細霉素衍生物的制作方法

專利名稱：細霉素衍生物的制作方法
技術領域：
本發明涉及新穎的細霉素(leptomycin)衍生物及其治療用途。更特別
的細霉素衍生物，并i該、相應的結合物包括通過il接體結合;所述細胞 結合劑的所述細霉素衍生物。所述結合物提供能夠在體內被活化和釋放 的治療劑，并且以靶向的方式遞送到特定細胞群。
背景技術：
已出現許多涉及用單克隆抗體-藥物結合物靶向腫瘤細胞的報告 {Sela et al, Immunoconjugates,第189-216頁(C. Vogel, ed. 1987); Ghose et al, Targeted Drugs,第1-22頁(E. Goldberg, ed. 1983); Diener et al, Antibody Mediated Delivery Systems,第1-23頁(J. Rodwell, ed. 1988); Pietersz et al, Antibody Mediated Delivery Systems,第 25-53 頁 (J, Rodwell, ed. 1988); Bumol et al, Antibody Mediated Delivery Systems,第 55-79頁(J. Rodwell, ed. 1988); G.A. Pietersz & K.Krauer, 2 J. Drug Targeting, 183-215 (1994); R. V. J. Chari, 31 Adv. Drug Delivery Revs,， 89-104 (1998); W.A. Blattler & R.V丄Chari, in Anticancer Agents, Frontiers in Cancer Chemotherapy, 317-338, ACS Symposium Series 796; 以及I. Ojima et al eds, American Chemical Society 2001}。細月包毒藥物例 如甲氨蝶呤、柔紅霉素、多柔比星、長春新堿、長春堿、美法侖、絲裂 霉素C 、苯丁酸氮芥、刺孢霉素(calicheamicin)和maytansinoids已結合 于多種鼠科單克隆抗體。在某些情況下，該藥物分子通過中間載體分子 連接于抗體分子，該中間載體分子例如血清白蛋白{Garnett et al, 46 Cancer Res, 2407-2412 (1986); Ohkawa et al, 23 Cancer Immunol. Immunother. 81-86 (1986); Endo et al, 47 Cancer Res. 1076-1080 (1980)}、 右旋糖酐(Hurwitz et al, 2 Appl. Biochem. 25-35 (1980); Manabi et al， 34 Biochem. Pharmacol. 289-291 (1985); Dillman et al, 46 Cancer Res. 4886-4891 (1986);以及Shoval et al, 85 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 8276-8280 (1988)}、或者聚谷氨酸(Tsukada et al, 73 J. Natl. Cane. Inst.721-729 (1984); Kato et al, 27 J. Med. Chem. 1602-1607 (1984); Tsukada et al, 52 Br. J. Cancer 111-116 (1985)}。
目前有大量的連接體可用于制備此類免疫結合物，包括能裂解的和 不能裂解的連接體。然而，體外細胞毒試驗已顯示，抗體-藥物結合物4艮 少達到與游離的未結合的藥物相同的細胞毒效能。這提示藥物分子從結 合的抗體釋放的機制是非常低效的。免疫毒素領域的早期著作顯示，通
過單克隆抗體與催化活性蛋白毒素之間的二硫鍵形成的結合物比含有 其它連接體的結合物更具毒性{Lambert et al, 260 J. Biol. Chem. 12035-12041 (1985); Lambert et al, Immunotoxins 175-209 (A. Frankel, ed. 1988); Ghetieetal, 48 Cancer Res. 2610-2617 (1988)}。此種改善的細胞 毒性要歸因于高的還原型谷胱甘肽的細胞內濃度造成該抗體分子與該 毒素之間二硫鍵的有效裂解。Maytansinoids和刺孢霉素是高細胞毒性的 藥物的最初實例，它們通過二硫鍵連接到單克隆抗體。已顯示這些藥物 的抗體結合物在體外具有高的效能，以及在小鼠中的人腫瘤移植物模型 中特別的抗胂瘤活性(R. V. J. Chari et al., 52 Cancer Res" 127-131 (1992); C. Liu et al., 93, Proc. Natl. Acad. Sci.， 8618-8623 (1996); L.M. Hinman et al., 53, Cancer Res,, 3536-3542 (1993);以及P.R. Hamann et al, 13, BioConjugate Chem.， 40-46 (2002)}。
細霉素B:
OH O
是一種最初從鏈霉菌屬(Steptomyces spp.)中分離的天然產物，如US 4,771,070和US 4,792，522中所報道的。它在篩選抗微生物活性時被最初 識別，并隨后^皮鑒定為抗腫瘤劑(Komiyama et al., J.Antibiotics 1985, 38(3), 427-429和US 2003/0162740)。在分子水平，細霉素B作為核轉 出受體CRM1的抑制劑，其結合并影響"載貨蛋白"的核轉運。在細胞水 平，細霉素B通過在細胞循環的Gl和G2相末端抑制細胞而起效(Kalesse etal.，Synthesis2002, 8, 981-1003)。然而，其對哺乳動物細胞的極度毒性
7(Hamamoto et al., J. Antibiotics 1983， 36(6), 639-645)使得它不可能用于 臨床。因此，非常希望減小細霉素衍生物對非粑細胞的毒性。
通過經耙向遞送到腫瘤位置而改變體內分布，導致對非靶組織的低 毒性，由此降低全身毒性而可以大大改善細霉素衍生物的治療作用。為 了實現該目標，本發明人考慮制備細霉素B衍生物與特異性靶向腫瘤細 胞的細胞結合劑的結合物，為的是呈現高度粑向特異性細胞毒性。
發明概述
本發明目的是提供含有連接基團的細霉素衍生物，所述連接基團可 共價結合于細胞結合劑，并且該相應的結合物包括通過連接體結合于所 述細胞結合劑的所述細霉素衍生物。所述結合物提供能夠在體內被活化 和釋放的治療劑，并且以耙向的方式遞送到特定細胞群。為了進一步增 強水溶性，可將任選的聚乙二醇間隔基導入到該連接基團中。
本發明化合物可用于細胞毒結合物，在該結合物中細胞結合劑與本 發明的一種或多種化合物連接。細胞結合劑包括抗體及其片斷、干擾素 類、淋巴因子類、維生素類、激素類和生長因子類。還提供了含有此類 結合物的藥物組合物。
該細胞毒結合物可用于通過施用有效量的上述藥物組合物來治療 受試者的方法。根據所選細胞結合劑結合的細胞類型，許多疾病可以體 內、離體或體外治療。此類疾病包括例如多種癌癥的治療，包括淋巴瘤、 白血病、肺癌、乳腺癌、結腸癌、前列腺癌、腎癌、胰腺癌等。
因此，提供了通過結合到特異性細胞結合劑的方式而可用于靶向特 定細胞類型的細霉素衍生物。
附圖簡述


圖1顯示了實施例6的結合物huC242-SSNPB-細霉素衍生物的體外
細胞毒性和特異性。
發明詳述
本發明人發現能夠連接到細胞結合劑的細霉素衍生物，從而通過經 粑向將該衍生物遞送到腫瘤位置而改變體內分布，導致對非靶組織的低 毒性，由此降低全身毒性而改善此類衍生物的治療作用。為了實現此目標，本發明人合成示例性的細霉素衍生物，其包括使 細霉素衍生物結合到細胞結合劑的連接基團。該連接基團可含有聚乙二 醇間隔基。該連接基團用于結合細胞結合劑，并且優選包括二硫鍵或硫 化物(或者本文稱為硫醚)鍵。
以前已顯示，使用可裂解鍵例如二硫鍵，高度細胞毒藥物連接到抗 體確保細胞內全部活性藥物的釋放，并且此類結合物以抗原特異性方式
呈細胞毒性(R, V. J. Chari et al, 52 Cancer Res. 127-131 (1992); R.V.J. Chari etal., 55 Cancer Res. 4079-4084 (1995);以及美國專利5,208,020和 5,475,092}。在本發明中，本發明人描述了細霉素衍生物的合成，它們 結合到單克隆抗體的方法，以及測定此類結合物的體外細胞毒性和特異 性的方法。因此，本發明提供了制備涉及清除患病細胞或異常細胞的治 療劑的有用化合物，所述的細胞^皮殺死或溶解，它們例如腫瘤細胞、病 毒感染的細胞、微生物感染的細胞、寄生蟲感染的細胞、自身免疫細胞 (產生自身抗體的細胞)、活化的細胞(與移植物排斥或移植物抗宿主疾病 有關的那些)或者任何其它類型的患病細胞或異常細胞，同時顯示出最小 的副作用。
因此，本發明教導了細霉素衍生物的合成，該細霉素衍生物可化學 連接到細胞結合劑，并且在保護基團釋放時仍維持母體細霉素衍生物的 高度細胞毒性。當與細胞結合劑連接時，這些化合物對細胞結合劑結合 的細胞是呈細胞毒性的，并且對非靶細胞具有低得多的毒性。
本發明的細霉素衍生物
本發明的細霉素衍生物包括能夠使該衍生物結合到細胞結合劑的 連接基團。
根據本發明，"細霉素衍生物"是指如Kalesseetal在Synthesis 2002 8, 981-1003中所定義的細霉素家族的成員，并且包括細霉素類例如細 霉素A和細霉素B, callystatin類,ratj adone類例如ratj adone A和ratj adone B， anguinomycin類例長口 anguinomycin A、 B、 C、 D, kasusamycin類, leptolstatin， leptofuranin類例戈口 leptofumnin A、 B、 C、 D。細霉素A和 B的衍生物是優選的。
為了使該衍生物連接到細胞結合劑，該衍生物必需包括允許該衍生 物通過連接體例如二硫鍵、硫化物(或者本文稱為硫醚)鍵、酸不穩定的基團、光不穩定的基團、肽酶不穩定的基團或酯酶不穩定的基團連接到 細胞結合劑的部分(連接基團)。制備該衍生物以便它們含有通過例如二 硫鍵、硫醚鍵、酸不穩定的基團、光不穩定的基團、肽酶不穩定的基團 或酯酶不穩定的基團使該細霉素衍生物連接到細胞結合劑所必需的部 分。為了進一步增強在水溶液中的溶解度，該連接基團可含有聚乙二醇 間隔基。
優選地，使用硫化物連接體或二硫化物連接體，因為所靶向的細胞 的還原環境導至該硫化物或二硫化物的裂解并釋放具有相關的細胞毒 性增加的該衍生物。
根據優選的方面，本發明提供了細霉素衍生物，其中的末端羰基官 能團代表了能夠使該衍生物連接到細胞結合劑的部分。該連接部分可含 有聚乙二醇間隔基。實例包括能夠通過二硫鍵、硫醚鍵、酸不穩定的基 團、光不穩定的基團、肽酶不穩定的基團或酯酶不穩定的基團連接的部
分，并且是本領域公知的(參見，例如，美國專利5,846,545,其通過引
用并入本文}。優選的部分是能夠通過二硫鍵例如碌u醇或二硫化物連接
的那些。可以使用含有任何末端離去基團的混合的二疏化物，如谷胱甘 肽，烷硫基如甲硫基、吡啶基硫基、芳基硫基、硝基吡啶基硫基、羥基 羰基吡啶基硫基、(硝基)羥基羰基吡啶基硫基等，只要此類二硫化物能 夠進行使該衍生物與細胞結合劑偶合的二硫化物-交換反應。 更具體的，本發明衍生物是式(I):
OH O
T—S—(Z)n—Y—X
R17
(I)
其中
Ra和Ra，是H或-Alk;優選地Ra是-Alk,優選曱基，并且Ra，是H; R17是任選被OR、 CN、 NRR，、全氟烷基取代的烷基；優選地， R17是烷基，更優選曱基或乙基；
R9是任選被OR、 CN、 NRR，、全氟烷基取代的烷基；優選地，R9
10是烷基，更優選甲基；
X是-O-或-NR-;優選地，X是-NR-;
Y是-U-、 -NR-U-、 -O-U-、 -NR-CO-U-、 -U-NR-CO-、 -U-CO-、 -CO-U-;
優選地，當X是—O畫時，Y是一U誦、畫NR誦U畫、國U國NR陽CO-;
其中 U選自直鏈或支鏈的—Alk畫、-Alk(OCH2CH2)m-、 -(OCH2CH2)m-Alk-、 -Alk(OCH2CH2)m-Alk-、 -(OCH2CH2)m-、-環烷基-、-雜環基-、-環烷基-Alk-、 -Alk-環烷基-、-雜環基-Alk-、 -Alk-雜環基-;
其中m是選自l至2000的整數；
優選地，U是直鏈或支鏈的-Alk-，
Z是國Alk-;
n是0或1;優選地n是0;
T表示H,硫醇保護基團例如Ac、 R4或SR4，其中R^表示H、曱 基、Alk、環烷基、任選取代的芳基或雜環基，或者T表示
OH O
R17
其中
Ra、 Ra，、 R17、 R9、 X、 Y、 Z、 n定義如上文； 優選地，T是H或SRp其中Ri表示Alk,更優選曱基； R、 R，相同或不同，是H或烷基；
Alk表示直鏈或支鏈的烷基；優選地Alk表示(-(CH2-q(CH3)q)p-,其 中p表示l至10的整數；并且q表示0至2的整數；優選地，Alk表示 —(CH2)-或-C(CH3)r。
或其藥學可接受的鹽、水合物、或水合的鹽，或者這些化合物的多
晶型晶體結構或其光學異構體、外消旋體、非對映體或對映體。 優選的化合物可選自
(2E,10E,12E,16Z,18EHR)-6-羥基-3,5,7,9,11,15,17-七甲基 -19-((2S,3S)-3-曱基-6-氧代-3,6- 二氫-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷 -2,10,12,16,18-五烯酸的(2-甲基硫烷基-乙基)-酰胺
雙-[(2E,10E，12E,16Z,18E)-(R)-6-羥基-3,5,7,9,11,15,17-七甲基-19-((2S,3S)-3-甲基-6-氧代-3,6-二氫-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷-2,10,12,16,18-五烯酸的(2-巰乙基)-酰胺]
(2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-羥基-3,5,7,9,11,15，17-七甲基陽19-((2S,3S)-3-甲基-6-氧代-3,6- 二氫畫2H國吡喃-2-基)-8-氧代國十九烷-2,10,12,16,18-五烯酸的(2-巰基-乙基)-酰胺
(2E,10E,12E，16Z,18E)-(R)-6-羥基國3,5,7，9,11,15,17-七曱基-19-((2S,3S)-3-甲基-6-氧代-3,6- 二氬-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷-2,10，12,16,18-五烯酸的(2-曱基二硫烷基-乙基)-酰胺
(2E,10E,12E，16Z,18E)-(R)-6-羥基-3,5,7,9,11,15,17-七曱基-19-((2S,3S)-3-甲基-6-氧代-3,6- 二氫-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷-2， 10,12,16,18-五烯酸的(2-甲基-2-曱基二硫烷基-丙基)-酰胺
(2E,10E,12E,16Z,18E)畫(R)畫6國羥基-3，5,7,9，11,15，17-七甲基-19-((2S,3S)-3-甲基-6-氧代-3,6- 二氫-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷-2,10,12,16,18-五烯酸的(2-巰基-2-甲基-丙基)-酰胺
或其藥學可接受的鹽、水合物、或水合的鹽，或者這些化合物的多晶型晶體結構或其光學異構體、外消旋體、非對映體或對映體。
如定義于本文的，烷基包括直鏈或支鏈的d-C2o烷基。直鏈烷基的實例包括曱基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基。支鏈的烷基的實例包括異丙基、異丁基、仲丁基、叔丁基、異戊基和l-乙基丙基。環烷基即環狀烷基的實例包括環丙基、環丁基、環戊基和環己基。芳基的實例包括苯基和萘基。取代的芳基的實例包括被以下基團取代的例如苯基或萘基的芳基烷基基團，卣素例如Cl、 Br、 F，硝基，氨基，磺酸基，羧酸基，羥基和烷氧基。雜環是指任選的芳族環，其包含一個或多個選自0、 N和S的雜原子，實例包括呋喃基、吡咯基(pyrrollyl)、吡啶基、(例如，2-取代的嘧啶基團)和p塞吩。
可以對本發明的含有疏化物或二硫化物的或者含有巰基的衍生物評價它們在體外培養條件下抑制各種不需要的細胞系增殖的能力。細胞系例如Ramos細胞系和HL60可容易地用于評l介這些化合物的細胞毒性。可以使待評價的細胞暴露于所述化合物24小時，再通過已知的方法直接分析測定細胞的生存分數。然后可從這些分析的結果計算IC5Q值。
如用于本文的，表達"能連接到細胞結合劑"是指包含至少一個連接基團或其前體的細霉素衍生物，所述至少一個連接基團或其前體適合于
12使所述衍生物結合到細胞結合劑；優選的連接基團是硫醇、硫化物或二硫化物鍵，或其前體。
如用于本文的，表達"連接到細胞結合劑"是指包含至少 一種通過適宜的連接基團或其前體結合到細胞結合劑的細霉素衍生物的結合物分
子；優選的連接基團是硫醇、硫化物或二硫化物鍵，或其前體。
如用于本文的，術語"患者"是指動物例如供育種、陪伴或保存目的的有價值的動物，或者優選人或人類兒童，其罹患或者可能罹患一種或
多種本文所述的疾病和病癥。
如用于本文的，"治療有效量"是指本發明化合物有效預防、減輕、消除、治療或控制本文所述疾病和病癥的癥狀的量。術語"控制"意指其中可以有本文所述疾病和病癥的進展的緩解、中斷、阻止或中止的所有
的進程，但是不是必然指所有疾病和病癥的癥狀的全部消除，并且欲意包括預防性治療。
如用于本文的，術語"藥學可接受的"是指這樣的化合物、材料、賦形劑、組合物或劑型，它們在合理的醫學判斷范圍內，它們適合于與人類和動物的組織接觸而無過度的毒性、刺激性、過敏反應或與合理的利益/風險比相稱的其它疑難并發癥。
如用于本文的，"藥學可接受的鹽"是指所公開化合物的衍生物，其中所述的母體化合物通過制備其酸式鹽或堿式鹽而被修飾。藥學可接受的鹽包括例如從非毒性無機或有機酸形成的本發明化合物常規的非毒性鹽或季銨鹽。例如，此類常規的非毒性鹽包括從無機酸例如鹽酸、氬
溴酸、硫酸、氨基石黃酸、磷酸、硝酸等得到的那些；以及從有機酸例如乙酸、丙酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、甲磺酸、苯磺酸、葡萄糖醛酸、谷氨酸、苯甲酸、水楊酸、曱苯磺酸、草酸、富馬酸、馬來酸、乳酸等制備的鹽。其它加成鹽包括銨鹽例如氨丁三醇鹽、葡甲胺鹽、吡咯乙醇(epolamine)鹽等，金屬鹽例如鈉鹽、鉀鹽、4丐鹽、鋅鹽或鎂鹽。
本發明藥學可接受的鹽可以從含有堿性或酸性部分的母體化合物通過常規化學方法合成。通常，此類鹽可以通過使這些化合物的游離酸或堿形式與化學計量的適宜的堿或酸在水中或在有機溶劑中或在此兩者的混合物中反應來制備。 一般地，非水介質如醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈是優選的。適宜的鹽的列表可在Remington'sPharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA,1985,p. 1418中找到，其公開通過引用并入本文。
根據再進一步的目的，本發明還涉及制備本發明化合物的方法。
本發明的化合物和方法可以以本領域技術人員公知的多種途徑制備。所述化合物可以例如通過使用或改編下文描述的方法來合成，或者如本領域技術人員理解的根據它們的變化形式來合成。對于本領域技術人員而言，適宜的修飾和取代將會是容易地顯而易見并且是公知的，或者可以容易地從科技文獻獲得的。
特別是，此類化合物可從R.C. Larock, Comprehensive OrganicTransformations, Wiley-VCH Publishers, 1999中找到。
應理解，本發明化合物可含有一個或多個不對稱取代的碳原子，并且可以以光學活性或外消旋形式分離。因此，意圖包括一種結構的全部手性的、非對映體的、外消旋的形式以及全部幾何異構形式，除非特別指出了具體的立體化學或異構體形式。本領域公知如何制備和分離此類光學活性形式。例如，立體異構體的混合物可以通過標準技術分離，該標準技術包括，但不限于，外消旋形式的拆分，正相、反相和手性色譜層析，優選鹽形成、重結晶等；或者通過從手性原料手性合成或通過靶手性中心的有計劃合成。
本發明化合物可通過多種合成路線來制備。試劑和原料是可商購的，或者是通過本領域普通技術人員根據公知技術容易合成的。全部取代基，除非另有指明，均如前文所定義。
在下文描述的反應中，可能需要保護反應性官能團，例如羥基、氨基、亞胺基、硫代或羧基，其中這些在終產物中是期望的，以避免它們不希望的參與反應。常規保護基團可以根據標準操作使用，例如參見T.W.Greene禾口P. G. M. Wuts在/Vofec"ve Oow/w (9rgawz'c C7ze柳/Wry, 3rded.， John Wiley and Sons, 1999中；J. F. W. McOmie在尸ro化c"ve Oow/wCVgam'c S聲/ze^， Plenum Press, 1973中。
一些反應可以在石咸存在下進行。對于在此反應中所用的堿的性質無特別的限制，并且常規用于此類反應的任何堿均可在此同等使用，只要其對分子的其它部分沒有不良作用。適宜的堿的實例包括氫氧化鈉，碳酸鉀，三乙胺，堿金屬氫化物如氫化鈉和氫化鉀；烷基鋰化合物如曱基鋰和丁基鋰；以及堿金屬醇鹽如曱醇鈉和乙醇鈉。
通常，反應在適宜的溶劑中進行。可以使用各種溶劑，只要它對反應或者對有關的試劑無不良作用。適宜的溶劑的實例包括烴，其可以是芳香族的、脂肪族的或環狀脂肪族的烴，例如己烷、環己烷、苯、曱苯和二甲苯；酰胺類例如二甲基酰胺，醇類例如乙醇和甲醇，以及醚類例如二乙基醚和四氫p夫喃。
該反應可以是寬泛的溫度范圍內進行。 一般地，我們發現有利地在0。C至150。C的溫度(更優選從約室溫至100。C)下進行該反應。反應所需時間還可以寬泛變化，這取決于許多因素，特別是反應溫度以及試劑的性質。然而，只要該反應在上述優選條件下是有效的，3小時至20小時的時間通常是足夠的。
由此制備的化合物可以通過常規方式從反應混合物中回收。例如，可以通過從反應混合物中蒸餾出溶劑來回收該化合物，或者，如果需要，在從反應混合物中蒸餾出溶劑之后，將殘余物傾入到水中，接著用水不混溶的有機溶劑萃取，再從該萃取物中蒸餾出溶劑。另外，如果需要，該產物進以進一步通過多種公知技術來純化，所述的公知技術例如重結晶、再沉淀或多種色譜技術，特別是柱色譜法或者制備型薄層色譜法。
制備本發明式(I)化合物的方法包括使式(n)和(in)相應化合物反應
的步驟
其中Ra、 Ra，、 R17、 R9、 X、 Y、 Z、 T、 n定義如式(I)。
一般地，此反應可以在常規偶合試劑存在下進行，該偶合試劑包括抑制外消旋作用的試劑例如HOBT,和/或用于將羧酸活化成酰胺或酯形式的脫水劑例如DIC、 DCC。
T—S—(Z)n—Y—XH
(III)典型地，此反應可以在適宜的有機溶劑例如二氯曱烷中進行。
當式(I)中T是H時，該反應可另選地用N-酰化劑例如新戊酰氯在堿包括有機堿如三乙胺存在下進行。
另選地，當式(I)中T是H時，式(I)化合物還可以從式(I)相應化合物(其中T是S-R1)在二硫鍵的還原劑如三烷基膦并且更特別地是TCEP存在下獲得。此反應通常可以在水性介質例如有機溶劑和水的混合物如THF/水中進行。
式(I)化合物的二聚體可以通過使式(II)相應化合物與式(IV)相應化合物
HX-Y-(Z)n-S-S-(Z)n-Y-XH (IV)
在常規偶合試劑存在下反應來制備，該偶合試劑包括抑制外消旋作用的試劑例如HOBT,和/或用于將羧酸活化成酰胺或酯形式的脫水劑例如DIC、 DCC。
典型地，此反應可以在適宜的有機溶劑例如二氯甲烷中進行。該方法還包括分離所得產物的其它步驟。
本發明還涉及細霉素衍生物結合物，其包含通過連接體連接到一種或多種本發明細霉素衍生物的細胞結合劑，所述的連接體包含所述的連接基團。
優選地，細胞結合劑是抗體或其片斷。優選地，所述的連接體包含-S-或-s-s-基團。
細胞結合劑的制備
細胞結合劑可以是目前已知或成為已知的任何種類，并且包括肽類和非肽類。 一般地，這些可以是含有至少一個結合位點的抗體(特別是單
克隆抗體)或抗體片斷，淋巴因子類、激素類、生長因子類、營養素轉運分子(例如轉鐵蛋白)，或者任何其它細胞結合分子或物質。
可以使用的細胞結合劑的更具體的實例包括-單克隆抗體；-單鏈抗體j
-抗體片斷例如Fab、 Fab'、 F(ab')2和Fv (Parham， 131 J. Immunol.2895-2902 (1983); Spring et al, 113 J. Immunol. 470-478 (1974); Nisonoffet al, 89 Arch. Biochem. Biophys. 230-244 (I960)};
-干擾素類；
-肽類；
-淋巴因子類例如IL-2, IL-3, IL-4, IL畫6;
國激素類例如胰島素、TRH (促曱狀腺激素釋放激素)、MSH (黑色素細胞刺激素)、甾體激素類例如雄激素類和雌激素類；
-生長因子和集落刺激因子例如EGF、 TGFa、胰島素樣生長因子(IGF畫I、 IGF-II) G國CSF、 M畫CSF和GM-CSF {Burgess, 5 Immunology Today155-158 (1984)};維生素類例如葉酸鹽；以及
-轉鐵蛋白{O'Keefe et al, 260 J. Biol. Chem. 932-937 (1985)}。
單克隆抗體技術容許產以特異性單克隆抗體的形式產生極具選擇性的細胞結合劑。本領域特別公知的是產生單克隆抗體的技術，該單克隆抗體是通過用感興趣的抗原例如完整的靶細胞、從該靶細胞分離的抗原、全病毒、減毒病毒和病毒蛋白例如病毒外殼蛋白來免疫小鼠、大鼠、侖鼠或任何其它哺乳動物而產生的。
適宜的細胞結合劑的選擇是取決于被靶向的特定細胞群的選擇事項，但是如果能得到適宜的，通常單克隆抗體是優選的。
例如，單克隆抗體MY9是一種鼠科IgGi抗體，其特異性結合于CD33抗原{J.D. Griffin et al 8 Leukemia Res., 521 (1984)},并且如果該粑細胞如在急性髓性白血病(AML)的疾病中表達CD33,其可;^皮使用。類似地，單克隆抗體抗-B4是一種鼠科IgCh抗體，其在B細胞上結合于CD19抗原{Nadler et al, 131 J. Immunol. 244-250 (1983)}，并且如果該靶細胞是B細胞或者是例如在非何杰金氏淋巴瘤或慢性成淋巴細胞性白血病中表達此抗原的患病細胞，其可祐 使用。
另夕卜，結合于骨髓細胞的GM-CSF可以用作針對來自急性骨髓性白血病的患病細胞的細胞結合劑。結合活化的T-細胞的IL-2可用于預防移植移植物排斥，用于治療和預防移植物-抗-宿主疾病，以及用于治療急性T-細胞性白血病。結合黑素細胞的MSH可用于治療黑素瘤。
結合物的制備
衍生物和細胞結合劑的結合物可以使用目前已知或者日后開發的任何技術形成。 一般地，本發明結合物的制備方法包括使本發明細霉素 衍生物與細胞結合劑在試劑的存在下反應的步驟，所述的試劑包含對衍 生物的連接基團和細胞結合劑有活性的官能團，以便該衍生物和細胞結 合劑通過包含所述連接基團的連接體連接在一起。優選地，所述的連接 體包含硫化物鍵或二硫化物鍵。
衍生物可以制備成含有游離氨基，然后通過酸不穩定的連接體或者 通過光不穩定的連接體連接到抗體或其它細胞結合劑。該衍生物可以與 具有適宜序列的肽縮合，接著連接到細胞結合劑以產生對肽酶不穩定的 連接體。細胞毒性化合物可以制備成含有伯羥基基團，其可以被琥珀酰 化并連接到細胞結合劑以產生結合物，該結合物可以通過細胞內酯酶裂 解以釋放游離細霉素衍生物。優選地，該衍生物合成成含有游離的或受
保護的硫醇基團，有或沒有含PEG的間隔基，然后一種或多種含硫化物、
二硫化物或硫醇的衍生物各自通過二硫鍵或硫醚鍵共價連接到細胞結 合劑。
本發明代表性的結合物是細霉素衍生物與抗體、抗體片斷、表皮生
長因子(EGF)、黑色素細胞刺激素(MSH)、促曱狀腺激素(TSH)、雌激素、 雌激素類似物、雄激素和雄激素類似物的結合物。
下文描述了制備細霉素衍生物和細胞結合劑的各種結合物的代表
性實例。
二硫化物連接體抗體huMy-9-6是定向抑制CD33抗原的鼠科單克 隆抗體My-9-6的遺傳性人源化形式，其發現于人骨髓細胞的表面，包括 急性髓性白血病(AML)的多數案例(E丄Favaloro, K.F. Bradstock, A. Kabml, P. Grimsley & M.C. Berndt, Disease Markers, 5(4):215 (1987); M.G. Hoffee, D. Tavares, R丄Lutz, Robert J., PCT國際申請(2004) WO 2004043344)。 My-9-6可以用于結合物的制備。用N-琥珀酰亞胺基-3-耽 啶基二硫代丙酸酯如前所述修飾該抗體(J. Carlsson, H. Drevin & R. Axen， Biochem. J., 173:723 (1978)},每抗體分子平均導入4個吡啶基二硫 代基團。使該修飾的抗體與含有硫醇的細霉素衍生物反應，產生二硫化 物-連接的結合物。
硫醚連接體本發明含有硫醇的衍生物可以如前所述通過硫醚鍵連 接到抗體和其它細胞結合劑(美國專利US5,208，020)。該抗體或其它細胞 結合劑可以用已知的或可商購的例如以下的化合物修飾N-硫代琥珀酰亞胺基4-(5-硝基-2-p比啶基-二硫代)丁酸酯(SSNPB)、 N-琥珀酰亞胺基 4-(馬來酰亞胺基甲基)環己烷-羧酸酯(SMCC)、 N-琥珀酰亞胺基-4-(N-馬 來酰亞胺基曱基)-環己烷-l-羧基-(6-氨基己酸酯(amidocaproate)),其 為SMCC的"長鏈"類似物(LC-SMCC)。這些交聯試劑形成不可裂解的得 自基于馬來酰亞胺基部分的連接體。
包含基于卣代乙酰基部分的交聯試劑包括N-琥珀酰亞胺基-4-(碘 乙酰基)-氨基苯曱酸酯(SIAB)、 N-琥珀酰亞胺基碘乙酸酯(SIA)、 N-琥珀 酰亞胺基溴乙酸酯(SBA)和N-琥珀酰亞胺基3-(溴-乙酰氨基)丙酸酯 (SBAP)。這些交聯試劑形成不可裂解的得自基于卣代乙酰基部分的連接 體。該修飾的細胞結合劑可以與含有硫醇的藥物反應，得到硫醚連接的 結合物。
酸不穩定的連接體本發明含有氨基的細霉素衍生物可以如前所述 通過酸不穩定的連接體連接到抗體和其它細胞結合劑(W. A. Blattler et al, Biochemistry 24, 1517-1524 (1985);美國專利US4,542,225、 4,569,789、 4,618,492、 4,764，368}。
類似地，本發明含有酰肼(hydrazido)基的細霉素衍生物可以如前所 述通過酸不穩定的腙連接體連接到抗體和其它細胞結合劑的碳水化合 物部分{對于腙連接體的實例參見B. C. Laguzza et al, J. Med. Chem., 32, 548-555 (1989); R. S. Greenfield et al, Cancer Res., 50, 6600-6607 (1990)}。
光不穩定的連接體本發明含有胺基團的細霉素衍生物可以如前所 述通過光不穩定的連接體連接到抗體和其它細胞結合劑(P. Senter et al, Photochemistry and Photobiology, 42, 231-237 (1985); 美國專利 US4,625,014}。
肽酶不穩定的連接體本發明含有胺基團的細霉素衍生物還可以通 過肽間隔基連接到細胞結合劑。前面已顯示，藥物與大分子蛋白質載體 之間的短肽間隔基在血清中穩定，但是容易被細胞內肽酶水解(A. Trouet et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 79, 626-629 (1982)}。含有有氨基基團 的細霉素衍生物可以使用縮合劑例如1 -乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二 亞胺-HCl (EDC-HC1)而與肽縮合，得到可以連接到細胞結合劑的肽衍生 物。
酯酶不穩定的連接體本發明具有羥基烷基基團的細霉素衍生物可以用琥珀酸酐琥珀酰基化，然后連接到細胞結合劑，產生一種結合物， 該結合物可以通過細胞內酯酶裂解而釋放游離藥物(例如參見E.
Aboud-Pirak et al.， Biochem Pharmacol., 38， 641-648 (1989)}。
通過已知方法以相同方式制備抗體、抗體片斷、蛋白質或肽激素類、 蛋白質或肽生長因子類和其它蛋白質的結合物。例如肽和抗體可以通過 本領域已知的方法用例如以下的交聯劑修飾N-琥珀酰亞胺基3-(2-敗 咬基二硫代)丙酸酯、N-琥珀酰亞胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)、 4-琥珀酰亞胺基-氧基羰基-a-曱基-00-(2-吡啶基二硫代)-甲苯(SMPT) 、 N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SDPB)、琥珀酰亞胺基吡啶基-二硫代丙酸酯(SPDP)、 4-(2-吡啶基二硫代)丁酸N-氫琥珀酰亞胺酯 (SPDB)、琥珀酰亞胺基4-[N-馬來酰亞胺基曱基]環己烷-l-羧酸酯(SMCC): N-硫代琥珀酰亞胺基-3-(2-(5-硝基-p比啶基二硫代)丁酸酯(SSNPB)、 2-亞 氨基四氫噻吩(2-iminothiolane)、或S-乙酰基琥珀酸酐。參見，Carlsson et al., 173, Biochem. J. 723-737 (1978); Blattler et al., 24, Biochem. 1517-1524 (1985); Lambert et al., 22, Biochem. 3913-3920 (1983); Klotz et al., 96, Arch. Biochem. Biophys., 605 (1962);以及Liu et al" 18, Biochem., 690 (1979) , Blakey and Thorpe, 1 Antibody, Immunoconjugates & Radio-pharmaceuticals, 1-16 (1988), Worrell et al. 1 Anti-Cancer Drug Design 179-184 (1986)。然后使由此得到的游離的或受保護的含有硫醇的 細胞結合劑與含有二硫化物或硫醇的細霉素衍生物反應，產生結合物。 通過以上方法制得的結合物可以通過標準柱色諳法或通過HPLC純化。
單克隆抗體或細胞結合劑與本發明細霉素衍生物之間優選的結合 物是如上文討論的通過二硫鍵或硫醚鍵連接的那些。此類細胞結合結合 物是通過已知方法制備的，該方法例如將單克隆抗體用琥珀酰亞胺基吡 啶基-二硫代丙酸酯(SPDP)修飾{Carlsson et al, 173， Biochem. J., 723-737 (1978)}。然后通過用含有硫醇的細霉素衍生物處理將所得硫代吡啶基團 置換，產生二硫化物連接的結合物。通過二硫化物橋連接的含有1至10 個細霉素衍生物的結合物通過此方法容易地制備。由此方法制備的結合 物充分描述于美國專利US5,585，499,其通過引用并入本文。
細胞結合劑和本發明細霉素衍生物之間的結合物的體外細胞毒性本發明細霉素衍生物以及它們與細胞結合劑的結合物的細胞毒性 可以在裂解保護基團并轉化成活性藥物之后測定。對非粘附細胞系例如
Namalwa和HL60的細胞毒性可以通過細月包增殖曲線的后-外推法 (back-extrapolation)來領'J定，其長口 Goldmacher et al, 135, J. Immunol" 3648-3651 (1985)中所述。這些化合物對粘附細胞系例如A-375和 SCaBER的細胞毒性可以通過克隆形成分析(clonogenic assay)測定，其如 Goldmacher etal., 102 J. Cell Biol. 1312-1319 (1986)中所述。
抑制所選細胞群生長的治療劑和方法
技術領域：
本發明還提供抑制所選細胞群生長的治療劑，其包含
(a) 細胞毒量的 一種或多種與細胞結合劑連接的上述細霉素衍生 物，和
(b) 藥學可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
類似地，本發明還提供抑制所選細胞群生長的方法，其包括使細胞
胞毒劑接觸，所述細胞毒劑包含一種或多種與細胞結合劑連接的上述細 霉素衍生物。
該細胞毒劑如上文所述制備。
適宜的藥學可接受的載體、稀釋劑、和賦形劑是公知的，并且可以 通過本領域技術人員根據臨床表現依據來確定。
適宜的載體、稀釋劑和/或賦形劑的實例包括(l)Dulbecco's磷酸緩 沖鹽溶液，pH約7.4，含有約1 mg/ml至25 mg/ml人血清白蛋白，(2) 0.9% 鹽水溶液(0.9% w/v NaCl)，和(3) 5% (w/v)右旋糖。
抑制所選細胞群生長的方法可以在體外、體內或離體實施。
的全部細胞，所述的變異體不表達靶抗原；或者殺滅表達不需要的抗原 的變異體。
非臨床體外應用的條件是根據熟練技術人員容易確定的。 離體應用的實例包括在它們移植到同 一患者之前處理自體骨髓，以
便殺滅患病的或惡性細胞；在它們移植之前處理骨髓，以便殺滅有活性
的T細胞并防止移植物抗宿主病(GVHD)。可以按下文進行臨床離體處理，以便在癌癥治療或自身免疫疾病治 療中在自體移植之前從骨髓中除去肺瘤細胞或淋巴樣細胞，或者在移植
之前從同種異體骨髓或組織中除去T細胞和其它淋巴樣細胞以便預防 GVHD。從患者或其它個體收集骨髓，然后在含有血清的介質中培養， 向其中中加入本發明的細胞毒劑，其濃度為約10 iiM至1 pM,在約37°C 下培養約30分鐘至約48小時。培養濃度和時間的確切條件(=劑量)是熟 練技術人員容易確定的。培養之后，將該骨髓細胞用含有血清的介質洗 滌，再根據已知方法通過靜脈內(i.v.)輸注返回到患者。在患者接受其 它治療的情況下，例如在收集骨髓和再輸注受處理的細胞的時間之間的 燒蝕(ablative)化療或全身照射療程中，使用標準醫學設備將該受處理的 骨髓細胞在液氮中冷凍保存。
對于臨床體內應用，本發明的細胞毒劑將以測試了無菌和內毒素水 平的溶液供應，或者以可重新溶解于無菌注射用水中的冷凍干燥的固體 供應。結合物施用的適宜方案的實例如下。結合物以靜脈內(i.v.)彈丸 劑(bolus)每周給藥達6周。單次注射劑量(bolus dose )在50至400 ml 的生理鹽水中給予，其中可加入人血清白蛋白(例如0.5至1 ml的人血 清白蛋白濃溶液，100mg/mL)。劑量將為每周靜脈內(i.v.)約50 至 10mg/kg體重(每次注射范圍為10 (ag至100mg/kg)。治療6周之后，患 者可接受第二療程的治療。在有關給藥途徑、賦形劑、稀釋劑、劑量、 次數等方面的具體臨床方案可以通過熟練技術人員根據臨床表現依據 來確定。
可以根據體內或離體方法殺滅所選細胞群來治療的醫學病癥的實 例包括任何類型的惡性腫瘤，其包括，例如，肺癌、乳腺癌、結腸癌、 前列腺癌、腎癌、胰腺癌、卵巢癌、和淋巴器官癌；黑素瘤；自身免疫 性疾病，例如系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、和多發性硬化癥；移 植物排斥，例如腎移植排斥、肝移植排斥、肺移植排斥、心臟移植排斥、 和骨髓移植排斥；移植物抗宿主病；病毒感染，例如CMV感染、HIV 感染、AIDS等；細菌感染；以及寄生蟲感染，例如賈第蟲病、阿米巴 病、血吸蟲病，以及由本領域技術人員確定的其它類。
實施例
本發明現通過參考非限制性實施例來說明。除非另有說明，所有的百分數、比率、部分等以重量計。 才才誶+禾口方法
熔點是使用電熱儀測定的，未經校正。NMR光譜是在Bruker AVANCE400 (400 MHz)光譜儀上記錄的。化學位移以ppm報告，相對 于TMS為內標。質鐠是使用Bruker Esquire 3000系統獲得的。紫外光譜 在Hitachi U1200分光光度計上記錄。HPLC使用Beckman Coulter GOLD 125系統進行，該系統配備Beckman Coulter系統GOLD 168可變波長檢 測器和Waters RADIALPAK ( —種反相C-18柱)。薄層色譜法是在 AnaltechGF硅膠TLC板上進行的。用于快速色譜法的硅膠來自Baker。 四氫呋喃通過用鈉金屬蒸餾干燥。二甲基乙酰胺和二甲基曱酰胺通過用 氬化釣在減壓下蒸餾干燥。所用的全部其它溶劑為試劑級或HPLC級。
人癌細胞系HL60、 Namalwa、 A-375、 COLO205和Ramos得自美 國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)。 Kara 是鼠科腫瘤細胞系，其已穩定轉染人CD33抗原。
試驗部分
質譜分析按以下進行
EI-CI分析直接導入(DC》樣品沉積在細絲上)
質譜儀FinniganSSQ7000;質量范圍m/z=29-900;電子能量70eV; 源溫度70。C;反應物氣體(reactantgaz)氨性CI; EI =通過電子碰撞離子 化；C》化學電離。
電噴霧分析:(陽性電噴鑒ES+;陰性電噴鑒ES—)
LC誦MS國DAD國ELSD:
MS: Waters-Micromass ZQ; L￡: Agilent HP 1100; LC柱Xbridge WatersC18， 3X50 mm, 2.5 pm;洗脫液梯度 水(含0.1%曱酸)+乙 腈；UV: DAD (人=200曙400 nm)。
實施例1:
(2E，10E,12E, 16Z,18E)誦(R)-6-羥基-3,5,7，9,11,15,17-七甲基 -19-((2S,3S)-3-曱基-6-氧代-3,6- 二氫-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷 -2,10,12,16,18-五烯酸的(2-曱基硫烷基-乙基)-酰胺<formula>formula see original document page 24</formula>
向20 mg的(2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)誦6曙羥基-3，5，7,9，11,15,17畫七甲 基-19-((2S,3S)-3-曱基-6-氧代-3，6-二氫-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷 -2,10，12,16,18-五烯酸和5.6 mg的HOBT (l-羥基苯并三唑)在0.3 ml的二 氯曱烷中的溶液中在近20。C溫度下導入7.65 pl的DIC (N，N'-二異丙基 碳二亞胺)，然后導入5.2 mg的2-(硫代曱基)乙胺。將反應混合物在近 20°C溫度下攪拌20.5小時，然后通過直接沉積到2個制備型硅膠TLC 板(厚0.5mm， 20x20 cm)上純化。將制備型TLC板用甲醇/二氯曱烷的 混合物(5/95,以體積計)洗脫，然后將所需產物從硅膠中用甲醇/二氯曱 烷的混合物(15/85 , 以體積計)提取。獲得 1.4 mg的 (2E,10E，12E，16Z,18E)-(R)-6-羥基-3,5,7,9,ll,15,17-七甲基-19國((2S,3S)-3-曱基-6-氧代-3,6-二氫-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷-2,10,12,16，18-五烯 酸的(2-甲基硫烷基-乙基)-酰胺為黃色固體，其特征如下
質譜
CI: m/z=617: [M+NH4]+; m/z=600: [M+H]+
在光鐠儀BRUKER AVANCE DMX-600上獲得的600 MHz處的1H NMR光譜具有以下化學位移(S, ppm)—以氯仿為溶劑-dl (CDC13-dl), 參比7,27,溫度303K: 0,79 (d, J = 6,5 Hz, 3H); 0,97 (d, J = 7,0 Hz, 3H); 1,07 (d, J = 7,0 Hz, 3H); 1,12 (d, J = 7,0 Hz, 3H) ; 1,15 (d, J = 7,5 Hz, 3H); 1,71 (m, 1H); 1,81 (s, 3H); 1,82 (m部分隱蔽，1H); 1,83 (s, 3H); 2,08 (m, 2H); 2,11 (s， 3H); 2,13 (s, 3H); 2,15 (dd, J = 6,5和13,5 Hz, 1H); 2,45 (m 寬峰，1H); 2,53 (m, 1H); 2,66 (t, J = 6,5 Hz, 2H); 2,70 (m, 1H); 2,82 (m, 1H); 3,50 (q, J = 6,5 Hz, 2H); 3,61 (m, 1H); 3,65 (m, 1H); 5,01 (dd, J = 4,5和7,5 Hz， 1H); 5，09 (d, J = 10,0 Hz， 1H); 5,26 (d, J = 10,0 Hz, 1H); 從5，55至5,66 (m， 2H); 5, 69 (dd, J = 7,5和16,0 Hz, 1H); 5,97 (t寬峰， J = 6,5 Hz, 1H); 6,00 (d, J = 10,0 Hz, 1H); 6,02 (d, J = 15,5 Hz, 1H); 6,75 (d, J = 16,0 Hz, 1H); 6,95 (dd, J = 6,0和10,0 Hz, IH)。
實施例2 :雙誦[(2E,10E,12E，16Z,18E)-(R)畫6國羥基-3,5,7,9,11,15,17-七曱基 -19-((2S,3S)-3-曱基-6-氧代-3,6- 二氬-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷 -2，10,12,16,18_五烯酸的(2-巰乙基)-酰胺]
向20 mg的(2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)國6畫羥基-3,5,7,9,11,15,17畫七甲 基畫19-((2S,3S)-3國曱基-6-氧代-3,6畫二氫-2H-吡喃-2-基)隱8國氧代-十九烷 -2,10,12,16,18畫五烯酸和5.6 mg的HOBT (l-羥基苯并三唑)在0.3 ml的二 氯曱烷中的溶液中在近20。C溫度下導入12.8 mg的胱氨酸二鹽酸鹽、 7.65 pl的DIC (N,N'-二異丙基碳二亞胺)，然后導入11.6 pi的三乙胺。 將反應混合物在近20°C溫度下攪拌22小時，然后通過直接沉積到2個 制備型硅膠TLC板(厚0.5 mm, 20x20 cm)上純化。將制備型TLC板用 曱醇/二氯曱烷的混合物(5/95,以體積計)洗脫，然后將所需產物從硅膠 中用曱醇/二氯曱烷的混合物(15/85,以體積計)提取。獲得4.6 mg的雙 -[(2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-羥基-3,5,7,9,11，15,17-七-曱基 -19-((28,38)-3-甲基-6-氧代-3,6-二氫-211-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷-2, 10,12,16，18-五烯酸的(2-硫代乙基)-酰胺]為白色固體(white solid blanc), 其特征如下
質鐠
ES+: m/z=1167: [M+H]+
ES-:: m/z=1211: [M-H+HCOOH]-
實施例3 :
(2E，10E,12E,16Z,18E)畫(R)畫6畫羥基-3,5，7,9,11,15,17-七甲基 -19-((2S,3S)-3-曱基-6-氧代畫3,6國二氫畫2H畫吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷 -2,10,12,16,18-五烯酸的(2-巰基-乙基)-酰胺<formula>formula see original document page 26</formula>
向20 mg的(2E,10E,12E,16Z,18EHR)-6-羥基-3,5,7,9,ll,15,17-七曱 基-19-((2S,3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氪-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷 -2,10,12,16,18-五烯酸和8 pl的三乙胺在0.15 ml的二氯曱烷中的溶液中 在近0。C溫度下導入6.1 pi的新戊酰氯。在近0。C溫度下15分鐘之后， 加入4.4 mg的2-氨基乙硫醇在0.15 ml的二氯甲烷和0.05 ml的乙醇中 的溶液。將反應混合物在近20。C溫度下攪拌1小時，然后通過直接沉 積到2個制備型硅膠TLC板(厚0.5 mm, 20x20 cm)上純化。將制備型 TLC板用曱醇/二氯甲烷的混合物(8/92,以體積計)洗脫，然后將所需產 物從硅膠中用甲醇/二氯甲烷的混合物(15/85,以體積計)提取。獲得2.3 mg的 (2E,10E,12E，16Z,18E)-(R)-6畫羥基-3,5,7,9,11,15,17-七曱基 -19-((2S,3S)-3-甲基-6-氧代-3,6- 二氬-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷 -2,10，12,16,18-五烯酸的(2-巰基-乙基)-酰胺為無色玻璃狀物，其特征如 下
質譜
ES+:m/z=586: [M+H]+
ES-:: m/z=630: [M-H+HCOOH]-
在光譜儀BRUKER A VANCE DRX-400上獲得400 MHz處的1H NMR光鐠具有以下化學位移(5, ppm)—以氯仿為溶劑-dl (CDCD-dl), 參比7,27，溫度303K: 0,80 (d, J = 6,5 Hz, 3H); 0,98 (d, J = 6,5 Hz, 3H);
1.08 (d, J = 7,5 Hz， 3H); 1,14 (d, J = 6,5 Hz, 3H); 1,16 (d, J = 7,0 Hz， 3H); 1,72 (m， 1H);從1,80至1,87 (m隱蔽，1H); 1,82 (s, 3H); 1,84 (s， 3H);
2.09 (m, 2H); 2,11 (s, 3H); 2,16 (dd, J = 6,5和13，5 Hz， 1H); 2，54 (m， 1H);從2,65至2,74 (m， 3H); 2,83 (m, 1H); 3,48 (q, J = 6,5 Hz, 2H);從 3,60至3,70 (m, 2H); 5,00 (dd, J = 4,0和7,0 Hz, 1H); 5,10 (d, J = 10,5 Hz, 1H); 5,27 (d, J = 10,5 Hz, 1H); 5,58 (s, 1H); 5,60 (td部分隱蔽，J = 7,5 和15,5 Hz, IH); 5,70 (dd, J = 7,0和15,5 Hz, 1H);從5,96至6,06 (m, 3H); 6,75 (d寬峰，J = 15,5 Hz, 1H); 6,97 (dd, J = 6，0和10,0 Hz, IH)。實施例4 :
(2E,10E,12E,16Z，18EHR)-6-羥基國3,5,7，9,11,15,17-七甲基 -19-((2S,3S)-3-曱基-6-氧代-3,6- 二氬-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷 -2,10,12,16,18-五烯酸的(2-曱基二硫烷基-乙基)-酰胺
OH O
向20 mg的(2E,10E,12E，16Z，18E)-(R)-6陽羥基-3，5，7,9,ll,15，17-七曱 基-19-((2S,3S)-3-曱基-6-氧代-3,6-二氫-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷 -2,10,12,16,18-五烯酸和5.6 mg的HOBT (l-羥基苯并三唑)在0.15 ml的 二氯曱烷中的溶液中在近20。C溫度下導入7.65 pl的DIC (N，N'-二異丙 基碳二亞胺)，然后導入8 mg的2-甲基二硫代-乙胺在0.15 ml的二氯曱 烷中的溶液。將反應混合物在近20°C溫度下攪拌2小時，然后通過直 接沉積到2個制備型硅膠TLC板(厚0.5 mm， 20x20 cm)上純化。將制備 型TLC板用曱醇/二氯甲烷的混合物(7/93，以體積計)洗脫，然后將所需 產物從硅膠中用曱醇/二氯曱烷的混合物(15/85,以體積計)提取。獲得
3.4 mg的 (2E，10E,12E,16Z，18E)-(R)-6-羥基-3,5,7,9，ll,15,17-七曱基 -19-((2S,3S)-3-甲基-6-氧代-3，6- 二氫-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷 -2,10,12,16,18-五烯酸的(2-甲基二硫烷基-乙基)-酰胺為淺黃色油狀物，其 特征如下
質譜
ES+: m/z=632: [M+H]+
ES-:: m/z=630: [M誦H]-; m/z=676: [M國H+HCOO町
在光譜儀BRUKER A VANCE DRX-400上獲得的400 MHz處的1H NMR光譜具有以下化學位移(5, ppm)—以氯仿為溶劑-dl (CDCD-dl), 參比7，27,溫度303K: 0,81 (d, J = 6,5 Hz, 3H); 0,98 (d, J = 6,5 Hz， 3H); 1，08 (d, J = 7,5 Hz, 3H); 1,14 (d, J = 6,5 Hz, 3H); 1，16 (d, J = 7,0 Hz, 3H); 1,72 (m， 1H);從1,79至1,86 (m， 1H); 1,82 (s, 3H); 1,84 (s, 3H); 2，09 (m, 2H);2,ll(s寬峰，3H);2,15(dd,=5，5和13,5 Hz, 1H);2,35(s寬峰， lH); 2,43 (m, 3H); 2,54 (m, 1H); 2,70 (m, 1H); 2,83 (m, 1H); 2，86 (t, J =
6.5 Hz, 2H);從3,59至3,70 (m, 4H); 5，01 (dd， J = 4,0和7,0 Hz, 1H);5,11 (d， J = 10,0 Hz, 1H); 5,27 (d, J = 10,0 Hz， 1H); 5,56 (s, 1H); 5,60 (td 部分隱蔽，J = 7,5和15,5 Hz, 1H); 5，70 (dd, J = 7,0和15,5 Hz, 1H); 5,93 (t, J = 6,0 Hz, 1H); 6，00 (d, J = 10,0 Hz, 1H); 6,02 (d, J = 15,5 Hz, 1H); 6,75 (d, J = 15,5 Hz, 1H); 6,96 (dd, J = 6，0和10,0 Hz, 1H). 實施例5 :
(2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)畫6誦羥基畫3,5,7,9，11,15,17-七曱基 -19-((2S，3S)-3-曱基-6-氧代-3，6- 二氬-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷 -2,10,12,16,18-五烯酸的(2-甲基-2-曱基二硫烷基-丙基)-酰胺
向225.4 mg的(2E，10E,12E,16Z,18E)-(R)國6國羥基畫3,5,7，9,11,15,17畫七 甲基-19-((2S,3S)-3-甲基-6-氧代-3,6-二氫-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷 -2,10,12,16,18-五烯酸在1.5 ml的二氯曱烷中的溶液中在近0。C溫度下導 入63.6 mg的HOBT (l-羥基苯并三唑)和110 mg的2-曱基-2-甲基二硫烷 基-丙胺在1.5 ml的二氯曱烷中的溶液，然后導入86.2 pl的DIC (N,N'-二異丙基碳二亞胺)。將反應混合物在近0。C溫度下攪拌15小時，然后 用30 ml的二氯曱烷稀釋。將有機相用10 ml的水洗滌兩次，用硫酸鈉 干燥，在燒結玻璃上過濾，然后在減壓下在近40°C溫度下濃縮。將所 得殘余物通過柱色譜法在硅膠(20g Si02， 15-35 ^m)上純化，洗脫梯度 為甲醇/二氯曱烷從0/100至10/90 (以體積計)。在減壓下在近40。C溫度 下將含有所需產物的級分濃縮。獲得212.1 mg的(2E，10E,12E, 16Z,18E)-(R)-6-羥基畫3,5,7,9，ll,15,17-七曱基誦19-((2S,3S)-3-甲基-6-氧代 -3,6-二氫-211-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷-2,10,12,16,18-五烯酸的(2-曱基 -2-曱基二硫烷基-丙基)-酰胺為黃色玻璃狀物，其特征如下
質譜
ES+: m/z=660: [M+H]+
ES—: m/z=658: [M-H]-; m/z=704: [M國H+HCOOH]-
在光語儀BRUKER AVANCE DRX-400上獲得的400 MHz處的1H NMR光譜具有以下化學位移(5, ppm)—以氯仿為溶劑-dl (CDCD-dl),參比7,27,溫度303K: 0,80 (d, J = 6,5 Hz, 3H); 0,97 (d， J = 6,5 Hz, 3H); 1,08 (d, J = 7,5 Hz, 3H); 1，14 (d, J = 6,5 Hz, 3H); 1,16 (d, J = 7,0 Hz, 3H); 1,32 (s, 6H); 1,72 (m， 1H); 1,82 (s, 3H); 1,83 (m隱蔽，1H); 1,84 (s, 3H); 2,08 (m, 2H); 2,11 (s寬峰，3H); 2,15 (dd， J = 6,5和13,5 Hz, 1H); 2,43 (s, 3H); 2,54 (m, 1H); 2,70 (m, 1H); 2,83 (m， 1H); 3,45 (d, J = 6,0 Hz, 2H); 從3，59至3,69 (m, 2H); 5,00 (dd， J = 4，0和7,0 Hz, 1H); 5,10 (d, J = 10，5 Hz, 1H); 5,26 (d, J = 10,0 Hz, 1H);從5,54至5,64 (m, 2H); 5,70 (dd, J = 7,0和15,5 Hz, 1H); 5,83 (t， J = 6,0 Hz, 1H); 6,00 (d, J = 10,5 Hz, 1H); 6,02 (d, J = 15,5 Hz, 1H); 6,75 (d, J = 15,5 Hz, 1H); 6,96 (dd, J = 6,5和 10,5 Hz, 1H).
實施例6 :
(2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-羥基畫3，5,7,9,11,15,17-七曱基 -19-((2S,3S)-3-甲基-6-氧代-3,6- 二氬-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷 -2,10,12,16,18-五烯酸的(2-巰基-2-曱基-丙基)-酰胺
向200 mg的(2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)國6畫羥基-3,5,7,9,ll,15，17畫七甲 基-19-((2S,3S)-3-曱基-6-氧代-3,6-二氬-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷 -2,10，12,16,18-五烯酸的(2-甲基-2-曱基二硫烷基-丙基)-酰胺在7.7 ml的 四氫呋喃和3.85 ml的水中的溶液中在近20。C溫度下加入217.2 mg的 TCEP(三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽)。在近20。C溫度下16小時之后，將反應 混合物用30 ml的乙酸乙酯稀釋，用15 ml的水、15 ml的鹽水洗滌2 次，用硫酸鎂干燥，用燒結玻璃過濾，再在減壓下在近40°C溫度下濃 縮。將所得黃色油通過柱色譜法在硅膠(20g Si02， 15-35 |im,洗脫梯 度為甲醇/二氯甲烷從1/99至10/90(以體積計))上純化。在減壓下在近 40。C溫度下將含有所需產物的級分濃縮。獲得122.6 mg的 (2E，10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-羥基-3,5,7,9,ll,15,17-七曱基畫19-((2S,3S)國3畫 甲基-6-氧代-3,6-二氫-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷-2,10,12，16,18-五烯酸的(2-巰基-2-曱基-丙基)-酰胺為黃色玻璃狀物，其特征如下 質譜
ES+: m/z=614: [M+H]+
ES—: m/z=612: [M-H]-; m/z=658: [M-H+HCOOH]-
在光語儀BRUKER AVANCE DRX-500上獲得的500 MHz處的1H NMR光語具有以下化學位移(5， ppm)—以氯仿為溶劑-dl (CDCD-dl)， 參比7,27，溫度303K: 0,80 (d， J = 6,5 Hz, 3H); 0,97 (d， J = 6，5 Hz, 3H); 1,07 (d, J = 7,5 Hz, 3H); 1,13 (d, J = 6，5 Hz， 3H); 1,16 (d, J = 6,5 Hz, 3H); 1,38 (s, 6H); 1,72 (m， 1H); 1,82 (s, 3H); 1,84 (s, 3H); 1,85 (m部分隱 蔽，1H); 2,09 (m, 2H); 2,11 (s, 3H); 2,17 (dd, J = 6,5和13,5 Hz, 1H); 2,54 (m, 1H); 2,70 (m, 1H); 2,83 (m, 1H); 3,38 (d, J = 6,5 Hz, 2H);從 3,61至3,70 (m, 2H); 5,01 (dd, J = 4,0和7,0 Hz, 1H); 5,09 (d, J = 10,0 Hz， 1H); 5,26 (d, J = 10,0 Hz, 1H); 5,59 (dt部分隱蔽，J = 7,5和15,5 Hz, 1H); 5,63 (s， 1H); 5，69 (dd, J = 7,0和15,5 Hz, 1H); 6,00 (d, J = 10,0 Hz, 1H); 6，02 (d, J = 15,5 Hz， 1H); 6,04 (t部分隱蔽，J = 6,5 Hz, 1H); 6,75 (d, J = 15,5 Hz, 1H) ; 6,97 (dd, J = 6,0和IO，O Hz, IH)。
抗體與細霉素衍生物的結合
抗結腸癌抗體huC242與細霉素衍生物的結合
制備人源化的抗結腸胂瘤抗體(huC242)與實施例6化合物的二^5危化 物連接的結合物(在本文稱為實施例6的huC242-SSNPB-細霉素)。使該 huC242抗體與6-倍摩爾過量的抗體修飾劑SSNPB (N-硫代琥珀酰亞胺 基4-0硝基J-p比咬基二硫代)丁酸酯)以9 mg/ml的抗體濃度在50 mM磷 酸鉀緩沖液(pH6.5,含有50mMNaCl、 2 mM EDTA、 5% 二甲基乙酰 胺)中在環境溫度下反應90分鐘。將反應混合物通過Sephadex G-25尺 寸排阻色語純化，該色譜在pH 6.5的含有50 mM NaCl和2 mM EDTA 的50 mM石粦酸鉀緩沖液中平衡。添加及不添加p-巰基乙醇分析該-修飾的抗體樣品，并確定每個抗體中具有摻入的~ 6個硝基吡啶基二硫代基
團。將每個連接基團2-倍摩爾過量的細霉素-SH藥物加入到該修飾的抗 體樣品中，該抗體為2mg/ml，在50mM磷酸鉀緩沖液(pH6.5,含有50 mM NaCl、 2 mM EDTA、 10°/。二曱基乙酰胺)中。反應后經分光光度法(394 nm)和HPLC測定5-硝基吡咬-2-硫酮的釋放。在環境溫度下反應約90 min之后，將該混合物通過Sephadex G-25尺寸排阻色譜在50 mM石岸酸 鉀緩沖液(pH 6.5,含有50 mM NaCl、 2 mM EDTA)中純化。在250 nm/280 nm處的吸收比，結合物為0.78，相比之下未修飾抗體為0.37,證明細 霉素基團摻入到該結合物中(導致在250 nm處吸收度增加)。
去糖基化huC242-細霉素結合物的質譜分析顯示了 147492 、148212、 148936和149660道爾頓處的結合物峰，其相應于每個抗體分子中摻入 的1、 2、 3和4個細霉素分子。
抗-CD19 (huB4)抗體與細霉素衍生物的結合
抗-CD19抗體(人源化的B4抗體)與細霉素的結合物是用二^fu化物 和不可裂解的硫醚連接體制備的。笫一樣品(-S-S-連接體)包括抗-CD19 (huB4)抗體，該抗體通過二硫化物連接體SSNPB (N-疏代琥珀酰亞胺基 4-(5-硝基-2-p比啶基二硫代)丁酸酯)連接到實施例6的化合物。第二樣品 包括huB4抗體，該抗體通過馬來酰亞胺連接體SMCC (N-琥珀酰亞胺基 4-(馬來酰亞胺基-甲基)環己烷羧酸酯)連接到實施例6的化合物。
HuB4-SSNPB-細霉素結合物(實施例6的huB4-SSNPB-細霉素):
使4 mg的huB4抗體與7.5-倍摩爾過量的SSNPB連接體以8 mg/ml 的抗體濃度在50 mM磷酸鉀緩沖液(pH 6.5,含有50 mM NaCl、 2 mM EDTA、 5% 二甲基乙酰胺)中在環境溫度下反應90min。將反應混合物 通過Sephadex G-25尺寸排阻色譜在50 mM磷酸鉀緩沖液(pH 6.5,含有 50 mM NaCl、 2 mM EDTA)中純化。添加及不添加卩-巰基乙醇分析該修飾的抗體樣品，并確定每個抗體中具有摻入的5.3個硝基吡啶基二硫代 基團。將每個連接基團3-倍摩爾過量的藥物加入到該修飾的抗體樣品 中，該抗體為1 mg/ml，在50 mM磷酸鉀緩沖液(pH 6.5,含有50 mM NaC1、2 mM EDTA、 10%二曱基乙酰胺)中。反應后經分光光度法(394 nm) 和HPLC測定5-硝基吡啶-2-硫酮的釋放。在環境溫度下過夜反應之后， 使該混合物在10 mM檸檬酸緩沖液(pH 5.5,含有135 mMNaCl)中通過 SephadexG-25尺寸排阻色譜純化。添加及不添加P-巰基乙醇分析樣品， 并確定每個抗體中具有4.3個反應的連接體。尺寸排阻色譜(SEC)分析顯 示95%單體抗體。
HuB4-SMCC-細霉素結合物
huB4、 ，9
使4 mg的huB4抗體與7.5-倍摩爾過量的SMCC連接體以8 mg/ml 的抗體濃度在50 mM磷酸鉀緩沖液(pH 6.5，含有50 mM NaCl、 2 mM EDTA、 5% 二甲基乙酰胺)中在環境溫度下反應90min。將反應混合物 通過Sephadex G-25尺寸排阻色語在50 mM磷酸鉀緩沖液(pH 6.5,含有 50 mM NaCl、 2 mM EDTA)中純化。摻入到樣品中的馬來酰亞胺 (maleimide)基團的數目是通過添加過量的硫醇(半胱氨酸)來分析的，并 確定每個抗體中具有3.3個連接基。將每個馬來酰亞胺基團3-倍摩爾過 量的實施例6的藥物加入到該修飾的抗體樣品中，該抗體為1 mg/ml， 在50mM磷酸鉀緩沖液(pH6.5,含有50mMNaCl、 2mMEDTA、 10% 二甲基乙酰胺)中。在環境溫度下過夜反應之后，使該混合物在10 mM 檸檬酸緩沖液(pH5.5,含有135 mMNaCl)中通過Sephadex G-25尺寸排 阻色語純化。SEC分析顯示98%單體抗體。
去糖基化huB4-SMCC-細霉素結合物的質譜分析顯示了 145138、 145860和146566道爾頓處的結合物峰，其相應于每個抗體分子中摻入的1、 2和3個細霉素分子。 生物學結果
通過WST-生存能力分析，實施例6的huB4-SSNPB-細霉素結合物 對Ramos (CD19抗原一陽性)和HL60 (抗原陰性)癌細胞的毒性評價分 別顯示出1.4 x l(T9 M和4.2 x l(T9 M的1(350值，由此證實了細霉素-抗體 結合物的抗原特異性細胞毒活性。
實施例6的huC242-SSNPB-細霉素結合物對COLO 205 (CanAg抗 原—陽性)癌細胞和A375細胞的毒性評價，分別顯示出1.3xl0"GM和 〉5.0 x l(T9 M的IC5。值(圖1)。
某些專利和出版的文獻已在本公開中提及，它們的教導以其各自的 全部內容通過引用各自并入本文。
雖然本發明已經詳細地并參照其特定實施方案進行了描述，對于本 領域技術人員明顯的是，可以進行各種改變和修飾而不會脫離其精神和 范圍。
權利要求
1. 細霉素衍生物，其包括能夠使所述細霉素衍生物結合到細胞結合劑的連接基團。
2. 根據權利要求1的細霉素衍生物，其中所述的連接基團包括硫醇 鍵、硫化物鍵或二硫化物鍵。
3. 根據權利要求1或2的細霉素衍生物，其中所述衍生物如式(I):OH OR17(I)其中Ra和Ra'是H或-Alk;R17是任選被OR、 CN、 NRR，、全氟烷基取代的烷基； R9是任選被OR、 CN、 NRR，、全氟烷基取代的烷基； X是-O-或-NR-;Y是-U-、 -NR-U-、 -O-U-、 -NR-CO-U-、 -U-NR-CO-、 -U-CO-、 -CO-U-;其中U選自—Alk- 、 -Alk(OCH2CH2)m- 、 -(OCH2CH2)m-Alk-、 -Alk(OCH2CH2)m-Alk-、 -(OCH2CH2)m-、-環烷基-、-雜環基-、-環烷基-Alk陽、 -Alk-環烷基-、-雜環基-Alk-、 -Alk-雜環基-;其中m是選自1至2000的整數；Z是-Alk-;n是0或1;T表示H，硫醇保護基團例如Ac、 R4或SRi，其中R^表示H、曱 基、Alk、環烷基、任選取代的芳基或雜環基，或者T表示<formula>formula see original document page 2</formula>其中Ra、 Ra，、 R17、 R9、 X、 Y、 Z、 n定義如上文； R、 R，相同或不同，是H或烷基； Alk表示直鏈或支鏈的烷基；或其藥學可接受的鹽、水合物、或水合的鹽，或者這些化合物的多 晶型晶體結構或其光學異構體、外消旋體、非對映體或對映體。
4. 權利要求3所述的細霉素衍生物，其中Ra是-Alk，并且Ra，是H。
5. 根據權利要求3或4所述的細霉素衍生物，其中R17是烷基。
6. 根據權利要求3、 4或5所述的細霉素衍生物，其中R9是烷基。
7. 根據權利要求3至6任一項所述的細霉素衍生物，其中X是-NR。
8. 根據權利要求3至7任一項所述的細霉素衍生物，其中Y是-U。
9. 根據權利要求3至8任一項所述的細霉素衍生物，其中U是-Alk。
10. 根據權利要求3至9任一項所述的細霉素衍生物，其中-Alk-是直鏈或支鏈的d-C20烷基。
11. 根據權利要求3至IO任一項所述的細霉素衍生物，其中T是 H或SRi，其中R^表示Alk。
12. 根據前述權利要求任一項所述的細霉素衍生物，其選自 (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-羥基-3,5,7,9,11,15,17-七甲基-19-((2S,3S)-3-曱基-6-氧代-3，6- 二氫-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷 -2,10,12，16，18-五烯酸的(2-曱基硫烷基-乙基)-酰胺；雙-[(2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-羥基-3,5,7,9,11,15,17-七曱基 -19-((2S,3S)-3-曱基-6-氧代-3,6- 二氬-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷 -2,10,12,16,18-五烯酸的(2-巰乙基)-酰胺];(2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-羥基畫3，5,7，9,11,15,17-七曱基 -19-((2S,3S)-3-曱基-6-氧代-3,6- 二氬-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷 -2,10,12,16,18-五烯酸的(2-巰基-乙基)-酰胺；(2E,10E,12E,16Z，18E)-(R)-6-羥基-3,5,7,9,11,15,17-七甲基 -19-((2S,3S)-3-曱基-6-氧代-3，6- 二氫-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷 -2,10,12,16,18-五烯酸的(2-曱基二硫烷基-乙基)-酰胺；(2E,10E,12E,16Z,18EHR)-6-羥基-3,5,7,9,11,15,17-七甲基 -19-((2S,3S)-3-甲基-6-氧代-3,6- 二氫-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷 -2,10，12,16,18-五烯酸的(2-曱基-2-曱基二硫烷基-丙基)-酰胺；(2E,10E,12E,16Z,18EHR)-6-羥基-3,5,7,9,11,15,17-七甲基 -19-((2S，3S)-3-曱基-6-氧代-3,6- 二氫-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷 -2,10,12,16,18-五烯酸的(2-巰基-2-曱基-丙基)-酰胺；或其藥學可接受的鹽、水合物、或水合的鹽，或者這些化合物的多晶型晶體結構或其光學異構體、外消旋體、非對映體或對映體。
13. 細霉素衍生物結合物，其包含通過連接體與一種或多種根據前 述權利要求任一項所述的細霉素衍生物連接的細胞結合劑，所述連接體 包含所述的連接基團。
14. 權利要求13所述的細霉素衍生物結合物，其中所述的細胞結合 劑是抗體或其片斷。
15. 權利要求13或14所述的細霉素衍生物結合物，其中所述的連 接體包"fe-S-或-S-S-基團。
16. 權利要求13、 14或15所述的細霉素衍生物結合物，其中所述 的連接體包括連接到對硫醇、硫化物或二硫化物有反應性的官能團的所 述連接基團。
17. —種藥物組合物，其包含根據權利要求1至12任一項所述的細 霉素衍生物和藥學可接受的載體。
18. —種藥物組合物，其包含根據權利要求13至16任一項所述的 結合物和藥學可接受的載體。
19. 權利要求l至12任一項的細霉素衍生物用于制備治療癌癥的醫 藥的用途。
20. 權利要求13至16任一項的結合物用于制備治療癌癥的醫藥的 用途。
21. 制備權利要求3至12任一項的化合物的方法，其包括使式(II) 和(III)相應化合物反應的步驟<formula>formula see original document page 4</formula>(II)T—S—(Z)n—Y—XH (III)其中Ra、 Ra，、 R17、 R9、 X、 Y、 Z、 T、 n定義如式(I)。
22. 制備權利要求3至12任一項的化合物的方法，其中在式(I)中T 是H,該方法包括使其中的T是S-Rl的式(I)相應化合物在二硫鍵的還 原劑存在下反應的步驟。
23. 制備權利要求3至12任一項的二聚體化合物的方法，其包括使 式(II)相應化合物與式(IV)相應化合物反應的步驟HX國Y-(Z)n國S畫S-(Z)n-Y-XH (IV)
24. 制備權利要求13至16任一項的結合物的方法，其包括使權利 要求1至12任一項定義的細霉素衍生物與修飾的細胞結合劑反應的步 驟，所述的細胞結合劑包含對該衍生物的所述連接基團有反應性的官能 團，以便該衍生物和該細胞結合劑通過所述連接體連接在一起，該連接 體包含所述連接基團。
25. 權利要求24所述的方法，其中所述修飾的細胞結合劑包含對該 衍生物的所述連接基團有反應性的官能團，該修飾的細胞結合劑是通過 使所述細胞結合劑與選自SMCC、 SSNPB、 LC-SMCC、 SIAB、 SIA、 SBA、 SBAP的試劑反應獲得的。
全文摘要
公開了具有部分例如硫化物或二硫化物的細霉素衍生物，其可結合于細胞結合試劑例如抗體。還描述了此類細霉素衍生物結合物的治療用途；此類結合物具有治療用途，因為它們能以靶向的方式向特定細胞群釋放細胞毒性的細霉素衍生物。
文檔編號A61K47/48GK101466409SQ200780021535
公開日2009年6月24日 申請日期2007年5月23日 優先權日2006年6月9日
發明者A·康默康, H·鮑查德, R·V·J·查里 申請人:賽諾菲-安萬特