重組減毒梭狀芽孢桿菌生物體和疫苗的制作方法

專利名稱：：重組減毒梭狀芽孢桿菌生物體和疫苗的制作方法
技術領域：
：本發明涉及減毒梭狀芽孢桿菌(C7o^7'^i/w)生物體、其制備及使用方法、及a-毒素突變蛋白和其編碼核酸。
背景技術：
：厭氧細菌病原體是農業生產的嚴重經濟負擔。梭狀芽孢桿菌家族細菌代表一類特殊的負擔，因為這些細菌可致使家禽及其它有經濟價值的飼養動物患嚴重疾病。控制這些生物體的先前努力依賴于衛生處理及在動物飼料中施用抗生素。具體地說，產氣莢膜梭狀芽孢桿菌(C.pe，/"gew)是一種發現于土壤、腐敗有機物質中的厭氧細菌，且是人類及動物的腸道菌叢的一部分。根據其產生的毒素譜，將產氣莢膜梭狀芽孢桿菌的不同菌林標識為生物型A至生物型E[Justin等人，Aoc/ze脂Wo/W,6253-6262(2002);McDonel(1986)，細菌毒素的藥理學(PHARMACOLOGYOFBACTERIAL-TOXINS);F.Dorner及J.Drews(編輯)PergamonPress,Oxford]。生物型A菌抹作為各類別壞疽及腸道疾病的病原具有特別重要性。一種由產氣莢膜梭狀芽孢桿菌引起的特別嚴重的腸道疾病是壞疽性腸炎(本領域也稱作"壞死性腸炎")，一種可導致人類及飼養動物二者患壞死病、敗血癥及溶血病的腸壞疽[參見，Pearson等人，,j肌A/^/./SS(11):1309-10(1986);Al-Sheikhy及Truscott,」Wtm2/「":256-63(1977)]。對于禽類，例如雞(紅原雞(G"〃wga〃^))而言，壞疽性腸炎是一個非常嚴重的問題。A型或C型產氣莢膜梭狀芽孢桿菌可引起重大的損失，尤其在肉用仔雞生產中[Ficken及Wages，AAecr0fZC￡血他，InDiseasesofPoultry,第10版，第261-264頁(1997)]。除與壞死性腸炎暴發相關的損失外，據報導，產氣莢膜梭狀芽孢桿菌相關性疾病也會損害畜群的生產能力[Lovl及Kaldhusdal,爿v/朋尸W/zo/ogy30:73-81(2001)]。如上所述，在動物伺料中加入抗菌劑是最常見的控制方法。然而，抗菌劑(例如，抗生素)成本較高且人們對細菌抗性提高的擔心日盛。近來，人們已試圖提供可抵抗有害梭狀芽孢桿菌菌種的疫苗。舉例而言，Lovland等人Mv/a"尸"Ao/og少"(7」83-92(2004)]闡明了與氬氧化鋁佐劑一起使用的基于產氣莢膜梭狀芽孢桿菌A型及C型類毒素的候選疫苗。據報導，對母雞進行接種可產生特異性抗體以保護子代免受由產氣莢膜梭狀芽孢桿菌亞臨床攻擊引起的腸道損傷。由脫毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌毒素制備的其它基于類毒素的疫苗已為人們所知[參見，例如，美國專利笫4，292,307號，其闡述了如下的毒素A型、B型及D型產氣莢膜梭狀芽孢桿菌、水胂梭菌(C/.Oe血m加e似)及腐敗梭菌(C7.iSe/^7'cwm)]。也建議使用重組類毒素制劑。舉例而言，Titball等人[美國專利第5,851,827號、第6,403,094號及笫5,817,317號]報導了編碼抗原性產氣莢膜梭狀芽孢桿菌肽的核酸、這些肽自身、以及由這些肽制備的疫苗。例如，闡述了具有天然產氣莢膜梭狀芽孢桿菌a-毒素的氨基酸殘基261至300,但缺少天然毒素的磷脂酶C和鞘磷脂水解酶(hydrolyzins)結構域的肽。也報導了這些肽可誘導抵抗該天然毒素的免疫保護。另外，美國專利第6,610,300號描述了基于產氣莢膜梭狀芽孢桿菌P-毒素突變蛋白的抗原性片段的疫苗。然而，無論類毒素疫苗是源自天然生物體或以重組方式獲得，制備及向有免疫接種需要的動物施用類毒素蛋白均被視為沉重的經濟負擔，特殊環境下(例如，治療可能對整個有機體疫苗的其它組份過敏或敏感的人)除外。而且，基于蛋白/類毒素的疫苗通常需要重復加強免疫以維持完全效能。另一建議解決方案是改造可產生代替野生型毒素的a-毒素突變蛋白的抗原活性病毒。舉例而言，Bennett等人[Fz'ra〃mmw"o/."p」:97-105(1999)]已闡明表達產氣莢膜梭狀芽孢桿菌a-毒素的無毒性C結構域的重組牛痘病毒載體。遺憾的是，盡管在過去20年里建議使用若干重組牛痘疫苗，但對安全性(向環境中釋放活的感染性牛痘病毒，其可傳6播給對該病毒無抗性的人)的擔心仍長期存在。已知產氣莢膜梭狀芽孢桿菌的a-毒素(p/c基因)具有若干生物活性，包括溶血活性、磷脂酶C活性、鞘磷脂酶活性、磷酸二酯酶活性及致死活性。在本
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中，有許多關于可降低毒性的此a-毒素變突的報導。Schoepe等人[/"/e"./www".69(7/」7194-7196(2001)〗闡述一種可產生無毒性a-毒素的天然產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌株。然而，修飾此菌林以產生抵抗除毒性野生型產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌種外的其它變異體的免疫保護將比較困難。Williamson及Titball[Kaccz'"e//(72力1253畫1258(1993)]證實該毒素自氨基酸殘基247至氨基酸殘基370的單獨區域足以免疫小鼠抵抗由產氣莢膜梭狀芽孢桿菌實驗性誘導的氣性壞疽。Alape-Gir6n等人[^^.J.267:5191-5197(2000)]已經報導替換Asp269、Asp336、Tyr275、Tyr307及Tyr331可;咸少a隱毒素毒'l"生。Nagahama等人[/w/e"./附mww.(15:3489-3492(1997)]報導替換Asp-56、Asp-130或Glu-152可減少a-毒素毒性。Nagahama等人[J.5ac化n'o/ogy/77:1179-1185(1995)]報導在產氣莢膜梭狀芽孢桿菌a-毒素中使用中性氨基酸(例如甘氨酸)替換68位處的組氨酸可導致該a-毒素突變蛋白的溶血活性、磷脂酶C活性、鞘磷脂5^活性以及致死活性的完全喪失。據信，此單一氨基酸變化可滅活該蛋白的3個鋅結合結構域中的一個。后來，將由替換His68所滅活的鋅結合結構域表示為Zn2[Justin等人，Aoc/^m^o^/:6253-6262(2002)]。盡管有上述說明，但本
技術領域：
中仍需要一種可廣泛地保護飼養動物(包括禽類，例如雞)免受梭狀芽孢桿菌菌種(包括產氣莢膜梭狀芽孢桿菌)感染的安全、經濟且有效的方法。不應將本文任一參考文獻的引用詮釋為認可此參考文獻作為本申請的"現有技術"使用。發明簡述為了克服本領域技術中的上述缺點，本發明提供編碼產氣莢膜梭狀芽孢桿菌a-毒素的基本上(substantially)無毒性突變蛋白的核酸分子。在一個這種實施方案中，該核酸分子編碼包含減去至少18個連續氨基酸殘基的SEQIDNO:3氨基酸序列的a-毒素突變蛋白，其中所缺失氨基酸殘基之一是ffiS68。在另一實施方案中，該核酸分子編碼包含減去至7少12個連續氨基酸殘基的SEQIDNO:3氨基酸序列的a-毒素突變蛋白，其中所缺失氨基酸殘基之一是HiS68。在又一實施方案中，該核酸分子編碼包含減去至少9個連續氨基酸殘基的SEQIDNO:3氨基酸序列的突變蛋白，其中所缺失氨基酸殘基之一是HiS68。在再一實施方案中，該核酸分子編碼包含減去至少6個連續氨基酸殘基的SEQIDNO:3氨基酸序列的突變蛋白，其中所缺失氨基酸殘基之一是HiS68。在又一實施例中，該核酸分子編碼包含減去至少3個連續氨基酸殘基的SEQIDNO:3氨基酸序列的突變蛋白，其中缺失氨基酸殘基之一是His68。在一個實施方案中，本發明的核酸分子編碼從SEQIDNO:3氨基酸序列缺失不多于48個連續氨基酸殘基的突變蛋白。在另一實施方案中，核酸分子編碼從SEQIDNO:3氨基酸序列缺失不多于36個連續氨基酸殘基的突變蛋白。在再一實施方案中，核酸分子編碼從SEQIDNO:3氨基酸序列缺失不多于24個連續氨基酸殘基的突變蛋白。在又一實施方案中，本發明的核酸分子編碼從SEQIDNO:3氨基酸序列缺失不多于18個連續氨基酸殘基的突變蛋白。在一特定實施方案中，本發明提供編碼從SEQIDNO:3氨基酸序列缺失9個連續氨基酸殘基(其中一個是HiS68)的突變蛋白的核酸分子。在一具體的該類實施方案中，該核酸分子編碼其中所缺失的9個連續氨基酸殘基是介于SEQIDNO:3的Tyr62至Trp7o之間的突變蛋白。在一更特定實施方案中，該核酸分子編碼其中所缺失的9個連續氨基酸殘基是由單一亮氨酸殘基替換的突變蛋白。在另一實施方案中，該核酸分子包含SEQIDNO:2的核苷酸序列，其中核苷酸268-294缺失。在一個具體的該類實施方案中，SEQIDNO:2核苷酸序列的核苷酸268-294由編碼單一亮氨酸殘基的3個核苷酸替換。本發明也提供產氣莢膜梭狀芽孢桿菌a-毒素的基本上無毒性突變蛋白。在一個該類實施方案中，該a-毒素突變蛋白包含減去至少18個連續氨基酸殘基的SEQIDNO:3氨基酸序列，其中所缺失氨基酸殘基之一是His68。在另一實施方案中，該突變蛋白包含減去至少12個連續氨基酸殘基的SEQIDNO:3氨基酸序列，其中所缺失氨基酸殘基之一是His68。在又一實施方案中，該突變蛋白包含減去至少9個連續氨基酸殘基的SEQIDNO:3氨基酸序列，其中所缺失氨基酸殘基之一是His6g。在再一實施方案中，該突變蛋白包含減去至少6個連續氨基酸殘基的SEQIDNO:3氨基酸序列，其中所缺失氨基酸殘基之一是His68。在又一實施方案中，該突變蛋白包含減去至少3個連續氨基酸殘基的SEQIDNO:3氨基酸序列，其中所缺失氨基酸殘基之一是His68。在一個實施方案中，本發明的突變蛋白包含不大于48個自SEQIDNO:3氨基酸序列缺失的連續氨基酸殘基。在另一實施方案中，該突變蛋白包含不多于36個自SEQIDNO:3氨基酸序列缺失的連續氨基酸殘基。在再一實施方案中，該突變蛋白包含不多于24個自SEQIDNO:3氨基酸序列缺失的連續氨基酸殘基。在又一實施方案中，該突變蛋白包含不多于18個自SEQIDNO:3氨基酸序列缺失的連續氨基酸殘基。在一特定實施方案中，本發明提供自SEQIDNO:3氨基酸序列缺失9個連續氨基酸殘基(其中一個是HiS68)的基本上無毒性突變蛋白。在一個更具體的該類實施方案中，所缺失的9個連續氨基酸殘基介于SEQIDNO:3的Tyr62至Trp7()之間。在又一更特定實施方案中，所缺失的9個連續氨基酸在該突變蛋白的氨基酸序列中由單一亮氨酸殘基替換。本發明進一步提供減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體，其具有整合入減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體染色體的編碼產氣莢膜梭狀芽孢桿菌a-毒素的基本上無毒性突變蛋白的核酸分子。此整合核酸分子優選位于與編碼野生型產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體中野生型a-毒素的核酸分子位置同源的染色體位置。因此，本發明的減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體因缺少功能性野生型p/c基因而為基本上無毒性的。如本文所例示，該減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體可為A型產氣莢膜梭狀芽孢桿菌。在本發明的一個特定實施方案中，該減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體是產氣莢膜梭狀芽孢桿菌CPERF/AaToxin365-054(ATCC保藏號PTA7364)。在本發明的另一特定實施方案中，該減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體是產氣莢膜梭狀芽孢桿菌CPERF/AaToxin365-053(ATCC保藏號PTA7365)。可自哺乳動物或禽類的宿主動物分離由本發明方法減毒的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體。這些哺乳動物可包括牛、羊及豬。適當的禽類的實例包括雞、火雞、鴨、家鴿(pigeon)、鵝、野鴿(dove)、天鵝、山鵓(partridge)及松雞。本發明也提供疫苗。這些疫苗可包含本發明的減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體。本發明的疫苗也可包含藥學上可接受的緩沖劑、賦形劑和/或佐劑。另外，本發明提供在動物中誘導針對產氣莢膜梭狀芽孢桿菌的免疫性的方法。一個這種實施方案包括對該動物施用免疫有效劑量的本發明疫苗。本發明的疫苗可由許多途徑施用，包括經口、肌內、靜脈內、皮內、皮下及鼻內。可將本發明的疫苗施于動物銅料的表面上和/或噴灑于該動物上以便于經口施用。本發明進一步提供包含本發明疫苗的動物飼料。本發明也提供另外表達至少一種基因(編碼非產氣莢膜梭狀芽孢桿菌多肽)的本發明減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體。在一個這種實施方案中，一個或多個非產氣莢膜梭狀芽孢桿菌多肽是細菌多肽，例如，來自大腸桿菌(51.co//)、沙門氏菌(salmonella)、勞森氏菌(lawsonia)、或彎曲桿菌(campylobacter)等的抗原性蛋白和/或其組合。另一選擇為，或與之組合，非產氣莢膜梭狀芽孢桿菌多肽可為非細菌多肽。這些非細菌多肽的實例包括哺乳動物或禽類蛋白，例如，細胞因子(cytokine)，如雞IL-18;病毒，如輪狀病毒或冠狀病毒；及寄生蟲，如艾美球蟲(eimeria)、等孑包子J求蟲(isospora)、及隱孑包子蟲(Cryptosporidium)。在另一方面中，本發明提供一種選擇性地與抗原決定部位(epit叩e)結合的抗體，所述抗原決定部位從產氣莢膜梭狀芽孢桿菌a-毒素的基本上無毒性突變蛋白缺失。這些抗體可區分該基本上無毒性突變蛋白與野生型產氣莢膜梭狀芽孢桿菌a-毒素。本發明也提供包含本發明的抗體的檢測試劑盒，其可用于識別動物個體是否已接種疫苗或者已天然感染產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體。因此，本發明也提供識別和/或區分已天然感染產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體的動物與已接種減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體的動物的方法。在一個這種實施方案中，該方法具體包括使來自該動物的流體(fluid)試樣與抗體接觸，該抗體可選擇性地結合至發現于野生型產氣莢膜梭狀芽孢桿菌a-毒素中的抗原決定部位，所述抗原決定部位從本發明產氣莢膜梭狀芽孢桿菌a-毒素的基本上無毒性突變蛋白缺失。因此，該抗體可區分那些已經接種本發明產氣莢膜梭狀芽孢桿菌a-毒素的基本上無毒性突變蛋白(和/或表達該突變蛋白的減毒產氣莢膜梭狀芽孢10桿菌生物體)的動物與那些感染或曾感染野生型產氣莢膜梭狀芽孢桿菌a-毒素的動物。下一步驟是測定該抗體是否與該流體試樣反應，例如，結合至該流體試樣所含抗原。當該抗體與該流體試樣反應時，可將該動物識別為已經天然感染產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體的個體。圖l顯示產氣莢膜梭狀芽孢桿菌a-毒素編碼區的基因組圖。圖中顯位置。;中也指出所形成的27堿基對缺失的;位。"F/7/c"^示y//c基因(CPE00");"plc"表示編碼a-毒素(磷脂酶C)的基因且"CobW"表示下游基因。圖2A顯示產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌林CP6的plc基因一部分的序列[SEQIDNO:4;此為CP6的;/c基因片段的SEQIDNO:22的一部分(即，核苷酸262-300)]及對應肽序列(SEQIDNO:5)，其中下劃線表示用于形成該缺失的BamHl內切核酸酶限制酶切位點。圖2B顯示用于在母體產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌林1240中形成缺失的引物的序列(SEQIDNO:6),此形成缺失體CPERF001。下劃線表示該引物中所含BamHl限制酶切位點以便于構建該缺失。圖中也顯示對應肽(SEQIDNO:7)。圖2C顯示CPERF001(SEQIDNO:8;核苷酸103-117)中及對應肽(SEQIDNO:9)中所形成缺失的序列。下劃線表示復原BamHl內切核酸酶限制酶切位點。圖3A再次顯示產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌抹CP6的plc基因的一部分的序列[SEQIDNO:4，核苷酸262-300]及對應肽序列(SEQIDNO:5),其中下劃線表示用于形成該缺失的BamHl內切核酸酶限制酶切位點。圖3B顯示用于在母體產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌林29中形成缺失的引物的序列(SEQIDNO:10)，此形成缺失體CPERF002。圖中也顯示對應肽(SEQIDNO:11)。圖3C顯示CPERF002中所形成缺失的序列(SEQIDNO:12)及對應肽(SEQIDNO:13)。ii發明詳述因此，本發明提供以相對于天然或野生型梭菌屬毒素具有不可檢測的毒性和/或基本上低毒性的突變蛋白形式表達一種或多種梭菌(Clostridia)毒素(例如a-毒素)的經改造的梭菌生物體及培養物。優選地，本發明的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌突變型生物體可作為活疫苗容易地施用給動物。也提供本發明的突變蛋白產氣莢膜梭狀芽孢桿菌a-毒素以及編碼該突變蛋白的核酸分子、用于表達a-毒素的載體、及使用它們的方法。為了清楚地闡述本發明，可定義如下若干術語。疫苗是一種包含免疫原及其它藥學上可接受的可選成份(在某些實施例中，包括適宜佐劑)的組合物。本文所用術語"免疫原"描述一種在被導入動物中時激發免疫應答的組合物、物質或載體。出于本發明的目的，免疫原包含任一能夠表達本發明a-毒素突變蛋白或將本發明a-毒素突變蛋白導入擬免疫接種動物中的載體的。載體包括，例如，在將該載體導入動物中時可表達本發明a-毒素突變蛋白的本發明產氣莢膜梭狀芽孢桿菌或其它適宜微生物。載體也包括本領域已知核酸分子，例如，質粒等，其在直接導入動物中時可通過(例如)進入動物細胞并在動物中表達a-毒素突變蛋白來表達本發明的a-毒素突變蛋白。免疫原也可為單獨或作為適宜疫苗組合物的一部分使用的蛋白，例如本發明的a-毒素。除非另有說明，否則本文所用術語"免疫"及"接種"是同義的且可互換使用以描述將免疫原導入動物從而在該動物中產生免疫應答。所產生免疫應答可為被治療動物提供保護免疫性，此可限制或減少已接種動物的臨床病狀，例如，氣性壞疽和/或死亡率，然后用毒性劑量的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌種(對其而言，本發明的疫苗是保護性的)刺激已接種動物。術語"佐劑"被定義為可刺激免疫系統的一種或多種物質。在本文中，佐劑可用于增強對一種或多種疫苗抗原/分離物的免疫應答。可在施用該疫苗之前、同時或之后對靶動物施用佐劑。本發明的佐劑可自許多來源的任一個獲得，這些來源包括天然來源、重組體來源和/或以化學方式合成等。用作佐劑的化學化合物的實例包括但不限于含鋁化合物；可代謝及不可代謝的油；嵌段聚合物；ISCOM(免疫刺激復合物)；維生素及礦物質(包括但不限于維生素E、維生素A、硒及維生素B12);QuilA(皂苷)；以不同水平與聚烯基聚酯交聯的基于交聯丙烯酸的聚合物(例如丙-2-烯酸聚合物)，如以商標CARBOPOL⑧出售的；和/或均勻分布于水中的樣i米級油滴的乳液，例如，以商標Emulsigen⑧出售的。有時被明確稱作免疫刺激劑的佐劑的其它實例包括細菌及真菌細胞壁組份(例如，脂多糖、脂蛋白、糖蛋白、胞壁酰肽、p-l,3/l,6-葡聚糖)、源自植物的各種復雜的碳水化合物(例如，聚糖、醋孟南(acemannan))、源自動物的各種蛋白及肽(例如，激素、細胞因子、協同刺激因子)、及源自病毒及其它來源的核酸(例如，雙鏈RNA、CpG)。另外，任一數量的各上述物質的組合可提供佐劑效果，因此，其可形成本發明的佐劑。本文所用術語"抗體"欲涵蓋多克隆抗體、單克隆抗體和/或其片段或重組體衍生物，包括摻入抗體可變結構域的經改造結合蛋白。如本文所用，本發明a-毒素蛋白的氨基酸殘基的殘基編號及位置是基于產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌抹13使用的編號系統。產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌林13的a-毒素由GenBank登記編號NC003366報導，如由SEQIDNO:l所示。該完整的蛋白的長度是398個氨基酸。由下文所例示的突變蛋白載體編碼的a-毒素對應于具有氨基酸殘基90-98缺失的SEQIDNO:l蛋白。在該蛋白突變中有一28個氨基酸信號序列裂解。因此，所例示缺失對應于長度為370個氨基酸的成熟蛋白的氨基酸殘基62-70(SEQIDNO:3)。編碼本發明a-毒素蛋白的DNA的密碼子編號基于產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌抹13的戶/c基因，如GenBank登記編號NP560952中所報導及如SEQIDNO:2所示。a-毒素的編碼序列在產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌株13中為自核苷酸48590至49786。本文所例示的兩個構建體中的密碼子缺失對應于NP560952基因的核苷酸48857至(且包括)48883。此缺失發現于a-毒素基因內且對應于SEQIDNO:2的編碼序列中的核苷酸268-294。此外，為方便說明而使用單數術語，但并不受限于此。因此，舉例而言，當提及包含一種產氣莢膜梭狀芽孢桿菌細胞的組合物時包括所提及的一種或多種這些細胞。也應理解，本發明并不限于本文所揭示的特定構型(configuration)、過程步驟及材料，這些構型、過程步驟及材料可有少許變化。也應理解，本文所用專業術語僅出于闡述特定實施例的目的而使用且并非受限于此，因為本發明的范圍僅受限于隨附的權利要求及其等同物。在本發明的一個特定方面中，提供"基本上無毒性"的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌的非逆轉性突變體，即，可表達具有極小或無毒性的免疫原性a-毒素進而使其適于用作保護性疫苗的生物體。因此，本發明的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體相對于野生型產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體具有充分減少的毒性，以致在接種此疫苗的動物中可有效誘導抗a-毒素或抗產氣莢膜梭狀芽孢桿菌免疫應答的條件下使用時，可用作疫苗或抗原。因此，本發明的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體相對于野生型產氣莢膜梭狀芽孢桿菌是"減毒的"。短語"基本上無毒性"亦欲用于具有充分低或無毒性的上述免疫原性a-毒素突變蛋白，進而也使其適用作保護性疫苗。例如，由下列本領域已知檢測中的一種來測定毒性減少試-驗動物組中的溶血活性、磷脂酶C活性、鞘磷脂酶活性、磷酸二酯酶活性及一般致死活性。一般而言，由這些標準檢測不可檢測殘余毒性。盡管如此，相對于衍生突變蛋白的野生型產氣莢膜梭狀芽孢桿菌a-毒素的相等數量感染性單位的毒性，可證明最小量(例如自約10-4至約10-2)的一種或多種這類活性的存在在獸醫環境中是可接受的。在一個實施方案中，采用產氣莢膜梭狀芽孢桿菌的生物型A菌林實施本發明，其作為各類別壞疽及腸道疾病的病原具有特別的重要性。具體地說，產氣莢膜梭狀芽孢桿菌的a-毒素是缺失-減毒的目標，因為此毒素的減毒足以致使產氣莢膜梭狀芽孢桿菌相對于野生型菌抹不具有致死性。概言之，本發明的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌p/c基因表達a-毒素突變蛋白。a-毒素突變蛋白具有包含Zn2環的His以及側接(flanking)殘基在內的缺失以大大地降低任一回復突變至毒性形式的可能性。現在已發現Zn2環His殘基(例如，SEQIDNO:3的His68)的缺失以及側接Zn2環His殘基的額外殘基的缺失可提供保留足夠免疫原性的a-毒素以在接種本發明產氣莢膜梭狀芽孢桿菌的動物中誘導保護免疫性同時也不可能回復突變至編碼野生型a-毒素。可能缺失的額外殘基相對于His68在C-末端方向和/或在N-末端方向上缺失，且在這些方向的任一個上，這些額14外殘基的數量可介于約4個至約60個殘基之間。或者，Hisw8及側接殘基可類似地缺失。相對于SEQIDN0:3，除包含His68缺失之外，本發明a-毒素突變蛋白的一個實施方案也包含來自HiS68位置的任一側(在C-末端或N-末端方向上)的至少30個氨基酸殘基缺失。在另一實施方案中，相對于SEQIDNO:3,除包含His68缺失之外，本發明a-毒素突變蛋白也包含來自His68的任一側的至少20個氨基酸殘基缺失。在又一替代實施方案中，相對于SEQIDNO:3，除包含His68缺失之外，本發明a-毒素突變蛋白也包含來自HiS68的任一側的至少5個氨基酸殘基缺失。在再一實施方案中，相對于SEQIDNO:3，本發明的a-毒素突變蛋白包含自約殘基62至約殘基70的缺失。視情況，這些缺失氨基酸殘基可由一個或多個其它殘基(例如，單一亮氨酸殘基)替換。在又一實施方案中，產氣莢膜梭狀芽孢桿菌(X-毒素突變蛋白產生或分離自產氣莢膜梭狀芽孢桿菌或者替代重組生物體，其被用作研究試劑和/或用于診斷試劑盒或檢測中，作為(例如)抗a-毒素抗體的靶。產氣莢膜梭狀芽孢桿菌a-毒素突變蛋白的又一用途是用于不能夠接受接種本發明減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體的動物(例如，人類)的特殊疫苗中。另外，本發明提供相對于本發明a-毒素突變蛋白可特異性地與野生型a-毒素結合的抗體。在另一實施方案中，提供一種優選與野生型產氣莢膜梭狀芽孢桿菌a-毒素蛋白結合同時對本發明a-毒素突變蛋白呈現最小結合或不結合(例如，避免與具有如上文所詳述缺失的a-毒素突變蛋白結合)的抗體。因此，所提供抗體可用于區分該a-毒素缺失突變蛋白與野生型a-莢月莫梭狀芽孢;干菌的動物。、產生及篩選這些選擇:抗^的方法為本領域所知。類似地，也可產生可識別本發明a-毒素突變蛋白但不識別野生型蛋白的抗體。本發明的抗體可為多克隆抗體、單克隆抗體("mAb")或用于制備及篩選單克隆抗體的技術已經被詳盡地闡述[參見，例如，Stites等人(編輯)8as7'cawt/C7/m'c"http://m廳wo/ogy(第4版),LangeMedicalPublications,LosAltos，California(1988);Harlow及Lane,v4w"力otto,爿15Z^6orafo/jMawwa/,CSHPress(1988);Goding,Mowoc/owa/JW6od^.'尸n力cz)/es7V"c/7'ce(第2片反),AcademicPress,NewYork(1986);及Kohler和Milstein,Atowe256:495-497(1975)，所有這些文獻的全文均以引用方式并入本文中]。例如，但不限于此，通過使用經純化野生型產氣莢膜梭狀芽孢桿菌a-蛋白(例如與適宜佐劑的組合)進行接種可在諸如小鼠或雞等適宜動物中產生免疫應答。舉例而言，為了免除野生型a蛋白的毒性，該免疫原可為對應于缺失殘基的肽，且若需要可通過與適宜佐劑組合或通過與適宜載體蛋白偶聯來增強該肽的免疫原性。與載體蛋白的偶聯為本領域所知，且可由(例如)提供具有末端半胱氨酸的肽并使用馬來酰亞胺偶聯化學或磺基琥珀酸亞氨基4-[N馬來酰亞氨基]環己烷-l-羧酸酯連接子(來自Pierce)將該肽偶聯至鑰孔蜮血蘭素(KLH)或牛血清白蛋白(BSA)來完成。在不需要末端半胱氨酸時也可采用碳化二亞胺連接子。對于單克隆抗體制備而言，可從被免疫接種動物獲得脾淋巴細胞，從這些淋巴細胞制備雜交瘤，可獲得一種或多種表達抗a蛋白的潛在的適宜雜交瘤。篩選抵抗突變蛋白及野生型a-蛋白的雜交瘤，并識別、克隆及使用表達僅結合野生型a-毒素的抗體的雜交瘤以產生僅結合野生型a蛋白的單克隆抗體。任選地，獲得來自經識別的雜交瘤無性繁殖系的cDNA,且在其它本領域已知的表達系統中產生重組抗體或抗體片段。如上文所述，一般而言，接種的一個潛在缺點是在使用抗天然菌林的抗體測試感染時，所得被接種動物可能產生假陽性從而阻礙感染動物的識別。因此，本發明提供一種用于區分已經感染天然產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體的動物個體與使用本發明a-毒素突變蛋白接種的動物的檢測試劑盒。這種檢測試劑盒包括一定量的對本發明a-毒素突變蛋白呈現最小結合或不結合的選擇性抗野生型a-毒素抗體。該檢測試劑盒也可包括足以進行至少一次診斷試驗的其它適宜試劑。在另一實施方案中，使用易于檢測的標記部分(例如，任何本領域已知的酶標記，如過氧化物酶；熒光標記物，如熒光素；珠體，包括磁性小珠；及諸如此類)對該抗體進行標記(tagged或labeled)。任選地，該試劑盒可進一步包括選擇性地與選擇性抗野生型a-毒素抗體結合的標記抗體。免疫分析法為本技16術領域所熟知，包括三明治型免疫分析法、竟爭性免疫分析法、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)及其它。本發明也提供用于識別及區分感染天然(即野生型)產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體的動物與使用包含本發明減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體的疫苗接種的動物的方法，其按照(例如)下列步驟進行(a)使來自該動物的流體試樣與上述選擇性抗野生型a-毒素抗體接觸，該選擇性抗野生型a-毒素抗體對本發明a-毒素突變蛋白呈現最小結合或不結合；及(b)測定該抗體是否與該流體試樣反應；其中當該抗體與該流體試樣反應時，該動物^皮識別為已經天然地感染產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體的動物。制備減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌林可按照下述實施將野生型產氣莢膜梭狀芽孢桿菌分離物轉化成適于作為疫苗施用的減毒或基本上無毒性菌抹的方法。可使用僅編碼a-毒素突變蛋白的基因替換位于細菌染色體上的a-毒素(//c)基因，從而使該產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體不能夠產生野生型a-毒素。概言之，產生疫苗生物體的方法包括但不限于下列常用步驟，不必按下列順序。(1)識別欲通過接種加以保護的動物類別及所獲得的一種或多種用于篩選目的的臨床分離物。對于a-毒素而言，此步驟通常為可選步驟，因為來自某一動物物種的分離物不可能為其它動物物種提供保護。(2)由(例如)PCR或其它本領域已知核酸擴增技術并使用適宜側接引物以擴增來自產氣莢膜梭狀芽孢桿菌分離物的p/c基因，并使用適宜引物進行擴增以產生所期望的缺失突變。或者，可探測適當文庫。(3)形成包含缺失//c基因的自殺載體，其中產氣莢膜梭狀芽孢桿菌復制起點已經移除，和/或可在產氣莢膜梭狀芽孢桿菌中復制的復制起點完全不存在；且在任一情況下，包含毗鄰突變//c基因的適宜選擇性標記，例如，抗生素標記。隨后可由(例如)電穿孔或其它本領域已知方法將此載體插入產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體中。(4)篩選其中已經將突變蛋白;/c基因成功地整合入細菌染色體中的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體。可通過在選擇性試劑(例如，對應于選擇性標記的抗生素)存在下培養步驟(3)的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體來進行。舉例而言，可在抗生素選擇下生長的唯一產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體可為那些已通過同源重組將自殺載體及其抗生素抗性基因直接整合入細菌染色體中的。因此，這些生長的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體可具有兩個毗鄰p/c基因，一個是野生型而另一個可能具有缺失突變。(5)篩選已進行了另一重組事件(event)的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體，該重組事件可移除選擇性標記(例如抗生素標記)以及野生型//c基因。這可通過在不存在選擇性試劑(例如抗生素)時培養(4)的生物體并在血瓊脂上選擇非溶血性克隆來進行。由于突變蛋白核酸的插入是通過同源重組完成的，因此編碼該a-毒素突變蛋白的核酸分子是在與編碼野生型a-毒素的核酸分子的位置同源的染色體位置整合的，該野生型a-毒素存在于未減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌中。更具體而言，可從患病動物或其它來源獲得產氣莢膜梭狀芽孢桿菌的野外分離物。首先，將從相關野外分離物獲得的基因組DNA插入適宜的雙重微生物穿梭載體(例如具有選擇性標記(如抗生素標記)的穿梭質粒)中以評定其可轉化性。概言之，適宜穿梭載體可包含l個、2個、3個或更多個下列特征克隆位點、產氣莢膜梭狀芽孢桿菌復制起點、大腸桿菌復制起點及抗生素抗性基因和/或選擇性標記。適用于此目的或容易地適應于此目的的本領域已知載體包括(例如)Roberts等人所述重組穿梭質粒pHR106[J///A^co&o/268-270(1988)];Bannam等人所述pJIR750及pJIR75l質粒[尸/w脂c/"..233-235(1993)];317-319];tyras等所述穿梭質粒pJIR1456及pJIR1457[1988,尸/cwmW39，160-164];及Kim等人所述pAK201穿梭載體[1989,j/^/E"w>o"A/zcro6/0/55,360-365]，這些文獻的內容全部以引用方式并入本文中。產氣莢膜梭狀芽孢桿菌復制起點的移除可將穿梭載體轉變成自殺載體。舉例而言，一種穿梭質粒是pJIR418,由Sloan等人在1992,尸/wmW27,207-219闡述，該文獻以引用方式并入本文中。可產生^1(^轉化體/微克質粒DNA且對抗生素標記(例如氯霉素或紅霉素)敏感的分離物是缺失的潛在候選者。來自候選菌抹的基因組DNA隨后用作候選菌株的//c(a-毒素)基因及側接序列的長程PCR的模板。舉例而言，如下文所例示，使用產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌林13染色體以識別用于擴增編碼該a-毒素的基因的引物。隨后使用這些引物以自另一菌抹克隆a-毒素基因，所述另一菌林是CP6家禽分離物。在對PCR產物進行亞克隆后，對a-毒素基因及側接區進行測序并繪制限制性內切酶圖譜。通過側接限制酶切位點合成新的寡核苷酸引物并將兩次獨立擴增的產物克隆至適宜的自殺質粒(已經移除產氣莢膜梭狀芽孢桿菌復制起點)，例如下文所例示質粒1192-23.1中，以形成具有該缺失的期望的疫苗菌抹。通過任一本領域已知標準方法將所提供的對分離物具有特異性的自殺載體插入對應動物的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌抹中。舉例而言，這可通過電穿孔完成。當將該自殺載體被插入產氣莢膜梭狀芽孢桿菌(不具有產氣莢膜梭狀芽孢桿菌復制起點)中時，該自殺載體不能夠在細胞質中復制，且除非其成功地整合入細菌染色體中，否則不可存活。成功的整合體是可在抗生素(對應于剛剛導入的抗生素標記基因)存在下生長的生物體。盡管在下文所例示載體中采用氯霉素和/或紅霉素標記，但可采用任一本領域已知的選擇性標記基因。這些重組事件由野生型//c基因與缺失;/c基因質粒DNA的同源性形成。將所得重組細菌稱為整合體。該整合體含有在//c基因基因座受到整合的導入同源性載體的拷貝。因此，所得整合體包括戶/c基因的兩個拷貝原來的正常拷貝及導入的缺失版本。所導入抗生素抗性基因位于p/c基因的兩個拷貝之間。在戶/c基因的兩個拷貝之間可能發生極少的隨機重組事件。此重組事件可能產生兩種結果中的一種。在這兩種情形中，均已經移除介入兩個p/c基因(包括抗性基因)拷貝之間的DNA。在第一種結果中，回復該正常的或野生型//c基因進而重新得到不具有抗生素標記的初始母體菌抹。在第二種結果中，野生型p/c基因被缺失拷貝替換，產生不具有抗生素標記的期望的a-毒素缺失體構建體。從培養基中移除抗生素可使那些已經重組的細菌存活并復制。隨后，通過不存在表達野生型a-毒素的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌通常所呈現溶血現象時血瓊脂上的生長狀況來識別缺失重組克隆。接受接種的動物概言之，可產生減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌疫苗并可自其分離有用的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌野生型菌林的動物包括任一對其而言產氣莢膜梭狀芽孢桿菌感染是一問題的動物。相關脊推動物包括禽類、哺乳動物及魚，且具體而言是具有經濟和/或農業重要性的動物。下文所列舉動物是那些預期可受益于產氣莢膜梭狀芽孢桿菌疫苗和/或自其可獲得有用的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌野生型分離物者。盡管可能的情形時常是任一此疫苗包含最初自擬接受接種的動物種屬或物種分離的組份，但此并非必需條件。這些動物的非限制性列表包括那些禽類、牛、羊等家族以及水生動物(例如，可進行水產養殖和/或自野外捕獲并在銷售前于容納槽中保持存活一段時間)。這些包括魚，例如，鱒魚或鮭魚、及其它出于經濟效益而養殖或捕獲的物種。非脊推動物水生動物包括龍奸、螃蟹、軟件動物類，例如魷魚、章魚、蛤、牡蠣、muscles、扇貝等。應理解禽類可包括(例如)雞、火雞、鵝、鴨等。應理解牛可包括(例如)畜牛、肉牛、小菜牛等。應理解羊可包括(例如)羔羊(lamb)等。出于本發明的目的，應理解術語"魚"可包括但不限于魚的7WeoW分組，即，硬骨魚類。re/eoW分組包括鮭目0^/mom/orm^order)(其包括鮭科(Sa/mom^/e)及多盧形目(尸w"/ow2worder)(其包括刺臀魚科潛在魚受試者的實例包括鮭科、鯧科(Swram'&e)、鯛科(印an^e)、慈鯛科(ac/z/Wae)、刺臀魚科(Ce"frarc/nt/ae)、三線石鱸(three-LineGrunt)(三線7鳥魚(尸an2/7n'Wiipoma、及藍目艮《勺(Blue國EyedPlecostomus)(f邑琶魚(尸/ecoWomws。鮭科分類群名稱常用名緋形白鮭湖泊白鮭霍氏白鮭(Greg0肌s霍氏白鮭(Bloater)大麻哈魚(Owco勿wc/^&由)狗鮭(Chumsalmon)駝背大麻哈魚粉色鮭魚銀大麻哈魚銀鮭(CohoSalmon)20孟蘇大麻p合魚納爾卡大麻哈魚大鱗大麻哈魚真柱白鮭克4立克大麻口合魚麥奇鉤吻鱒大西洋鮭(^fl/卿sfl/fl。褐鱒(5"fl/腳frM加)褐鱒X紅點鱒".Zbwtfwfl/iV)北極紅點鮭(5Vi/vg/iVtfisfl/z/艦s)強壯紅點鮭溪紅點鮭(^fl/vg"聽s,ow"7m//s)白j汪紅點鮭花,禁、紅點鮭rtyfl/vg/f7ifis賺/附a)湖紅點Mvg/i7iMSwfl歸vcfiW)(銀色鮭魚(SilverSalmon))櫻鮭(孟蘇鮭魚(masousalmon))撒克愛鮭(SockeyeSalmon)切奴克鮭魚(chinookSalmon)圓白鮭(roundwhitefish)切喉鱒彩虹鱒大西洋鮭魚褐色鱒魚雜種虎鱒(Tigerhybrid-trout)北極嘉魚(Arcticcharr)公牛鱒溪流鱒曰本嘉魚(白斑嘉魚)花羔紅點斑鮭(Dollyvarden)(宮部紅點鮭(Miyabecharr))湖泊鱒魚河鱒鯧科的某些成員分類群名稱_常用名捷鋸魚旨(Cgwf/wn'^ocvwn^J堤海多盧費城鋸魚旨(Cg""卯r/對/s巖海；,21條故鋸鯧(Cg"^卯n'幼^WnV^fl)黑海鱸4朱沙鯧Wf/gC畫6/v/加似附)矮小沙河鱸美麗沙魚旨(D/p/g"m附/jpr附仍畫)沙河多盧金緣石斑魚rEpi7igpAg/MS黑纟彖石斑魚rEpiVigj^g/"s紅鼻鱸牙黃帶魚旨OS^/r"wwj/Aoe》e)堊魚旨(tyg/TflWfis似WMgflrtf/w)匸黃邊鼻鱸發光鯧堊多盧分類群名稱鯛科的某些成員常用名南方羊鯛羊頭，鯛(Cfltoifis簍休兔牙鯛(Xflgorfofir/iowi6o/rfg^)耳鯛(Sparusaurata)門齒鯛fiftg朋/纖f^c/im卯s)羊鯛真鯛(Sheepsheadporgy)菱體兔齒鯛(Pinfish)烏頰魚海鯛變色窄牙鯛(Scup)分類群名稱慈鯛科的某些成員常用名寬體寶麗鯛(Aequidenslatifrons)白《師王(Cichlasomanigrofasciatum)Crenichichlasp.大神仙魚(Pterophyllumscalare)莫桑比克羅非魚(Tilapiamossambica)吳郭魚(Oreochromisspp)奧利亞羅非魚(Sarotherodonaurea)藍突吝貞麗魚(Blueacara)剛果慈鯛(Congocichlid)才炎型鯛(Pikecichlid)天使魚莫桑比克口育魚類(Mozambiquemouthbreeder)羅非魚(Tilapia)金色羅非魚(GoldenTilapia)22刺臀魚科的某些成員分類群名稱常用名巖鈍鱸C4附6/卯Ztor即g對r/s)巖鱸太陽多盧(Cgw^viir/^s附acnpfer"s)日鱸(Flier)埃弗格來茲小太陽魚黑斑小日艫(五ZttMO附"gvgygZfldgr)小曰多盧〖五/fl5^0應o&g/Jg朋A^e)橫帶小曰多盧(￡7咖函^zowflf函)(Evergladespigmysunfish)奧克小太陽魚(Okefenokeepigmysunfish)帶狀小太陽魚藍點九刺日鱸(^2M2^Mte藍存太陽條暗色九刺日鱸(Jg朋度flW,/l"S^狀太陽條紅胸太陽魚(Xgpfm/s紅腹太陽魚茈太陽魚agpo附/scvflMgZ/w)藍綠鱗鰓太陽魚(Greensunfish)藍太陽魚X駝背太陽魚藍綠鱗鰓太陽魚X瓜仁太陽魚駝背太陽魚(Xgp畫'sg/66o纖)瓜仁太陽魚(Pumpkinseed)太陽魚(Xgp麵'sgii/o觸)貪食太陽魚(Warmouth)橙點太陽魚(Orange-spotted橙點太陽魚(Xgfo/m^/^/m'//^p.,、"sunfish)銥資態太陽魚(Xgpoyw/s/wflcncfei>"s)藍總魚長耳太陽魚(Xgpo/wi:s/wggflZ^iV)長耳太陽魚(Longearsunfish)紅百艮黑多盧(Mcr卯fg脂譜麼)淺灘多盧(Shoalbass)小口黑鱸(M"卯fg脂fto/(mf柳')'J、嘴鱸j趕;、黑多盧,Vn自/mpmw"m/幽s)j趕,泉纟盧大口黑纟盧(Mc/w&脂sfl/腳/to)大嘴鱸白刺蓋太陽魚(T謹ojdsfl朋"/fl"V)刺蓋太陽魚(Whitecrappie)黑刺蓋太陽魚暗刺蓋太陽魚(Blackcrappie)在另一實施例中，動物是伴侶動物或人。出于本發明的目的，應23理解術語"伴侶動物"包括所有動物一馬(馬科)、貓(貓科)、狗(犬科)、及嚙齒類動物(包括小鼠、大鼠、豚鼠、兔)、及禽類(例如，家鴒、鷚鵡)等。接受此接種的鳥類可與商業性家禽業或非商業性家禽業相關。這些包括(例如)鴨科04"a"&e),例如天鵝、鵝、及鴨；鴒科(Co/wm&^^),例如野鴒及家鴒(如馴養家鴒)；雉科(尸/ww'amWae)，例如山鵓、松雞及火雞；77^/em^e,例如家雞；鸚鵡科(尸W"a"'"e)，例如長尾鸚鵡、金剛鸚鵡(macaws)、及普通鸚鵡(例如作為寵物飼養或用于收集銷售)。雞例示于下文中。野生型分離物的來源一般而言，可使用最初自任一如上文所述相關感染動物和/或自環境分離的野生型產氣莢膜梭狀芽孢桿菌開始制備本發明的減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體。該環境包括任一含有可存活產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體和/或可存活產氣莢膜梭狀芽孢桿菌孢子的材料，包括(例如)受污染食物、土壤、水、動物墊料、糞便等。Justin等人[Aoc/zem^^y6253-6262(2002)]對來自在序列及生物化學性質方面幾乎一致的不同產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌抹的a-毒素進行了特征分析。然而，Justin等人也闡述自禽類來源(天鵝)分離的菌抹，該菌林與其它菌株相比具有呈現大程度的序列變異及底物特異性改變的a-毒素。出于此原因，相信大多數分離物當轉化成減毒形式時可產生抵抗產氣莢膜梭狀芽孢桿菌的許多其它天然菌抹的a-毒素的保護免疫性。然而，若兩分離物間的a-毒素可能發生變異，則較佳情形經常為對來自需要抗產氣莢膜梭狀芽孢桿菌疫苗的動物物種的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體進行分離及減毒。下文所例示分離物是從雞分離的并在此物種中測試。疫苗本發明的減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體通常配制成藥學上可接受的疫苗組合物。這些疫苗組合物是依照給藥途徑配制且可與活性抗原劑相容。該活性抗原劑為例如本發明的減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌A型生物體的一種或多種菌抹。視情況，該疫苗組合物也可包含一種或多種無毒性a-蛋白與這些減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌A型生物體組合。舉例而言，該疫苗組合物中所含的減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌A型生物體基本上上均為活的且可存活的，雖然對于某些特定情況，例如為使某些人或免疫缺陷(immune-compromised)動物免疫，該疫苗只含殺死的減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌A型生物體。該疫苗組合物包含生理學上相容的緩沖劑和/或鹽，視情況與佐劑和/或任選的免疫增強劑或刺激劑組合(共同施用或者連續施用，例如在接種疫苗之前或之后)。適合的免疫刺激劑包括，但不限于，細胞因子、生長因子、趨化因子(chemokines)、來自淋巴細胞、單核細胞、淋巴器官細胞的細胞培養物的上清液、細胞制劑或細胞提取物(例如金黃色葡萄球菌(&"http://^/ococc附awe^)或脂多糖制劑)、促細月包分裂劑(mitogens),或佐劑(包括小分子量藥物)。免疫刺激劑可在培育期間任何時刻卵內施用。在特定方面中，該免疫刺激劑可在含有減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌A型生物體的培養基中進行施用。施用疫苗的方法上述本發明疫苗由例如下列途徑之一或其組合注射或接種而施用經口、鼻內、非經腸、皮下、劃破、和/或肌內，以本領域已知的任何適合制劑，例如相容的緩沖劑和/或生理學上可接受的鹽水，視情況與佐劑和/或任選的免疫增強劑或刺激劑組合施用(共同施用或者連續施用，例如在接種疫苗之前或之后)。對于經口服用疫苗/接種疫苗方法，可輕易地采用本
技術領域：
中已知的任何生理學上適宜的緩沖劑或懸浮劑。另外，可將該組合物摻入(例如混合入)飲用水中或噴涂至食物顆粒上、撒施于或噴涂于玉米或其它谷物上，等等。胃腸道是產氣莢膜梭狀芽孢桿菌感染的常見位點，且因此口服也屬于一種接種方法。預計，胃腸道中本發明活減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體的存在可在胃腸道的粘膜層產生局部保護免疫應答且也可以竟爭方式用于防止野生型產氣莢膜梭狀芽孢桿菌的后續定居。對于禽類(例如家禽，包括雞、鴨、鵝等)而言，口服方法或卵內注射是特別有用的接種途徑。卵內途徑例示于下文中且自激發孵化雞來產生自動免疫及保護。由產氣莢膜梭狀芽孢桿菌表達的外源基因通過上述實例中所發展技術，將任一非天然基因(即產氣莢膜梭狀25芽孢桿菌的外源基因)視情況插入產氣莢膜梭狀芽孢桿菌的染色體DNA中。對于異種蛋白表達而言，可進行基因融合，保留側接a-毒素基因的序列、a-毒素啟動子及其信號序列。在一個實施方案中，可使用外源基因替換大部分//c基因編碼序列。插入基因下游的;/c基因的其余核苷酸是在閱讀框外，且因此不產生功能性a-毒素。或者，可將外源基因于閱讀框內插入至編碼a-毒素突變蛋白的核苷酸序列，形成a-毒素-異種蛋白融合蛋白。可通過(例如)N-末端FLAG標記序列及適當的限制酶切位點合成外源基因的寡核苷酸引物。可將該PCR產物克隆至自殺載體中；將FLAG標記及外源基因插入具有a-毒素信號序列的閱讀框內。該異種蛋白是在a-毒素啟動子控制下表達且由p/c信號序列靶向分泌。可由蛋白質印跡法(Westernblot)使用抗FLAG抗體監測上清液培養基中所分泌異種蛋白。可將任一適宜外源基因以此方式插入產氣莢膜梭狀芽孢桿菌基因組中。這些包括(例如)來自胃腸道病原體的DNA編碼抗原，包括(例如)諸如大腸桿菌、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬、勞森氏菌屬等細菌的抗原性蛋白；諸如艾美球蟲屬、等孢子球蟲屬、隱孢子蟲屬等寄生蟲的抗原性蛋白；及諸如輪狀病毒、冠狀病毒等病毒的抗原性蛋白，以免疫接種經此重組產氣莢膜梭狀芽孢桿菌治療的動物。可由此重組產氣莢膜梭狀芽孢桿菌表達的其它蛋白包括治療性蛋白或肽。視情況，這些包括胃腸道的內源性肽，包括三葉因子或任一類別的本領域已知細胞因子，例如雞IL-18等。一種此產氣莢膜梭狀芽孢桿菌構建體表達雞IL-18蛋白。含有基因融合的活細菌的施用可遞送治療劑量的IL-18至腸且因不產生a-毒素而對宿主動物相對無害。也可使用此系統表達其它治療劑。本文引用了許多參考文獻，各文獻的全部內容以引用方式并入本文中。出于說明目的，本發明包括下列具體實施例且除非另有說明，否則這些實施例并非欲限制本發明的范圍。實施例l產氣莢膜梭狀芽孢桿菌a-毒素缺失體同源載體制造用于構建產氣莢膜梭狀芽孢桿菌a-毒素缺失體的同源質粒載體l162-55-20。將該質粒摻入若干重要的元件；大腸桿菌質粒pUC18的復制區；產氣莢膜梭狀芽孢桿菌氯霉素(c^P)及紅霉素(wm^尸)抗性基因(二者也在大腸桿菌中表達)；及由特定9個氨基酸缺失滅活的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌a-毒素基因O/c)。按照下列以若干步驟制造質粒1162-55-20。首先，自產氣莢膜梭狀芽孢桿菌(菌抹CP6)的近期禽類分離物克隆p/c基因。使用產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌抹13的序列(GenbankNC003366;SEQIDNO:2)設計擬用于克隆戶/c基因的寡核香酸引物。自SigmaGenosys,Woodlands,TX購得這些及所有后續引物。定位于少;7/c基因(CPE0035)內的上游引物，即5'AGCTGCATAAGCAAAAGTTCCAACTC3'(SEQIDNO:14)對應于菌林13的核苷酸47675-47700(SEQIDNO:2)。定位于co6『基因(CPE0037)內的下游引物，即5'GCAGAAACTCTTCTTAGACCTATTCTTTTAGGC3'(SEQIDNO:15)是與菌抹13的核苷酸50597-50629互補。在長程聚合酶鏈反應(PCR)中一起使用這些引物及來自產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌株CP6的基因組DNA。可自菌抹13的已知序列(如圖1中所示)預知自上游y/7/c基因至下游co6『基因的2955個堿基對的產物。a-毒素啟動子、信號序列及;/c基因(CPE0036)編碼序列包含于此片段中，即，介于上游;^/c基因與下游co6『基因之間。隨后將PCR2955個堿基對片段克隆至產生質粒1162-52.1的克隆用載體pCR-Blunt(Invitrogen公司，Carlsbad,CA)中。自此片段(SEQIDNO:22;且對應多肽是SEQIDNO:23)測定菌抹CP6的2955個堿基對片段的;/c編碼區的核普酸序列且證實該核普酸序列與產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌抹13的p/c基因的核苷酸序列(SEQIDNO:2)基本上同源。.接下來，自穿梭質粒pJIR418克隆大腸桿菌復制區及產氣莢膜梭狀芽孢桿菌抗性基因(Sloan等人，1992,尸/w附,d27,207-219;GenebankM77169)。使用限制酶BamHI及SpeI消化質粒pJIR418并用Klenow聚合酶填充末端。大片段的連接反應產生質粒1162-45.1并恢復BamHI限制酶切位點。此質粒保留大腸桿菌復制區，但不同于pJIR418,其不含有產氣莢膜梭狀芽孢桿菌復制起點。因此，該質粒能夠在大腸桿菌中但不可在產氣莢膜梭狀芽孢桿菌中自主復制。在下一步驟中，將p/c基因的C-末端部分亞克隆至中間體質粒1162-45.1。使用BamHI及EcoRI消化質粒1162-52.1釋放一1742個堿基對片段，其含有a-毒素基因的C-末端部分，自定位于//c基因下游的唯一BamHI位點經由co6『基因至定位于母體質粒多克隆位點的EcoRI位點內的。在定位于質粒1162-45.1多克隆位點內的BamHI位點與EcoRI位點之間克隆該1742個堿基對片段。在所得質粒1162-53.7中，//c基因的C-末端部分與親本質粒的c^尸及wwAP基因是在相同轉錄取向上。在最后一步中，將該p/c基因的N-末端部分克隆至質粒1162-53.7的唯一BamHI位點。這可通過制造源自在質粒l162-52.1中亞克隆的a-毒素基因的PCR片段來完成。上游引物，即5'ggatccAGCTGCATAAGCAAAAGTTCCAACTC3'(SEQIDNO:16)與先前所述y//c引物(SEQIDNO:4)是一致的，只是包含側接BamHI位點(小寫字母)。定位于a-毒素基因內的下游引物，即5'IDNO:17)與菌株13的核苦酸48824-48857互補且包含側接BamHI限制酶切位點及間隔子核苷酸以保持閱讀框架(小寫字母)。將自PCR與這些引物及質粒1162-52-1模板DNA形成的BamHI片段克隆至質粒1162-53.7的唯一BamHI位點。分離在相同轉錄取向上含有兩個;/c基因區的質粒。此質粒1162-55.20含有具有期望的9個氨基酸缺失并在野生型毒素的ala61與asp71之間添加有一leu殘基的戶/c基因(參見圖2)。該質粒的DNA測序確認該閱讀框架及24個密碼子(編碼8個氨基酸殘基)凈缺失。實施例2產氣莢膜梭狀芽孢桿菌重組體CPERF001的構建使用下列策略將在實施例1中所構建p/c基因的缺失形式導入產氣莢膜梭狀芽孢桿菌。該同源載體l162-55.20被稱為產氣莢膜梭狀芽孢桿菌"自殺質粒"，因為其產氣莢膜梭狀芽孢桿菌復制起點已經移除。當將此質粒轉化成產氣莢膜梭狀芽孢桿菌時，其不能夠復制且不可存活。然而，倘若將經轉化細菌置于氯霉素和/或紅霉素選擇下，則質粒DNA可能因與p/c基因的同源性而被迫重組至細菌基因組中。所得重組細菌被稱為整合體。該整合體含有在//c基因基因座受到整合的導入同源載體的拷貝。因此，所得整合體含有兩個//c基因拷貝原來的正常拷貝及導入缺失形式。所導入抗性基因定位于兩個/7/c基因拷貝之間。當自該整合體去除抗生素選擇時，在兩個//c基因拷貝之間發生重組。此重組事件可能產生兩種結果中的一種。在這兩種情形中，均已經移除介入兩個戶/c基因(包括抗性基因)拷貝間的DNA。在第一種結果中，回復該正常的p/c基因從而可回收初始母體菌抹。在第二種結果中，正常的//c基因經缺失拷貝替換，產生期望的a-毒素缺失體構建體。由于缺失體菌抹的a-毒素經滅活，所以此菌抹是非溶血性的。因此，可由在血瓊脂平板上篩選非溶血性克隆來識別期望的缺失體整合體。由于期望形成所需整合體的重組事件以低頻率發生，因此關鍵是使用具有高轉化效率的母體產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌林。因此，分析產氣莢膜梭狀芽孢桿菌的若干近期禽類分離物的轉化效率。使用經輕微#~飾(闡述于下文中)的如Allen及Blaschek(4p/"ec/<2"<i五m^owmew/^/A^cro^o/ogy5(2322(1988))所述穿梭質粒pJIR418轉化這些分離物。菌抹1240呈現最高轉化效率(參見表1),9.2xl0M"轉化體/微克pJIR418質粒DNA。選擇此菌抹作為構建缺失體CPERF001的親本菌林。選擇菌抹29作為CPERF002的親本菌林。表l產氣莢膜梭狀芽孢桿菌禽類分離物的轉化效率產氣莢膜梭狀芽孢桿菌A型菌林轉化體/微克pJIR418293.6x104235.6x10212204.0x10612409.2x106CP畫2無12307.1xl035227無5230無上文所列舉野生型菌抹的來源是Dr.J.GlennSonger,Dept.ofVeterinarySciencesandMicrobiology,UniversityofArizona,Tucson,Arizona85721以1:25稀釋來自TSYC培養基(30克/公升胰酶大豆肉湯，5克/公升酵母菌提取物，0.5克/公升半胱氨酸)的過夜厭氧培養物的產氣莢膜梭狀芽29孢桿菌菌抹1240個細胞并使的生長至八6()()=0.5436。在將100毫升細胞以18，000x克離心10分鐘后，由將細胞重新懸浮于等體積的預還原蔗糖磷酸鎂("SMP"，以270mM蔗糖，1mMMgCl2，7mMNaP04，pH7.3制備)緩沖液中兩次繼而形成具有0.5毫升SMP的最終再懸浮液來制備電穿孔感受態細胞。此形成約2.0毫升最終體積。在0.2厘米吸收池中使用4微克質粒1162-55.20對若干等份的100微升細胞進行電穿孔。在1.37千伏、100奧姆電阻及50微法拉電容下使用Bio-RadGenePulserII。在電穿孔后，立刻使用2.0毫升預還原胰酶大豆酵母菌半胱氨酸培養基("TSYC"是以30克胰酶大豆肉湯、5克酵母菌提取物、0.5克半胱氨酸、950毫升水制備)稀釋細胞并在37。C下將其在厭氣瓶中培養3個小時。在回收期后，將細胞稀釋物置于TSYC+25微克/毫升氯霉素平板上。將這些平板在37。C下，于厭氣瓶中培育過夜。在過夜生長之后，觀測到每微克1162-55.20DNA平均有50個氯霉素抗性菌落。使7個推定的整合體的各菌落在非選擇性TSYC培養基中生長至出現4個連續出芽并將其置于非選擇性血瓊脂平板上。這些非選擇性原液之一即1192-31.7呈現若干非溶血性菌落。將21個這些非溶血性菌落補接(patch)于非選擇性主平板并將復制物(replica)置于TSYC+氯霉素平板上。21個菌落中有2個對氯霉素敏感。使l個氯霉素敏感性推定缺失體，即1192-32.14與1240野生型及整合體1192-31.7—起生長并置于血瓊脂平板上。1240野生型菌抹顯示清晰的(3溶血區而1192-32.14缺失體是非溶血性菌落的純凈培養物并將其重命名為CPERFOOl。其它血液平板用作主平板并將復制物置于非選擇性及選擇性培養基上。1240野生型及CPERF001均對氯霉素及紅霉素敏感。正如我們所預期，整合體1192-31.7對氯霉素及紅霉素二者均具有抗性。為了排除抗生素抗性基因存在但不在CPERF001中表達的可能性，合成用于PCR反應的對氯霉素及紅霉素基因具有特異性的PCR引物。自野生型菌株、整合體菌林及CPERFOO1菌林制備基因組DNA并將其用作抗生素基因引物的PCR反應的模板。PCR分析的結果顯示正響應僅來自自殺質粒及整合體而非母體1240或缺失體CPERF001。此確認抗性基因序列的預期損失。為了確認a-毒素基因內的缺失，由PCR使用適當的a-毒素特異性引30物擴增圍繞該缺失的1086bp區。對經擴增片段進行克隆并測序。測序結果確認自a-毒素基因的tyr62至trp70有9個氨基酸缺失及單一leu插入(參見圖2A-2C)。分析CPERF001的滅活a類毒素蛋白表達。在無氧生長6個小時以后，收集若干等份l毫升細胞并離心之。由聚丙烯酰胺凝膠電泳分析15微升未經濃縮上清液培養基并使用針對重組a-毒素蛋白的兔子多克隆抗體對其進行蛋白質印跡法分析(j/accz'"e11(12):1253-1258(1993))。結果顯示對于a類毒素蛋白而言，特異性抗體可與期望大小的蛋白反應。CPERF001是產氣莢膜梭狀芽孢桿菌A型菌抹的經基因改造缺失體。此菌林分泌產氣莢膜梭狀芽孢桿菌a-毒素的滅活類毒素形式。由于此菌林不再表達活性a-毒素但保留大部分毒素抗原性，因此其可用作疫苗以防止由產氣莢膜梭狀芽孢桿菌引起的疾病。實施例3產氣莢膜梭狀芽孢桿菌重組體CPERF002的構建為了補償產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌林29的較低轉化效率(參見上表1)，構建新的同源載體。將該新的載體摻入直接自菌抹29基因組克隆的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌序列中。預計，此可產生更有效的重組步驟。該新的載體系按照下列制造的1192-38.3。在第一步驟中，自穿梭質粒pJIR418克隆大腸桿菌復制區及產氣莢膜梭狀芽孢桿菌抗性基因(Sloan等人，尸/ay脂'd27,207(1992);GenebankM77169)。使用限制酶Ndel消化質粒pJIR418。大片段的連接反應產生質粒1192-23.1。此質粒缺少產氣莢膜梭狀芽孢桿菌復制起點，但不同于實施例l中所構建質粒l162-45.1,其保留pJIR418的完整的多克隆位點。在下一步驟中，將p/c基因的C-末端部分亞克隆至中間體質粒1192-23.l中。來自菌抹29的基因組DNA用作長程PCR的模板。擴增自BamHI位點至CPE003S基因的一部分的//c基因(a-毒素)區域。上游//c引物，即5'CTGGGATCCTGATACAGATAATAATTTCTCAAAGGAT3'(SEQIDNO:18)對應于菌林13的核苷酸48880-48916(GenbankNC003366)。CPE0038基因內的下游引物，即5'actctgcagTTGTCATATCAATTAAATTAACTATAATCCC3'(SEQIDNO:19)與菌抹13的核苷酸51244-51275互補且含有包含PstI限制酶切位點在內的側接核苷酸(小寫字母)。獲得2402個堿基對的產物并用限制酶BamHI及PstI消化。使用經BamHI及PstI消化的1192-23.l的大片段連接此片段以產生質粒l192-36.10。在最后一步驟中，由PCR克隆//c基因的N-末端部分。上游引物，即5'actgagctcCTAGACACTTTGCTTCAATATTTGGGAA3'(SEQIDNO:20)對應于菌抹13的核苷酸46513-46540且包含側接核苷酸及SacI位點(小寫字母)。下游引物，即5'NO:21)與菌抹13的核苷酸48824-48855互補且包括側接核苷酸及BamHI位點。產生2363個-威基對產物并使用SacI及BamHI限制酶消化此產物。將經消化片段與經SacI及BamHI消化的1192-36.10的大片段連接以產生質粒l192-38.3。側接l192-38.3中//cBamHI位點之區的后續測序確認了自tyr62至trp70的9個氨基酸缺失。使用質粒1192-38.3對產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌林29細胞進行電穿孔。上文顯示菌株29是以3.6xl(^個轉化體/微克pJIR418質粒DNA的效率轉化。使菌株29細胞生長并按照實施例2中對其進行電穿孔，只是在3小時回收期后使用液體選擇技術。不是平板接種而是以12毫升TSYC+25微克/毫升氯霉素稀釋若干等份的0.67毫升細胞并使其在37。C下于厭氣瓶中生長過夜。使用此修飾是因為菌林29相對于1240具有較低轉化及平板接種效率之故。在過夜生長之后，再次在選擇培養基中稀釋細胞。隨后使來自二次出芽的細胞在無選擇時傳代5次，然后將其平板接種于血瓊脂平板上。來自血瓊脂平板的菌落均為溶血性的。隨后將2個血液平板一式兩份平板接種至TSYC、TSYC+25微克/毫升氯霉素及TSYC+50微克紅霉素平板。所有菌落均對紅霉素敏感但130個菌落中僅有l個對氯霉素敏感。將此菌落1192-45.4B重命名為CPERF002。使用a-毒素特異性引物對來自CPERF002的基因組DNA進行PCR分析，顯示a-毒素陽性帶。此帶較來自野生型菌抹29DNA的對應帶更小。對氯霉素及紅霉素抗性基因具有特異性的引物不能夠擴增CPERF002DNA但自質粒1192-38.3顯示強陽性帶。對CPERF002a-毒素進行測序，確認9個氨基酸缺失(參見圖3)。分析CPERF002的滅活a類毒素蛋白表達。在無氧生長6個小時以后，收集若干等份的l毫升的細胞并離心。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分32析15微升未經濃縮上清液培養基并使用針對重組a-毒素蛋白的兔多克隆抗體對其進行蛋白質印跡法分析(racc/"e11(12):1253-1258(1993))。結果顯示對于a類毒素蛋白而言，特異性抗體可與期望大小的蛋白反應。CPERF002是產氣莢膜梭狀芽孢桿菌A型菌抹的經基因改造缺失體。此菌抹分泌產氣莢膜梭狀芽孢桿菌a-毒素的滅活類毒素形式。由于此菌抹不再表達活性a-毒素但保留大部分毒素抗原性，因此其可用作疫苗以防止由產氣莢膜梭狀芽孢桿菌引起的疾病。實施例4產氣莢膜梭狀芽孢桿菌缺失體疫苗菌林提供:對野生聖"產氣莢膜梭狀芽孢桿菌攻擊的保護的能力。將該研究的第一部分設計為測定所施用活疫苗菌林對孵化蛋的孵化率是否具有任何不利影響。實驗組的分配及安全性結果闡述于表2中。安全性結果組號*疫苗(劑量)**孵化蛋的數量(％)1CPERF001(0.8xl02)x18(90%)2CPERF001(0.8x103)17(85%)3CPERF001(0.8x104)11(55%)4CPERF001(0.8xl05;)16(80%)CPE訓02(1.9x102)16(80%)6CPERF002(1.9xl03)17(85%)7CPE訓02(1.9x104)14(70%)8CPERF002(1.9x105)12(60%)9菌株1240(1.5x103)16(80%)10菌抹29(3.7x103)13(65%)11培養基對照19(95%)12未接種對照18(90%)*每組20個蛋**在孵化18天時以卵內方式施用1OO微升劑量(IM)33x以菌落形成單位("cfu")量測每個劑量的效價。在施用103或更少劑量(組1、2、5及6)時，這些組并非較僅接種培養基的組(組11)或未經接種的組(組12)具有明顯更低的孵化率。在最低劑量時，CPERFOO1顯示與培養基對照相同且較未經接種對照組更佳的孵化率。由于較高劑量的缺失體可對蛋孵化率具有不利影響，因此該研究的有效部分僅包含每一缺失體的2個最低劑量的組。使用(野生型)產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌株激發這些組以及培養基對照烏類(組11),該菌抹CP6是在鳥有20、21及22天大時以約108cfu/毫升/只鳥經口施用。在25對小腸內損傷i行打分。、''、"'O記分壞死性腸炎1+壞死性腸&+壞死性腸炎3十壞死性腸炎4十在小腸上無NE肉眼可見損傷；腸具有正常的彈性(在打開后自動巻回)。腸壁薄且軟垂(在打開時腸保持平坦且不會巻回至正常位置)；有過量或粘稠粘液覆蓋于粘膜上或者病灶或多病灶使粘膜中度變紅或漿膜管充血。單一或少數多病灶區使腸壁變紅并肺脹；單一或少數多病灶區使腸粘膜出現潰瘍或壞死。大量多病灶區使腸粘膜出現壞死及潰瘍±粘膜表面上大量出血或出現血纖蛋白層或壞死碎屑(土耳其浴巾外觀)。具有NE肉眼可見損傷記分2+或以上的死亡動物。可依照CharlesHofacre,D.V.M.,M.A.M.,Ph.D.,UniversityofGeorgia,PoultryDiagnosticandResearchCenter,953CollegeStationRoad，Athens,GA30602對記分進行較小改動。在研究結束時對來自未經接種對照組(未受激發)的五(5)只鳥進行34尸體檢剖以確認在研究過程中未暴露于產氣莢膜梭狀芽孢桿菌。結果示于表3中。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>*在25日齡時進行尸體檢剖與組11相比，組1及組2各自的記分在統計學上明顯更低(WilcoxonExactRankSumTestp^0.0250)。組5及組6的平均記分較組1l更低但在統計學上無不同(WilcoxonExactRankSumTestp^0.2177)。依照DavidSiev所述程序[Jowna/o/Mc/en4p—W5Vato"ca/她Aotfe,第4巻,No,2，500-508(2005)]對疫苗效率進行評定。當與組ll對比時，將疫苗在降低疾病嚴重性方面的效率評定為54%(組1)、65°/。(組2)、20°/。(組5)及270/0(組6)。實施例5產氣莢膜梭狀芽孢桿菌豬缺失體的構建使用上文實施例1及實施例2中所用策略來自產氣莢膜梭狀芽孢桿菌豬菌抹構建a-毒素缺失突變體。開始，使用質粒pJIR418對來自患病豬的野外分離物進行電穿孔以評定其可轉化性。產生2104個轉化體每微克質粒DNA并對氯霉素或紅霉素敏感的分離物是缺失的候選者。來自候選菌抹的基因組DNA用作戶/c(a-毒素)基因及側接序列的長程PCR的模板。在亞克隆PCR產物之后，對a-毒素基因及、側接區進行測序并繪制限制性內切酶圖譜。通過側接限制酶切位點合成新的寡核苷酸引物并將2次獨立擴增的產物克隆至自殺質粒1192-23.1以制造如實施例1中所述27個堿基對缺失。將該豬自殺載體電穿孔至對應產氣莢膜梭狀芽孢桿菌的豬菌林并使用上文實施例2中所述方法分離缺失突變體。由血瓊脂平板上不存在(3溶血作用及由對a-毒素基因進行DNA測序來確認缺失突變體。此構建體是產氣莢膜梭狀芽孢桿菌A型菌抹的經基因改造缺失體。此菌抹分泌產氣莢膜梭狀芽孢桿菌a-毒素的滅活類毒素形式。由于此菌抹不再表達活性a-毒素但保留大部分毒素抗原性，因此其可用作疫苗以防止豬患由產氣莢膜梭狀芽孢桿菌引起的疾病。下列生物材料的培養物已經由下列國際保藏機構保藏美國典型培養物保藏中心(ATCC)10801UniversityBoulevard,Manassas,Va.20110-2209,U.S.A.,在滿足國際認可用于專利程序目的的布達佩斯微生物保藏條約要求的條件下保藏。生物保藏生物體產氣莢膜梭狀芽孢桿菌CPERF/AaToxin365-054產氣莢膜梭狀芽孢桿菌CPERF/AaToxin365-053PTA7364登記編號2006年2月7日PTA73652006年2月7曰3權利要求1.一種編碼產氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridiumperfringens)α-毒素的基本上無毒性突變蛋白的核酸分子；其中α-毒素突變蛋白包含減去至少9個連續氨基酸殘基的SEQIDNO3的氨基酸序列；且其中缺失的氨基酸殘基之一是His68。2.權利要求1的核酸分子，其中a-毒素突變蛋白包含減去至少12個連續氨基酸殘基的SEQIDNO:3的氨基酸序列；且其中缺失的氨基酸殘基之一是HiS68。3.權利要求2的核酸分子，其中a-毒素突變蛋白包含減去至少18個連續氨基酸殘基的SEQIDNO:3的氨基酸序列；且其中缺失的氨基酸殘基之一是HiS68。4.權利要求1的核酸分子，其中a-毒素突變蛋白包含減去Tyr62至Trp7。的9個連續氨基酸殘基的SEQIDNO:3。5.權利要求1的核酸分子，其包含SEQIDNO:2的核酸序列；其中該核酸分子的核苷酸268-294缺失。6.權利要求5的核酸分子，其中缺失的核苷酸被編碼單一Leu殘基的核苷酸序列替代。7.—種產氣莢膜梭狀芽孢桿菌a-毒素的基本上無毒性突變蛋白；其中a-毒素突變蛋白包含減去至少9個連續氨基酸殘基的SEQIDNO:3的氨基酸序列；且其中缺失的氨基酸殘基之一是His68。8.權利要求7的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌a-毒素的基本上無毒性突變蛋白，其中a-毒素突變蛋白包含減去至少12個連續氨基酸殘基的SEQIDNO:3的氨基酸序列；且其中缺失氨基酸殘基之一是His68。9.權利要求8的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌a-毒素的基本上無毒性突變蛋白，其中該突變蛋白包含減去至少18個連續氨基酸殘基的SEQIDNO:3的氨基酸序列；且其中缺失氨基酸殘基之一是His6s。10.權利要求7的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌a-毒素的基本上無毒性突變蛋白，其中Tyr62至Trp7()的9個連續氨基酸殘基缺失且由單一Leu殘基替代。11.一種減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體，其通過將權利要求l的核酸分子整合入未減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體的染色體中而構建。12.權利要求ll的減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體，其是基本上無毒的。13.權利要求ll的減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體，其中核酸分子位于染色體上的位置與編碼未減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌中存在的野生型a-毒素的核酸分子的位置同源。14.權利要求ll的減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體，其是A型產氣莢膜梭狀芽孢桿菌。15.權利要求ll的減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體，其中用于構建的未減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌從宿主動物分離，所述宿主動物是哺乳動物或禽類。16.權利要求15的減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體，其中哺乳動物選自牛、羊和豬。17.權利要求15的減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體，其中禽類是雞、火雞、鵝、鴨、天鵝、野鴒、家鴒、松雞或山鵓。18.—種疫苗，其包含權利要求ll的減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體。19.權利要求18的疫苗，其進一步包含一種或多種下列物質藥學上可接受的緩沖劑、賦形劑或佐劑。20.—種在動物中誘發針對產氣莢膜梭狀芽孢桿菌的免疫性的方法，其包括給動物施用免疫有效劑量的權利要求18的疫苗。21.權利要求20的方法，其中由下列途徑的一種或多種施用該疫苗經口、肌內、靜脈內、皮內、皮下或鼻內。22.權利要求20的方法，其中疫苗施于動物銅料的表面上。23.權利要求20的方法，其中疫苗噴灑于動物以便于經口給藥。24.—種包含權利要求18的疫苗的動物飼料。25.權利要求ll的減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體，其包含至少一個編碼非產氣莢膜梭狀芽孢桿菌多肽的基因。26.權利要求25的減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體，其中非產氣莢膜梭狀芽孢桿菌多肽是非細菌多肽。27.權利要求26的減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體，其中非細菌多肽是禽類或哺乳動物多肽。28.權利要求27的減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體，其中非細菌多肽是禽類多肽。29.權利要求27的減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體，其中非細菌多肽是細胞因子。30.權利要求29的減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體，其中細胞因子是雞IL-18。31.—種選擇性地與抗原決定部位結合的抗體，所述抗原決定部位存在于產氣莢膜梭狀芽孢桿菌oc-毒素中，但從權利要求11的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌a-毒素的基本上無毒性突變蛋白中缺失，其中所述抗體可區分所述基本上無毒性突變蛋白與野生型產氣莢膜梭狀芽孢桿菌a-毒素。32.—種檢測試劑盒，其用于識別受試動物是否已天然感染產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體，其包含權利要求31的抗體。33.—種識別已天然感染產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體的動物與用減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體接種的動物的方法，該方法包括(a)使該動物的流體試樣與權利要求32的抗體接觸，(b)測定該抗體是否與該流體試樣反應；其中當該抗體與該流體試樣反應時，該動物^皮識別為已天然感染產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體的動物。34.—種產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體，它是具有ATCC保藏號PTA7364的CPERF/AaToxin365-054。35.—種產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體，它是具有ATCC保藏號PTA7365的CPERF/AaToxin365-053。全文摘要本發明公開了表達基本上無毒性α-毒素的減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridiumperfringens)生物體。所表達的α-毒素是一種缺失突變蛋白，相對于產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌株13的成熟α-毒素的α-毒素，缺少包含His₆₈的至少9個連續氨基酸殘基。本發明也公開編碼這些突變蛋白的減毒生物體以及這些減毒生物體作為疫苗的用途。文檔編號A61K39/08GK101489584SQ200780022596公開日2009年7月22日申請日期2007年4月12日優先權日2006年4月17日發明者G·彼得森,M·D·庫克朗,R·辛尼克,S·V·賴爾申請人:先靈-普勞有限公司