專利名稱：：具有免疫調節和抗腫瘤能力的肽的制作方法
技術領域：
：本發明包括在癌癥免疫療法領域中。更確切地說，衍生自鱟(Z/zzw7m)抗-LPS因子這種蛋白質的32-51區域的肽或其組合，所述肽不能與脂多糖結合并呈現出免疫調節和抗腫瘤性質以用于治療癌癥和轉移。現有技術近期已報道了生物應答的改性劑主要與目前療法相組合地用于治療癌癥以增強治療益處的用途(US2004/0101511)。另一方面，CpG序列(Toll-樣受體9(TLR9)的激動劑)的用途已被開發為新藥物以用于治療、控制和預防癌癥的多種適應癥，即非小細胞肺癌、黑素瘤和腎癌(KlinmanD.M.等人(2004)ImmunotherapeuticusesofCpGoligodeoxynucleotides.Aev4:249-258)。Toll-樣受體7(TLR7)的激動劑目前在I期臨床試驗中就激活免疫系統進行測試，具有作為新藥物以用于治療黑素瘤和其他腫瘤的有希望的結果(DudekA.Z.等人(2005)ASCOAnnualMeeting)。先前提及的TLR7和9的激動劑還基于其在宿主中促進有效免疫應答的能力在病毒感染中進行評估。此外，已開發了與TLR4結合的所謂的熱休克蛋白(Hsp)，并被制備為與人乳頭瘤病毒(HPV)E7癌蛋白質的融合蛋白。這種新免疫治療方法也稱為治療性疫苗，具有用于治療人乳頭瘤病毒相關疾病的廣泛前景(ChuN.R等人(2000)Immunotherapyofahumanpapillomavirus(HPV)type16E7-expressingtumourbyadministrationoffusionproteincomprisingMycobacteriumbovisbacilleCalmette-Guerin(BCG)hsp65andHPV16E7.^rp//腿mo/121:216-225)。Toll-樣受體是存在于免疫系統的細胞中的受體分子，其識別病原體相關的分子模式，如LPS、脂磷壁酸質、未曱基化的CpG序列以及病毒雙鏈和單鏈RNA。TLR對于侵入性病原體的識別幫助免疫系統指導平衡的Thl/Th2免疫應答，以有效地將感染清除出生物體。TLR激動劑作為藥物來治療癌癥的用途基于激活先天性和適應性的免疫系統。其主要機制在于激活由I型干擾素(例如，IFNa和P)和白介素12(IL-12)介導的Thl免疫應答。因此，達到高度特異的和持久的免疫應答(SwitajT.,JaliliA.等人(2004)CpGImmunostimulatoryoligodeoxynucleotide1826enhancesantitumoreffectofinterleukin12gene-modifiedtumorvaccineinamelanomamodelinmice.C///7/ca/(7a/7cer)esearc力，Vol.10:4165-4175)。免疫系統的這種雙重激活與幾種其他免疫治療方法相反，所述其他免疫治療方法不能在適應性免疫應答中產生持久效應，并且還非特異性地激活先天性免疫系統并具有后續的不希望的效應(SpeiserD.E等人(2005)RapidandstronghumanCD8+Tcellresponsestovaccinationwithpeptide，IFA，andCpGoligodeoxynucleotide7909.r力e/ow/7a7o尸6V2'/z/ca///「e5^.Vol.115(3))。樹突細胞(DC)是通過細胞-細胞相互作用和細胞因子的產生來連接先天性和適應性免疫應答的專業的抗原呈遞細胞。基于一系列表面分子標記物的表達以及不同TLR的表達，DC可以具有骨髓或淋巴起源。淋巴起源的DC(也稱為漿細胞DC)是I型干擾素的主要來源。考慮到這些性質，DC已作為有希望的細胞佐劑進行了處理，以開發針對癌癥和慢性病毒感染的治療性疫苗(SantiniS.M.等人(2003)AnewtypeIIFN-mediatedpathwayforrapiddifferentiationofmonocytesintohighlyactivedendriticcells,57e邁CeZ/s,21:357-362)。然而，這是非常昂貴和困難的技術，目前正通過其來開發其他更實際和費用更低的備選治療策略(VanEppsH.L.(2005)Newhopefortumor4vaccines,r力e/owi72a/o尸iUT^er/zzze/ifaiyl/e(//c//7e，Vol.202:1615)。最初通過其抗病毒活性進行描述，I型干擾素UFNct，P)近期已顯示對免疫系統發揮重要影響，通過其對DC的輔佐效應來促進細胞和體液免疫應答(Bogdan，C.(2000)ThefunctionoftypeIinterferonsinantimicrobialimmunity.Cwrr,/順""o厶12:419-424)。近期工作已顯示出內源性I型干擾素在高度免疫原性同系基因鼠類肉瘤消退的過程中，以及在保護宿主免于原發性致癌腫瘤形成中的關鍵作用(GavinP.Durm等人(2005)AcriticalfunctionfortypeIinterferonsincancerimmunoediting.y"we/順w7o/野，June12)。此夕卜，在病毒感染例如流感中,IFN-oc通過直接激活004+或008+T淋巴細胞而在起始抗病毒T淋巴細胞應答中起重要作用(FonteneauJ.F等人(2003)Activationofinfluenzavirus-specificCD+4andCD+8Tcells:anewroleforplasmacytoiddendriticcellsinadaptiveimmunity,/邁膨/7062'c^og7，101:3520-3526)。Hoess(WO95/05393)在他的發明中描述了以高親和力結合LPS的物質，其用于預防或治療感染，例如革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌介導的敗血癥、一般而言的細菌感染和真菌感染。此類物質是具有內毒素結合結構域的LPS結合肽(HoessA.等人(1993)Crystalstructureofanendotoxin-neutralizingproteinfromthehorseshoecrab,Limulusanti-LPSfactor,at1.5A°resolution,r力e/.12:3351-3356)。原始鱟抗-LPS因子(LALF)這種蛋白質的晶體結構揭示出類似于多粘菌素B的環，其帶正電荷、為兩親性的并包含暴露的疏水和芳香族殘基。基于這個原則，他證明了相應于LALF蛋白上的氨基酸31-52的序列結合并中和與肝素相關的效應的能力，所述效應例如為抗凝、血管發生以及抑制內皮和腫瘤細胞的增殖。然而，在上文提及的專利中不存在支持這種闡述的實驗數據。事實上，所授權的權利要求涉及用于去除溶液中的LPS的裝置，其中所述裝置包含固定在固體支持體中的肽(US6,384,188)。另一方面，Vallespi(US6,191,114)在她的發明中描述了包含LALF蛋白的氨基酸31-52的肽，其通過誘導IFN-ot和y而對于Hep-2和MDBK類型的細胞施加抗病毒效應；在她的發明中還描述了所述肽用于治療病毒感染和免疫抑制相關病癥的用途。此外，同一作者已證明了這種肽在敗血癥的動物模型中的抗感染效應(VallespiM.G.等人(2003)ALimulusanti-LPSfactor-derivedpeptidemodulatescytokinegeneexpressionandpromotesresolutionofbacterialacuteinfectioninmice,/"fer/za〃ona〃/Z7節/70/7力ar/zaco70^7，3:247-256)。存在許多針對癌癥的療法，包括化療、放射和基因療法。毒性是所有這些療法的一個主要缺點，其中在延長的時間段內施用高劑量以最終達到某些有益的療效。因此，仍需要開發新藥物用于獲得更有效的治療。基于免疫系統檢測和指導針對腫瘤的有效應答的基本作用，被設計為激活宿主先天性和適應性防御機制的藥物可以變成用于癌癥治療的有力工具。迄今沒有描述過在LALF蛋白質的序列HYRIKPTFRRLKWKKYKGKFW中的特定氨基酸置換，其消除了結合LPS的能力并增強免疫調節效應，還在體內賦予針對幾種腫瘤的抗腫瘤效應。發明詳述本發明解決了先前提及的問題，提供了衍生自LALF蛋白質序列HYRIKPTFRRLKWKKYKGKFW(SEQ.ID.NO:13)的32-51區域的肽，其中氨基酸已進行置換以消除結合LPS的能力并增強免疫調節和抗腫瘤效應。通過置換而衍生自所述序列的類似肽(其不結合LPS或肝素，并與親本肽相比較還提供增加的免疫調節和抗腫瘤效應)呈現出下述序列HARIKPTFRRLKWKYKGKFWHYRIKPTARRLKWKYKGKFWHYRIKPTFRRLAWKYKGKFWHYRIKPTFRRLKWKYKGKFA(SEQ.ID.NO:1)(SEQ.ID.NO:2)(SEQ.ID.NO:3)(SEQ.ID.NO:4)由Hoess和Vallespi描述的LPS結合肽是不利的，因為它們使混合的Thl/Th2特性鐠朝向對癌癥患者有害的占優勢的Th2特性譜方向偏離。由于免疫抑制這些患者通常呈現伴隨感染，其中不排除血液中LPS顆粒的存在。在LPS存在下誘導占優勢的Th2特性譜的肽的施用將導致不希望的效應，這使患者的免疫狀態進一步惡化并使針對腫瘤的宿主應答變壞。此外，由Vallespi描述的肽與LPS的結合將使這種肽的免疫調節效應降到最低。另一方面，在本發明中描述的肽缺乏與肝素的結合使得它們優于先前由Hoess和Vallespi描述的那些。在臨床患者例如患有缺血性心臟病、腦血管病、靜脈血栓栓塞性疾病(深靜脈血栓形成和肺栓塞)和下肢缺血的那些患者中，肝素的使用被指明為治療(D.CabestreroAlonso等人(2001)Heparinasdebajopesomolecularenpacientescri'ticos:usos，indicacionesytipos.#ed/c//7a/""/7"><3，Vol.95:18-26)。隨后施用肝素結合肽在這種情況下可以是禁忌的，因為千擾了這種藥物的效應。癌癥和血栓栓塞性疾病的關聯是可以顯著促成癌癥患者中的發病率和死亡率的經充分描述的現象，例如深靜脈血栓形成和肺栓塞。基于先前提及的這些原因，能夠獲得不能結合肝素并顯示出免疫調節和抗肺瘤效應的肽在治療癌癥患者中是有利的，大部分這些患者通常經歷外科手術并呈現出其他病癥例如高凝性(CastelliR.等人(2004)Theheparinsandcancer:Reviewofclinicaltrialsandbiologicalproperties.Kascu/ar#ed/c//2e,Vol.9:l-9)。本發明還包括具有2個或更多個由丙氨酸置換的氨基酸的肽，其包含下述氨基酸序列HYRIKPTARRLAWKYKGKFWHARIKPTARRLKWKYKGKFWHARIKPTFRRLAWKYKGKFWHARIKPTARRLAWKYKGKFWHARIKPTARRLAWKYKGKFA(SEQ.ID.NO:8)(SEQ.ID.NO:9)(SEQ.ID.NO:10)(SEQ.ID.NO:11)(SEQ.ID.NO:12)，和通過合成或重組過程獲得的這些前述肽的任何同源或模擬變體，以及任何包含它們的融合肽。同源變體涉及缺乏LPS或肝素結合能力并具有免疫調節和抗腫瘤效應的任何肽。類似地，所述模擬變體涉及其結構缺乏LPS或肝素結合能力并維持免疫調節和抗腫瘤效應的任何化學起源的分子(非蛋白質)。在本發明的一個優選實施方案中，藥物組合物包含一種或多種肽和化合物或其各自的藥學上可接受的鹽，以及藥學上可接受的賦形劑或載體。在本發明的其他優選實施方案中，藥物組合物另外還包含選自細菌、病毒或癌抗原的抗原。類似地，本發明的肽可以與針對癌癥的常規治療如化療、外科手術、放射等聯合使用。本發明還包括這些肽和化合物在制備藥物組合物中的用途，所述藥物組合物用于治療和/或預防需要有效的Thl免疫應答的免疫學病癥；治療或預防癌癥；以及發展出針對細菌或病毒起源的感染的有效的免疫應答。所描述的肽通過缺乏結合LPS的能力來進行定義，而不是先前描述為用于LPS結合的共有最佳結構域的原始HYRIKPTFRRLKWKYKGKFW序歹'J(Hoess等人(1993)Crystalstructureofanendotoxin-neutralizingproteinfromthehorseshoecrab,Limulusant卜LPSfactor,at1.5AQresolution,r力e/.12:3351-3356)。同樣地，與Vallespi在她的專利(US6,191,114)中將其描述為抗病毒和免疫調節肽的衍生自LALF蛋白質并且包含氨基酸32-51的肽相比較，在本發明中描述的肽增強由IFN-oc的分泌所介導的免疫調節效應。類似地，可以將本發明中描述的肽施用于免疫抑制的患者和需要激活其免疫狀態的那些患者，例如患有獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的患者和經歷復雜手術的患者。體內實驗數據證實了類似肽在移植入小鼠中的肺瘤中的功效，這些腫瘤衍生自鼠類黑素瘤B16細胞；來自C57BL/6小鼠的惡性肺上皮細胞；和得自小鼠肺癌的3LL-D122細胞。在另一個實施方案中，可以施用肽以使轉移事件降到最低。本發明的其他結果表明，所描述的肽顯示出對各種組織學起源的胂瘤細胞系的抗增殖效應，這證實了對癌細胞的直接的細胞毒性效應。原則上，所描述的肽可以單獨地或者與用于治療癌癥的目前療法(例如外科手術、放射或化療)聯合使用。類似地，當在預防方面進行施用時，在本發明中描述的肽產生針對腫瘤的快速的先天性免疫應答，隨后發展出適應性的抗原特異性免疫應答，這強調了其在針對癌癥的預防或治療性疫苗中的用途。附圖簡述圖1:肽對于結合細菌脂多糖(LPS)的能力的影響。圖1A，這些實驗一式三份地進行；顯示了一次實驗的抑制曲線。圖1B中顯示的抑制百分比表示3次獨立實驗的平均值。圖2:肽對于結合陰離子化合物肝素的能力的影響。顯示了3次獨立實驗的平均值。圖3:肽對于人單核細胞中干擾素a和P以及IL-12的產生的影響。3次實驗用不同供體來進行，顯示了其中之一的結果。圖4:肽在TC-1胂瘤模型中的抗腫瘤效應。圖5:L-2肽在黑素瘤模型中的抗腫瘤效應。圖6:L-2類似肽在TC-1腫瘤模型的預防性施用方案中的抗腫瘤效應。圖7:L-2類似肽在使用TC-1腫瘤細胞的雙重攻擊方案中的抗腫瘤效應。圖8:L-2類似肽的抗轉移能力。圖9:L-2類似肽對于TC-1、H125和L929細胞增殖的影響。實施例實施例1.肽合成本發明的肽根據固相操作程序來合成。粗制的肽用30%乙酸溶液進行萃取，凍干，并通過RP-HPLC進一步純化。純化的肽的分子量通過使用質譜儀JEOLJMS-HX110HF與FAB槍進行檢查。所得到的制劑是非抗原性的、非熱原性的并且對于在動物和人中施用是藥學上可接受的。置換通過將丙氨酸引入肽HYRIKPTFRRLKWKYKGKFW的原始序列的每個位置中來進行。實施例2.選擇缺乏結合脂多糖(LPS)的能力的類似肽這個測定法由ELISA類型的竟爭系統(HardyE.等人(1990EnhancedEUSAsensitivityusingTCAforefficientcoatingofbiologicallyactiveLPSorLipidAtothesolidphase././邁/ou"o/.#eM.Vol.176:111-116)組成。使用0.2%三氯乙酸(TCA),將聚苯乙烯平板(Costar，USA)用來自大腸桿菌0111:B4的LPS(1pg/ml)進行包被。平板于37。C溫育過夜，并用1X磷酸鹽緩沖鹽水(IXPBS)+Q.1%Tween-20(洗滌溶液)進一步洗滌10次。類似肽與固定至固體表面的LPS的結合通過使用0.2^iM的生物素化的LALF32—51肽的竟爭ELISA進行評估，獲得90。/。的最大LPS結合。為了估計抑制曲線，使用IOjuM-0.01jaM的不同濃度的類似肽，并且制作LALF32_51肽的曲線作為實驗對照。生物素化的LALF32-"在類似肽存在下于37'C溫育2小時，并且平板在那之后用洗滌溶液洗滌5次。與LPS結合的生物素化的LALF3^通過于37C與鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶綴合物(1:2，000稀釋度)溫育45分鐘來進行檢測。平板用洗滌溶液洗滌5次，并且添加底物溶液(0.05M檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液，pH5.5，1片3，3'，5，5'-四曱基聯苯胺和0.025%過氧化氫)。在15分鐘溫育后，反應通過添加2M疏酸來終止。吸光度在450nm處在平板閱讀器(SensidentScan)中進行定量。在類似肽的光密度值和LPS結合能力之間存在關聯。與LALF32-5,肽的抑制曲線相比較，具有更高LPS結合能力的類似肽顯示出更低O.D.的抑制曲線。與LALF3^肽的抑制曲線相比較，具有更低LPS結合能力的類似肽呈現出具有更高O.D.值的抑制曲線。結果顯示于圖1A中，其證實命名為L-2、L-8、L-12和L-20的肽喪失了結合LPS的能力，而肽L-9和L-19顯示出類似于LALF^肽的結合LPS的能力。另一方面，L-3肽顯示出更高的LPS結合能力。圖1B給出了根據其替代生物素化的LALF32—51(0.2nM)與吸附至固體表面的LPS進行結合的能力，在固定的0.5M濃度時，類似肽的抑制百分比。抑制％=(l-(([O.D.]樣品-[O.D.]最小)/([O.D.]最大一最小)"x100樣。。。在固定濃度的類似肽存在下的光密度值；最小:ELISA背景;a^無類似肽時的光密度值。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>L-1932HYRIKPTFRRLKWKYKGKAW51(SEQ.ID.NO:7)L-2032HYRIKPTFRRLKWKYKGKFA51(SEQ.ID.NO:4)作為來自這些分析的結果，從缺乏LPS結合能力的肽開始進行雙重、三重和四重突變HYRIKPTARRLAWKYKGKFW(SEQ.ID.NO:8)HARIKPTARRLKWKYKGKFW(SEQ.ID.NO:9)HARIKPTFRRLAWKYKGKFW(SEQ.ID.NO:10)HARIKPTARRLAWKYKGKFW(SEQ.ID.NO:11)HARIKPTARRLAWKYKGKFA(SEQ.ID.NO:12)實施例3.類似肽L-2、L-8、L-12和L-20的肝素結合能力的評估。這個測定法由類似于先前描述的那種的ELISA類型的竟爭系統組成。使生物素化的LALF3w,肽在IXPBS中吸附至聚苯乙烯平板(Costar，USA),并于4。C溫育過夜。將類似肽L-2、L-8、L-12和L-20以2/aM與在1XPBS+0.1%牛血清白蛋白(BSA)中的250個單位的肝素(肝素鈉，5，000U/ml，Liorad)相混合。之后，將混合物加入至包含與固體表面吸附的0.02nM生物素化的LALF32—51肽的ELISA平板中。在室溫下進行l小時溫育后，平板用洗滌溶液洗滌5次，并且通過于37。C與鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶綴合物(1:2，000稀釋度)溫育"分鐘來檢測與固體表面固定的生物素化的LALF3^肽。之后，平板用洗滌溶液洗滌5次，并且添加底物溶液。在另外溫育15分鐘后，反應用2M硫酸溶液來終止。缺乏類似肽與肝素的結合與光密度的減少相關，因為它們不能替代吸附至固體表面的生物素化的LALF32—51肽與肝素的結合。以100X摩爾過量的未標記的LALF3H,肽用作該測定法的對照。未標記的LALF^肽與肝素的結合由增加的光密度值得到證實，因為過量的冷的肽竟爭與肝素的結合。如圖2中所示，結果表明，在本發明中描述的肽L-2、L-8、L-12和L-M不能結合肝素。12實施例4.類似肽L-2、L-8、L-12和L-20對于人單核細胞中IFN-ct、IFN-y和IL-12的表達的影響。對于這個測定法，通過Ficol1-Hypaque梯度從供體的白細胞濃縮物或"血沉棕黃層(BuffyCoat)，，中分離出人單核細胞。在24孔平板中，將高達5xl()6個細胞種植在補充有10%胎牛血清的RPMI1640培養基中。進一步地以在0.1ml體積的RPMI培養基中40|ig/ml添加每種肽，并且將細胞在37。C和5%c02下培養18小時。總RNA通過使用TriReagent方法進行提取。之后，IFN-cx、IFN-y和IL-12基因的表達通過逆轉錄反應和PCR擴增(RT-PCR試劑盒，PerkinElmer)來測定。結果顯示為針對P-肌動蛋白持家基因的表達水平進行標準化的信使RM的相對量。在這個測定法中獲得的結果證實，在本發明中描述的肽L-2、L-8、L-12和L-20能夠誘導IFN-a、IFN-y和IL-12基因的表達，如圖3A中所示。類似肽L-2、L-8和L-12在誘導IFN-a基因表達方面比LALF32-w肽特別更加有效，如圖3B中所示。這個實施例證實，原始LALF3^序列中的氨基酸置換消除了結合LPS的能力，隨后增強所得到的肽的免疫調節效應。實施例5.類似肽L-2、L-8、L-12和L-20在TC-1腫瘤模型中的抗腫瘤效應。8-10周大的C57BL/6雌性小鼠用于這個測定法(n=10只動物/實驗組)。對于腫瘤移植，使用來源于惡性C57BL/6肺上皮細胞的TC-1腫瘤細胞，其重懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。將在200yl體積中50，000個細胞的量通過皮下途徑在右后肢中接種至小鼠。一旦腫瘤達到100mm3的體積，就通過皮下途徑在右脅腹中進行第一次肽施用，和第二次在10天后進行。在這個測定法中，評估4mg/kg體重的劑量(80jug/小鼠)。動物存活和腫瘤質量是為了測量目的肽的抗腫瘤效應而進行評估的參數，如圖4A和4B中所示。類似肽L-2、L-8、L-12和L-20分別對于抑制腫瘤進展和延長小鼠存活是有效的。這些結果證明了類似肽在小鼠中的實體瘤模型中的抗腫瘤效力。LogRank方法用作用于檢測組間的顯著差異的統計分析。結果證明，與LALF3^肽相比較，類似肽L-2、L-8、L-12和L-20顯著增加動物的存活('p〈0.05)。這些結果證實，在LALF蛋白質中的原始31-51序列中的氨基酸置換可以顯著增加肽的抗腫瘤能力。實施例6.類似肽L-2在黑素瘤模型中的抗腫瘤效應。8-10周大的C57BL/6雌性小鼠用于這個測定法(n=10只動物/實驗組)。對于腫瘤移植，使用MB16-F10腫瘤細胞，其重懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。將在200jLi1體積中15,000個細胞的量通過皮下途徑接種在右后肢中。4天后，施用L-2肽，第二次注射在第一次注射后7天進行，和在14天后進行第三次注射。在這個測定法中，評估4mg肽/kg動物體量的劑量。為了在這個測定法期間測量給定肽的抗腫瘤效應而進行評估的參數是腫瘤成活的時間和動物的存活。如圖5A中所示，L-2類似肽顯著延遲腫瘤移植('p〈0.05，LogRank方法)。經由LogRank方法進行的存活分析證實，L-2肽顯著增加動物的存活('p<0.05),比LALF^肽更有效，如圖5B中所示。這些結果證明了L-2肽的抗腫瘤效力，其不僅針對肺上皮癌細胞，還針對來自機體的其他組織學和解剖學部分的癌細胞，如黑素瘤。實施例7.在TC-1腫瘤模型中，在預防性治療方案中L-2類似肽的抗腫瘤效應。8-10周大的C57BL/6雌性小鼠用于這個測定法(n=10只動物/實驗組)。對于腫瘤移植，使用TC-1腫瘤細胞，其重懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。小鼠接受L-2肽的第一次注射(4mg肽/kg體重)。7天后，它們接受相同劑量的第二次注射；第一次肽注射14天后，用在200m1體積中的50，000個細胞通過皮下途徑在右后肢中對動物進行接種。為了測量肽的抗腫瘤效應而進行評估的參數包括腫瘤成活的時間(圖6A)和動物的存活(圖6B)。在這個測定法中獲得的結果證實，本發明的L-2肽對于防止腫瘤的發展是有效的并且還增加動物的存活。這些結果證明，本發明的肽顯示出防止腫瘤建立的預防效應。實施例8.L-2類似肽在雙重攻擊方案中的抗腫瘤效應。通過皮下途徑在左后肢中用在200|i1體積的PBS中的50，000個TC-1細胞第二次進一步攻擊在先前實施例的方案中沒有建立的腫瘤的動物(n=6)(第一次攻擊后第49天)。將相同量的腫瘤細胞接種至來自同一窩的"首次用于實驗的"小鼠(作為實驗的對照組)以保證年齡方面的同質性，并且維持在相同條件下但不接受肽(n-10只動物)。為了測量L-2肽的抗腫瘤效應而進行評估的參數包括腫瘤成活的時間和動物存活。在這個測定法中獲得的結果證實，L-2肽能夠保護小鼠免于受到用腫瘤細胞進行的第二次攻擊，其中延緩腫瘤的建立(圖7A)并增加動物存活(圖7B)。這個結果證明，本發明的肽能夠誘導持久的抗胂瘤應答，其針對用腫瘤細胞進行的第二次攻擊仍起作用，這證明了抗原特異性的適應性免疫應答的形成。實施例9.L-2類似肽在Lewis'癌的轉移^=莫型中的抗腫瘤效應。8-10周大的C57BL/6雌性小鼠用于這個測定法(n=8只動物/實驗組)。在后右足墊中用250，000個小鼠肺癌3LLD122細胞對這些動物進行接種。7天后，皮下注射劑量為4mg/kg體重的L-2類似肽。當腫瘤達到8mm的直徑時，通過外科手術從攜帶腿中除去原發性腫瘤。在這個手術操作后21天處死小鼠。對肺進行稱重以表明轉移至其上的量。圖8中所示的結果表明，本發明的L-2類似肽能夠減少轉移性腫實施例10.L-2類似肽對于肺瘤細胞生長的影響。對于這個測定法，在96孔培養平板(Costar)中，將TC-1細胞、H-125細胞(人非小細胞肺癌細胞)和L929細胞(鼠類成纖維細胞)以2xl(T細胞/mL種植在補充有胎牛血清(Gibco)的Dulbecco改良的Eagle培養基(DMEM)(Gibco)中。24小時后，將肽以9mM-300|iM的范圍加入至培養物中。在5%C02存在下將平板溫育72小時，并且在那之后，使用結晶紫進行揭示。平板用自來水進行充分洗滌，并且平板在562nm處進行讀取。結果顯示于圖9中。在體外具有顯著的抗增殖效應的促凋亡肽用作陽性對照(Perea，S.等人(2004)AntitumorEffectofaNovelProapoptoticPeptidethatImpairsthePhosphorylationbytheProteinKinase2Ca/jceriesearc力64:7127—7129)。獲^f的結果證實，L-2肽對于TC-l和H-125細胞產生劑量依賴性的抗增殖效應。然而，用本發明的肽在鼠類成纖維細胞L929細胞系中沒有檢測到效應。這個結果證實，本發明的肽在體外顯示出對腫瘤細胞的選擇性細月包毒'l"生效應。權利要求1.衍生自LALF蛋白質的32-51區域的具有免疫調節和抗腫瘤能力的肽，其缺乏LPS結合和肝素結合能力，并且包含下列氨基酸序列SEQ.ID.NO.1-4和8-12，以及這些肽的同源變體。2.模擬根據權利要求1的肽的化合物，其中所述化合物具有抗腫瘤作用并且缺乏LPS結合或肝素結合能力。3.藥物組合物，其包含一種或多種根據權利要求1和2的肽和化合物，以及藥學上可接受的賦形劑或栽體。4.根據權利要求3的藥物組合物，其中所述組合物另外還包含免疫原。5.根據權利要求4的藥物組合物，其中所述免疫原選自肽、神經節苷脂或蛋白質性質的免疫原，病毒樣顆粒，或細菌起源的蛋白質嚢泡。6.根據權利要求1和2的肽和化合物在制備用于治療和/或預防免疫學病癥和癌癥的藥物組合物中的用途。7.根據權利要求6的用途，其中使用有效量以刺激人類中的先天性免疫應答。8，根據權利要求6的用途，其特征在于應用其以抑制轉移。全文摘要本發明涉及開發衍生自其中引入了氨基酸置換的序列HYRIKPTFRRLKWKKYKGKFW的肽，所述肽不能與脂多糖結合并具有免疫調節和抗腫瘤作用。所述肽或其組合用于治療癌癥，以及與常規療法協同地用于治療癌癥。文檔編號A61K38/17GK101426813SQ200780013884公開日2009年5月6日申請日期2007年2月23日優先權日2006年2月24日發明者B·E·阿塞韋多卡斯特羅,G·E·吉倫涅托,H·E·加雷佩雷茲,I·D·C·托倫斯馬德拉索,M·格拉巴列斯皮,O·雷伊斯阿考斯塔,R·烏比塔戈麥斯申請人:遺傳工程與生物技術中心