專利名稱：：具有對阿爾茨海默病和帕金森病的預防或治療有用的新組合的銀杏葉提取物及其提取和...的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種銀杏葉提取物，其包含相對于所述提取物總重量10-14重量％(優選11-13重量％和最優選12重量％)的碎內酯、20-30重量％的銀杏黃酮苷和少于5ppm的銀杏酸，其在抑制NO(—氧化氮)的產生和治療阿爾茨海默病和帕金森病中，優于包含標準銀杏葉提取物(德國藥典2000)的常規銀杏葉提取物，并且本發明還涉及其提取和純化方法以及含有其作為活性組分的藥物組合物。
背景技術：
：銀杏葉提取物有效的用于治療外周動脈閉塞疾病、眩暈、血管性耳鳴和退行性耳鳴、器質性腦病綜合征，并且在德國、法國及當前的世界范圍內被開始用作藥物治療。銀杏葉提取物含有多種活性成分，例如銀杏黃酮苷(槲皮素，山奈酚和異鼠李黃素)，碎內酯(terpenetrilactone)(銀杏苦內酯A、銀杏苦內酯B、銀杏苦內酯C和銀杏內酯)，并且已知該提取物的藥物活性歸功于它們的組合[藥物研發(DrugsR.D.)vo1.4(3)，188-193,2003]。標準化的銀杏葉提耳又物(德國藥典DAB2000)5-7%的辟內酯、22-27%的銀杏黃酮苷和少于5ppm的銀杏酸。這些組分中，銀杏黃酮苦減少自由基，且碎內酯可有效對抗血小板活化因子(PAF)并抑制血小板聚集和一氧化氮的產生，還伴有神經保護活性[藥靶研究最新進展(CumDrugTargets),Vol.Jul:1(1),25-58,2000]。銀杏酸已知可引起變態反應和癌癥。特別地，關于銀杏葉提取物的神經保護作用已有研究。DeFeudisF.V.等報道了黃酮和銀杏苦內酯減少自由基和活性氧部分并抑制脂質過氧化，并且銀杏內酯改善線粒體中呼吸商[Curr.DrugTargets,Vol.Jul:1(1),25-58,2000]。BealM.F.等報道了帕金森氏病的發作與腦細胞線粒體退化有關，并且銀杏葉提取物改善由線粒體退化引起的帕金森氏病[神經病學年報(Ann.Neurol.)，Vol.53Suppl3,39-47,2003]。類似地，YangS.F.等報道了銀杏葉提取物在由MPTP(1-曱基_4_苯基_1,2,3,6-四氫吡啶(tetrahydropyrine))誘導的帕金森氏病的動物模型上顯示了出眾的治療有效性[中國藥理學才艮(ActaPharmacol.Sin.)，Vol.22(12),1089-1093,2001]。進一步地，卩-淀粉樣蛋白因為促進神經元自由基的產生，被認為是與阿爾茨海默病有關的問題。據Sm池J.V.等報道，銀杏葉提取物有效降低(3-淀粉樣蛋白誘導的自由基[阿爾茨海默病雜志(J.AlzheimersDis).,Vol.5(4),287-300,2003]。如上所述，4艮杏葉提取物具有神經保護活性且可有效治療血管性癡呆和阿爾茨海默病并改善認知能力，且長期被用于治療器質性腦病綜合征和外周動脈閉塞疾病。已進行多種嘗試致力于開發具有更佳活性的銀杏葉提取物的新的提取或純化方法。例如，德國專利號DE-B1767098公開了用于制備含有大量黃酮苦的銀杏葉提取物的方法。美國專利號6,844,451公開了從銀杏葉中純化萜內酯(銀杏苦內酯和銀杏內酯)的方法。然而所得的方法僅為制備與常規提取物含量類似的銀杏葉提取物。特別地，鑒于銀杏葉提取物表現出功效不是通過一種或特定類型的組分，而是通過銀杏黃酮苷和萜內酯的組合物，上述提取物及其因此，活性優于標準化的銀杏葉提取物(DAB)的銀杏葉提取物直到現在仍未被開發出來，且如何從銀杏葉中直接提取和純化上述提取物仍未見報道
發明內容技術方案泛研究，旨在保持常規的標準銀杏葉提取物活性的同時顯示更佳的治療活性。最終，他們發現與常規的銀杏葉提取物相比，含有較多的萜內酯和同樣量的銀杏黃酮的銀杏葉提取物可實現該目的。進一步地，作為另外的廣泛研究的結果，本發明的發明人開發了直接從銀杏葉中提取和純化上述銀杏葉提取物的方法。然而，本發明的優點不僅限基于組分中碎內酯含量的增加，還發現了最優配比，因此能夠開發一種銀杏葉提取物，其具有對阿爾茨海默病模型和帕金森病模型提高了的有效性。筒而言之，本發明提供了具有抗氧化活性和抑制自由基的銀杏葉提取物，及其制備方法和含有該銀杏葉提取物的藥物組合物。與常規的銀杏葉提取物相比，本文的銀杏葉提取物含有相似含量的銀杏黃酮苷和較高含量的萜內酯，因此可有效預防或治療與神經元損傷有關的疾病，例如阿爾茨海默病和帕金森氏病。本發明旨在提供一種具有治療或預防例如阿爾茨海默病和帕金森病的腦機能障礙提高的有效性的、具有新組合的銀杏葉提取物，及其制備方法和含有該才是耳又物的藥物組合物。為完成上述目的，本發明提供了一種具有新組合的銀杏葉提取物，其在例Irf_*~/一、>trtl、^2-一，/人Jr/rt、一I—/.1>TTA_i"l7*/、/>""fTrf、—1-七frTl.1-■/，，口.、Y，.，-TT-口鬥w》欠〉母茅夂媽，甲日^^采禍曰3月西T兒恥r早力于日7《打7f口丁貝r萬丫衣"6出i凡開'/百'r玍，及從銀杏葉中提取和純化銀杏葉提取物的方法。特別地，本發明實施方式涉及一種銀杏葉提取物，其含有相對于所述提^f又物總重量10-14重量％(優選11-13重量％且最優選12重量％)的萜內酯、20-30重量％的銀杏黃酮苷和少于5ppm的銀杏酸。本發明另一實施方式涉及從銀杏葉中提取和純化銀杏葉提取物的方法，其包括(1)通過將銀杏葉浸入例如丙酮、C,-C5醇及它們的混合物的有機溶劑中，或者浸入20-80體積％的所述有機溶劑的含水溶液中，之后在5-140。C下提取并過濾，獲得第一提取液，(2)通過使用庚烷或己烷對第一提取液進行分級萃取，并棄去溶于庚烷或溶于己烷的部分，獲得第二提取液，(3)通過使用體積比為1:2-2:1的丁醇和曱苯混合溶劑對第二提取液進行分級萃取，獲得第三提取液，其溶于丁醇-曱苯混合物中，(4)通過將第三提取液置于5-3(TC下2-24小時，獲得第四提取液，隨后過濾，以及(5)將已過濾的第四提取液減壓濃縮并千燥所述濃縮物，從而獲得用于預防或治療阿爾茨海默病和帕金森氏病的銀杏葉提取物，其含有相對于從銀杏葉中得到的提取物總重量10-14重量％(優選11-13重量％且最優選12重量％)的萜內酯，20-30重量。/。的銀杏黃酮苷和少于5ppm的銀杏酸。更詳細地，在步驟(l)中，干燥的銀杏葉粉末浸于相對于所述銀杏葉重量的約1-30倍體積、優選5-10倍體積的選自丙酮以及諸如曱醇、乙醇、丙醇、丁醇和戊醇的d-Cs醇中的至少一種有機溶劑中，或者浸于相對于所述銀杏葉重量的約1-30倍體積、優選5-10倍體積的約20-80體積％(v/v%)(優選40-70體積％和更優選50-60體積％)所述有機溶劑的含水溶液中。提取在約5-140。C(優選所述溶劑沸騰溫度附近)的溫度下進行約1-24小時(優選10-18小時)，從而提供一種銀杏葉的粗提取物。過濾后，所述提取物被減壓濃縮至少于相對初始總重量的10重量％。可選^l奪地，由此獲得的濃縮物通過加入水稀釋，以致于該濃縮物等于總含水溶液的10-50重量°/。，并冷卻至低于2(TC的溫度，然后沉淀脂溶性成分并過濾。步驟(2)中，至此獲得的第一提取溶液通過加入0.1-10倍(優選0.3-1.0倍)體積的庚烷(或己烷)得到分級萃取，以移除溶于庚烷(或溶于己烷)部分，至此獲得的第二提取溶液，不含有已知可引起變態反應和癌癥的銀杏酸。步驟(3)中，至此獲得的第二提取溶液可通過使用體積混合比為2:1-1:2(優選1:1)的丁醇-甲苯混合物，進行多次(優選2-3次)分級萃取，至此獲得溶于丁醇_曱苯混合物中的第三提取溶液。步驟(4)中，將第三提取溶液置于5-30。C中2-24小時，至此獲得第四提取溶液。步驟(5)中，將純化的第四提取溶液蒸發并干燥，至此最終提供具有想要獲得的組4、的才是耳又物，即一種《艮杏葉才是耳又物，其相對于所述才是耳又物總重量含有10-14重量％(優選11-13重量％和最優選12重量％)的萜內酯，20-30重量％的銀杏黃酮苷和少于5ppm的4艮杏酸。有10-14重量％(優選11-13重量％和最優選12重量％)的萜內酯、20-30重量％的銀杏黃酮苷，其在抑制一氧化氮(NO)的產生，以及預防或治療阿爾茨海默病和帕金森氏病中優于傳統的銀杏葉提取物。進一步地，此處的銀杏葉提取物含有少于5ppm的已知的會引起變態反應和癌癥的銀杏酸。葉提取物的藥物組合物可按照常規方法通過使用藥學可接受的載體例如稀釋劑、賦形劑、崩解劑、粘合劑和潤滑劑，被制成粉劑、顆粒劑、片劑、硬膠嚢，軟膠嚢或注射劑。藥學上可接受的載體的實例諸如稀釋劑、賦形劑、崩解劑、粘合劑和潤滑齊寸，包括但不限于韓國藥典(KP)、美國藥典(USP)、日本藥典(JP)和德國藥典(DAB)中的那些示例。上述資料和專利均被全文引用在此作為參考。藥物組合物優選本發明銀杏葉提取物的含量為每單位劑型(perunitdosageform)含20-240mg(更優選40-120mg)。盡管此處藥物組合物日劑量取決于給藥途徑和治療條件，優選成年人的每日給藥頻率為l-4次。圖1顯示了測試物(GBE、YY-1224和YY-1824)抗一氧化氮生成的抑制活性。圖2顯示了通過蛋白質印跡法觀察的iNOS蛋白結果。圖3顯示了通過RT-PCR法觀察的iNOSmRNA結果。圖4顯示了平均逃離潛伏期，其為工作記憶試驗的結果，所述工作記憶試驗在以50mg/kg的劑量口服給予測試物至ICR小鼠7天后，然后腦室內(i.c.v.)給予400pmol的p-淀粉樣蛋白完成。圖5顯示了環狀穿越(annuluscrossing)數，其為探針試驗結果，所述探針試驗在以50mg/kg的劑量口服給予測試物(每種銀杏葉提取物)至COX-2(+/+)小鼠7天后,然后腦室內(i.c.v.)給予400pmol的P-淀粉樣蛋白完成。圖6顯示了銀杏葉提取物對改善MPTP誘導的運動能力降低的療效。特別地，圖6顯示了小鼠的運動能力(locomoteractivity),所述小鼠被給予測試物(50mg/kg,p.o.)8天，并以1天的間隔給予能減少運動能力并引起神經毒性的MPTP(25mg/kg,i.p.)6次。僅給予MPTP組(辦)顯示了運動能力有意義的減少，而》會予GBE、YY-0924、YY-1224和YY-1824的組(*)顯示了運動能力的增加。圖7為顯微照片，其顯示了MPTP減少黑質(substantianigra)中酪氨酸羥化酶的表達，而測試物增加了酪氨酸羥化酶的表達。圖8為顯示了有關酪氨酸羥化酶免疫反應的圖。MPTP減少了酪氨酸羥化酶在黑質中的表達(##)、而GBE，YY-1224和YY-1824增加了酪氨酸羥化酶的表達(*,**，*)。圖9為顯^t照片，顯示MPTP增加了炎癥應答，即增加小神經月交質細胞在黑質中增殖，而測試物減少了小神經膠質細胞的增殖。圖10為顯示關于小神經膠質細胞增殖的免疫應答的圖。MPTP增加了炎癥應答，即增加了黑質中小神經膠質細胞的增殖(##)，而GBE、YY-1224和YY-1824減少了小神經膠質細胞的增殖(**)。圖ll為顯微照片，其顯示了MPTP增加了炎癥應答，即紋狀體中小神經膠質細胞的增殖，而測試物減少了所述小神經膠質細胞的增殖。圖12顯示了關于小神經膠質細胞增殖的免疫應答。MPTP增加了炎癥應答，即增加了紋狀體中小神經膠質細胞的增殖(##),而GBE、YY-1224和YY-1824減少了所述小神經膠質細胞的增殖(**)。圖13為顯微照片，顯示了曱基苯異丙胺減少了酪氨酸羥化酶在黑質中的表達，而測試物增加了酪氨酸羥化酶的表達。圖14為顯示了關于酪氨酸羥化酶免疫應答的圖(Y軸表達酪氨酸羥化酶的細胞數量)。曱基苯異丙胺減少了黑質中酪氨酸羥化酶的表達(絲)，而GBE、YY-1224和YY-1824增加了酪氨酸羥化酶的表達(*，**,*)。圖15為顯微照片，其顯示了曱基苯異丙胺增加了炎癥應答，即增加了小神經膠質細胞在黑質中的增殖，而測試物減少了小神經膠質細胞的增殖。圖16顯示了關于小神經膠質細胞增殖的免疫應答。曱基苯異丙胺增加了炎癥應答，即增加了小神經膠質細胞在黑質中的增殖(絲)，而GBE、YY-1224和YY-1824減少了小神經膠質細胞的增殖(**)。圖17為顯微照片，其顯示了曱基苯異丙胺增加炎癥應答，即增加小神經膠質細胞在紋狀體中的增殖，而測試物減少了所述小神經膠質細胞的增殖。圖18顯示了關于小神經膠質細胞的免疫應答。MPTP增加了炎癥應答，即增加小神經膠質細胞在紋狀體中的增殖(##),而GBE、YY-1224和YY-1824減少了小神經膠質細胞的增殖(**)。具體實施例方式本發明通過下述實施例被更為明確地描述。此處實施例僅旨在舉例說明本發明，但決不限制所要求的發明，對照實施例1將銀杏葉的干燥粉末(10kg)置于容器中，加入100L丙酮水溶液(60體積°/。)提取。12小時后進行加壓過濾，將濾液減壓濃縮至IOL。該濃縮物加水稀釋至20L并劇烈地攪拌(vigorouslyagitate)。此后將所述稀釋溶液于15。C放置12小時，且上清液與沉淀分離，隨后過濾。所得濾液減壓濃縮并干燥，由此制得252g銀杏葉提取物。實施例1將銀杏葉的干燥粉末(5kg)置于容器中，加入50L乙醇水溶液(50體積%)提取。12小時后進行加壓過濾，并將濾液減壓濃縮至5L。該濃縮物加水^^f王丄UL開/'J,"、J:"12W見^f于。-。/5^1""|^1虧;^，平-/務收，丄〕L刀人且丄么'J、HM,_tL_i_/fq液與沉淀分離，隨后過濾。由此得到的水層(aqueouslayer)用5L庚烷處理3次，并且去除溶于庚烷的部分。留下的水層用IOL丁醇和曱苯(1:1,v/v)的混合溶劑處理3次。該混合溶劑層于15。C放置12小時后使用濾紙過濾。所得留下的溶液減壓濃縮并干燥，由此制得57.3g純化的銀杏葉提取物。實施例2對照實施例1制備的銀杏葉提取物100g溶解于1L乙醇水溶液(50v/v%)中。該溶液用500ml己烷處理三次，除去溶于己烷的部分。留下的水層用1L丁醇和曱苯(l:l，v/v)的混合溶劑處理三次。該混合溶劑層于15。C放置12小時后使用濾紙過濾。留下的溶液減壓濃縮并干燥，由此制得54.7g純化的銀杏葉提取物。實施例3將銀杏葉的干燥粉末(5kg)置于容器中，加入50L乙醇水溶液(50體積%)提取。12小時后加壓過濾，并將濾液減壓濃縮至5L。該濃縮物加水稀釋至10L并劇烈地攪拌。此后將所得稀釋溶液于15。C放置12小時，并且上清液與沉淀分離，隨后過濾。由此得到的水層用5L己烷處理3次，并且去除溶于己烷的部分。留下的水層用10L丁醇和曱苯(1:1，v/v)混合溶劑處理3次。該混合溶劑層于15。C放置12小時后使用濾紙過濾。留下的溶液減壓濃縮并干燥，由此制得48.7g純化的銀杏葉提取物。實施例4對照實施例1制備的4艮杏葉提取物100g溶解于1L乙醇水溶液(50v/v%)中。該溶液用500ml庚烷處理三次，除去溶于庚烷的部分。剩余的水層用1L丁醇和曱苯(1:2，v/v)的混合溶劑處理三次。該混合溶劑層于15。C放置12小時后使用濾紙過濾。留下的溶液減壓濃縮并干燥，由此制得60.1g純化的銀杏葉提取物。對照實施例2將銀杏葉的干燥粉末(5kg)置于容器中，加入50L乙醇水溶液(50體積%)提耳又。12小時后加壓過濾，并將濾液減壓濃縮至5L。該濃縮物加水稀釋至IOL并劇烈地攪拌。此后將所得稀釋溶液于15。C放置12小時，并且上清液與沉淀分離，隨后過濾。由此得到的水層用5L庚烷處理3次，并且去除溶于庚烷的部分。留下的水層用IOL丁醇和曱苯(1:6;v/v)混合溶劑處理3次。該混合溶劑層于15。C放置12小時后使用濾紙過濾。留下的溶液減壓濃縮并干燥，由此制得35.3g純化的銀杏葉提取物。對照實施例3對照實施例1制備的銀杏葉提取物100g溶解于1L純水中。該溶液用500ml的庚烷處理三次，并除去溶于庚烷的部分。留下的水層用1L丁醇和曱苯(1:4，v/v)的混合溶劑處理三次。該混合溶劑層于15。C放置12小時后使用濾紙過濾。留下的溶液減壓濃縮并干燥，由此制得28.2g純化的銀杏葉提取物。對照實施例4將銀杏葉的干燥粉末(5kg)置于容器中，加入50L乙醇水溶液(50體積%)提取。12小時后加壓過濾，并將濾液減壓濃縮至5L。該濃縮物加水稀釋至10L并劇烈地攪拌。此后將所得稀釋溶液于15。C放置12小時，并且上清液與沉淀分離，隨后過濾。由此得到的水層用5L庚烷處理3次，并且去除溶于庚烷的部分。留下的水層用IOL丁醇和甲苯(4:1，v/v)混合溶劑處理3次。該混合溶劑層于15。C放置12小時后使用濾紙過濾。留下的溶液減壓濃縮并干燥，由此制得80.2g純化的銀杏葉提取物。對照實施例5將銀杏葉的干燥粉末(5kg)置于容器中，并加入50L乙醇水溶液(50體積％)提取。12小時后加壓過濾，并將濾液減壓濃縮至5L。該濃縮物加水稀釋至10L并劇烈地攪拌。此后將所得稀釋溶液于15。C放置12小時，并且上清液與沉淀分離，隨后過濾。由此得到的水層用5L庚烷處理3次，并且去除溶于庚烷的部分。留下的水層用10L丁醇和曱苯(l:3，v/v)混合溶劑處理3次。該混合溶劑層于15t^文置12小時后使用濾紙過濾。留下的溶液減壓濃縮并干燥，由此制得79.1g純化的銀杏葉提取物。將上述實施例和對照實施例中制備的銀杏葉提取物，如德國藥典DAB2000(銀杏干燥提取物，標準化的)中描述的那樣進行組分分析。表1[表]<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><制備實施例>制備含有銀杏葉提取物的藥物組合物本文中所使用的，"YY-1224"是指實施例2制備的銀杏葉提取物，其含有約12重量％的碎內酯和約24重量％的銀杏黃酮苷。制備實施例1根據常規方法通過壓制和包衣下述組分制成的含有YY-1224的片齊ij。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>含有YY-1224的硬膠嚢<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><制備實施例3〉根據常規方法通過混合和填充下述組分制備的含有YY-1224的軟膠嚢。表4[表4][表]<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>按照常規方法通過配制并加入下述組分制備的含有YY-1224的注射劑。表5[表〗含有YY-1224的注射劑<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><實驗實施例>藥理學評價下文提供了本發明的銀杏葉提取物抑制NO(—氧化氮)產生以及抗癡呆和帕金森氏病的活性。本文所使用的，"GBE"(標準化的銀杏葉提取物)是指含有6重量％碎內酯和約24重量％的銀杏黃酮苷的銀杏葉提取物；"YY-0924"是指含有約9重量％的碎內酯和約24重量％的銀杏黃酮香的銀杏葉提取物；"YY-1224"是指含有約12重量％的碎內酯和約24重量％的銀杏黃酮苷的銀杏葉提取物；以及"YY-1824"是指含有約18重量％的辟內酯和約24重量％的銀杏黃酮苷的銀杏葉提取物。<實驗實施例1>抑制一氧化氮產生的活性除了作為重要的信號傳遞物質外，一氧化氮還與炎癥、神經細胞損傷和阿爾茨海默病的發作相關。因此已開發了具有抑制歸因于iNOS(誘導型一氧化氮合酶)的過多一氧化氮產生的活性的新藥物。這些藥物中，銀杏苦內酯A、銀杏苦內酯B和銀杏內酯被報道抑制一氧化氮的產生。RAW264.7細胞是小鼠的巨噬細胞，可被接種并培養于96孔細胞培養板2小時，隨后再加入不同濃度(1-1000/mL)的測試物和脂多糖(LPS)另外培養24小時。在與格里斯試劑(Griessreagent)反應后一氧化氮的產生用分光光度計由全自動定量繪圖酶標儀在550nm定量測定。圖1顯示了GBE、YY-1224和YY-1824對一氧化碳產生的抑制活性，YY-1224是本發明的銀杏葉提取物，與GBE(標準化的銀杏葉提取物)相比顯示出極為優良的活性。<實驗實施例2>iNOS蛋白和iNOSmRNA的產生為了研究歸功于YY-1224和YY-1824的抑制一氧化氮產生的機理，通過蛋白質印跡法和依據ChiYS等(生化藥理學(Biochem.Pharmacol.)61,1195-1203，2001)的RT-PCR方法觀察iNOS蛋白和iNOSmRNA,結果見圖2和圖3。圖2顯示了通過蛋白質印記法觀察到的i—NOS蛋白結果。與標準化的銀杏葉提取物(GBE)相比，YY-1224和YY-1824被確定在更低的濃度抑制iNOS蛋白的產生。圖3顯示了通過RT-PCR方法觀察到的iNOSmRNA結果。與標準化的銀杏葉提取物(GBE)相比，YY-1224和YY-1824被確定在更低的濃度抑制iNOSmRNA的產生。通過上述結果，YY-1224和YY-1824對一氧化氮產生的抑制活性可能被推測是由于減少iNOS蛋白和iNOSmRNA的產生。<實驗實施例3>YY-1224改善p-淀粉樣蛋白誘導的ICR小鼠記憶和認知損傷的活性以50mg/kg的劑量，口服給予測試物至ICR小鼠7天，隨后腦室內(i.c.v.)給予400pmolp-淀粉樣蛋白。在工作記憶試-瞼進行前，對照組給予不容易引起阿爾茨海默斑的40-氨基酸肽(A(31-40)。試驗組被給予容易引起阿爾茨海默斑的42-氨基酸肽(Api-42)。為了進行工作記憶試驗，將一個圓形浴盆(直徑90cm，高60cm)裝滿水，并在浴盆中間(表面1cm以下)安裝一個透明的平臺。將小鼠隨機置于距離浴盆外壁2cm遠的5個固定點之外的某一位置。該工作記憶試驗通過測定小鼠到達平臺所需的時間來進行。圖4顯示了對照組和試驗組在工作記憶試驗期間的平均逃離潛伏期。盡管給予A卩l-42，-淀粉樣蛋白延長了平均逃離期(絲)，GBE、YY-0924、YY-1224和YY-1824的預治療縮短了平均逃離期，因此顯示出記憶和認知的改善(**)。特別地，YY-1224在改善由(3-淀粉樣蛋白誘導的記憶和認知損傷中被確定顯著優于任何對照實施例。<實驗實施例4>YY-1224在改善由(3-淀粉樣蛋白誘導的COX-2(+/+)小鼠記憶和認知損傷的活性。以50mg/kg的劑量，口服給予測試物至COX-2(+/+)小鼠7天，所述小鼠為具有COX-2基因的野生型小鼠，隨后腦室內(i.c.v.)給予400pmol(3-淀粉樣蛋白。進行探針試驗前，對照組給予不容易引起阿爾茨海默斑的40-氨基酸肽(A(31-40)。試驗組被給予容易引起阿爾茨海默斑的42-氨基酸肽(AP1-42)。為了進行^探針試驗，將一個圓形浴盆(直徑90cm，高60cm)裝滿水，并在浴盆中間(表面lcm以下)安裝一個透明的平臺。將小鼠隨機置于距離浴盆外壁2cm遠的5個固定點之外的某一位置，并被允許記住該平臺的位置。該探針試^r通過測量小鼠穿過平臺的次數來進行。圖5比較了環形穿越(annuluscrossing)數，作為給COX-2(+/+)小鼠按50mg/kg劑量給予測試物7天和400pmo1的(3-淀粉樣蛋白(i.c.v.)之后的探針試驗結果。所述A(31-42p-淀粉樣蛋白的給藥有意義地減少了環形穿越次數(##),這通過GBE、YY-0924、YY-1224和YY-1824的預治療而得到了改善(**)。特別地，YY-1224可在改善(3-淀粉樣蛋白引起的記憶和認知損害中被確定是顯著優于任何對照實施例。<實驗實施例5>改善MPTP誘導的運動能力的降低以50mg/kg的劑量，將測試物口服(p.o.)給予COX-2(+/+)小鼠8天。在該藥物治療期間，還以1天的間隔給予可降低運動能力并引起神經毒性的MPTP(25mg/kg,Lp.)6次。根據BurnsR.S.等(國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)80，4546-4550，1983)測定自發活動。對照組^皮鄉合予生理鹽水溶液。圖6顯示了銀杏葉提取物在改善MPTP誘導的運動能力降低的效果。特別地，圖6顯示了小鼠的自發活動，所述小鼠是被給予測試物(50mg/kg，p.o.)8天，并且被以1天的間隔給予MPTP(25mg/kg，i.p.)6次，所述MPTP能降低運動能力并引起神經毒性。僅給予MPTP的組(絲)顯示了運動能力的顯著降低，而給予GBE、YY-0924、YY-1224和YY-1824的組(*)顯示了運動能力的提高。特別地，給予YY-1224的組(**)在提高運動能力中具有顯著優勢。<實驗實施例6>抗MPTP誘導的多巴胺合酶表達損傷和腦炎癥細胞(小膠質細胞)表達的抑制活性多巴胺為重要的信號傳遞物質，帕金森氏病被報道是由黑質中的多巴胺總量減少引起的。MPTP減少了酪氨酸羥化酶的表達，并在動物試驗中廣泛用于制造帕金森氏病的模型。通過給予MPTP(F4/80蛋白質的表達的增加)引起小神經膠質細胞的增殖被用于腦部炎癥模型。以50mg/kg的劑量，將測試物口服(p.o.)給予C0X-2(+/+)小鼠8天。在所述藥物治療期間，還以1天的間隔給予可降低運動能力并引起神經毒性的MPTP(25mg/kg，Lp.)6次。酪氨酸羥化酶在黑質中的表達以及黑質和紋狀體中小膠質細胞的增殖通過Liu,X.H.等.的(腦研究(BrainResearch)，625，29-37，1993)進行評價。對照組被給予生理鹽7jc溶液。圖7為顯微照片，其顯示MPTP減少了黑質中酪氨酸羥化酶的表達，而測試物增加了酪氨酸羥化酶的表達。圖8是顯示了與酪氨酸輕化酶相關的免疫反應的圖(Y軸表達酪氨酸羥化酶的細胞數)。MPTP減少了黑質中酪氨酸幾化酶的表達(辦)，而GBE、YY-1224和YY-1824增加了酪氨酸鞋化酶的表&(*，承承,承)圖9為顯孩i照片，其顯示了MPTP增強炎癥應答，即增加小膠質細胞在黑質中的增殖，而測試物減少了小膠質細胞的增殖。圖10是顯示了與小膠質細胞增殖相關的免疫應答的圖(Y軸小膠質細胞中特異蛋白質的表達程度，即F4/80，用染色區(coloredarea)和暗區(darkness)作為相對于生理鹽水溶液給藥組的比率來表示)。MPTP增強炎癥應答，即增加黑質中小膠質細胞的增殖(絲)，而GBE、—YY-1224和YY-1824減少了小膠質細胞的增殖(**)。圖ll為顯微照片，顯示MPTP增強炎癥應答，即增加小膠質細胞在紋狀體中的增殖，而測試物減少了小膠質細胞的增殖。圖12為顯示了關于小膠質細胞增殖的免疫應答的圖(Y軸小膠質細胞的特異蛋白質的表達程度，即F4/80,用染色區和暗區作為相對于生理鹽水溶液給藥組的比率來表示)。MPTP增強炎癥應答，即增加紋狀體中小膠質細胞的增殖(##),而GBE、YY-1224和YY-1824減少了小膠質細胞的增殖(**)。通過上述結果，可確定YY-1224和YY-1824可有意義地減少黑質中多巴胺合酶的表達并減少黑質和紋狀體中炎癥應答。進一步，值得注意的是YY-1224具有顯著優良的活性。<實驗實施例7>抗曱基苯異丙胺(MA)誘導的多巴胺合酶損傷和小膠質細胞表達的抑制活性。以50mg/kg的劑量，將測試物例如GBE、YY-1224和YY-1824口服(p.o.)給予C0X-2(+/+)小鼠7天。在藥物治療期間，曱基苯異丙胺(MA)也以2小時的間隔(7.5mg/kg，i.p.)被給予4次。評價酪氨酸羥化酶在黑質中的表達和小膠質細胞在黑質和紋狀體中的增殖。對照組被給予生理鹽水溶液。圖13為顯微照片，其顯示了甲基苯異丙胺減少了在黑質中酪氨酸羥化酶的表達，而測試物增加了酪氨酸輕化酶的表達。圖14是顯示了關于酪氨酸羥化酶的免疫應答的圖(Y軸表達酪氨酸羥化酶的細胞數量)。甲基苯異丙胺減少了黑質中酪氨酸羥化酶的表達(##)，而GBE、YY-1224和YY-1824增加了酪氨酸羥化酶的表達(*，**，*)。圖15為顯微照片，其顯示了曱基苯異丙胺增強的炎癥應答，即增加小膠質細胞在黑質中增殖，而測試物減少了小膠質細胞的增殖。圖16為顯示了關于小膠質細胞增殖的免疫應答的圖(Y軸小膠質細胞中特異蛋白質的表達程度，即F4/80,用染色區(coloredarea)和暗區(darkness)作為相對于生理鹽水溶液給藥組的比率來表示)。甲基苯異丙胺增強了免疫應答，例如黑質中小膠質細胞的增殖(絲)，而GBE、YY-1224和YY-1824減少了小膠質細胞增殖(承承)圖17為顯微照片，顯示了甲基苯異丙胺增強的炎癥應答，即增加小膠質細胞在紋狀體中增殖，而測試物減少了小膠質細胞的增殖。圖18為顯示了關于小膠質細胞增殖的免疫應答的圖(Y軸小膠質細胞中特異蛋白質的表達程度，即F4/80，用染色區(coloredarea)和暗區(darkness)作為相對于生理鹽水溶液給藥組的比率來表示)。MPTP增強了炎癥應答，即增加紋狀體中小膠質細胞的增殖(##),而GBE、YY-1224和YY-1824減少了小膠質細胞增殖(**)。通過上述結果，可確定YY-1224和YY-1824可有意義地減少黑質中多巴胺合酶的表達并減少黑質和紋狀體中炎癥應答。進一步的，值得注意的是YY-1224具有顯著優良的活性。通過使用本發明的銀杏葉提取物進行了多種試驗，測定其抑制一氧化氮的產生、改善(3-淀粉樣蛋白誘導的阿耳茨海默病和MPTP誘導的帕金森病，以及改善曱基苯異丙胺誘導的神經元損傷的活性。結果，YY-1224和YY-1824被證實在抑制一氧化氮增殖中優于標準化的銀杏葉提取物。特別地，YY-1224在改善P-淀粉樣蛋白誘導的阿耳茨海默病和MPTP誘導的帕金森病中顯著優于標準化的銀杏葉提取物和對照實施例制備的提取物(YY-0924和YY-1824)。因此，本發明的銀杏葉提取物可用于治療或預防由一氧化氮產生并伴有神經元損傷導致的腦機能障礙而引起的的疾病，例如(3-淀粉樣蛋白誘導的阿耳茨海默病和帕金森病。工業實用性如上所述，本發明的銀杏葉提取物在抑制一氧化氮產生以及改善阿耳茨海默病和帕金森病中優于常規的銀杏葉提取物。進一步地，根據本發明的制備方法，通過簡單的步驟一種含有高含量辟內酯的新銀杏葉提取物可被直接從銀杏葉中提取和純化，因此顯著提高了生產率。本發明公開的該具有新組合的銀杏葉提取物能顯著良好地改善器質性腦損傷，可被制成粉劑、顆粒劑、片劑、硬膠嚢、軟膠嚢或注射劑，可用于治療或預防阿耳茨海默病和帕金森病或與一氧化氮產生相關的其它多種疾病。權利要求1.一種銀杏葉提取物，其用于阿爾茨海默病和帕金森病的預防或治療，其含有相對于所述提取物總重量的10-14重量％的萜內酯、20-30重量％的銀杏黃酮苷和少于5ppm的銀杏酸。2.—種從銀杏葉中提取和純化銀杏葉提取物的方法，其包括(1)通過將銀杏葉浸入選自由丙酮、d-Cs醇及它們的混合物所組成的組中的有機溶劑中，或者浸入20-80體積％所述有機溶劑的含水溶液中，之后在5-140。C下提取并過濾，獲得第一提取溶液，(2)通過使用庚烷或己烷對第一提取液進行分級萃取，并棄去溶于庚烷或溶于己烷的部分，獲得第二提取液，(3)通過使用體積比為1:2-2:1的丁醇和曱苯混合溶劑對第二提取液進行分級萃取，獲得第三提取液，其溶于丁醇-曱苯混合物中，(4)通過將第三提取液置于5-30。C下2-24小時，獲得第四提取液，隨后過濾，以及(5)將已過濾的第四提取液減壓濃縮并干燥所述濃縮物，從而獲得用于預防或治療阿爾茨海默病和帕金森氏病的銀杏葉提取物，其含有相對于從銀杏葉中得到的提取物總重量10-14重量％的萜內酯、20-30重量％的銀杏黃酮香和少于5ppm的銀杏酸。3.根據權利要求2所述的方法，其中，所述步驟(3)中丁醇和曱苯混合體積比為1:1。4.根據權利要求2所述的方法，其中，所述銀杏葉提取物含有11-13重量％的辟內酯。5.—種銀杏葉提取物，其用于阿爾茨海默病和帕金森病的預防或治療，含有相對于所述提取物總重量10-14重量％的萜內酯10-14重量％、20-30重量％的銀杏黃酮苦和少于5ppm的銀杏酸，所述提取物按照權利要求2制備。6.根據權利要求1或5所述的銀杏葉提取物，其抑制一氧化氮的產生并改善(3-淀粉樣蛋白誘導的記憶和認知損害，并改善MPTP誘導的和曱基苯異丙胺誘導的多巴胺合酶減少和神經元中的炎癥反應。7.根據權利要求1或5所述的銀杏葉提取物，其含有11-13重量％的萜內酯。8.根據權利要求7所述的銀杏葉提取物，其含有12重量％的萜內酯。9.一種藥物組合物，其每單位劑型含有量為20-240mg的權利要求l或5所述的銀杏葉提取物。10.根據權利要求9所述的藥物組合物，其進一步含有至少一種選自由稀釋劑、賦形劑、崩解劑、粘合劑和潤滑劑所組成的組中的藥學上可接受的載體，并被制成粉劑、顆粒劑、片劑、硬膠嚢、軟膠嚢或注射劑。全文摘要本發明涉及一種銀杏葉提取物，其包含相對于所述提取物總重量10-14重量％(優選11-13重量％和最優選12重量％)的萜內酯、20-30重量％的銀杏黃酮苷和少于5ppm的銀杏酸，其在抑制NO(一氧化氮)的產生和治療阿爾茨海默病和帕金森病中，優于包含標準銀杏葉提取物(德國藥典2000)的常規銀杏葉提取物，并且本發明還涉及其提取和純化方法以及含有其作為活性組分的藥物組合物。文檔編號A61K36/16GK101432008SQ200780015327公開日2009年5月13日申請日期2007年4月27日優先權日2006年4月28日發明者李京姬,李龍五,洪準基,金顯杓,金暎河,金瀅春,金裕鮮申請人:株式會社柳柳制藥