專利名稱：：用于促進骨生長和維持骨健康的營養組合物及與其有關的方法用于促進骨生長和維持骨健康的營養組合物及與其有關的方法
背景技術：
：概括而言，本發明涉及有益于健康的營養組合物。更具體而言，本發明涉及可用于例如改善骨密度和骨形成的有益組合物，以及與其有關的方法。骨量在整個生命過程中逐步發展，并由遺傳、力學和激素機制調節。骨礦物質的獲得出現在童年，在20歲左右達到骨量峰值。在此期間，骨形成超過骨吸收。在生命的后期和尤其是更年期左右或在年老人群中，由于伴有過量骨吸收的較高骨轉換，使骨量和質量受損，導致骨量、微結構、構造和強度的逐漸損失。為了維持骨健康，重要的是恢復骨形成和骨吸收之間的平衡。在骨細胞水平調節該骨再造過程涉及骨形成細胞(成骨細胞)和骨吸收細胞(破骨細胞)之間密切的相互作用。植物營養素、尤其黃酮類可對骨再造過程產生積極的影響。報道最多的數據是有關大豆異黃酮的，在一些研究中顯示了其在劑量為50-90mg/天時可預防絕經女性骨丟失并改善骨礦物質密度(BMD)。然而，并非在所有研究中異黃酮類都是陽性的，對于它們的功效仍存在爭議。另外，因為先前的研究顯示在老年人中飲茶者的平均BMD高于非飲茶者，對茶的益處存在一些流行病學證據，但沒有進行干預性研究來證實該發現。當前，在鑒定可刺激骨形成的活性劑方面存在濃厚的興趣。顯示重組BMP-2的遞送誘導骨或軟骨的形成。例如，骨形態發生蛋白2(BMP-2)是TG邪家族的成員并且是胚胎發育期骨生長以及進一步的骨生長和修復的關鍵調節劑。他汀類(通過抑制HMG-CoA還原酶降低膽固醇的有效藥物)可改善骨形成，其改善骨形成是部分通過誘導BMP-2來介導的(G.Mundy等人，286:1946-1949(1999);C.J.Edwards等人，丄a"c"，355:52218-2219(2000))。他汀類也能夠降低絕經女性髖部骨折的風險(P.S.Wang等人，X4編283:3211-3216(2000))。發明概述概括而言，本發明涉及用于維持骨健康或預防、緩解和/或治療骨病的營養組合物。本發明也提供了用于促進骨生長或維持骨健康的營養產品、補充劑或藥物的制備，以及與此有關的方法。具體而言，本發明提供了用于促進對骨生長重要的骨形成和通過平衡骨再造維持骨健康的營養產品、補充劑或藥物的制備，以及與其相關的方法。本發明的一個實施方案提供了組合物，其包含含有有效量的植物或植物提取物的活性成分，所述植物或植物提取物含有至少一種具有誘導骨形態發生蛋白表達能力的植物化學成分。在一個實施方案中，所述植物或植物提取物還抑制骨吸收。在一個實施方案中，所述植物是迷迭香或葛縷子。在一個實施方案中，所述植物化學成分選自楔葉澤蘭素、鼠尾草酚、野黃芩素、芫花素、山柰酚、金合歡素、迷迭香酸、迷迭香酚、薊黃素、木犀草素、7-表迷迭香酚和圖7A的化合物C-0063-W-06，及其組合。在一個實施方案中，組合物可以是選自以下的形式營養均衡的食物、寵物食物、膳食補充劑、治療劑、藥物組合物及其組合。在一個實施方案中，組合物可旨在在骨折愈合期有助于骨再生、在生長期增加骨形成和骨礦物質密度以及優化骨量峰值或降低骨丟失，尤其是人或寵物中與年齡有關的骨丟失。在一個實施方案中，組合物可旨在構建人或寵物的軟骨。在一個實施方案中，組合物可旨在預防人和寵物的骨關節炎。本發明的另一個實施方案提供了組合物，其包含含有有效量的迷迭香植物或迷迭香植物提取物的活性成分，所述植物或植物提取物含有至少一種具有誘導骨形態發生蛋白表達能力的植物化學成分。例如，植物化學成分可選自楔葉澤蘭素、鼠尾草酚、野黃芩素、芫花素、山柰酚、金合歡素及其組合。本發明的另一個實施方案提供了用于制備預防、緩解和/或治療人或寵物的骨病或維持骨健康的食物組合物的方法，所述方法包括提供食物組合該組合物，所述植物或植物提取物含有至少一種具有刺激骨形態發生蛋白表達和/或抑制骨吸收能力的植物化學成分。例如該組合物可包含選自以下的組分菊苣、茶、可可、生物活性物、抗氧化劑、脂肪酸、益生元纖維、葡萄糖胺、硫酸軟骨素及其組合。本發明的另一個實施方案提供了用于治療、緩解或預防骨病或維持骨健康的方法，所述方法包括向需要這些的個體施用治療有效量的組合物，該組合物包含含有有效量的至少一種植物或植物提取物的活性成分，所述植物或植物提取物含有至少一種具有誘導骨形態發生蛋白表達能力的植物化學成分。本發明的另一個實施方案提供了用于在人或寵物的生長期增加骨形成、骨礦物質密度并優化骨量峰值的方法，所述方法包括使個體進食包含含有有效量的至少一種植物或植物提取物的活性成分的組合物，所述植物或植物提取物含有至少一種具有誘導骨形態發生蛋白表達能力的植物化學成分。本發明的另一個實施方案提供了用于治療、緩解和/或預防寵物和人的骨關節炎的方法，所述方法包括使患有或處于骨關節炎風險的個體進食包含含有有效量的至少一種植物或植物提取物的活性成分的組合物，所述植物或植物提取物含有至少一種具有誘導該個體中骨形態發生蛋白表達能力的植物化學成分。本發明的另一個實施方案提供了治療或預防骨質疏松癥的方法，所述方法包括向患有或處于骨質疏松癥風險的個體施用治療有效量的組合物，該組合物包含含有有效量的至少一種植物或植物提取物的活性成分，所述植物或植物提取物含有至少一種具有誘導該個體中骨形態發生蛋白表達能力的植物化學成分。本發明的另一個實施方案提供了在骨折愈合期間刺激骨再生的方法，所述方法包括使骨折的個體進食治療有效量的組合物，該組合物包含舍有有效量的至少一種植物或植物提取物的活性成分，所述植物或植物提取物含有至少一種具有誘導該個體中骨形態發生蛋白表達能力的植物化學成分。本發明的另一個實施方案提供了降低骨丟失的方法，所述方法包括使顯示骨丟失的個體進食包含含有有效量的至少一種植物或植物提取物的活性成分的組合物，所述植物或植物提取物含有至少一種具有誘導該個體中骨形態發生蛋白表達能力的植物化學成分。本文還描述了其他特征和優點，其在以下詳細說明和附圖中是顯而易見的。附圖筒要說明圖1顯示提取流程。圖2顯示提取方法和第一次分級的總結。圖3A顯示迷迭香和葛縷子提取物的BMP-2試驗結果。圖3B顯示迷迭香和葛縷子提取物的堿性磷酸酶試驗結果。圖3C顯示迷迭香和葛縷子提取物在器官培養中的骨形成作用。圖4顯示從NRC最初MeOH/水提取物開始的提取方法和各提取物的BMP-2活性(從80g干燥的葉提取(己烷=6g))。圖5顯示應用迷迭香提取物的體內骨形成。圖6A顯示在BMP-2試驗中發現呈陽性的酚類化合物。圖6B顯示BMP-2陽性的酚類化合物的堿性磷酸酶試驗。圖6C顯示器官培養骨形成實例是楔葉澤蘭素和鼠尾草酚。圖7A-B顯示迷迭香提取物2188中分離的化合物。圖8A顯示迷迭香提取物對人破骨細胞活性的詳細作用。8圖9A、B和C顯示迷迭香提取物和鼠尾草酚對關節軟骨代i射的詳細作用。圖10顯示由迷迭香提取物或鼠尾草酚誘導人成骨細胞(hPOBtert)中的骨橋蛋白(OPN)mRNA。圖11顯示鼠尾草酚誘導II相酶NQOl表達，即代表性Nrf-l調節的基因/蛋白。發明詳述本發明涉及可用于例如改善骨密度和骨形成的有益組合物，以及與其有關的方法。例如，本發明的一個實施方案涉及刺激骨形成和改善骨維持的植物和植物提取物。植物中，許多類異戊二烯(單萜、倍半萜等)是HMG-CoA還原酶和蛋白質異戊二烯化的調節劑，其機制可能與抑制骨吸收或促進骨生成有關。因此，某些植物的化合物可以是潛在的骨吸收的抑制劑和/或骨形成的促進劑。在本發明的實施方案中，各提取物是從可食用和/或藥用植物中制備的，據稱這些植物具有緩解絕經期癥狀的潛在益處或能夠影響膽固醇合成通路，并因此具有刺激BMP-2和骨形成的潛能。如下文所詳細討論的，通常通過4個步驟的方法制備提取物(a)己烷，(b)甲醇-水，(c)用糖苷酶水解甲醇—水提取物，并再用乙酸乙酯提取，以及(d)用PVPP柱除去大量多酚。甲醇-水和乙酸乙酯提取物用于體外篩選。用a-和(5-糖苷酶代替酸來水解提取物以保證從其苷中水解出黃酮苷元(生物活性形式)。以下生物試驗用于骨形成分析BMP-2報告基因試驗(高通量篩選)成骨細胞中的堿性磷酸酶體外顱蓋培養，骨形成體內注射于顱蓋，骨形成。例如，通過BMP-2高通量報告基因試驗，隨后通過堿性磷酸酶試驗和器官培養模型以及最終的體內注射于小鼠的顱蓋，對各提取物進行了骨形成篩選。進一步測試陽性提取物的各亞級分和/或各純化合物的活性。為了確定活性化合物進行了一種活性提取物的化學成分分析。令人驚訝地發現，從迷迭香植物中提取分離的化合物可作為用于骨發育、生長和/或維持的活性化合物。例如，至少3種酚類化合物(例如楔葉澤蘭素、鼠尾草酴、野黃茶素)可有助于迷迭香提取物的合成代謝潛能。迷迭香的其他酚類化合物包括芫花素、山柰酚、金合歡素。在成骨細胞/破骨細胞共培養系統中測試了迷迭香植物提取物和純化合物。迷迭香提取物以及這3種酚類化合物顯示具有調節控制骨再造的關鍵細胞因子(即OPG/RANKL)的活性。另外，發現迷迭香提取物和鼠尾草酚可能通過AP-l/Nrf-2信號通路刺激人成骨細胞中骨橋蛋白(OPN)的表達。活性迷迭香提取物的三種成分是新的，且未曾有文獻報道。而且，因為一些化合物屬于相同的化學類型，這些成分的交聯生物學評價可產生令人感興趣的結構-活性關系(例如鼠尾草酚/迷迭香酚/異迷迭香酚)，其可為迷迭香提取物提供另外的策略，也可為含有已知的大多數活性成分的其他植物提供策略。在本發明的一個實施方案中，在用己烷脫脂的步驟后得到的迷迭香植物的MeOH/水提取物(最初干燥葉的25%)含有發揮該活性作用的分子且可用于食品中。由于活性化合物被其他化合物稀釋且部分也由于以結合的形式存在，最初的MeOH/水提取物在體外試驗中僅發現輕微的活性。通過乙酸乙酯萃取和/或糖苷酶水解然后乙酸乙酯萃取的純化/濃縮后，在BMP-2試驗中發現了高活性。根據本發明實施方案的植物或植物提取物可用于制備食物組合物。該組合物可以是營養均衡食物或寵物食物、膳食補充劑、治療或藥物組合物的形式。例如，植物或植物提取物可單獨應用或與其他植物如菊苣、茶、可可聯合應用，或與其他生物活性分子如抗氧化劑、脂肪酸、益生元纖維、葡萄糖胺、硫酸軟骨素聯合應用。10在本發明的一個實施方案中，制備了用于人消費的食物組合物或營養配方。該組合物可為全營養配方、乳制品、冷凍或常溫穩定的飲料、湯、膳食補充劑、膳食替代品和營養棒或甜食。除了根據本發明的迷迭香植物或迷迭香植物提取物外，營養配方還可包含蛋白質源。優選應用膳食蛋白質作為蛋白質源。膳食蛋白質可為任何合適的膳食蛋白質；例如動物蛋白(如乳蛋白、肉蛋白和印蛋白)；植物蛋白(如大豆蛋白、小麥蛋白、大米蛋白和豌豆蛋白)；游離氨基酸的混合物；或其組合。特別優選乳蛋白如酪蛋白、乳清蛋白和大豆蛋白。組合物也可包含碳水化合物源和脂肪源。如果營養配方包括脂肪源，該脂肪源優選提供該營養配方能量的約5%至約55%;例如提供能量的約20%至約50%。組成脂肪源的脂類可為任何合適的脂肪或脂肪混合物。植物脂肪特別適用；例如大豆油、棕櫚油、椰子油、紅花油、葵花子油、玉米油、蕓苔油、卵磷脂等。如果需要，也可加入動物性脂肪如乳脂。營養配方中可加入碳水化合物源。所述碳水化合物源優選提供該營養組合物能量的約40%至約80%。可應用任何合適的碳水化合物，例如蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、玉米糖漿固體和麥芽糖糊精及其混合物。如果需要也可加入膳食纖維。如果應用，則其優選包含營養配方的至多約5%的能量。膳食纖維可來自任何適當來源，包括例如大豆、豌豆、燕麥、果膠、瓜爾膠、阿拉伯樹膠和低聚果糖。營養配方中也可包括符合適當指標的量的適合的維生素和礦物質。如果需要，可在營養配方中摻入一種或多種食物級乳化劑；例如二乙酰酒石酸單甘油酯、二乙酰酒石酸雙甘油酯、卵磷脂及單甘油酯和雙甘油酯同樣地可包含合適的鹽和穩定劑。植物提取物也可與維生素和礦物質組合。優選可經腸施用的營養組合物；例如以散劑、片劑、膠嚢劑、液態濃縮劑、固體產品或即時飲的飲料的形式。如果想生產粉末狀營養配方，可將經過勻化加工處理的混合物轉移到合適的干燥器如噴霧干燥器或冷凍干燥器中并轉化為粉末。在另一實施方案中，營養組合物包含基于乳的谷物食品以及益生元配方。優選地，基于乳的谷物食品是作為益生元配方的載體的嬰兒谷物食品。在另一實施方案中，可用至少一種本發明的植物或植物提取物強化普通食品。例如發酵乳、酸奶、新鮮乳酪、凝乳、甜食如糖果或甜々欠料、甜條、早餐谷片或條、飲料、奶粉、豆制品、非乳發酵品或用于臨床營養的營養補充物。組合物中#_物或植物提取物的量可根據植物源和它的用途而改變。在一個優選的實施方案中，其有效日劑量為至少約1mg活性分子/天，更優選為1mg至200mg活性分子/天。在另一個實施方案中，可制備至少包含如上所述的迷迭香提取物或植物化學成分的藥物組合物，所述提取物或植物化學成分的量足以在個體中達到預期效應。該組合物可為片劑、液體、膠嚢劑、軟膠嚢劑、糊劑、錠劑、膠劑或可々大用溶液或乳劑、干的經口補充物、濕的經口補充物。該藥物組合物可進一步包含適于向靶組織遞送不同性質的各活性分子的載體和賦形劑。栽體/賦形劑的種類和其量取決于物質的性質和藥物遞送和/或施用方式。可以理解熟練人員基于他自己的知識可選擇適當的組分和蓋倫劑型。本發明的植物或植物提取物可用于制備寵物食物組合物。所述組合物可作為寵物正常飲食的補充物或作為全營養寵物食物的組分施用，并且更優選在低熱量寵物食物中。它也可為藥物組合物。植物或植物提取物可單獨應用或與其它植物如菊苣、茶、可可聯合應用，或與其它生物活性分子如抗氧化劑、脂肪酸、益生元纖維、葡糖胺、硫酸軟骨素聯合應用。優選地，對于寵物食物組合物，用于15kg的犬的每克干寵物食物包含約0.01至0.5g干植物；用于15kg的犬的每克濕寵物食物包含約0.001至0.1g干植物。根椐本發明的全營養寵物食物組合物可為粉狀、千燥形式、治療劑或為濕的、冷凍的或常溫穩定的寵物食物產品。可將它冷凍或作為常溫穩定產品提供。這些寵物食物可以本領域已知的方式生產。寵物食物也可任選包含益生元、益生微生物或其它活性劑，例如長鏈脂肪酸。寵物食物中益生元的量優選占重量的10%以下。例如，益生元可占寵物食物重量的約0.1%至約5%。對于用菊苣作為益生元來源的寵物食物，所包括的菊苣可占食物混合物重量的約0.5%至約10%;更優選占重量的約1%至約5%。如果應用益生微生物，寵物食物優選每克寵物食物包含約104至約101()個益生微生物細胞；更優選每克約106至約108個益生微生物細胞。寵物食物可包含占約0.5%至約20%重量的益生微生物混合物；優選地占重量的約1%至約6%;例如占重量的約3%至約6%。如果需要，可向寵物食物添加礦物質和維生素以使它們營養全面。此外，根據需要，也可將多種其它成分如糖、鹽、香料、調料、調味劑等摻入寵物食物中。在另一實施方案中，可制備膳食添加劑以改善寵物食物的質量。作為膳食添加劑，它們可被封入膠囊內或以散劑形式提供并與正餐(濕的或干的)一起包裝或單獨包裝。例如，含有本發明提取物的粉末可以粉末形式包裝入小袋中或包裝到凝膠或脂或其它合適的載體中。根據使用者的要求，這些單獨的包裝單位可與正餐一起提供或為與正餐或治療劑一同應用的多單位包裝。為達到有益效果，寵物消耗的寵物食物的量取決于寵物的大小、寵物的類型和寵物的年齡。但是，每天提供每千克體重約0.5至5克干植物的寵物食物的量對犬和貓一般是足夠的。對人或動物施用上述食物或寵物食物組合物，可在骨折愈合期改善骨再生。它有助于在生長期刺激骨形成和骨礦物質密度，并優化骨量峰值。特別是它可在兒童期提供最佳骨生長。該食物組合物有助于預防骨丟失，特別是哺乳動物中與年齡相關的骨丟失或長期住院相關的骨丟失。它降低了骨質疏;k癥的危險并改善骨折后的恢復。此外，它有助于構建哺乳動物的軟骨，預防寵物和人的骨關節炎，其導致個體(例如寵物和/或人)的活動或移動性更好。實施例以下實施例是以舉例和非限制的形式闡述本發明的多種實施方案，并且還闡述了根椐本發明的各實施方案進行的實驗性測試。實施例1選擇的植物和純化合物根據對植物中酚類的認識選擇植物(i)從含有雌激素樣物質的植物數據庫中選棒了25種植物以及大豆沐1A)(ii)含有影響膽固醇合成途徑的物質并因此具有間接刺激BMP-2和骨形成的潛能的9種植物+大豆(表IB)(m)純化合物雌二醇-17p、染料木素、黃豆配基、20種黃酮類化合物、菊苣化合物(倍半萜內酯類)。表1A:選自雌激素樣植物數據庫的植物列表<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>淫羊藿淫羊藿屬(Epimedium)短角淫羊藿(Epimediumbrevicornum)地上部分SaintCatherine'sLace野蕎麥屬(Eriogonum)大絨毛蓼(Eriogonumgiganteum)莖/葉/才艮秀尾鳶尾屬(Iris)白豸尾(Irispallida)根莖秀尾秀尾屬(Iris)白豸尾細胞培養物秀尾秀尾屬(Iris)黃秀尾(Irispseudacorus)葉/種子刺柏刺柏屬(Juniperus)歐洲刺柏(Junipemscommunis)果實/葉/木部LecaniodiscusLecaniodiscuscupianoides葉/種子美國山胡相t山胡4權屬(Lindera)美國山胡梯t(Linderabenzoin)葉/果實羅勒羅勒屬(Ocimum)丁香羅勒(Odmumgratissimum)葉/種子酸木南燭屬(Oxydendrum)南燭木(Oxydendrumarboretum)葉大車前車前草屬(Plantago)車前草(l)lantagomajor)葉桃李屬(Pru國)桃(Prunuspersica)種子光滑漆樹(smoothsumac)鹽膚木屬(Rhus)光葉漆(Rhusglabra)葉/果實黃芩黃芩屬(Scutellaria)Scutellariacostaricana全草黃芩黃芩屬黃芩(Scutellariabaicalinensis)全草普通菊蒿艾菊屬(Tanacetum)普通菊蒿(Tanacetumvulgare)葉藥蒲公英蒲公英屬(Taraxacum)藥蒲公英(Taraxacumofficinalis)根斑鳩菊斑鳩菊屬(Vernonia)夜香牛(Vernoniacinerea)葉15表IB:因其對膽固醇和BMP-2的潛在作用而選擇的植物列表<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>迷迭香迷迭香酸金合歡素山柰酚洋蔥，蘋果槲皮素茶兒茶素茶表兒茶素芽菜素柑橘橙皮素葡萄抽柚苦配基葡萄白藜,醇根皮素香葉木素香葉木苷薊黃素粗毛豚草素菊苣萵苣苦素山萵苣苦素3-脫氧萵苣苦素香葉醇香芽酮植物提取流程參考圖1，提取流程包括以下步驟己烷，脫脂(提取物未經篩選)MeOH/H20(la)MeOH/H20,用a-和p-糖普酶水解，經乙酸乙酯萃取(lb)la經PVPP柱純化以除去高分子量的多酚類(2a)lb經PVPP柱純化以除去高分子量的多酚類(2b)。提取物2a和2b給出與提取物la和lb相似的結果，因此隨后停止了多酚純化的步驟。提取過程包括用糖苷酶處理(代替酸水解)以保證黃酮苷類向苷元的轉化。分乙酸乙酯、然后乙酸乙酉旨/曱醇(95/5)、隨后乙酸乙酉旨/甲醇(50/50)以及最后曱醇(圖2)。篩選步驟和生物學方法按以下各步驟進行骨形成篩選(i)非水解MeOH/H20提取物(la)和乙酸乙酯中的相應的經糖苷酶水解的提取物(lb)的BMP-2高通量報告基因篩選。在培養基中稀釋所制備的50mg/ml在DMSO中的植物提取物儲備液，提取物在1至100ng/ml的濃度下測試兩次。(ii)重新制備在BMP-2篩選中呈陽性的提取物，并根據劑量-反應再次篩選以確定其為"命中物"。(iii)陽性物/命中物的細分級和候選的純化合物的BMP-2測試。(iv)在BMP-2試驗中顯示陽性的提取物進一步進行采用堿性磷酸酶試l^的成骨細胞分化測試并采用培養的顱蓋骨和組織形態測定法在骨形成的器官特征模型中進行測試以確證骨形成，如Traianedes等人所述(1998)。(v)最后在體內將"命中"提取物注射入小鼠顱蓋骨，并監測骨的面積和厚度。在4天的體外新生鼠顱蓋試驗中評價提取物。骨與提取物孵育4天整。(vi)通過測定當破骨細胞消化骨時釋放在培養基中的I型膠原的量監測吸收活性。(vii)在牛關節軟骨外植體中，對細胞因子誘導的II型膠原降解、MMP-介導的聚集蛋白聚糖降解和聚集蛋白聚糖酶介導的降解的作用。結杲在BMP-2報告基因和器官培養中篩選植物提取物表2和3給出如下的BMP-2篩選的詳細結果。18-發現15種提取物對BMP-2呈陽性。其中，在2輪BMP-2篩選中鑒別出了5種確定的命中物和活性亞級分(迷迭香、藥蒲公英、美國山胡椒、香附子、白秀尾)，以及5種另外感興趣的陽性提取物(迷迭香、葛縷子、百里香、留蘭香和葡萄)。-在鼠顱蓋器官培養模型中也確定了2輪BMP-2篩選中的確定命中物和活性亞級分(迷迭香、藥蒲公英、美國山胡椒、香附子、白秀尾)和5種另外感興趣的陽性提取物(迷迭香、葛縷子、百里香、薄荷和葡萄)是有活性的。-在顱蓋器官培養模型中，進一步確證了活性提取物或亞級分可刺激骨形成白駑尾、香附子、迷迭香、百里香、葛縷子。表2:在BMP-2篩選中呈陽性且在器官培養中確證的提取物的總結植物提取物Extii0活性濃度(Hg/ml)在器官培養中的骨形成結果&注釋大豆EtOAc200110，50輕微骨形成迷迭香MeOH/水200410，50在顱蓋培養中骨形成良好迷迭香EtOAc200510(50，毒性)輕微骨形成香附子亞級分！201210，50輕微骨形成白狄C18MeOH亞級分202210部分骨形成亞級分百里香EtOAc206710部分骨形成葛縷子EtOAc207410輕微骨形成表3:植物提;^物結果至命中物的鑒別的全面總結在"英文名部位提取BMP-2陽性提取物BMP-2陽性亞級分器官培養大豆細胞培養物乙酸乙酯7682001菖蒲塊莖MeOH/H2。731未檢測果實MeOH/H20219未檢測<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>植物提取物篩選的結論在器官培養骨形成試驗中確定的BMP-2命中物是大豆種子、迷迭香葉、百里香葉、葛縷子種子的提取物。在堿性磷酸酶試驗和器官培養中確定的對BMP-2活性的迷迭香和葛縷子命中物的實例圖3A-C顯示迷迭香和葛縷子提取物的命中物的骨形成試驗結果。提取方法對BMP-2活性的影響用甲醇/水笫一次提取預先脫脂的迷迭香葉后(ext.2127),在10pg/ml對BMP-2基因表達的誘導為1.5X(圖4)。專門用乙酸乙酯(2188)提取該提取物，導致增加了BMP-2的表達(8X誘導)。這表明EtOAc提取過程^使活性化合物從最初的MeOH/水提取物中濃縮。用糖苷酶水解后，得到的乙酸乙酯提取物(2189)也是有活性的，顯示萃取出了另外的活性分子。提取物2189比非水解部分的活性略強。這些結果明確顯示了兩種提取物(非水解2188和水解2189)的活性，表明活性分子以兩種形式游離形式和/或在最初提取物中的結合形式(糖基化)存在。體內注射后的顱蓋骨形成在3種獨立的骨形成體外試驗(BMP-2、堿性磷酸酶、骨器官培養)以及顱蓋體內試驗中，迷迭香(迷迭香提取物)顯示骨形成活性(參見圖5)。將迷迭香提取物(首先用水提取葉，水解水提取物，然后用乙酸乙酯提取)注射到鼠的顱蓋，隨后進行先體外后體內的骨形成分析。純化合物的篩選在1-10nM的濃度測試酚類化合物。表4列出了在BMP-2試驗中有活性的酚類化合物。圖6A-C顯示在骨形成試驗中呈陽性的一些酚類化合物。表4:在BMP-2、ALP和器官培養試驗中有活性的酚類化合物:黃酮類BMP漏2誘導ALP活性誘導器官培養中的骨形成楔葉澤蘭素3-8X2X，4X在2.5、5.0、10nM有良好骨2.5-10,5，10,形成鼠尾草酚4,5-7X2X在2.5nM有輕微骨形成2.5-10nM2.5-10nM(非劑量-反應)在5、10^M有良好骨形成野黃芩素3國4X2X在2.5pM沒有骨形成5，10nM10nM在5、10jiM有部分骨形成芫花素4X51.5X10nM沒有骨形成山柰酚2.5X1-10nM2剛4X2.5-10fiM在10nM有輕微骨形成金合歡素3-5X5-10jiM2X5-10pM(非劑量-反應)沒有骨形成迷迭香成分分析表5顯示從迷迭香提取物中發現的純化合物。表5:迷迭香的成分名稱類型化合物芫花素黃酮7-甲基-芹菜素芫花素_4，-葡萄糖苷黃酮7-曱基-芽菜素-4，-葡萄糖苷鼠尾草素黃酮多曱基化芽菜素^菜素黃酮木犀草素_3，_0_葡萄糖醛酸苷黃酮木犀草素_3，_0_葡萄糖醛酸苷香葉木素黃酮3'-0-甲基-木犀草素木犀草素黃酮橙皮苦二氫黃酮糖基化的橙皮苷咖啡酸酚酸鼠尾草酚二碎酚鼠尾草酸二碎酚迷迭香酸酚酸BMP-2活性的迷迭香提取物的分析根據顯示骨形成活性集中于從進行(2189)或不進行(2188)酶水解的甲醇/水提取物制備的乙酸乙酯提取物的前述結果，選擇提取物用于分析(參見圖4)。選擇對乙酸乙酯提取物2188的主要成分進行植物化學研究，包括通過HPLC/ELSD/UV/MS鑒定和純化這些化合物。該工作是由AnalyticonDiscoveryGmbH(波茨坦)完成的。然后完成了對在BMP-2試驗中有活性的迷迭香提取物的深入的植物化學評價。初步結果是分離了13個化合物。鑒定了9個化合物。其他4個化合物需要進一步的研究。進一步的研究描述了由AnalyticonDiscoveryGmbH(波茨坦)通過H-NMR和2D-NMR(H，H-COSY、HMBC、HMQC)對這4個化合物進行的結構解析。Analyticon提供了13個經鑒定的純化合物以對其進行對骨健康的生物活性評價。這些化合物列于表6中，其結構如圖7A-B所示。其中，3個是23新化合物，未曽有文獻報道(XI、XII和XIII)。這13個成分的化學結構-生物活性的關聯可為骨健康研究的進一步發展提供令人感興趣且有意義的工具。表6:從迷迭香提取物2188中分離的14個化合物<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>健康試驗中評價其生物活性。迷迭香提取物及其抗骨吸收活性骨質疏松是一種慢性疾病，其特征是緩慢的骨丟失。骨不是死亡組織。相反，通過新的骨組織代替老的骨組織而不斷地再造骨。該再造由4吏骨沉積的成骨細胞和溶解骨的破骨細胞控制。通常，骨形成和骨吸收之間密切關聯，因而沒有出現凈骨丟失。骨質疏松時，因為骨丟失比骨形成更占優勢，該關聯是不完善的。為了治療骨質疏松，目標可以是增加骨形成，可以是降低骨丟失，或既增加骨形成又降低骨丟失。在該實施例中，顯示迷迭香提取物可降低骨丟失。通過測定當其消化骨時釋放到培養基中的I型膠原蛋白的量監測其吸收活性。I型膠原蛋白是骨中主要的有機分子。當消化骨時，骨的礦物相溶解，使膠原纖維暴露于具有蛋白水解酶活性的基質金屬蛋白酶。一旦被消化，膠原蛋白就變得可溶，并被釋放到通過ELISA試驗-CTX-I試驗可定量測定其存在的培養基中。圖8A詳細給出了迷迭香提取物對人破骨細胞活性的如下影響迷迭香提取物1(提取物P31，可從Robertet商購獲得)在10ng/ml的濃度相對于單獨的培養基(對照(CTL))降低從骨切片釋放的I型膠原蛋白的量(圖8A)。迷迭香提取物和骨關節炎骨關節炎是一種特征為關節軟骨緩慢破壞的疾病。該軟骨的破壞是由于軟骨細胞合成代謝和分解代謝活性不平衡造成的。軟骨細胞是軟骨中存在的唯一類型的細胞，并擔負著維持軟骨細胞外基質的作用。在骨關節炎的情況下，代謝增加并引起軟骨丟失。軟骨細胞外基質由兩種主要的分子組成II型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖。膠原蛋白主要被基質金屬蛋白酶(MMPs)消化，而聚集蛋白聚糖可被MMPs和稱為聚集蛋白聚糖酶的其他類型的酶降解。在此我們研究的是2種不同的迷迭香提取物和該提取物的主要成分之一鼠尾草酚是否可抑制培養的關節軟骨外植體中膠原蛋白和聚集蛋白聚泮唐的降解。培養來自健康牛的關節軟骨的外植體。但是，這些外植體天然顯示很低的分解代謝活性，用其測試潛在生物活性物的抗分解代謝活性是不200780020499.0理想的。為改善該試驗的靈敏度，在共同作為MMP和聚集蛋白聚糖酶活性誘導劑的2種本領域已知的促炎細胞因子TNF-ot和制癌蛋白存在下培養所迷外植體。迷迭香提取物和鼠尾草酚對關節軟骨分解代謝的作用圖9A、B和C詳細給出了迷迭香提取物和鼠尾草酚對關節軟骨分解代謝的如下作用迷迭香提取物l(提取物P31，可從Robertet商購獲得)在10嗎/ml的濃度下完全抑制了由促炎細胞因子TNF-a和制癌蛋白誘導的膠原蛋白的降解(對照(CTL))(圖9A)。迷迭香提取物1(提取物P31，可從Robertet商購獲得)在10pg/ml的濃度下完全抑制了由促炎細胞因子TNF-a和制癌蛋白誘導的MMP介導的聚集蛋白聚糖的降解(對照(CTL))(圖9B)。迷迭香提取物1(提取物P31，可從Robertet商購獲得)在10pg/ml的濃度下也抑制了由促炎細胞因子TNF-a和制癌蛋白誘導的聚集蛋白聚糖酶介導的聚集蛋白聚糖的降解(對照(CTL))。類似地，濃度為1或5ng/ml的另一種迷迭香提取物—一迷迭香提取物2(如以上所述從圖爾的NestecR&DCenter獲得)和濃度為1或5fiM的鼠尾草盼也抑制了由細胞因子誘導的膠原蛋白的降解(圖9C)。OPNmRNA誘導細胞培養-將HPOBTert破骨細胞接種于涂覆膠原蛋白的板中，使其在補充有10%胎牛血清、1%L-谷氨酰胺和青霉素/鏈霉素、1mM(3-磷酸甘油和50fig/ml抗壞血酸的MEMEagleexModification培養基中在5%C02和95%空氣的潮濕環境中于37。C生長。當加入鼠尾草酚和抑制劑時，采用等量的Me2SO作為溶^f某對照。通過實時PCR分析mRNA水平-采用NucleoSpinRNAII試劑盒(Macherey-Nagel，瑞士)提取細胞總RNA。采用用于RT-PCR的第一鏈cDNA合成試劑盒(Roche，Mannheim,德國)對經不同處理的等量的(lpg)26RNA進行逆轉錄。從試劑盒向每個樣品中加入2pl10x反應緩沖液、4pl25mMMgCl2、2pl核苷酸混合物、2pl隨機引物、1jilRNAse抑制劑和0.4jalAMV逆轉錄酶。采用PTC-100TM(Concept,瑞士)在以下熱循環條件下(25。C10min，42。C60min和75°C5min)操作逆轉錄酶。實時定量PCR-在25pi中重復進行3次定量PCR。其由12,5jnlTaqman2xUniversalPCRMasterMix、1.25plAssay-on隱Demand引物和探針(AppliedBiosystems,USA)以及6.25pl無RNAse7JC組成。在ABI7000儀器(AppliedBiosystems)中以以下溫度分布進行擴增50。C2min、95。C10min,隨后是95。C15s和60。Clmin的40個循環。將基因表達水平核_正到p-肌動蛋白表達水平。圖10顯示通過實時PCR確定OPNmRNA水平，迷迭香提取物或鼠尾草酚劑量依賴性地誘導OPN的表達。使HPOBtert細胞在所示劑量的迷迭香提取物或鼠尾草酚中保持48h。NOOl誘導細胞質提取物的制備-用冷的磷酸鹽緩沖液洗滌hPOBtert細胞兩次，并用裂解緩沖液(1%曲通X-100、20mMTris/HClpH8、137mMNaCl、10%甘油、2mMEDTApH8以及新加入的蛋白酶抑制劑ImM苯基甲基碌酰氟、0.15U/ml抑肽酶、10pg/mlLeupeptide和10jug/ml胃酶抑制劑)收集。將樣品在13000rpm于4。C離心5分鐘，將上清液轉移至新管中。采用BioRad蛋白質試驗確定蛋白質濃度。將每種樣品約50^g與適當體積的樣品緩沖液混合，與5pl蛋白質標準物一起在95。C保持5分鐘使其變性，將其在水上冷凍，負載于10%預制凝膠，并采用抗NQOl抗體進行免疫印跡分析。免疫印跡-用SDS-PAGE溶解50ng蛋白質細胞裂解物。電泳后，根據廠商說明將蛋白質轉移到PVDF膜(Invitrogen)。將探查到OPN和NQOl的膜封閉，并在Tris-緩沖鹽水/吐溫(20mMTris堿，pH7.6,137mM，0.1%吐溫20)中的5%乳狀物中進行探查。通過化學發光顯影(蛋白質印跡檢測系統(AmershamBiosciences)M吏印跡可見。抗體-NQOl(sc-16464)-特異性抗體購于SantaCruzBiotechnologiesInc(SantaCruz,CA)。卩-肌動蛋白抗體(A-5441)購于Sigma。第二抗體購于Sigma。圖11顯示鼠尾草酚誘導II相酶NQOl(代表性的Nrf-1調節的基因/蛋白)的表達。安全性情況耐受性試驗在青年雄性Sprague-Dawley大鼠中進行耐受性試驗。對這些大鼠以每日每kg動物體重lg(提取物2127，MeOH/水)"通過管祠"口服喂養5天。在此處理期間或隨后10天的觀察期內沒有發現異常行為、死亡或毒性癥狀。因此認為迷迭香在這些條件下是安全的。結論將來源于32種植物的120種提取物在BMP-2試驗中進行篩選，將其中15種確定為陽性命中物。最有希望的提取物是來源于迷迭香以及來源于香附子、白駑尾、百里香和葛縷子的那些，發現它們在鼠顱蓋器官培養模型中也是有活性的。BMP-2試驗的命中物在用于體外骨形成的堿性磷酸酶和器官培養功能試驗中進行了確證。迷迭香(迷迭香提取物)是最有希望的命中物，其在3種獨立的骨形成體外試驗(BMP-2、堿性磷酸酶、骨器官培養)以及顱蓋體內試驗中顯示了骨形成活性。例如，迷迭香提取物在體內注射于鼠顱蓋后刺激了骨形成。6種酚類化合物(迷迭香的成分)(楔葉澤蘭素、鼠尾草酚、野黃茶素、芫花素、山柰酚、金合歡素)在3種骨形成試驗中是有活性的。活性最強的是楔葉澤蘭素和鼠尾草酚。從活性迷迭香提取物中分離鑒定了13種純的分子。其中3種是新化合物(XI、XII和XII),未曾有文獻^Jl。此外，本數據還顯示迷迭香提取物和鼠尾草酚能夠延緩軟骨破壞。該性質使其成為令人感興趣的候選物以在人或寵物中預防骨關節炎或延緩其進展。本數據也顯示迷迭香提取物能夠增加骨形成，還能夠降低骨吸收。顯示兩種性質的單一的化合物/提取物并不常見。這使得迷迭香提取物成為非常令人感興趣的候選物以在人或寵物中預防骨關節炎或延緩其進展。應理解的是對于本領域技術人員而言，本文所描述的目前優選的實施方案的多種變化和改進是顯而易見的。這些變化與改進可在不脫離本主題的主旨和范圍權利要求1.組合物，其包含含有有效量的植物或植物提取物的活性成分，所述植物或植物提取物含有至少一種具有誘導骨形態發生蛋白表達能力的植物化學成分。2.權利要求1的組合物，其中所述植物或植物提取物還抑制骨吸收。3.權利要求l的組合物，其中所述植物是迷迭香。4.權利要求l的組合物，其中所述植物化學成分選自楔葉澤蘭素、鼠尾草酚、野黃芩素、芫花素、山柰酚、金合歡素及其組合。5.權利要求l的組合物，其是選自以下的形式營養均衡的食物、寵物食物、膳食補充劑、治療劑、藥物組合物及其組合。6.權利要求1的組合物，其旨在在骨折愈合期有助于骨再生、在生長期增加骨形成和骨礦物質密度以及優化骨量峰值或降低骨丟失，尤其是人或寵物中與年齡相關的骨丟失。7.權利要求1的組合物，其旨在在人或寵物中構建軟骨和/或預防軟骨丟失。8.權利要求l的組合物，其旨在預防人或寵物的骨關節炎。9.組合物，其包含含有有效量的迷迭香植物或迷迭香植物提取物的活性成分，所述植物或植物提取物含有至少一種具有誘導骨形態發生蛋白表達能力的植物化學成分。10.權利要求9的組合物，其中植物化學成分選自楔葉澤蘭素、鼠尾草酚、野黃茶素、芫花素、山柰酚、金合歡素及其組合。11.用于制備預防、緩解和/或治療人或寵物的骨病或維持骨健康的食物組合物的方法，該方法包括提供食物組合物；以及向該食物組合物中加入包含植物或植物提取物的活性成分來制備該組合物，所述植物或植物提取物含有至少一種具有刺激骨形態發生蛋白表達和/或抑制骨吸收能力的植物化學成分。12.根據權利要求11的方法，其中所述植物是迷迭香。13.根據權利要求11的方法，其中所述植物化學成分選自楔葉澤蘭素、鼠尾草酚、野黃芩素、芫花素、山柰酚、金合歡素及其組合。14.權利要求ll的方法，其中所述組合物包含選自以下的組分菊苣、茶、可可、生物活性物、抗氧化劑、脂肪酸、益生元纖維、葡萄糖胺、硫酸軟骨素及其組合。15.用于治療、緩解或預防骨病或維持骨健康的方法，所述方法包括向需要這些的個體施用治療有效量的組合物，該組合物包含含有有效量的至少一種植物或植物提取物的活性成分，所述植物或植物提取物含有至少一種具有誘導骨形態發生蛋白表達能力的植物化學成分。16.根據權利要求15的方法，其中所述植物或植物提取物還抑制骨吸收。17.根據權利要求15的方法，其中所述植物是迷迭香。18.根據權利要求15的方法，其中所述植物化學成分選自楔葉澤蘭素、鼠尾草酚、野黃芩素、芫花素、山柰酚、金合歡素及其組合。19.在人或寵物的生長期增加骨形成、骨礦物質密度并優化骨量峰值的方法，所述方法包括使個體進食包含含有有效量的至少一種植物或植物提取物的活性成分的組合物，所述植物或植物提取物含有至少一種具有誘導骨形態發生蛋白表達能力的植物化學成分。20.根據權利要求19的方法，其中所述植物或植物提取物還抑制骨吸收。21.根據權利要求19的方法，其中所述植物是迷迭香。22.根據權利要求19的方法，其中所述植物化學成分選自楔葉澤蘭素、鼠尾草酴、野黃芩素、芫花素、山柰酚、金合歡素及其組合。23.用于治療、緩解和/或預防寵物和人的骨關節炎的方法，所述方法包括使患有或處于骨關節炎風險的個體進食包含含有有效量的至少一種才直物或植物提取物的活性成分的組合物，所述植物或植物提取物含有至少一種具有誘導該個體中骨形態發生蛋白表達能力的植物化學成分。24.根據權利要求23的方法，其中所述植物或植物提取物還抑制骨吸收。25.根據權利要求23的方法，其中所述植物是迷迭香。26.根據權利要求23的方法，其中所述植物化學成分選自楔葉澤蘭素、鼠尾草酚、野黃芩素、芫花素、山柰酚、金合歡素及其組合。27.治療或預防骨質疏松癥的方法，所述方法包括向患有或處于骨質疏松癥風險的個體施用治療有效量的組合物，該組合物包含含有有效量的至少一種植物或植物提取物的活性成分，所述植物或植物提取物含有至少一種具有誘導該個體中骨形態發生蛋白表達能力的植物化學成分。28.在骨折愈合期間刺激骨再生的方法，所述方法包括使骨折的個體進食治療有效量的組合物，該組合物包含含有有效量的至少一種植物或植物提取物的活性成分，所述植物或植物提取物含有至少一種具有誘導該個體中骨形態發生蛋白表達能力的植物化學成分。29.降低骨丟失的方法，所述方法包括使顯示骨丟失的個體進食包含含有有效量的至少一種植物或植物提取物的活性成分的組合物，所述植物或植物提取物含有至少一種具有i秀導該個體中骨形態發生蛋白表達能力的植物化學成分。全文摘要本發明涉及用于維持骨健康或預防、緩解和/或治療骨病的組合物和方法。本發明也提供了用于促進骨生長或維持骨健康的營養產品、補充劑或藥物的制備，以及與此有關的方法。本發明的一個實施方案提供了包含含有有效量的植物或植物提取物的活性成分的組合物，所述植物或植物提取物含有至少一種具有誘導骨形態發生蛋白表達能力的植物化學成分。文檔編號A61K36/53GK101460185SQ200780020499公開日2009年6月17日申請日期2007年4月3日優先權日2006年4月3日發明者A·圖什,B·勒莫爾,D·庫爾圖瓦,E·奧福德-卡萬,G·I·蘇恩,G·威廉森,L·阿梅耶申請人:雀巢產品技術援助有限公司