或-C(O)-；
R2為選自H、(C1-C4)烷基、F、(C1-C4)氟代烷基、(C1-C4)烷氧基、-C(O)OH、-C(O)-NH2、-(C1-C4)烷基胺、-C(O)-(C1-C4)烷基、-C(O)-(C1-C4)氟代烷基、-C(O)-(C1-C4)烷基胺和-C(O)-(C1-C4)烷氧基的結(jié)構(gòu)，和
R3為H或任選地被1-3個獨立選擇的選自(C2-C7)鏈烯基、(C2-C7)炔基、芳基、(C3-C7)環(huán)烷基、(C5-C7)環(huán)鏈烯基和雜環(huán)的取代基取代的結(jié)構(gòu)。
20、根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述具有通式(A)結(jié)構(gòu)的化合物為
或其活性代謝物、或藥學(xué)上可接受的前藥或溶劑合物。
21、根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述化合物為4-羥基苯基維甲酰胺、4-甲氧基苯基維甲酰胺；或其活性代謝物、或藥學(xué)上可接受的前藥或溶劑合物。
22、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進一步包括給與哺乳動物選自體外血液分離、局限性視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)位、光動力學(xué)療法、玻璃疣激光治療、黃斑裂孔手術(shù)、黃斑轉(zhuǎn)位手術(shù)、Phi-Motion、質(zhì)子束療法、視網(wǎng)膜剝離和玻璃體手術(shù)、鞏膜扣帶術(shù)、黃斑下手術(shù)、經(jīng)瞳孔溫?zé)岑煼?、光系統(tǒng)I療法、微電流刺激、RNA干擾、給與眼睛如碘化二乙氧膦酰硫膽堿或二乙氧膦酰硫膽堿或碳酸酐酶抑制劑的藥物、微芯片植入、干細(xì)胞療法、基因替代療法、核酶基因療法、光感受器/視網(wǎng)膜細(xì)胞移植、激光凝固術(shù)以及針灸的治療。
23、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進一步包括視網(wǎng)膜變性的附加治療。
24、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述哺乳動物是人。
25、根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中，所述的人具有選自Stargardt病、退行性視網(wǎng)膜色素變性、退行性錐-桿營養(yǎng)不良、干性年齡相關(guān)性黃斑變性、滲出性年齡相關(guān)性黃斑變性、錐-桿營養(yǎng)不良、視網(wǎng)膜色素變性、基于脂褐素的視網(wǎng)膜變性、光感受器退化和地圖樣萎縮的眼睛疾病或性狀。
全文摘要
引起可逆夜盲癥的化合物可用于治療與可在視覺循環(huán)過程中蓄積的廢物的過量產(chǎn)生相關(guān)的眼病。本發(fā)明提供使用此類化合物以及它們的衍生物治療例如黃斑變性和營養(yǎng)不良或者減輕與這些眼病有關(guān)的癥狀的方法和組合物。此類化合物以及它們的衍生物可作為單一藥物治療使用或與其它藥物或療法聯(lián)合使用。
文檔編號A61K38/00GK101500594SQ200780022882
公開日2009年8月5日 申請日期2007年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月22日
發(fā)明者Y·韓, N·L·馬塔 申請人:西來昂診療公司