專利名稱：：含有肽作為有效成分的組合物的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種含有肽作為有效成分的組合物。此外，本發明還涉及含有前述組合物的食品或藥物組合物。另外，本發明還涉及前述組合物的制造方法。
背景技術：
：糖尿病是以基于胰島素作用不足、持續高血糖狀態為特征的代謝疾病群的總稱。糖尿病由胰島素敏感性降低和胰島素分泌減少以一定程度組合而引發，并發生糖、脂質、蛋白質代謝的特征性異常。最近，糖尿病被認為是一種生活習慣病，可期待通過適當的對應措施獲得改善的疾病。但是，若糖尿病發展到重度則會引發神經紊亂、視網膜病變或腎病等并發癥，使日常生活的活動顯著降低。糖尿病大致分為胰島素依賴型(IDDM)和胰島素非依賴型(NIDDM)。胰島素依賴型是由于病毒等原因導致的、由自身免疫機制使胰臟(3細胞壞死或停止機能，致使不能合成、分泌胰島素的類型。而胰島素非依賴型是由于年齡增加或壓力等不明確的多種因素導致胰島素分泌不足或胰島素抗性，導致顯示高血糖的類型。約90%糖尿病患者屬于胰島素非依賴型。胰島素非依賴型的輕度或中度患者的治療主要采用飲食療法和運動療法。例如，通過限制飲食的熱量、由運動促進糖的代謝等，以使血糖值穩定。從糖尿病的預防或防止惡化的觀點來看，希望飲食療法更加充實，即希望出現可預防糖尿病或防止其惡化的食品。另外，如果飯后的血糖值突然上升及其持續(餐后高血糖)常年持續的話，可能引發糖耐量異常，使糖尿病惡化。伴隨糖尿病惡化，有加重血管損傷、引發神經紊亂、腎病、視網膜病變、進而引起心肌梗塞、腦中風等并發癥的發病的危險。餐后高血糖的抑制被認為對胰島素非依賴型糖尿病的治療有效果，且目前使用作為糖攝取抑制藥的a-葡萄糖香酶抑制劑、作為胰島素分泌促進藥的磺酰脲劑等醫療用藥品。基于這樣的狀況，在藥品領域中，人們也希望出現可預防糖尿病或可防止其惡化的藥品。可抑制血糖值上升的生物物質有胰島素。胰島素是生物體內唯一的通過例如促進肝臟的糖代謝、引起肌肉細胞或脂肪細胞的糖攝取的亢進，由此使血糖值降低的激素。攝取到肌肉或脂肪細胞的糖，代謝為糖原儲存到組織內。肌肉、脂肪細胞中胰島素作用機理之一可列舉將細胞內庫中存在的葡糖轉運體4(GLUT4)移動(動員)至細胞膜上。到目前為止，認為胰島素引起的與促進肌肉或脂肪細胞的糖攝取有關的信號傳遞機制如下。即，胰島素與細胞膜上的胰島素受體(insulinreceptor:IR)結合后，將存在于IR的細胞內部分的酪氨酸激酶活化，使胰島素受體底物(insulinreceptorsubstrates:IRSs)家族酪氨酸磷酸化。被酪氨酸磷酸化的IRSs使磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)活化，隨后進行若干信號傳遞，將細胞內潛在的GLUT4移動至細胞膜上(例如，參考N.Engl.J.Med.,341，248-257,1999)。胰島素也作為藥品來預防糖尿病、或防止其惡化。如上所述，由于糖代謝的異常與生活習慣病中很多疾病相關，需要用于預防生活習慣病或防止其惡化的食品或藥品。另外，在運動領域中，體力，尤其是持久力、抗疲勞能力、疲勞恢復能力等非常重要。并且，運動導致的肌肉疲勞是由于能量產生源即組織中的糖原被消耗達到一定界限時引起的。即，組織中的糖原一旦枯竭，肌肉便陷入不能運動的狀態。另外，才居才艮道(例^t口，參考ActaPhysiol.Scand.，71,140-150，1967)組織中的糖原儲存量與持久力之間呈正相關。因此，為提高持久力、抗疲勞能力、疲勞恢復能力等，提高組織中的糖原儲存量非常重要。另一方面，最近的研究成果才艮道(例如，參考Science，284，974-977，1999)稱在微生物來源的低分子物質或天然植物提取物中發現具有促進細胞的糖攝取作用的物質。另外，例如，還有報道(例如，參考日本特開2005-289861號7>報)稱乳清蛋白及其水解物具有糖原儲存效果。另外，已經有報道稱乳蛋白水解物具有產生糖尿病治療作用的降血糖作用(例如，參考日本特開平04-149139號公報)，乳清蛋白水解物具有血糖調節作用(例如，參考日本特表2006-510367號公報)。
發明內容鑒于這樣的現狀，本發明人們的目的在于提供一種具有預防或治療糖尿病或血糖值上升、促進糖原儲存，或者增進體力、增進運動能力、提高持久力或恢復疲勞的效果中的至少任l種效果的組合物。此外，本發明人們的目的還在于提供一種具有至少l種前述效果的食品或藥物組合物。另外，本發明人們的目的在于提供具有至少l種前述效果的組合物的制造方法。本發明人們反復深入研究，結果發現一種含有肽作為有效成分且可使血糖值降低、可促進糖原儲存的組合物，完成了本發明。也就是說，根據本發明的一種方式，提供一種含有具有促進糖攝取作用的肽作為有效成分，用于促進糖攝取的組合物。"具有促進糖攝取作用的肽"優選為具有亮氨酸和/或異亮氨酸的二肽。另外，根據本發明的另一種方式，提供一種含有具有亮氨酸和/或異亮氨酸的二肽作為有效成分的組合物。在本發明中，"組合物"包括"肽本身(單一的肽，或多種肽的混合物)"，"蛋白質水解物"或"蛋白質水解物通過膜處理、溶劑分級等進行提純而獲得的混合物，，等。另外，在上述任一方式中，"具有亮氨酸和/或異亮氨酸的二肽"可優選j吏用選自由Ile-Leu、Ile-Trp、Ala-Leu、Val_Leu、Gly-Leu、Asp_Leu、Lys-Ile、Leu-Leu、Ile-Ile、Leu-Ile、lie-Asn、Leu-Ala、Leu-Glu、Leu-Val及lie-Val所組成的組中的至少一種以上二肽。通過含有本發明的組合物，可提供具有預防或治療糖尿病或血糖值上升、促進糖原儲存，或者增進體力、增進運動能力、提高持久力或恢復疲勞的效果中的至少任l種效果的食品或藥物組合物。此外，根據本發明還提供含有肽作為有效成分的組合物的制造方法。本申請的公開與2006年4月21日提出的日本特愿2006-117439號申請中記載的主題相關，其公開的內容在此引用。具體實施例方式本發明的組合物的一種方式為含有具有促進糖攝取作用的肽作為有效成分，用于促進糖攝取的組合物。具有促進糖攝取作用的肽優選為含有亮氨酸和/或異亮氨酸的二肽。特別優選使用Ile-Leu、Ile-Trp、Ala-Leu、Val-Leu、Gly-Leu、Asp-Leu、Lys-Ile、Leu-Leu、Ile-Ile、Leu-Ile、Ile-Asn、Leu-Ala、Leu-Glu、Leu-Val、或Ile-Val。另外，本發明的組合物的其它方式為含有具有亮氨酸和/或異亮氨酸的二肽作為有效成分的組合物。該方式的組合物可以以例如生理活性組合物、營養組合物或功能性組合物形式佳_用。另外，該方式的組合物也可用于促進糖攝取。含有亮氨酸和/或異亮氨酸的二肽特別優選使用Ile-Leu、Ile-Trp、Ala-Leu、Val-Leu、Gly-Leu、Asp-Leu、Lys-Ile、Leu-Leu、lie-Ile、Leu-Ile、lie-Asn、Leu-Ala、Leu-Glu、Leu-Val、或Ile-Val。在上述任一方式中，作為有效成分的肽具有預防或治療糖尿病或血糖值上升的效果(在本說明書中，在無特別指出時血糖值上升的預防效果和降低血糖值效果作為同義詞使用。)、糖原儲存促進效果，或者增進體力、增進運動能力、提高持久力或恢復疲勞的效果。本發明的肽可以認為是類似胰島素的生理活性物質，并且推測其作用機理與胰島素相同。目前，作為藥品使用的胰島素是分子量為3500以上的肽，若經口給藥則不能吸收到體內。但是，本發明的肽、特別是具有亮氨酸和/或異亮氨酸的二肽，為通過經口給藥可顯示促進細胞攝取糖的作用的肽，從而可抑制血糖值的上升。另外，這些肽未顯示出對人體存在有害作用。具有促進糖攝取作用的肽可促進肌肉細胞、肝細胞等細胞特別是肌肉細胞的糖攝取作用。在肌肉細胞中，起因于胰島素與胰島素受體結合，存在于胰島素受體信號下游的磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidyli畫itol-3-kinase;PI3K)被活化，然后經過若干個信號傳遞，使葡糖轉運體4(glucosetransporter4;GLUT4)移動至細胞表面。然后，通常糖通過存在于細胞表面的GLUT4被攝取至細胞內。該途徑可被GLUT4抑制劑或PI3K抑制劑抑制。正如后述實施例所示，本發明的組合物，肽產生的促進糖攝取效果也受GLUT4抑制劑或PI3K抑制劑的抑制。因此，推測由肽帶來的促進糖攝取作用與胰島素產生的作用同樣是GLUT4介導的作用，并與胰島素產生的作用同樣為PI3K介導的作用。GLUT4抑制劑已知有例如細胞松弛素B，PI3K抑制劑已知有例如LY294002(Biochemical.Journal,333,471-490,1998)。本發明的含有肽的組合物可降低血糖值。通過降低血糖值，使糖尿病或血糖值上升的預防或治療成為可能。另外，本發明的組合物具有將糖原儲存在組織中的作用。因此，可提高運動能力，可充分期待在運動現場的有效性。此外，根據本發明的組合物，可提高運動時的持久力、抗疲勞能力、疲勞恢復能力、體力、運動能力、精力、能量補給力等。本發明的肽可由氨基酸合成，優選通過將蛋白質水解獲得。因此，作為本發明的組合物的一個例子，可舉出含有蛋白質水解所得的肽的蛋白質水解物。水解優選通過蛋白質水解酶進行的水解。可使用動物性蛋白質及植物性蛋白質作為原料，例如可列舉牛肉、豬肉、雞肉、蛋類、大豆、牛奶、花生、玉米、小麥等。在本發明中，優選使用酪蛋白、大豆蛋白、小麥谷蛋白、乳清蛋白及牛肉，特別優選使用乳清蛋白。乳清蛋白可使用例如將奶酪或酪蛋白的制造過程中所得的奶酪乳清或酪蛋白乳清通過超濾、納米過濾等過濾方法進行過濾而得到的混合物、分離提純的|3-乳球蛋白、a-乳清蛋白、乳鐵蛋白等。蛋白質水解中的酶、酸或堿處理的條件(例如，底物的濃度、酶量、處理溫度、pH或時間等)可適當進行設定。蛋白質水解中所使用的酶優選在食品衛生上無害的酶，例如可列舉屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)屬或曲霉菌(aspergillus)屬的微生物源的蛋白酶、來自木瓜的木瓜蛋白酶、來自菠蘿的菠蘿蛋白酶等植物源的蛋白酶，胰酶、胰蛋白酶等動物源的蛋白酶，這些蛋白酶可單獨使用或組合使用。例如，為了獲得Ile-Leu的情況下，優選組合來自芽孢桿菌屬的蛋白酶和來自曲霉菌屬的蛋白酶進行水解；為了獲得Ile-Trp的情況下，優選在用胰蛋白酶反應后，用來自曲霉菌屬的蛋白酶進行反應。另夕卜，為了獲得Val-Leu、Lys-Ile、lie-Ile、Leu-Ile、Ile-Asn、Leu-Ala、Leu-Glu及Ile-Val的情況下，優選使用來自曲霉菌屬的蛋白酶；為了獲得Ala-Leu及Asp-Leu的情況下，優選在用胰蛋白酶反應后，用來自芽孢桿菌屬的蛋白酶進行反應；為了獲得Gly-Leu、Leu-Leu及Leu-Val的情況下，優選在用胃蛋白酶進行反應后，用來自曲霉菌屬的蛋白酶進行反應。利用蛋白質水解酶進行水解時，例如處理溫度優選為35~55°C,處理時間優選為3~9小時，并且酶的使用量優選相對100g蛋白質為0.5~10g。通過吸附劑處理法、膜分離法、溶劑分級法、使用通常采用的樹脂的柱色譜操作等提純方法，可從蛋白質分解物分離和提純出高純度的具有促進糖攝取作用的肽。在進行分離和提純之前，也可從蛋白質水解物中提取出肽。用于提取肽的溶劑優選使用水、乙醇、甲醇、丙酮或這些的混合溶劑。溶劑例如可^f吏用90體積％的乙醇水溶液。提取時蛋白質水解物與溶劑的比例無特別限制，相對于l份蛋白質水解物(干燥)希望溶劑為2至1000重量倍，考慮到提取操作、效率，尤其希望為5至100重量倍。另外，提取溫度為"室溫"至"常壓下溶劑的沸點"的范圍，這樣比較方便。提取時間因提取溫度而變化，優選為數小時至2天內的范圍。通過進行這樣的操作，可以溶劑提取物的方式獲得提純的肽。因此，作為本發明的組合物的一個例子，可列舉含有提純后的肽的溶劑提取物。溶劑提取物優選以冷凍干燥后的狀態使用。將蛋白質水解物或其溶劑提取物添加至吸附型的色i普并進行分級時，例如有如下方法。首先，將冷凍干燥的蛋白質水解物或其溶劑提取物溶解于少量的水、曱醇、乙醇等溶劑或這些溶劑的混合溶劑中。隨后，使所得的溶液過柱，使肽吸附到吸附劑上。然后，用水將柱充分洗滌，用曱醇、乙醇、丙酮等親水溶劑或這些溶劑的混合溶劑將肽洗脫即可。還可使用其它分離模式的色譜代替吸附型柱色譜。此外通過將兩種以上的吸附模式和/或其它分離模式的柱色譜組合使用，可獲得更高純度的分離和^提純的肽。作為吸附劑填充柱，例如可列舉SephadexLH-20(瑞典，Pharmacia制)、夕、、474才>HP20(三菱化成工業制)、DevelosilODS(野村化學制)、ODS-A(YMC制)、ODS-AQ(YMC制)、MCI-GEL(三菱化成工業制)、MCI-CHP20(三菱化成工業制)、七匕'一；CHP1MG(三菱化成工業制)、卜3^—/LHW40F(東乂一制)。這樣分離和提純的肽也可作為本發明的組合物進行使用。另外，肽的混合物即分離和提純前的蛋白質水解物或溶劑提取物可直接作為本發明的組合物或經冷凍干燥后作為本發明的組合物來使用。本發明的組合物某些情況下可直接攝取。本發明的組合物，除有效成分的肽之外，還可含有公知的物質。例如，本發明的組合物還可含有為作原料的各種蛋白質經水解而生成的其它肽、水解中所用的催化劑。另外，為增加細胞的糖攝取量，還可含有各種糖類。如上獲得的本發明的組合物可配合到一般的食品(包括飲料)中。配合有本發明的組合物的食品，可作為糖尿病或血糖值上升的預防或治療用食品來使用。同樣，還可作為促進組織中的糖原儲存、提高運動能力的食品來使用。此外，同樣還可作為增進體力、增進運動能力、提高持久力或恢復疲勞的食品來使用。本發明的食品，由于具有促進肌肉細胞的糖攝取作用、糖原的儲存促進作用，因此可作為日常攝取的食品、作為補充劑攝取的健康食品或功能性食品進行提供。并且，本發明的食品適合于希望抑制血糖值的上升用、預防或治療糖尿病、以及希望增進體力或預防體力降低、增進運動能力、提高持久力、恢復疲勞的消費者或者對這些癥狀在意的消費者。因此本發明的食品可作為特定保健用食品、患者用食品進行提供。此外，本發明的食品在用于人以外的哺乳動物對象時，還可作為銅料使用。本發明的食品的形態并無特別限定。本發明的食品的具體例可列舉飲料、粉末飲料、濃縮飲料、片劑、焙烤食品、湯類、漢堡、粉末狀食品、膠嚢狀食品、果凍、咖喱、面包、香腸、酸奶、奶酪、巧克力、口香糖、果醬、冰激凌等。具有促進糖攝取作用的肽優選為水溶性。具有亮氨酸和/或異亮氨酸的二肽為水溶性。水溶性的肽可廣泛添加于一般的食品中。例如，通過每天々大用約1L配合有合計0.001重量％以上的水溶性肽的茶飲料，l天可攝取10mg的肽。為了抑制血糖值上升，優選根據所用肽的活性配合于食品中，肽的攝取量以純品計在O.l~10,000mg/日的范圍內酌情加減。本發明的組合物還可作為血糖值上升抑制劑、糖尿病預防或治療劑等藥物組合物來使用。另外，可作為用于通過促進糖原儲存來治療、預防或改善疾病或癥狀的糖原儲存促進劑來使用。此外，可作為體力增進劑、運動能力的增進劑、持久力的提高劑或疲勞恢復劑等藥物組合物來使用。這些藥物組合物的主要給藥方式為經口劑。作為經口劑中可使用的載體，例如可列舉賦形劑、結合劑、稀釋劑、添加劑、香料、緩沖劑、增稠劑、著色劑、穩定劑、乳化劑、分散劑、懸浮劑、防腐劑等。具體而言，可列舉碳酸鎂、硬脂酸鎂、滑石、砂糖、乳糖、果膠、糊精、淀粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、低融點蠟、可可脂等。根據經口劑的用途等，可分別單獨使用或組合使用這些載體。本發明的藥物組合物作為血糖值上升抑制劑、糖尿病預防/治療劑、糖原儲存促進劑等經口劑使用時的給藥量可隨患者的年齡、癥狀等適當改變。一般而言，給藥量優選在以肽純品計為O.l~10，000mg/日的范圍內。可配合到本發明的食品或藥物組合物中的其它成份，例如可列舉碳水化合物、蛋白質、氨基酸、礦物質類和/或維生素類等。此處，碳水化合物可列舉淀粉、玉米淀粉等多糖類，糊精、蔗糖、葡萄糖、果糖等其它糖類等。另外，此處，蛋白質可為動物性蛋白質，也可為植物性蛋白質，還可為它們的混合物，例如可列舉乳蛋白、大豆蛋白、卵蛋白等。另外，氨基酸可列舉必須氨基酸即亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、曱硫氨酸、組氨酸，以及非必須氨基酸即谷氨酰胺、甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、精氨酸、胱氨酸、酪氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸、鳥氨酸、牛磺酸等。另外，礦物質類無特別限定，可列舉鈣、鎂、鐵等。另外可列舉鈉、鉀、或其它營養方面必需的元素即鋅、銅、鉻、硒、錳、鉬等。另外，維生素類無特別限定，可列舉營養上必需的維生素A、維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素B12、維生素C、維生素D、維生素E、煙酸、泛酸、葉酸、輔酶Q10等。本發明中的有效成分即肽，作為表現抑制血糖值上升作用或增進糖原儲存作用的活性物質，具有充分的有效性。本發明的組合物具有糖尿病或血糖值上升的預防或治療、促進糖原儲存，或者增進體力、增進運動能力、提高持久力或恢復疲勞的效果。另外，通過含有本發明的組合物，可提供發揮糖尿病或血糖值上升的預防或治療、促進糖原儲存，或者增進體力、增進運動能力、提高持久力或恢復疲勞效果的食品或藥物組合物。實施例下面，通過舉出有效成分即肽的制造例、以及各種生物試驗例、制劑實施例等，對本發明進行更詳細的說明。但是，本發明并不受這些實施例的任何限制。另外，實施例中，在無特別指出時，"％"是指"重量％","份"是指"重量份"。制造例l將酪蛋白、大豆蛋白、小麥谷蛋白、乳清蛋白及牛肉各50g分別溶解于1L水中。將各溶液的pH值調整為7.0后，加熱至50°C，保溫。向溶液中加入500mg芽孢桿菌屬源的蛋白酶(ProteaseM"Amano"，AmanoEnzymes,Inc.)和500mg曲霉菌屬源的蛋白酶(ProteaseN"Amano，，,AmanoEnzymes,Inc.)，孵育8小時，然后加熱10分鐘使蛋白酶失活。所獲得的溶液通過冷凍干燥制成粉末狀。將粉末在0.1%三氟乙酸(TFA)水溶液中稀釋1000倍(體積比)，在下述條件下使用LC/MS對Ile-Leu、lie—Trp、Ala-Leu、Val-Leu、Gly一Leu、Asp-Leu、Lys-Ile、Leu-Leu、Ile-Ile、Leu-Ile、Ile-Asn、Leu-Ala、Leu-Glu、Leu-Val及Ile-Val的含量進行定量。表l中示出每lg蛋白質的各種肽的生成量(mg)。從酪蛋白、大豆蛋白、小麥谷蛋白、乳清蛋白及牛肉中，獲得了如表l中所示的肽。分析條件柱DevelosilODS-HG-3(15mmx2mm)流動相A液0.05%TFA水溶液B液0.05%TFA乙腈溶液從開始通入流動相起進行梯度變化，^吏其/人開始0min時為3體積％B液變為40min后為20體積％B液(均為相對于A液及B液的合計的比例)。柱溫35°C流速0.2mL/minMS條件Ionization(離子葉匕)API-ESpositive(正離子才莫式)SIMion(選擇監測離子)m/z245Dryinggas(干燥氣體)350。C下10L/minNebulizer(噴霧器壓力):25psigFragmentor(毛細管電壓)30VEMgain(電子倍增器增益)1表l<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>制造例2將50g乳清蛋白溶解于1L水中。向溶液中分別單獨或組合加入1)500mg芽孢桿菌屬源的蛋白酶(ProteaseM"Amano，，，AmanoEnzymes,Inc.),2)500mg曲霉菌屬源的蛋白酶(ProteaseN"Amano，'，AmanoEnzymes,Inc.),3)500mg胰蛋白酶(Novo公司)，4)500g胃蛋白酶(和光純藥)，5)500mg復合風味蛋白酶(Flavorzyme)(Novo公司)，6)500mg曲霉菌屬源的蛋白酶(々-r《if4厶(商品名)，AmanoEnzymes,Inc.),7)500mg曲霉菌屬源的蛋白酶(ProteaseA"Amano",AmanoEnzymes,Inc.)，以及8)500mg曲霉菌屬源的蛋白酶(ProteaseP"Amano",AmanoEnzymes,Inc.)，進行乳清蛋白的水解(表2)。將蛋白酶加熱失活后，將所得的溶液通過冷凍干燥制成粉末。將粉末在0.1。/q三氣乙酸(TFA)水溶液中稀釋1000倍(體積比)，根據上述條件使用LC/MS(液相色譜-質譜)對Ile-Leu、Ile-Trp、Ala-Leu、Val-Leu、Gly—Leu、Asp-Leu、Lys-Ile、Leu-Leu、Ile-Ile、Leu-Ile、lie-Asn、Leu-Ala、Leu-Glu、Leu-Val及Ile-Val進行定量。結果在表2中示出。在將l)芽孢桿菌屬源的蛋白酶和2)曲霉菌屬源的蛋白酶組合進行反應時，獲得了含有最高含量的lie-Leu的蛋白質水解物。另外，在3)胰蛋白酶反應后，再用2)曲霉菌屬源的蛋白酶進行反應時，獲得了含有最高含量的Ile-Trp的蛋白質水解物。另夕卜，Val—Leu、Lys—Ile、Ile—Ile、Leu—Ile、Ile—Asn、Leu-Ala、Leu-Glu及Ile-Val在用6)曲霉菌屬源的蛋白酶進行反應的情況下，Ala-Leu及Asp-Leu在以3)胰蛋白酶反應后，再以l)芽孢桿菌屬源的蛋白酶進行反應的情況下、Gly-Leu、Leu-Leu及Leu-Val在以4)胃蛋白酶反應后，再以2)曲霉菌屬源的蛋白酶進行反應的情況下，可獲得含有最高含量的這些肽的蛋白質水解物。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>制造例3將50g乳清蛋白溶解于1L水中。將溶液的pH值調整為7.0后，加熱至50。C，保溫。向溶液中加入500mg芽孢桿菌屬源的蛋白酶(ProteaseM"Amano",AmanoEnzymes,Inc.)和500mg曲霉菌屬源的蛋白酶(蛋白酶N"Amano",AmanoEnzymes,Inc.),孵育8小時，然后加熱10分鐘4吏蛋白酶失活。然后，從通過冷凍干燥制成粉末狀的10g乳清蛋白水解物中，用1L的0%、50%、60%、70%、80%、90%、95%乙醇(乙醇相對于乙醇水溶液總體的體積％),提取出lie-Leu及lie-Trp。將提取液以濃縮蒸發器進行濃縮后，通過冷凍干燥制成粉末。將粉末在0.1%三氟乙酸水溶液中稀釋1000倍(體積比)，以上述條件使用LC/MS,對lie-Leu及lie-Trp進行定量。結果在表3中示出。用90%乙醇提取的提取物中含有Ile-Leu及Ile—Trp最多。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>(mg/g蛋白質)實施例1片劑根據常規方法，取規定量的下述成分，均勻混合，并壓縮成型，制得直徑7mm,每片150mg的片劑。異亮氨酰亮氨酸(促進糖攝取的二肽)30份谷氨酰胺54分纈氨酸54分亮氨酸7份異亮氨酸3份玉米淀粉1SM分晶態纖維素30份硬脂酸鎂l份實施例2食品取規定量的下述成分，進行均勻化，制得本發明的食品。制造例1中制成的含有促進糖攝取的肽的蛋白質分解物(粉末)90份谷氨酰胺2寸分焦磷酸鐵1份玉米淀粉7份實施例3錠狀點心使用實施例2制造的食品，以下面的配方，根據常規方法制造錠狀點心。砂糖52份濃縮果汁5份檸檬酸6份香料2份乳化劑3份實施例2的食品32份生物試驗例l:對肌肉細胞糖攝耳又速度的影響Wistar系i,性大鼠(體重120g)(16只)在戊巴比妥麻醉下，小心地無傷地取出滑車上肌(epkrochlearis)。在含有0.1%BSA(牛血清白蛋白)、8mM葡萄糖及32mM甘露醇的KRH(136mMNaCl、4.7mMKC1、1.25mMCaCl2、1.25mMMgS04.7H20、20mMHepes、lmg/mLBSA;pH7.4,以下相同)緩沖液中，在5%C02、95%02下，將滑車上肌在35。C培養1小時。然后，取出滑車上肌，在含有0.1。/。BSA、40mM甘露醇及lmMIle-Leu(國產化學(林))、lmMIle-Trp(國產化學(林))、或者lmM亮氨酸當量的制造例1中制成的乳清蛋白水解物的KRH緩沖液中，在5%C02、95%02、30。C下培養30分鐘(每組8個樣品)。然后，取出滑車上月幾，在含有0.1%BSA、32mM甘露醇、8mM2-脫氧葡萄糖的KRH緩沖液中，在5%C02、95%02、30。C下精確培養20分鐘。精確培養20分鐘后，馬上將滑車上肌用液氮冷凍。其后，將冷凍的滑車上肌在0.3M高氯酸水溶液中進行均質化，中和懸浮液后，用酶法對2-脫氧葡萄糖-6-磷酸的量進行定量，測定糖攝取速度。糖攝取速度(平均值士標準誤差)在表4中示出。lie-Leu、lie-Trp及蛋白質水解物全部都具有肌肉細胞的糖才聶取作用。表4肌肉細胞的糖攝WA(jumol/min/gl幾肉)對照(猛加)0.95±0.101mMIle-Leu1.88±0.40*1mM1le-Trp1.92土0.31*D0mg/L蛋白質水^4勿1.45±0.20**小于5%，差異具有顯著性生物試驗例2:PI3K抑制劑、GLUT4抑制劑對肌肉細胞糖攝取速度效果的影響Wistar系雄性大鼠(體重120g)(每組8只)在戊巴比妥麻醉下，小心地無傷地取出滑車上肌。在含有0.1%BSA、8mM葡萄糖及32mM甘露醇的KRH緩沖液中，在5%C02、95%02、35。C下將滑車上肌培養1小時。然后，取出滑車上肌，在含有0.1%BSA、40mM甘露醇及lmMIle-Leu(國產化學(林))、lmMlie-Leu+lO(iMLY294002(sigma公司)、或者lmMlie-Leu+70nM細胞+>弛素B(sigma7^司)的KRH緩沖液中，在5%(:02、95%02、30。C下培養30分鐘。然后，取出滑車上肌，在含有0.1。/。BSA、32mM甘露醇、8mM2-脫氧葡萄糖的KRH緩沖液中，在5%C02、95%02、30。C下精確培養20分鐘。精確培養20分鐘后，馬上將滑車上肌用液氮冷凍。其后，將冷凍的滑車上肌在0.3M高氯酸水溶液中進行均質化，中和懸浮液后，用酶法對2-脫氧葡萄糖-6-磷酸的量進行定量，測定糖攝取速度。糖攝取速度(平均值士標準誤差)在表5中示出。通過加入作為PI3K抑制劑的LY294002、作為GLUT4抑制劑的細胞松弛素B,抑制了lie-Leu產生的糖攝取作用。這表明Ile-Leu通過PI3K，將GLUT4移動至細胞膜上，由GLUT4介導，促進肌肉細胞的糖攝取作用。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>生物試^^例3:經口糖負荷試驗使用約360g的Wistar系雄性大鼠(每組6只)。以2.0g/kg體重(BW)的量向斷食18小時的大鼠給予30%葡萄糖水溶液。并且，作為試驗物質類，以0.1g/kg體重(BW)的量將制造例l中制成的乳清蛋白水解物或Ile-Leu加入到30。/。葡萄糖水溶液中，進行給予。30、60、90、120、180分鐘后乂人大鼠的尾靜脈血進行采血，用DIA傳感器(葡萄糖測定套裝)(ARKRAY，Inc.)測定血糖值。血糖值的變化量(平均值士標準誤差)在表6中示出。與單獨給予糖液的情況相比，通過增加蛋白質水解物或Ile-Leu,可顯著抑制血糖的上升。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>生物試驗例4:使用2型糖尿病模型小鼠確認糖尿病發病預防效果的試驗讓10周齡的2型糖尿病小鼠模型動物雄性KK-Ay小鼠(日本夕k抹))自由攝取水及伺料，飼養3周(每組8只)。將25%酪蛋白日糧(依照AIN93G)，或者在25%酪蛋白日糧中添加3%的量的制造例1中制成的乳清蛋白水解物作為飼料，分別使小鼠攝取上述飼料。在飼養開始前和飼養3周后從小鼠的尾靜脈采血，測定血糖值。血糖值(平均值士標準誤差)在表7中示出。攝取酪蛋白日糧的小鼠血糖值上升，糖尿病惡化。與此相反，攝取添加有乳清蛋白水解物的酪蛋白日糧的小鼠，血糖值的上升被顯著抑制。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>*小于5%,差異具有顯著性生物試驗例5:糖原儲存效果確認試驗讓Wistar系雄性大鼠(每組8只)自由攝取水及飼料，伺養1周。其中，第16天，讓大鼠每天進行6小時游泳訓練。解剖前1天(第7天)給予18g的限制日糧。隨后，給大鼠加上體重的2%重量的重物，使其進行4小時的游泳運動使糖原消耗枯竭。然后，使其攝取作為對照的25%酪蛋白日糧(依照AIN93G),或者使其攝取將25%酪蛋白日糧中所含的酪蛋白換成制造例1中制成的乳清蛋白水解物的飼料。攝取開始起12小時后，在乙醚麻醉下將大鼠解剖，取出肝臟和肌肉。馬上用取出的臟器進行糖原量的分析。糖原量(平均值士標準誤差)在表8中示出。乳清蛋白水解物具有糖原儲存促進作用。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>*小于5%,差異具有顯著性生物試驗例6:對肌肉細胞的糖攝取速度的影響使用l型膠原包被培養皿，在5%(:02條件下，在添加10%牛血清的伊格爾培養基(aMEM)中培養大鼠成肌細胞L6。將依照常規方法通過胰蛋白酶處理回收的細胞以50000cells/孔種于1型膠原包被的48孔板中，培養3天使之匯合。除去培養基后，在每孔中加入500|uL的添加2%牛血清的伊格爾培養基(aMEM)培養5天，進行細胞的誘導分化。以500pLKRH緩沖液(136mMNaCl、4.7mMKC1、1.25mMCaCl2、1.25mMMgS04.7H20、20mMHepes、lmg/mLBSA,pH7.4)，將各孔洗滌，注意不要剝離細胞。隨后，向各孔中加入500pL分別含有lmMlie-Leu、Ile-Trp、Ala-Leu、Val-Leu、Gly-Leu、Asp-Leu、Lys-Ile、Leu-Leu、lie-Ile、Leu—Ile、lie-Asn、Leu-Ala、Leu-Glu、Leu-Val或lie-Val(國產化學(才朱))的KRH緩沖液，反應3小時。然后，除去KRH緩沖液，加入100|iL含8mM的2-脫氧葡萄糖的KRH緩沖液，精確反應10分鐘。用100pL0.1N的NaOH終止反應，并以等量的0.1NHC1進行中和后，采用酶法對2-脫氧葡萄糖-6-磷酸進行定量，由此測定糖攝取速度。糖攝取速度(平均值士標準誤差)在表9中示出。lie-Leu、Ile-Trp、Ala-Leu、Val-Leu、Gly-Leu、Asp-Leu、Lys-Ile、Leu-Leu、Ile-Ile、Leu-Ile、lie-Asn、Leu-Ala、Leu-Glu、Leu-Val及Ile-Val具有促肌肉細胞的糖攝取作用。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>*小于5%,差異具有顯著性生物試驗例7:用小鼠進行持久運動能力提高效果的確認試驗讓約20g的雄性C57BL/6J小鼠(日本夕k7(抹))自由攝取水及飼料，銅養3周(每組8只)。銅養的第1周，從15米/分鐘、15分鐘、無傾斜條件下的踏車運動開始，逐漸使小鼠習慣速度和運動時間提高至22米/分鐘、30分鐘、無傾斜的踏車運動。從第2周開始至飼養結束都在速度22米/分鐘、30分鐘、無傾斜的條件下實施運動負荷。該運動負荷1周進行5天。其攝取的飼料分別為25%酪蛋白日糧(依照AIN93G)，以及將25%酪蛋白日糧中所含的酪蛋白換成制造例1中制成的乳清蛋白水解物的飼料。飼養3周后，進行運動能力測試。使用踏車，在30米/分鐘的速度、無傾斜的條件下，施加運動負荷，測定小鼠到精疲力竭為止的時間。持久運動時間(平均值士標準誤差)在表10中示出。與攝取酪蛋白日糧的小鼠相比，攝取蛋白質水解物的小鼠持久運動時間增加至約1.74咅。表10持久運動時間(分鐘)25%酪蛋白日糧37±9蛋白質水解物日糧63±7*小于5%,差異具有顯著性本發明的組合物具有在體外(invitro)促進糖攝取作用，同時如上述生物試—驗例所示，在體內(invivo)的Wistar大鼠或小鼠試驗中，也具有血糖上升抑制效果、糖原儲存效果、持久運動能力提高效果。權利要求1.一種用于促進糖攝取的組合物，其含有具有促進糖攝取作用的肽作為有效成分。2.根據權利要求1所述的組合物，其中，具有促進糖攝取作用的肽為具有亮氨酸和/或異亮氨酸的二肽。3.根據權利要求1或2所述的組合物，其中，具有促進糖攝取作用的肽為選自由Ile-Leu、Ile-Trp、Ala-Leu、Val-Leu、Gly-Leu、Asp-Leu、Lys-Ile、Leu-Leu、lie-Ile、Leu-Ile、lie-Asn、Leu-Ala、Leu-Glu、Leu-Val及lie-Val所組成的組中的至少一種。4.根據權利要求1~3任一項所述的組合物，其中，用于促進糖攝取的組合物為含有將蛋白質水解而獲得的、具有促進糖攝取作用的肽的蛋白質水解物。5.—種組合物，其含有具有亮氨酸和/或異亮氨酸的二肽作為有效成分。6.根據權利要求5所述的組合物，其中，二肽為選自由lie_Leu、Ile-Trp、Ala-Leu、Val_Leu、Gly—Leu、Asp-Leu、Lys-Ile、Leu-Leu、Ile-Ile、Leu-Ile、Ile-Asn、Leu-Ala、Leu-Glu、Leu-Val及Ile-Val所組成的組中的至少一種。7.根據權利要求5或6所述的組合物，其中，組合物為含有將蛋白質水解而獲得的二肽的蛋白質水解物。8.根據權利要求4或7所述的組合物，其中，蛋白質為選自由酪蛋白、大豆蛋白、小麥谷蛋白、乳清蛋白及牛肉所組成的組中的至少一種。9.根據權利要求1~3任一項所述的組合物，其中，肽具有促進肌肉細胞的糖攝取作用，用于促進肌肉的糖攝取。10.根據權利要求9所述的組合物，其中，肌肉細胞的糖攝取為由葡糖轉運體4(GLUT4)介導的作用。11.根據權利要求9所述的組合物，其中，月幾肉細胞的糖攝取為由磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)介導的作用。12.根據權利要求1~11任一項所述的組合物，其用于糖尿病或血糖值上升的預防或治療。13.根據權利要求1~11任一項所述的組合物，其用于促進糖原儲存。14.根據權利要求1~11任一項所述的組合物，其用于體力的增進、運動能力的增進、持久力的提高或恢復疲勞。15.—種食品，其含有權利要求1~11任一項所述的組合物，用于糖尿病或血糖值上升的預防或治療。16.—種食品，其含有權利要求1~11任一項所述的組合物，用于促進糖原儲存。、17.—種食品，其含有權利要求111任一項所述的組合物，用于體力的增進、運動能力的增進、持久力的提高或恢復疲勞。18.—種藥物組合物，其含有權利要求1~11任一項所述的組合物，用于糖尿病或血糖值上升的預防或治療。19.一種藥物組合物，其含有4又利要求1~11任一項所述的組合物，用于促進糖原儲存。20.—種藥物組合物，其含有權利要求111任一項所述的組合物，用于體力的增進、運動能力的增進、持久力的提高或恢復疲勞。21.權利要求1~11任一項所述的組合物的制造方法，其包括使用蛋白質水解酶將蛋白質水解的步驟。全文摘要本發明涉及一種用于促進糖攝取的組合物，其含有具有促進糖攝取作用的肽作為有效成分；還涉及一種組合物，其含有具有亮氨酸和/或異亮氨酸的二肽作為有效成分。這些組合物具有預防或治療糖尿病或血糖值上升、促進糖原儲存，或者增進體力、增進運動能力、提高持久力或恢復疲勞的效果。文檔編號A61P3/10GK101426513SQ20078001432公開日2009年5月6日申請日期2007年4月20日優先權日2006年4月21日發明者三本木千秋,倉重惠子,森藤雅史申請人:明治制果株式會社