專利名稱：：包含蛋白質nmb0938的藥物組合物的制作方法
技術領域：
：本發明涉及醫藥領域，特別地涉及用于預防性或治療性應用的新型疫苗組合物的開發，所迷新型疫苗組合物允許增加針對不同來源的疾病的疫苗抗原的免疫應答的質量。現有技術腦膜炎奈瑟氏球菌(^/wer/a球菌，其唯一的已知宿主是人，并且是腦膜炎球菌性腦膜炎(meningococcalmeningitis)的致病因子。通常，在正常群體中的無癥狀攜帶者之中發現這種細菌，這種小生境是關于其微生物分離的最常見來源。在世界上，小于2歲的兒童是最易于感染腦膜炎球菌性腦膜炎的群體，然而，青少年和正常成人群體也可能受到影響。未治療的腦膜炎球菌病(meningococcaldisease)對于大多數患病個體是致命的，和疫苗接種可以通過甚至避免細菌移居來預防這種情形。已開發了幾種策略，目的是獲得能夠滿足所需要求的疫苗，以便在一般群體中誘導針對這種疾病的保護。為了這個目的，已考慮了莢膜抗原，因為它們的免疫學特異性已允許將這種微生物分類成血清群。這些血清群中的5種已被定義為是造成全世界的腦膜炎球菌病的大多數臨床病例的原因。A血清群是撒哈拉南部非洲中該病流行的主要原因。B和C血清群與發達國家中發生的大多數病例相關。Y和W-135血清群在美國一些地區中流行的該疾病和感染的其余病例的大多數之中存在，過去幾年出現顯著增加。因此，莢膜多糖成為作為疫苗候選物進行研究和評估的目標。賦予針對A、C、Y和W-135血清群的保護的基于莢膜多糖的四價疫苗已在美國得到許可。疫苗接種后所引發的抗體是血清群特異性的(RosensteinN.等人，2001.#e/7//gococca/d"e跳N.Engl.J.Med,344,1378-1388)。不同于其余血清群的血清群B繼續為地方性和流行性腦膜炎球菌病的重要原因，并且這主要是由于完全缺乏針對其的有效疫苗。已注意到，B莢膜多糖是弱免疫原性的，加之關于基于這種化合物的疫苗存在誘導免疫耐受和自身免疫的理論風險，這是因為其與存在于人類胎兒結構中的寡糖鏈具有結構相似性。(FinneJ.等人，1987./wo/7oc7ooa/s/7f/6od/^roup^邁e/72'/7《ococc/cross-reactsw/f/^■//cojwc^e/zzi"http:///"ewa7a/dex^/ewra/〃^wes.J.Immunol,138:"02-"07)。因此，針對B血清群的疫苗的開發集中于使用亞莢膜抗原。^處蛋冷^和發^^霧在70年代對于生產基于外膜蛋白質(outermembraneprotein,OMP)的疫苗的最初嘗試基于通過使用去污劑來從外膜蛋白質制備物中去除LPS(FraschCE和RobbinsJD.1978.戶rofec〃o/sga2'/2"gr卿JExpMed147(3):629-44)。然后，使外膜蛋白質0MPs沉淀以產生懸浮于氯化鈉中的聚集體。盡管在動物研究中獲得有希望的結果，但這些疫苗無法在成人或兒童中誘導殺菌抗體(ZollingerWD等人，1978.Sa/W/s/dy卿w/c^e//c/0"syVehser/fl邁e/7/刀《/〃f//^加e2profe//rac"'/es/7/邁aha/d力咖a/7S.J.Infect.Dis.137(6):728-39)。這些疫苗的差的性能在很大程度上歸因于伴隨著沉淀過程而出現的三級結構的喪失。因此，接下來的合理步驟是生產以其在外膜嚢泡形式中的天然構象展示出所述蛋白質的疫苗(ZollingerWD等人，1979.co邵/eiC潔//，cocca/^r，S//則/7.J.Clin.Invest.63(5):836-48;WangLY和FraschCE.1984./eye7，e/7faiVe/^e".a邁e/7//^/〃^^row;"sero加e26profe//2p<3cc//7ea/7f/eya/waf/o///2a/z/oi/se邁of/e7.InfectImmun.46(2):408-14136)。這些外膜嚢泡疫苗比0MP聚集體顯著更具有免疫原性，并且免疫原性顯示出通過吸附至佐劑氬氧化鋁而得到進一步增強(WangLY和FraschCE.1984.Afe/^eWs膨/7//7^77/^/<^row;7Asero07^26/7rofe//7p^scc2'/es/2tfey3/wflf/0"http://2a/sowsezffoc^e/.InfectImmun.46(2):408-14136)。已使用不同配方的可溶性外膜嚢泡疫苗進行了許多功效試驗。在20世紀80年代，分別作為對于古巴(SierraGV等人，1991.^2cc/"e邁ass1mcc//2"2'o/7rew/"C"6a.NIPHAnnDis.14(2):195-210)和初P威(BjuneG等人，1991.i/尸ecfo/o"fer歷e辺6ra/2e7es/c/eyscc/zzeaga/zzsf^tow/A/ffe/7/i7gococca7d/sease//7yV0r『3/.Lancet.338(8775):1093-6)中的疾病暴發的響應而開發出了2種最深入研究的疫苗。由古巴的FinlayInstitute生產的0MV疫苗(商業上稱為VA-MENG0C-BC)是從菌林B:4:P1.19，15開始生產的，并且其由所述菌抹的0MPs的制備物和分離的C血清群莢膜多糖組成，并吸附至氫氧化鋁(SierraGV等人，1991.Kacc//esgs/""^tow;75We/sser/a邁e/72'/7^7^7d/s..prc^ec^2'o/7fr/a7a/2^邁as51yscc2./7af/o力resw/fs//zCMa.NIPHAnnDis.14(2):195-210)。這種疫苗對于古巴中該流行病的快速下降作出了貢獻(RodriguezAP等人，7%eMemInst0swaldoCruz.94(4):433—40)。由NorwegianNationalInstituteforPublicHealth(NIPH)生產的疫苗最初在由屬于克隆ET-5的菌林(B:15:PI.7，16)引起的疾病的高度地方性流行期間使用。這種單價疫苗也是從純化的外膜嚢泡生產的并吸附在氫氧化鋁上(BjuneG等人，1991.W/e^o"er/Z7e/Z76ra刀eyes/c7ef<scc//zeags2'/2st^towjp5邁e/32'/2gococcs/d/seasei/齡哮Lancet.338(8775):1093-6)。外膜嚢泡疫苗似乎有效地呈遞處于足夠天然的構象的外膜蛋白質，從而允許至少在青少年和成人中產生功能性殺菌抗體。所產生的抗體應答也已顯示增加腦膜炎球菌的調理吞噬。疫苗的精確配制(例如，0MP含量、LPS含量和佐劑的存在或不存在)對于免疫原性具有顯著"f》響(LehmannAK等人，1991.//z/邁w/7/zat/o/zs《a2'ij^tserogrowpcAe/77//wz7//7esce/3ce.APMIS.99(8):769—72;GomezJA等人，1998.jVeiMer/a邁e/z/z^2.〃c^.Vaccine.16(17):1633-9;SteeghsL等人，1999./邁/z7W3C^e"/ci7/o尸Owteryl/e邁6ra/2e尸rc^e/i7S//aZ/i70/o7;^sacc力ar/f/e-/e/7cye/^齒fs"to尸Neisseriameningitidis.'//2/7we/7ceo/"」心Wa/7"o"fAe//zwz7W7eAe570/2se.InfectImimm.67(10):4988-93)。但是，從患者中獲得的分離物的抗原鐠快速改變，并且僅覆蓋有限數目的所選菌林的疫苗可能在數年內變得無效，除非改變疫苗組成以反映當地的流行病學。目前，0MV疫苗已比任何其他B血清群疫苗更廣泛地使用，并且在由單一PorA類型引起的疾病暴發的背景下可能是有用的。在菌林之間產生交叉反應性的免疫原仍有待充分定義。來自FinlayInstitute和NIPH疫苗試驗的疫苗接種后血清的研究暗示，針對PorA(Pl，1類血清亞型蛋白質)和0pcA(另一種主要0MP，以前稱為0pc)的抗體(WedegeE等人，1998.//zMZMe^espo/^esa^s//"yJ/ay'ory)/e/!76ra/2ei4/7〃ge/^o/Neisseriameningitidisd/w/v'/gf力eyVoT^e《2.a/7i^ro^row/^/Vofec,/o"7>/a/.InfectImmun.66(7):3223-31)是重要的血清殺菌活性的介體(主要是PorA),并且這2種蛋白質均顯示出顯著的菌林間的變異性。PorA蛋白是具有顯著水平的變異性的抗原，其在暴發之間和期間纟至歷連續變異(JelfsJ等人，2000.Se《we力ceKar/sf/o"f力eporAGe/2eo尸aC7o刀eo尸Neisseriameningitidist/ur//7gf//(/e頂/c5^read,ClinDiagnLabImmunol.7(3):390-5)。在疫苗接種后和疾病后的殺菌抗體主要針對這種抗原。但是，其變異性卻使得具有這樣的問題，即用單個菌林的0MV疫苗(單價的)進行免疫接種所產生的保護作用是否是廣i普的。為了解決這個問題，在荷蘭(RIVM)開發了一種0MV疫苗，其包含6種不同的致病性分離物的PorA蛋白(VanDerLeyP和PoolmanJT.1992.C0/7"ruc〃0/7a/zw/〃7We/7//r0fe//2.InfectImraun.60(8):3156-61;ClaassenI等人，1996.co/Ua//2//7^yes/c/eKscc//e.Vaccine.14(10):1001-8)。在這種情況下，從經充分表征的H44/76窗林的2種變體中提取出疫苗嚢泡，所述H44/76菌林已進行了遺傳改造以表達3種獨立的PorA蛋白。尋我遽^拔^顯然，外膜蛋白質(OMP)可以誘導針對B血清群疾病的功能性免疫應答，但由于在外膜蛋白質的表面上暴露的區域的極大異質性，迄今為止開發的疫苗中沒有一種是具有普遍保護性的。由外膜囊泡(OMV)疫苗誘導的適度交叉反應免疫性已推動了對于誘導功能性抗體且存在于所有腦膜炎球菌菌林上的外膜抗原(或抗原群)的尋找。如果它們與血清群無關地存在于所有菌抹上，那么它們可能構成真正通用的腦膜炎球菌疫苗的基礎，這將消除在多糖疫苗接種后致病性菌抹上的莢膜轉變的潛在問題。由于免疫顯性的PorA蛋白的變異性，因而其作為通用疫苗的用途8受到限制，因此考慮了許多其他主要外膜蛋白質用于疫苗候選物，并且這些中的幾種在進一步的開發中。已考慮的那些包括5類蛋白質(0pcA)、NspA和鐵調節的蛋白質(TbpA和B、FbpA、FeU)。TbpB與TbpA—起構成了轉鐵蛋白結合復合物的一部分。近期工作暗示，TbpA在鐵結合中具有比TbpB更大的功能作用(PintorM等人，"98.o,yVe/i^er/fl/Tze"http://^/"/^.JMedMicrobiol47(9):757-60),且是比TbpB更有效的免疫原。已經通過新型技術發現了高度保守的次要外膜蛋白質，其中使用來自不同腦膜炎球菌菌林的外膜蛋白質制備物的組合來免疫小鼠(MartinD等人，1997.Co/2ser^/A^/wer/s/z/e/2//7^7〃^Swr/sce戶rc^e//2Co/7尸ers戶rofec"'o/7flga/zsfi5>/7er//z/e/^a7//尸ec〃0/7.JExpMed185(7):1173-83)。將來自小鼠的B細胞用于生產雜交瘤，隨后就針對多種腦膜炎球菌菌抹的交叉反應性對所述雜交瘤進行篩選。發現一種具有高度交叉反應性的單克隆抗體與稱為NspA的22kDa外膜蛋白質結合。用重組NspA蛋白進行免疫接種顯示出在小鼠中誘導針對A-C血清群的菌抹的交叉反應性殺菌應答。疫苗接種還保護小鼠免于致命性腦膜炎球菌感染(MartinD等人，1997.Co//"e"尸rc^ec〃o/s^s/nWi^er/zse/^ai7/7/*ec〃o/7.JExpMed185(7):1173-83)。在遺傳上趨異的腦膜炎球菌菌林中的NspA序列的比較證實，該蛋白質是高度保守的(97%的同源性)(CadieuxN等人，1999.Sa"er/c油/a/7f/Crc^s-/Vc^ec"VeJc〃W〃esc/"ayl/o/70c/o/za7J/2t/6of////recfedaga/zzsfjVe/sser/a邁627//^/^/(/75^p爿Oi/ferle邁6ra/7e戶rofe//2.InfectIimnun67(9):4955-9)。使用抗NspA單克隆抗體，通過ELISA在99.2%的來自A-C無清群的受試菌林上檢測出NspA的存在(MartinD等人，1997.6V/7seryediVe2'sser2'a/zze/z/i2^7^/d/s5Vr/^ce戶rofe//2CV/7尸er51尸rofecf/oz3a^a//^^Jj77er2'yze/7fa//"/"ecf/o/7.JExpMed185(7):1173-83)。這些單克隆抗體已顯示出針對眾多腦膜炎球菌菌林具有殺菌作用，并且能夠在小鼠模型中減少腦膜炎球菌菌血癥(CadieuxN等人,1999.勘"e/7c油7a/zdCrc^-/Vofec〃1^J"/「/〃es<2yl/oaoc7o/7a/爿/2^/6of///^'reefed<sga//7Sf^^eisser/a/z/e/7//2g/f2'd2'syV一組eryl/e邁6ra/7e尸rWe/仏InfectImmun67(9):4955-9)。盡管這個數據似乎暗示NspA是能夠跨越血清群界線發揮保護作用的有希望的疫苗候選物，但來自小鼠的多克隆抗重組NspA血清不與約35%的致病性B血清群腦膜炎球菌菌抹的表面結合，雖然在這些生物中存在卿j基因(MoeGR等人，1999."/7Tere/7ces/./7iWaceInfectImmun67(11):5664-75)。腐處義^適《承奢差^ii^/y及^^^W教喊MC58(B血清群腦膜炎球菌)(TettelinH等人，2000.c咖/77eteScience287(5459):1809-15172)和Z2491(A血清群菌林)(ParkhillJ等人，2000.co邁p/efeZMC4seg:/e/2ceo/"asero^roi/p爿sfra/;3o尸jVe/sser/a邁e/2./g/f/d/sZ24^/.Nature404(6777):502-6173)的基周組序列在2000年期間得到闡明和公開。經注釋的基因序列的可得性應當對腦膜炎球菌疫苗研究具有顯著影響。在MC58基因組測序正在進行的同時，Pizza等人開始鑒定被預測編碼膜結合的、表面暴露的或輸出的蛋白質的開放讀碼框。他們鑒定了570種此類0RFs，經由聚合酶鏈式反應擴增它們，并將它們克隆到大腸桿菌(^yc力eWc力/a中，以允許作為具有His尾巴或谷胱甘肽S-轉移酶的融合蛋白來表達所編碼的蛋白質(PizzaM等人，2000.yl/e"2'/3gococcws6//^7o/e一Ce/70邁e^e^i/e/2c//7^.Science287(5459):1816-20)。61%(350種)的所選擇的ORFs得到成功表達，無法表達的那些通常是包含超過一個疏水跨膜結構域的那些(可能排除了許多外膜結合蛋白質)。所述重組蛋白質進行純化，并用于對小鼠進行疫苗接種。然后，通過酶聯免疫吸附測定法(ELISA)和流式細胞術就與多種腦膜炎球菌菌林的表面結合來對免疫血清進行評估，并且使用血清殺菌測定法就針對2種菌林的殺菌活性來對免疫血清進行評估。最后，基于在所有3種測定法中的陽性應答選擇出了7種蛋白質用于進一步的研究。使用與佐劑相組合的許多這些蛋白質的試驗疫苗制劑已顯示在小鼠中誘導顯著的針對同源腦膜炎球菌菌林(MC58)的殺菌抗體滴度，但所述蛋白質中沒有一種誘導與MC58外膜嚢泡疫苗一樣高的SBA滴度(GiulianiMM等人，2000.Proceedings12thIPNC.第22頁)。另一方面，存在某些證據表明，這些蛋白質的組合可以在小鼠中顯示出比單種蛋白質更高的免疫原性(SantiniL.等人，2000.Proceedings12thIPNC.第25頁)。可能通過蛋白質表達的失敗或其免疫學性質的修飾而在這個工作期間排除的眾多開放讀碼框也可能具有疫苗潛力并需要進一步研究。一旦了解獨個抗原對于腦膜炎奈瑟氏球菌的發病機理的貢獻，就可以更有效地選擇疫苗組分。抗原自身可能成為有效的疫苗候選物，或者備選地，減毒的突變體可以被視為疫苗的組分。腦膜炎球菌病的預防和/或治療中的一個重要問題是，由于到目前為止用作疫苗的抗原的異質性，迄今為止可得的疫苗中沒有一種能夠賦予通用保護。發明描述本發明通過提供包含這樣的蛋白質的藥物組合物而促成解決了前面提及的問題，所述蛋白質的序列即使在不同血清學分類的奈瑟氏球菌屬(y^/^er/a)的菌種之間也是高度保守的。本發明所追求的技術目標是開發能夠增加宿主的全身和粘膜免疫應答的組合物，所述免疫應答針對不同的新型病原體或更廣鐠的現有病原體。在本發明的工作目標中，首次報道了蛋白質NMB0938作為具有治療或預防特征的疫苗組合物的組分的用途。ii更具體而言，本發明涉及旨在預防或治療由屬于奈瑟氏球菌屬的細菌引起的任何感染的藥物組合物，其包含這種蛋白質。在另一個優選的實施方案中，包含先前所述抗原的這些所提及的藥物組合物可用于預防或治療由腦膜炎奈瑟氏球菌(疋邁e/7i/^/〃d")或淋病奈瑟氏球菌^/K7r"oese)引起的疾病。本發明的目的特別是這樣的藥物組合物，其中蛋白質NMB0938在藥學上可接受的賦形劑中以0.5-100mg/劑的范圍存在。所述組合物任選地包含能夠增強針對藥學活性成分即蛋白質NMB0938的免疫應答的疫苗佐劑。在本發明的另一個實施方案中，藥物組合物可以包含具有重組、合成或天然起源的一種或多種抗原。在本發明的另一個實施方案中，所述組合的藥物組合物可以包含多糖抗原，包括細菌多糖，和更具體而言，腦膜炎奈瑟氏球菌多糖。本發明的藥物組合物可以包含綴合的蛋白質-多糖，其中多糖組分是細菌多糖。在本發明的一個優選實施方案中，包含NMB0938的藥物組合物還包含肽性質的抗原，目的是擴展由衍生自所述組合物的疫苗所誘導的保護譜。本發明揭示了這樣的藥物組合物，其特征在于為疫苗，該疫苗能夠在受體生物中產生針對由奈瑟氏球菌屬的細菌引起的感染的保護性應答。更具體而言，本發明的藥物組合物是這樣的疫苗，該疫苗能夠在受體生物中產生針對由腦膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌引起的感染的保護性應答。本文描述的藥物組合物通過腸胃外或粘膜途徑進行施用，包括通過口部途徑的施用。在本發明的另一個優選實施方案中，蛋白質NMB0938可以與其他抗原相組合地或相融合地使用。在這樣的組合物中，蛋白質NMB0938作為免疫原性較弱的肽、多糖或其他抗原的免疫增強劑或載體，目的是增強針對所述肽、多糖或其他抗原的免疫應答。實施例ll顯示，當病毒衍生肽與NMB0938綴合時，蛋白質NMB0938能夠增強針對所述肽的抗體水平。本發明的范圍內還包括使用蛋白質抗原的保護性決定簇，其中將它們插入NMB0938氨基酸序列內，目的是誘導針對此類決定簇的增強的免疫應答，從而形成作為藥物組合物的一部分的雜合蛋白質。在本發明的另一個優選實施方案中，本發明的藥物組合物可以在藥學上可接受的賦形劑存在下包含蛋白質NMB0938的片段，所述片段能夠誘導針對腦膜炎球菌或奈瑟氏球菌屬的任何其他細菌的保護性應答。在本發明的一個具體實施方案中，藥物組合物包含通過合成或重組DM技術產生的NMBQ938模擬表位或NMB0938模擬肽。術語"才莫擬表位"在本文中指任何能夠誘導抗體的肽，所述抗體與蛋白質NMB0938相結合，并由此能夠產生針對奈瑟氏球菌屬的保護性免疫應答。也為本發明的一部分的是用于診斷由奈瑟氏球菌屬的細菌引起的感染的方法，其包括在來自個體的生物樣品中以獨立的形式或與其他組分相結合地檢測蛋白質NMB0938或其片段或者編碼蛋白質NMB0938的基因(該基因被標識為Seq.ID.No3)。附圖簡述圖1.在蛋白質NMB0938的克隆和表達中使用的載體pM238。圖2.通過將相應于基因/7/z76^^《的核苷酸序列克隆在載體pM238中而獲得的最終構建體。圖3.通過細胞破裂而獲得的級分的SDS-PAGE分析。泳道l，全細胞；泳道2，破裂沉淀物；泳道3，破裂上清液；MWM:分子量標準參照物。圖4.從破裂沉淀物開始的重組蛋白質NMB0938的純化過程的不同級分的純度的SDS-PAGE分析。泳道l，全細胞；泳道2，破裂沉淀物；泳道3和4，在碳酸鹽-碳酸氬鹽緩沖液中用2M尿素溶解后的上清液和沉淀物；泳道5，純化的蛋白質。MWM:分子量標準參照物。圖5.在用相同抗原通過腹膜內途徑免疫小鼠后獲得的針對重組蛋白質NMB0938的抗體水平(IgG)，對所述抗原佐以弗氏佐劑(Freund)、氫氧化鋁(Alum)或腦膜炎奈瑟氏球菌C多糖(PsC)。顯示了在ELISA類型的測定法中獲得的結果，其表示為滴度的倒數，該滴度被計算為在光密度為免疫前血清樣品的光密度的2倍時的血清樣品的稀釋度。圖6.使用用重組蛋白質NMB0938通過腹膜內途徑進行免疫的小鼠的血清，識別存在于腦膜炎奈瑟氏球菌菌抹CU385(B血清群)和Z4181(C血清群)的0MVs中的抗原決定簇，對所述重組蛋白質NMB0938佐以弗氏佐劑(Freund)、氫氧化鋁(Alum)或C多糖(PsC)。結果表示滴度的倒數，該滴度被計算為在光密度為免疫前血清的光密度的2倍時的血清的稀釋度。圖7.使用BLAST程序在編碼蛋白質NMB0938的基因("Query")和不同腦膜炎奈瑟氏球菌血清群的經注釋的基因組序列("Sbjct")之間進行同源性檢索的結果。圖8.血清對于存在于5種腦膜炎奈瑟氏球菌菌林中的抗原的識別，所述血清是在通過腹膜內途徑用佐以氫氧化鋁的重組蛋白質NMB0938進行免疫接種后而產生的。在用該蛋白質和其他佐劑進行免疫接種后而產生的的血清具有類似的行為。結果表示滴度的倒數，該滴度被計算為在光密度為免疫前血清的光密度的2倍時的血清的稀釋度。圖9.使用用重組蛋白質NMB0938進行免疫接種而獲得的血清，在幼年大鼠模型中的針對腦膜炎球菌感染的被動保護實驗，對所述重組蛋白質NMB0938佐以弗氏佐劑(Freund)、氫氧化鋁(Alum)或腦膜炎奈瑟氏球菌C多糖(PsC)。使用菌林CU385來進行感染。C-:未處理動物的血清的混合物；C+:用菌林CU385的腦膜炎奈瑟氏球菌外膜嚢泡免疫的小鼠的血清。符號*表示相對于陰性對照組(C-)而言具有統計學上顯著的差異，其中涉及表示為菌落形成單位/毫升(cfu/ml)的菌血癥水平。圖10.所產生的raAbs(mAbsG7/23、5D8/24和4C7/16)對于重組蛋白質NMB0938和一組無關抗原的識別。抗原Pl，腦膜炎奈瑟氏球菌菌林B:4:P1.19，15的1類蛋白質；P64k，腦膜炎奈瑟氏球菌的丙酮酸脫氫酶的E3亞基；T.T，破傷風類毒素；HBsAg，乙型肝炎病毒表14面抗原。結果顯示為在ELISA類型的測定法中的吸光度(492nm)。圖11.腦膜炎球菌病的恢復期患者血清對于重組蛋白質NMB0938的識別。作為陰性對照，使用健康供體的血清。結果顯示為在ELISA類型的測定法中的吸光度(492nm)。圖12.抗-肽JYl抗體的滴度，其相應于用游離肽(JY1)、重組蛋白質(NMB0938)或綴合物JY1-NMB0938免疫的動物的血清。圖13.在用與腦膜炎奈瑟氏球菌C多糖相混合的重組蛋白質NMB0938(NMB0938+PsC)或用摻入脂質體中的重組蛋白質NMB0938(NMB0938—Lip)通過鼻內途徑免疫的小鼠的肺灌洗樣品中，針對重組蛋白質NMB0938的抗體水平(IgA)。實施實例/實施例的詳細描述實施例1.在B血清群腦膜炎奈瑟氏球菌外膜嚢泡制備物中蛋白質NMB0938的檢測。為了研究存在于B血清群腦膜炎奈瑟氏球菌(菌林B:4:P1.19，15)外膜嚢泡中的蛋白質，根據在文獻(Sabounchi-SchuttF等人，(2000).AnimmobilineDryStripapplicationmethodenablinghigh-capacitytwo-dimensionalgelelectrophoresis,f/e"ro;7力ore"'5121:3649-3656)中描述的方法來進行二維電泳。隨后使用胰蛋白酶(Promega，Madison,WI，U.S.)對經凝膠提取的蛋白質進行酶促消化。在消化后產生的肽通過使用微型柱(ZipTips，Millipore，MA，U.S.)而提取到溶液中。在進行質鐠法分析之前，用乙腈60%、甲酸1%從孩支型柱中洗脫下肽，隨后立即施加到納米尖端(nanotips)(Protana，Denmark)中。測量在配備電離源(nanoESI)的、具有四級和飛行時間的混合型質譜儀(QTof-2TM，Manchester,UnitedKingdom)中進行。在0.98秒中并在掃描之間使用0.02秒間隔，在400-2000的w/z范圍中獲取質譜法數據。數據獲取和數據處理使用MassLynx程序(版本3.5，Microraass)來進行。基于質譜數據的蛋白質鑒定使用ProFound程序(ZhangW和ChaitBT.2000.尸ro/^oi/"d.'a/zezperts/sfe歷/orprof/de"f//7cat/o/w"./^邁asss/e"ro邁e"/c;7ep〃de邁a卯/"g//lTo/tzw〃肌AnalChem72:2482-2489.http:〃prowl.rockefeller.edu/cgi-bin/ProFound)來進行。對于包含在數據庫SwissProt(http:〃www.ebi.ac.uk/swissprot/)和NCBI(hup://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的細菌基因和蛋白質序列進行搜索，其中作為將遇到的可能修飾考慮了甲硫氨酸的氧化、半胱氨酸的脫酰胺和羧基酰氨基曱基化(carboxyamidomethylation)。基于質譜的蛋白質鑒定用MASCOT程序(PerkinsDN等人，1999.c^2"6aseswW/g肌ssspe"ro/z7e"/Electrophoresis20:3551-3567.http:〃www.matrixscience.com/)來進行。搜索參數包括半胱氨酸的修飾以及可能的氧化和脫酰胺。從得自存在于外膜嚢泡制備物中的蛋白質鑒定的結果分析開始，選擇蛋白質NMB0938作為可能的疫苗候選物進行評估，從中通過質譜法鑒定出1種肽。實施例2.蛋白質NMB0938與在數據庫中報告的基因產物的同源性分析。關于蛋白質NMB0938的鑒定，使用BLAST程序(AltschulSF等人，1990.5as/c/oca7a7/#/7/z7e/^searc力too/.JMolBiol215:403-410，http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)在NCBI數據庫中進行序列同源性搜索。這一過程的結果表明僅與腦膜炎奈瑟氏球菌和淋病奈瑟氏球菌具有同源性，因此我們假定這種蛋白質代表了屬特異性的屬性。實施例3.在大腸桿菌中克隆和表達編碼腦膜炎奈瑟氏球菌的蛋白質NMB0938的/7/7/6^^《基因。為了克隆和表達/7頂6W"基因，使用pM-238克隆載體。這種載體允許使用不同的限制酶來進行克隆，和在大腸桿菌中以內含體的形式產生高表達水平的異源蛋白質。pM-238載體(圖1)具有下述元件色氨酸啟動子，相應于腦膜炎奈瑟氏球菌菌林CU385的P64k抗原的N-末端穩定性區段的序列(編碼47個氨基酸)，編碼C-末端組氨酸尾巴的序列，相應于T4噬菌體的轉錄終止子的序列，和作為選擇標記的相應于賦予氨千青霉素抗性的基因的序列。由于P-半乳糖苷酶hcZct亞基的存在，這種克隆載體還允許通過菌落的藍色或白色著色來選擇重組體。根據編碼蛋白質固B0938的基因的核苷酸序列(實施例1)，設計了寡核苷酸引物對(0938U和0938L)以用于從菌株CU385(B:4:Pl.19，15)基因組DNA中擴增無信號肽編碼區的所述基因區段，0938U:5、GCTTCTAGATCTTTCTCCGAGCAAAGACG3、(序列標識號1)0938L:5、GCCCCCGGGATCCATTGAAGTAGATG3、細肌(序列標識號2)為了預測信號肽，使用SignalPWorldWideWeb服務器(http:〃www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2，0)。在4吏用引物0938U和0938L對編碼NMB0938的基因進行PCR擴增(SaikiRK等人，(1988).SPrimer-directedenzymaticamplificationofDNAwitha17thermostableDMpolymerase.Sc/.e/zce239:487—491)后，PCR產物用J^I和A/z肌限制酶進行消化，并克隆到事先經消化的PM238克隆載體中。最終的構建體顯示于圖2中，并且將重組蛋白質NMB0938表達為與P64k的N-末端區段的融合蛋白。經克隆的基因/m6""的測序使用ALFexpressII自動測序儀(TermoSequenaseCyTM5DyeTerminadorKit,AmershamBiosciences)以及寡核苷酸1573(Seq.ID.No.8)和6795(Seq.ID.No.9)來進行，所述寡核苷酸分別結合P64k的穩定性區段和T4噬菌體轉錄終止子的序列。此處產生的質粒命名為pM-NMB0938以用于隨后使用。為了表達/M/6。i^《基因，通過化學方法用pM-NMB0938質粒轉化大腸桿菌GC366菌抹(圖2)。表達實驗在補充有1%葡萄糖、0.5%酵母提取物、0.1mMCaCh、1mMMgS04和50jag/mL氨芐青霉素的M9含鹽基本培養基(MillerJH.1972.ExperimentsinMolecularGenetics,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NEWYork,USA)中進行。細菌培養物在37。C和250rpm下溫育12小時。將生長培養物進行離心，并且通過超聲瓦解來進行細胞沉淀物的破裂(IKALABORTECHNIK)。來自沉淀物和上清液的級分通過SDS-PAGE(LaemmliUK.1970.C/eaMgeo/*"rw"i/ra//rofe//sc^r2'/2gf力e0/f力e力eado尸6acfer/0;7力flge7V.Nature277:680)并力口上用考馬斯亮藍R-25G染色來進行分析。表達的百分比通過凝膠光密度測定法來進行分析(LKBBromma2202Ultrascanlaserdensitometer;AmershamPharmaciaBiotech,UnitedKingdom)。在破裂沉淀物中獲得蛋白質NMB0938,為該級分的總蛋白質含量的約20%(圖3)。將細胞沉淀物的樣品溶解于包含不同摩爾濃度(2M、4M、6M和8M)的尿素的碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液(0.1M碳酸鈉，0.1M碳酸氫鈉)中。當使用具有2M尿素的前述緩沖液時，蛋白質NMB0938被溶解。使溶解后的上清液通過金屬親和層析以便達到目的蛋白質的純化。因此，獲得具有85%純度的樣品，如圖4中所示的。在其在實驗動物中進行評估之前，進行最后的透析步驟。實施例4.通過腹膜內途徑用蛋白質NMB0938進行免疫接種后誘導的免疫應答的評估。為了評估蛋白質麗B0938的免疫原性，設計并在小鼠中進行免疫接種實驗，其中施用佐以氫氧化鋁、弗氏佐劑或腦膜炎奈瑟氏球菌C多糖的蛋白質腦0938。使用這些制劑免疫雌性Balb/C小鼠(8-IO周齡)，這些小鼠分成4組，每組8只小鼠。通過腹膜內途徑進行3次免疫接種，每2次之間間隔7天。使用對照組，其在前3次免疫接種時接受PBS,然而，如同該實驗中的其他組一樣，在實驗開始后45天時接受佐以氫氧化鋁的所述蛋白質的加強劑量。在表l中描述了給每個組使用的組合物表l:在免疫接種實驗中所使用的Balb/C小鼠組<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>在所述加強劑量后獲得的血清樣品中，通過ELISA測定針對該重組蛋白質和細菌中存在的同源蛋白質的抗體(IgG)的滴度。在圖5中，顯示了個體動物的針對該重組蛋白質的抗體滴度。正好在第二次接種后檢測到特異性抗體水平(數據未顯示)，在最后l次接種后更加高。此外，進行經由Western印跡法的免疫鑒定，其中識別出相應于所述蛋白質的條帶(數據未顯示)。在用該重組蛋白質進行免疫接種后獲得的血清識別存在于菌抹CU385和Z4181的外膜蛋白質(0MP)制備物中的天然蛋白質。這些結果顯示在圖6中。由于根據Barttle，s檢驗在組之間缺乏方差齊性，因而通過非參數Kruskal-Wallis檢驗來對結果進行統計分析。在處理的平均值的比較中，以所需的組合，使用Dunn's多重比較檢驗。實施例5.在腦膜炎奈瑟氏球菌和淋病奈瑟氏球菌的不同菌林中編碼蛋白質NMB0938的基因序列的表征。為了分析奈瑟氏球菌屬的致病性物種中編碼蛋白質NMB0938的基因序列的保守性，使用BLAST程序(AltschulSF等人，1990.7則/a7/，e/7fsearc力"o人JMolBiol215:403-410.http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)來進行采用在NCBI數據庫中注釋的腦膜炎奈瑟氏球菌(A、B和C血清群)和淋病奈瑟氏球菌的基因組的相似性搜索(NC—003116.1,NC—003112.1，NC-003221,NC-002946)。圖7顯示了關于在每種所分析的基因組中產生顯著比對的那些序列的序列比較的結果。與所獲得的編碼蛋白質NMB0938的基因序列(Seq.ID.No.3)相比較，那些序列在B血清群中具有100%的同一性，在A血清群中具有95.22%的同一性，和在淋病奈瑟氏球菌的情況下具有94%的同一性。此外，對于屬于B血清群(B:4:P1.19，15)的3種古巴分離物，測定了所述基因的核苷酸序列(Seq.ID.No.5-7)，并且通過l吏用ClustalX程序(http:〃www.ebi.ac.uk/clustalw/)進行了序列比對。比對的結果顯示，在所分析的菌林中和一般而言在奈瑟氏球菌屬中在基西力邁MW《的核苷酸序列中存在極大的保守性。考慮到在前面提及的序列中存在高度的相似性，將蛋白質NMB0938用作疫苗候選物將允許產生有效的免疫應答，具有針對腦膜炎球菌病的廣譜保護(由于交叉反應性)。實施例6.通過用蛋白質NMB0938對Balb/C小鼠進行免疫接種而誘導的具有廣語作用的免疫應答的表征。為了評估用蛋白質NMB0938進行免疫接種是否誘導了與其他奈瑟20氏球菌屬菌林具有廣泛交叉反應性的應答，進行ELISA。用5種奈瑟氏球菌屬菌林的完整細胞包被聚苯乙烯平板，所述菌林屬于不同的血清型和血清亞型。將平板與血清混合物進行溫育，所述血清是針對具有不同佐劑的蛋白質NMB0938而獲得的，如實施例4中所描述的。圖8顯示，存在于腦膜炎奈瑟氏球菌的A、B和C血清群菌林中的抗原被在用佐以氫氧化鋁的重組蛋白質NMB0938進行免疫接種后獲得的血清所識別。如所觀察到的，免疫血清識別在不同菌林中存在的該蛋白質，其水平類似于在菌抹CU385中所發現的水平。在用具有其他佐劑的該蛋白質進行接種后所產生的血清具有類似的行為。實施例7.在幼年大鼠模型中由針對蛋白質NMB0938而產生的鼠類血清所誘導的保護作用。為了測定所獲得的抗血清的功能活性，在幼年大鼠中的腦膜炎球菌感染模型之中進'行被動保護測定法。將24只大鼠(5-6天齡)分成組，每組6只大鼠。確定通過腹膜內途徑施用的血清是否保護了大鼠不受由細菌(菌抹CU385)引起的感染，所述細菌在1小時后通過相同途徑接種。混合每個組的血清，并在將它們接種在幼年大鼠中之前作1/10稀釋(在無菌PBS中)。4小時后，對動物進行取樣，并且計數其血液中的活細菌。為了解釋所述結果，進行方差分析(Anova)，隨后為Dunnet，s多重比較檢驗，其中比較了所研究的各組與陰性對照(未處理的動物的血清混合物)。如在圖9中所觀察到的，與陰性對照組相比較，接受用佐以弗氏佐劑的蛋白質NMB0938進行免疫接種的小鼠的抗體的組顯示出統計上顯著的差異，因此所述抗體在幼年大鼠模型中是具有保護性的。通過用菌林233(C:2a:PL5)感染幼年大鼠進行了類似測定法，其中發現，如前面的實驗中一樣，用佐以弗氏佐劑的蛋白質NMB0938進行免疫接種的小鼠的抗體能夠保護大鼠不受腦膜炎球菌感染(數據未顯示)。通過用從古巴患者中分離的菌抹H44/48和U0/90感染幼年大鼠進行了類似測定法，所述菌林的血清學分類與菌抹CU385同源。此外，攻擊實驗用B血清群的菌抹H44/76(B:15:P1.7，16)來進行。在所有情況下，用佐以弗氏佐劑的蛋白質NMB0938進行免疫接種的小鼠的抗體能夠保護幼年大鼠不受腦膜炎球菌感染。實施例8.產生針對蛋白質NMB0938的單克隆抗體，其能夠介導針對腦膜炎奈瑟氏球菌的殺菌活性。為了產生針對蛋白質NMB0938特異性單克隆抗體(mAbs)，和研究介導針對腦膜炎奈瑟氏球菌的同源和異源菌林的殺菌活性的功能活性，用純度為80%的蛋白質NMB0938的制劑進行免疫接種程序。免疫接種在Balb/C小鼠(H-2d，雌性，5-6周齡)中進行，并且如下施加4劑在免疫接種程序的第0、15和30天時，通過皮下途徑施用經弗氏佐劑乳化的10pg抗原NMB0938/只小鼠(總體積100ul);在第50天時，通過腹膜內途徑施用在磷酸鹽緩沖鹽水(140mMNaCl、270mMKC1、1.5mMKH2P04、6.5mMNa2HP04x2H20,pH7.2)中的10iag抗原/只小鼠。抽血在第0和45天時進行。將來自具有最高滴度(通過使用蛋白質NMB0938作為包被抗原的間接ELISA而測量的)的動物的脾細胞與X63Ag8653小鼠骨髓瘤細胞融合。所得到的雜交瘤根據標準操作程序進行分離和篩選(GavilondoJT.1995.AnticuerposMonoclonales:TeoriayPrdctica，ElfosScientiae，LaHabana，Cuba)。由所述雜交瘤分泌的針對蛋白質NMB0938的抗體的反應性，以及其與無關抗原的交叉反應性，通過使用5mg/ml的每種抗原和相同濃度的每種待測定mAbs的間接ELISA來進行測試。圖IO顯示了在這個實驗中獲得的結果，獲得了總共3個陽性克隆(mAbsG7/23、5D8/24和4C7/16),其特異性地識別蛋白質NMB0938，并且與相應于P6々k的N-末端區段的氨基酸序列和其余所測定的無關抗原都不反應。為了測定針對蛋白質畫B0938而產生的mAbs介導針對腦膜炎奈瑟氏球菌的同源和異源菌林的殺菌應答的能力，進行殺菌測試。殺菌抗體滴度表示為能夠殺死50%或更多細菌的受試抗體的最高稀釋度的倒數；所述mAbs中的2種(5D8/24和4C7/16)具有高于1:128的針對同源菌林B:4:P1.19，15的殺菌滴度，以及1種(G7/23)具有高于1:80的滴度。它們還顯示出高于1:64的分別針對異源菌林B:15:Pl.7，16和C:2a:Pl.5的滴度。實施例9.針對蛋白質NMB0938的鼠類免疫應答的靶區域的表征。為了鑒定該蛋白質中更通常被針對該重組抗原而產生的鼠類抗血清所識別的區域，進行SPOTScan測定法。在纖維素膜上合成跨越該蛋白質序列的一組重疊肽，將其與1:IOO稀釋的血清混合物一起溫育。抗原-抗體反應通過下述方式來檢測與綴合物抗鼠類IgG-堿性磷酸酶一起溫育，隨后添加包含底物溴-氯-吲哚基-磷酸酯的溶液。觀察到幾個在該蛋白質內存在的共有的抗原性區域，與用于免疫接種的制劑無關(數據未顯示)。然而，在用佐以弗氏佐劑的該蛋白質進行免疫接種的組中存在廣泛得多的識別模式。實施例10.人類血清對于蛋白質NMB0938的識別。在這個研究中使用來自恢復期個體的人類血清的集合，所述研究通過ELISA來進行。平板用通過制備型電泳獲得的蛋白質NMB0938(5yg/ml)進行包被。用在包含Tween-20的PBS中的3%脫脂奶粉封閉平板后，將血清在相同溶液中進行稀釋(1:50)并在平板中進行溫育。如已廣泛報告的，進行免疫測定法。將健康供體血清用作陰性對照。此外，將來自用針對乙型肝炎的重組疫苗進行疫苗接種的個體的血清23混合物用作無關對照(數據未顯示)。圖11顯示了在這個測定法中使用5種恢復期的血清而獲得的結果。可以看出，人類血清識別該蛋白質，這表明它在腦膜炎球菌感染期間表達，并且它是免疫原性的。實施例11.蛋白質畫B0938作為肽的載體。為了證實重組蛋白質NMB0938的載體能力，使其與15聚體的合成肽綴合，所述合成肽來源于HIV-1(分離物JY1)的gpl20蛋白的V3區域。綴合通過戊二醛法來進行。在3-劑程序表中，將游離的JY1肽、重組蛋白質NMB0938和綴合物JY1-NMB0938施用給成年小鼠，其中免疫原由弗氏佐劑進行乳化。在第3劑后2周，從經免疫的動物中獲得血清樣品，并且通過ELISA來分析樣品以測定抗-肽抗體的滴度。為此，平板用游離肽(20jag/ml)進行包被，并且如先前已描述的來進行免疫測定法。該實驗的結果(圖12)顯示了蛋白質NMB0938的載體能力，其在綴合后能夠顯著增強針對肽JY1的抗體應答。實施例12.在通過粘膜途徑用蛋白質NMB0938進行免疫接種后誘導的免疫應答的評估。為了評估蛋白質NMB0938的免疫原性，設計并在小鼠中進行免疫接種實驗，其中施用包嚢到脂質體中或佐以腦膜炎奈瑟氏球菌C多糖的蛋白質NMB0938。如先前所描述的(CarmenateT等人，(2001).RecombinantOpcproteinfrom^e/sser/s歷e/72'/^7〃f//51reconstitutedintoliposomeselicitsopsonicantibodiesfollowingimmunization."/otecAno/.J"/."/ocAe瓜34:63-69)，通過脫水-再水化來獲得脂質體。使用這2種制劑，對于雌性Balb/C小鼠(8-10周齡)進行免疫接種。經鼻內途徑施用3劑(每劑50jag),每2次之間間隔15天。為了分析在粘膜水平上的免疫應答，在經免疫的動物的肺灌洗液中測量IgA抗體水平。在圖13中顯示了在所分析的2個組中檢測到的IgA抗體的水平。權利要求1.藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包含標識為Seq.ID.No4的蛋白質NMB0938。2.根據權利要求1的藥物組合物，其用于預防或治療由奈瑟氏球菌屬的細菌引起的感染。3.根據權利要求1的藥物組合物，其用于預防或治療由腦膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌引起的感染。4.根據權利要求1的藥物組合物，其中蛋白質NMB0938在藥學上可接受的賦形劑中以0.5-lOOjng/劑的范圍存在。5.根據權利要求4的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物任選地包含疫苗佐劑。6.根據權利要求1的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物另外還包含通過重組、合成或天然方式獲得的一種或多種具有不同性質的抗原。7.根據權利要求6的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包含多糖抗原，包括細菌多糖。8.根據權利要求7的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包含腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖。9.根據權利要求6的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包含蛋白質-多糖綴合物，其中多糖組分是細菌多糖。10.根據權利要求6的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包含肽抗原。11.根據權利要求1的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物是疫苗，其能夠在受體生物中產生針對由奈瑟氏球菌屬的細菌引起的感染的保護性應答。12.根據權利要求11的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物是疫苗，其能夠在受體生物中產生針對由腦膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌引起的感染的保護性應答。13.根據權利要求1的藥物組合物，其用于通過腸胃外或粘膜途徑施用。14.根據權利要求1的藥物組合物，其特征在于，單獨地、與其他抗原相組合或融合地將蛋白質NMB0938用作免疫增強劑或載體。15.藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包含抗原蛋白質MB0938的片段或模擬肽，和藥學上可接受的賦形劑。16.用于診斷由奈瑟氏球菌屬的細菌引起的感染的方法，其包括在來自個體的生物樣品中以獨立的形式或與其他組分相組合地檢測蛋白質NMB0938或其片段。17.用于診斷由奈瑟氏球菌屬的細菌引起的感染的方法，其包括在來自個體的生物樣品中以獨立的形式或與其他組分相組合地檢測編碼蛋白質NMB0938的基因，該基因被標識為Seq.ID.No3。全文摘要本發明涉及醫藥領域，特別涉及包含蛋白質NMB0938的藥物組合物的開發。本發明的組合物賦予針對由病原體或不由病原體引起的不同疾病的保護。蛋白質NMB0938被鑒定為腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)外膜囊泡(OMV)制備物的組分，它通過使用重組脫氧核糖核酸(DNA)技術而獲得，并且在動物模型中評估其免疫原性和保護活性。由于編碼蛋白質NMB0938的基因的高度保守性，因而包含這種蛋白質的組合物作為誘導廣泛反應性的免疫應答的抗原具有極大的價值。本發明的組合物可應用于人類醫藥學領域。文檔編號A61K39/095GK101448522SQ200780018360公開日2009年6月3日申請日期2007年3月29日優先權日2006年3月31日發明者D·加西亞迪亞茲,G·薩蒂納斯加西亞,R·帕容費伊特,S·岡薩雷斯布蘭克申請人:遺傳工程與生物技術中心