用于家禽疫苗接種的干粉組合物和系統的制作方法

專利名稱：用于家禽疫苗接種的干粉組合物和系統的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于在家禽中誘導抵御禽類疾病的保護性應答的獸醫疫苗接 種干粉組合物，所述禽類疾病例如但不限于新城疫和禽流感。本發明還涉及 利用這些干粉組合物經吸入對禽類實施疫苗接種的系統。
背景技術：
熟知禽類傳染性疾病對家禽生產有不利的經濟影響，對直接或間接接觸受 感染鳥類的其它動物(特別是哺乳動物)和人的健康也可能有不利影響。
例如，具體禽類病原體，例如但不限于新城疫病毒(下文簡寫為NDV)、傳 染性支氣管炎病毒(IBV)、傳染性粘液囊病病毒(IBDV)、火雞鼻氣管炎病毒 (TRTV)、傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)、減蛋綜合征(egg drop syndrome) (EDS) 病毒、禽腦脊髓炎病毒、禽網狀內皮組織增生病病毒(reticuloendotheleisis virus)、禽痘病毒、禽腺病毒、傳染性鼻炎、禽傷寒、禽霍亂、禽流感、雞 敗血支原^[本(Af;;co/7/asma ga〃&e; "cww)、大腸桿菌Cfi^c/ze〃.c/n.a co/,)、沙門菌 屬(Sa/mo"e//a ^; )等可從受感染的家禽傳播開來。
更具體地說，新城疫是導致家禽工業大量經濟損失的地理分布廣泛的家禽 病毒感染。NDV是所述疾病的病原體，其代表了副粘病毒屬的原型病毒。禽 類副粘病毒有9種血清型，稱為APMV-1到APMV-9。新城疫的復雜之處在于 不同的NDV毒株誘導的疾病嚴重程度明顯不同。通過吸入或攝入可發生傳染， 然后該病毒的傳染性形式可從一只鳥類傳播至另一只。
禽流感或"鳥類流感"是甲型流感病毒導致的動物傳染病，該病毒通常只 感染鳥類和豬(不常見)。禽流感病毒傾向于具有物種特異性，但能跨越物種屏 障而感染哺乳動物和人類。甲型流感病毒具有16種H亞型。已知只有H5和 H7亞型的病毒能導致高病原形式的疾病。現已證實導致當前全球禽流感流行 的H5N1病毒尤其頑固，就人類健康而言該病毒是目前特別關注的。大量疫苗接種技術(mass vaccination techniques)通常釆用噴霧和氣溶膠
疫苗接種(分別含粗的和細小的液滴)來保護家禽免遭呼吸道病毒傳染。噴霧和 氣溶膠疫苗接種中，霧化方法和裝置對于家禽疫苗接種特別重要，因為要求特 殊，例如該裝置必須用外部能源操作。
按照生產商的說明書或定制程序，在鳥類一生中通常要多次接種疫苗以最 佳防止疾病爆發。通常對約2-3周齡以下的雞實施所謂的初次疫苗接種(致敏)。 該初次疫苗接種后一般進行一次或多次所謂的二級疫苗接種(加強)。
家禽疫苗接種約48小時后， 一些呼吸道病毒，特別是NDV會出現接種 反應。受影響的家禽(例如雞)可表現出呼吸道癥狀、食欲減退、抑郁、生長遲 滯和死亡率升高。繼發性大腸桿菌病(colibacilosis)(大腸桿菌感染)會使接種反 應更復雜。為防止該情況，疫苗接種后36小時給予鳥類抗生素治療，這往 往證明是有效的。然而，過度使用或錯誤使用抗生素可誘導細菌耐藥性， 這在多藥耐藥菌株加重接種反應時會妨礙充分的治療。
通常根據疾病情況而利用低毒力(低毒(lentogenic))或中等毒力(中強毒 (mesogenic))的活病毒來接種家禽以抵御新城疫。然而，中強毒ND疫苗病毒只 適合加強疫苗接種。但是低毒群的毒力也有很大差異。常規使用的活疫苗包括 低毒毒株，例如V4、 HitchnerBl、 F和La Sota，以及中產毒株，例如毒株 H、 Mukteswar、 Koinarov禾口 Roakin。
活NDV疫苗的主要優點是可通過廉價的大量應用技術，例如噴霧、氣溶 膠和飲用水應用而給予。然而，如上所述，活疫苗可導致嚴重的接種反應，特 別是在氣溶膠疫苗接種后的下呼吸道反應。為盡可能降低該缺陷，利用極其溫 和的病毒，特別是用作初次疫苗接種的物質至關重要。然而，即使是常規使用 的溫和活NDV毒株HitchnerBl和La Sota仍能導致中等呼吸道接種反應。 因此，本領域急需改善NDV疫苗接種以避免接種動物中的接種反應，但仍 能產生抵御疾病的有效免疫力。
氣溶膠顆粒要有效，已知應考慮以下參數而使吸入顆粒沉積在鳥類呼吸道 的特定區域，所述參數是例如但不限于鳥的種類、其年齡、吸入顆粒的大小和 對接種后反應(post-vaccination reactions)的易感性。
用于產生粗噴霧的目前市售霧化器產生的顆粒中大部分沉積在較深的氣道中，即圍繞最佳大小的粒徑分布太寬。雖然此效應對于加強疫苗接種是理想 的，但在較年幼的鳥中可導致有害接種反應。
新產生的空氣傳播液滴會蒸發至其原始大小的約10%。如果用目前可用的 噴霧技術產生，該現象會妨礙充分的疫苗接種結果，原因在于
-在初次疫苗接種期間， 一定百分比的疫苗顆粒會沉積在不應沉積的鳥類 較深的氣道中，因此解釋了觀察到呼吸道接種后反應的發生率高；
-由于粒徑分布寬且不受控，在次級疫苗接種中，只有少部分由液滴蒸發 得到的顆粒被吸入下呼吸道。
除了液滴大小不合適外，因生產、重建和霧化期間滅活所致的疫苗病毒損 失是已知噴霧和氣溶膠疫苗接種效率低的另一主要原因。首先，凍干保存一般
在液體環境，例如無特定病原體(SPF)雞蛋的尿囊腔中培養的疫苗病毒。雖然
干燥形式時病毒對環境滅活因子不敏感，雖然可在干燥前加入穩定賦形劑，但
在活疫苗的生產和保存期間病毒濃度仍有些許損失。霧化前，疫苗餅(vaccine cake)需要重建，病毒濃度會因重建所用水中存在痕量消毒劑以及病毒在液體環 境中的溫度敏感性而進一步降低。疫苗液滴在分散后蒸發時，這種滅活作用更 甚。噴霧和氣溶膠疫苗接種期間疫苗濃度的極大降低會危及對充分免疫應答的 誘導。此外，目前的液體懸浮液疫苗還極其缺乏穩定性。
Allan等(」v/a"尸W/zo/ogy (1980) 9:153-162)指導了利用含有溶解于水的 山梨醇的新城疫病毒溶液，以極高速度從最高旋振(top spinning)表面產生濕氣 溶膠顆粒，這些顆粒可以通過一系列柱子在接觸室之前干燥，從而產生粒徑1-4 pm的幾乎單分散氣溶膠用于接種雞。
WO 97/36578披露噴霧干燥的微粒，這些微粒中至少90%的體積中值 粒徑為1-10 pm，含有用于基因治療的試劑和賦形劑(如碳水化合物)的基本 均一混合物。可用大尺寸載體配制這些微粒，利用干粉吸入器給予得到的 制劑。WO 97/36578未記載疫苗接種、獸醫應用以及微粒大小多分散性。
WO 99/52550披露了用于摻入水不可溶性蛋白質抗原的聚合物顆粒疫 苗遞送系統，所述系統用生物可降解的丙交酯-乙交酯共聚物乳液產生，其 中按照體積大小分布，所得聚合物顆粒的平均直徑是0.05-20 nm。圖2顯 示了平均粒徑為10 pm的示范性顆粒的大小分散性。WO 99/52550未記載14頁
禽類病毒和霧化作用，也未指明疫苗遞送系統中存在糖。
美國專利號6,651,655披露利用不含任何推進劑氣體(即，呼吸驅動的) 的干粉吸入器在患者中產生免疫應答的方法。加載于所述干粉吸入器中的 疫苗制劑包含空氣動力學粒徑小于50 pm的干粉疫苗顆粒，

圖1顯示示范 性的研磨疫苗粉末的粒徑分布。 一旦產生了這種用于深肺沉積的小顆粒， 將該微粉化的物質與乳糖大顆粒(g卩，約100 pm或比研磨疫苗顆粒大約50 倍的顆粒)混合。美國專利號6,651,655的干粉吸入器因其構建原理而明顯 不適用于家禽疫苗接種。
WO 2005/123131披露了用于噴霧干燥抗體或疫苗的制劑，其包含 4%-10重量％的抗體或疫苗抗原，0.1 mM-50mM—種或多種氨基酸，0.5-4 重量％的糖和水。根據所用的高壓噴霧設備，液滴產生的干粉粒徑范圍是 0.5-100 nm。 WO 2005/123131未記載微粒大小多分散性，也未考慮除氨基 酸和糖組合以外的其它配方。
Meszaros等(^cto rwen'"ar/a i/w"gw7》(1992) 40:121-127)披露了利用能 提供小于IO pm的液滴的Masterdrop MD-2500設備，通過氣溶膠疫苗接種 來免疫1-10日齡的雞以抵御新城疫。該出版物添加了液滴穩定劑以防止液 滴蒸發成干顆粒，但未記載液滴的平均大小和多分散性。
本發明的目的是克服這些缺點。
發明概述
本發明通過提供獸醫疫苗接種，特別是家禽疫苗接種用的有效干燥固體粉 末組合物而能以簡單而廉價的方式克服目前家禽疫苗接種技術中的缺陷，所述 組合物既可用于初次接種，也可用于加強疫苗接種。
首先，本發明涉及獸醫疫苗接種用的粉末組合物，特別是通過吸入用于家 禽疫苗接種的干粉組合物，所述組合物包含有效量的獸醫疫苗，特別是家禽疫 苗，所述疫苗含有一種或多種微生物或其諸部分和一種或多種用于所述獸醫 (特別是家禽)疫苗的載體，其中所述粉末采取平均粒徑約2-30 pm和/或粒徑多 分散性為1.1-4.0的顆粒形式。所述載體設置優選包含還原性或非還原性糖和 生物相容聚合物的組合，并任選包含其它載體。其次，本發明涉及在家禽中實施疫苗接種的方法和系統，所述方法包括將干粉疫苗接種組合物在所述家禽上
方霧化，特別是其中所述干粉疫苗接種組合物采取平均粒徑約2-30 pm和/或粒 徑多分散性為1.1-4.0的顆粒形式。再次，本發明涉及采用便捷而廉價的方式， 同時利用配制干粉劑型的標準生產設備制備上述干粉家禽疫苗接種組合物的 方法和工藝。
在一方面，本發明提供家禽疫苗接種用的干粉組合物，所述組合物適合于 在家禽上方直接霧化而無需重建成疫苗溶液從而克服了任何重建步驟固有的 疫苗濃度損失并克服了液滴干燥不受控的明顯風險，而這些缺點與家禽工業中 先將疫苗組合物溶解再在家禽上方霧化的當前實踐相關。在本發明的該方面， 霧化干粉疫苗組合物而無需事先重建成疫苗溶液能簡單而有效地分布，并避免 了顆粒凝聚從而造成粒徑不適于吸入的明顯風險。
附圖簡述
圖1顯示了以各組分(左標尺)和累積組分(右標尺)的體積百分比計，本發 明的示范性獸醫疫苗接種用干粉組合物的粒徑分布(以微米為單位)。
圖2顯示了經激光衍射技術檢測，與現有技術的霧化液體疫苗的累積液滴 大小分布相比，本發明的霧化干粉疫苗的累積粒徑分布。
圖3顯示了與現有技術的霧化細微液體疫苗相比，本發明的霧化細干粉疫 苗的病毒濃度，以每mS空氣中的EID5o表示。
圖4顯示了用霧化干粉疫苗進行疫苗接種后第2和第4周獲取的平均血凝 抑制(HI)血清滴度。誤差線表示標準差。
發明詳述
本發明第一方面的最相關特征是
-獸醫疫苗接種用粉末組合物，優選經吸入的家禽疫苗接種用干粉組合物 中存在合適量，優選支持量的一種或多種用于獸醫疫苗的載體，所述一種或多 種載體優選含有還原性或非還原性糖和生物相容聚合物的組合，并任選包含其 它類型的載體；和/或
-疫苗接種粉末采取平均粒徑約2-30 pm的顆粒，優選基本上干燥的顆粒形式，和/或
-疫苗接種粉末具有相對狹窄的粒徑多分散性，例如約1.1-4.0。
除非另有表述，涉及干燥疫苗接種粉末的粒徑時，本文所用的術語"多分
散性"指比例(1(84%)/(1(50%)，即基于體積的粒徑分布累積曲線上對應于 84%的直徑除以基于體積的粒徑分布累積曲線上對應于50%的直徑。
雖然均符合本發明的目的，但可根據待接種家禽的類型(物種)和年齡，通 過組合上述重要參數的具體子范圍來適當選擇有用的疫苗接種組合物。就此而 言，家禽的類型(物種)不是本發明的關鍵參數，所述類型不只包括雞，還包括 家養的鳥類，例如火雞、鵝、野雞(feasant)、小鴨子等和寵物鳥類。例如， 平均粒徑約10-30拜，優選約15-25 pm，甚至更優選約20 pm的粉末組合物 對于1日齡到約3周齡的雞的首次免疫接種特別理想。在另一方面，平均粒徑 約3-9 pm，例如約3-6 nm，或約5 pm的粉末疫苗接種組合物適宜家禽的次級 (加強)疫苗接種。
盡可能低的粒徑多分散性是精確控制本發明的干粉疫苗接種組合物和系 統的重要參數，其是相應疫苗接種方法成功與否的決定性參數。利用本發明的 干粉組合物己能獲得合適的疫苗接種效率，其中粒徑多分散性低于3.0，優選 低于2.5，甚至更優選低于2.0。由于粒徑較低時難以控制多分散性，還由于疫 苗接種效率和多分散性控制成本之間應合理平衡，在許多情況中，考慮到生產
再現性和成本的矛盾以及疫苗接種效率，干粉疫苗接種組合物的粒徑多分散性 為至少1.3，或至少1.5，甚至至少1.7便足夠了。因此，本發明的干粉組合物 的粒徑多分散性的合適工作范圍是約1.3-約3.0，優選1.5-2.5。
干粉組合物中存在的一種或多種載體的比例不是本發明的限制性特征，該 比例通常不影響組合物的生產可行性。依據各種參數，技術人員可利用本領域 的標準知識選擇該比例，所述參數例如但不限于載體的技術功能和數量，它 們相互的相容性、獸醫(特別是家禽)疫苗物質的類型和濃度，即微生物(或其諸 部分)的類型，和(任選地)要達到的目標平均粒徑(例如，依據待接種家禽的類 型和年齡)。以所述干粉組合物的重量計，所述一種或多種載體所占比例可以 寬泛至0.1%-99.999%，例如0.1%-99.9%，如0.5%-99.5%，或1%-99%，或 2%-98%，例如90%-99.999重量％。因此，以所述干粉組合物的重量計，疫苗物質所占比例可以是0.001%-99.9重量％，例如0.001%-10%。
干粉組合物中所述一種或多種載體的類型和性質不是本發明的限制性特 征，只要它們參與疫苗的穩定性和以粉末形式直接霧化的便利性，依據各種參 數，技術人員可以利用本領域的標準知識作出選擇，所述參數例如但不限于 各載體要執行的技術功能，其與一種或多種其它載體(如果有多種載體的話)的 相容性和成本因素。所述一種或多種載體優選獸醫學可接受的級別，可以從下 組中適當選擇，但不限于此
-還原糖，例如但不限于葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、山梨糖、木 糖、核糖、乳糖、麥芽糖、纖維二糖等，
-非還原糖，例如但不限于海藻糖、蔗糖等，
-多元醇，例如但不限于甘露醇、山梨醇、麥芽糖醇、木糖醇、赤蘚醇、 肌醇等，
-生物相容的聚合物，例如但不限于聚乙烯吡咯垸酮、聚乙酸乙烯酯、 脂族聚酯、聚(丙交酯)、聚(乙交酯)、丙交酯-乙交酯共聚物、聚己酸內酯、 丙交酯-己內酯共聚物、聚丙烯酸、角叉聚糖、脫乙酰殼多糖、纖維素衍生 物、葡聚糖、化學改性的葡聚糖、菊粉、麥芽糖糊精、聚乙二醇、聚環氧 乙垸、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇、淀粉等，
-蛋白質，例如但不限于白蛋白、奶粉、血清、酪蛋白等，和
-脂質，例如但不限于DPPC、 DSPC等。
然而，與家禽疫苗接種領域已知的其它類型獸醫學可接受載體相比，出乎 意料地發現還原糖或非還原糖與生物相容聚合物的組合對于疫苗穩定性和以 粉末形式直接霧化有優秀的作用。因此，優選用這種組合構成本發明干粉組合 物中存在的載體的基本部分。在具體的情況中，宜用上文所述的其它類型載體， 例如但不限于多元醇、脂質、蛋白質等補充該特定的載體組合。
在本發明干粉組合物中，與還原糖相比載體優先采用非還原糖。利用它們 的混合物也可實現這種優先性，所述混合物中非還原糖的比例占優。
這些一種或多種優選的獸醫學可接受載體可以單獨使用，或優選以任何適 當的比例聯用，從而優化粉末特性。例如，合適的穩定性載體在干燥后易變成 無定形，和/或用作替代水的物質和/或通過包裹作用而保護(核心)物質，這些性能有利于保留干粉組合物中所含微生物(例如，病毒)的原始結構，并促進粉末 隨時間的穩定性。
可適當地選擇常規活疫苗、減毒疫苗和滅活疫苗以及重組、亞單位、肽和
DNA疫苗作為本發明獸醫疫苗接種(優選家禽疫苗接種)用粉末組合物的獸醫
疫苗接種活性物質。
可通過任何已知的常規方法獲得可適當摻入本發明獸醫疫苗接種用粉末 組合物，特別是用于經吸入的家禽疫苗接種用干粉組合物中的疫苗物質，例如
減毒病毒。簡言之，可用相關病毒接種易感物(susceptible substrate)并增殖直 至該病毒復制達到所需濃度，然后收集含病毒的物質。能維持病毒復制的任何 基料均適合用于實施本發明，包括原代(禽類)細胞培養物，例如雞胚成纖維細 胞(CEF)或雞腎細胞(CK)，或哺乳動物細胞系，例如VERO細胞系或幼倉鼠腎 (BHK)細胞系。優選在無特定病原體(SPF)雞胚中增殖病毒。
更具體地說，可用于繁殖相關病毒的合適基料是SPF含胚卵。每個含胚 卵可接種，例如0.2ml含NDV的尿囊液，所述尿囊液包含至少102胚感染劑 量50(本文縮寫為EID50)。優選用約10SEID5o接種9-12日齡的含胚卵，然后在 37"C培育2-4天，隨后優選通過收集尿囊液收集ND病毒產物。然后以2500 g 離心該液體約10分鐘，再經濾膜(IOO pm)過濾上清液。
本發明還涉及產生上述獸醫疫苗接種用粉末組合物，特別是經吸入的家禽 疫苗接種用干粉組合物的方法，所述方法包括凍干包含以下混合物的水性制 齊IJ:有效量的獸醫(優選家禽)疫苗接種活性物質和適當量(優選支持量)的用于 所述獸醫疫苗接種活性物質的一種或多種載體(優選還原糖或非還原糖和生 物相容聚合物的組合)的混合物；然后研磨所述凍干步驟的直接產物從而提供 干顆粒形式的所述粉末組合物，所述顆粒的平均粒徑約2-30 nm，粒徑多分散 性任選約1.1-4.0。后一參數的子范圍如上所述。
在還有另一方面，本發明涉及制備上述獸醫疫苗接種用干粉組合物，特別 是經吸入的家禽疫苗接種用干粉組合物的方法，所述方法包括噴霧干燥包含 以下混合物的液相有效量的獸醫疫苗和支持量的用于所述獸醫疫苗的一種
或多種載體(優選還原糖或非還原糖和生物相容聚合物的組合)的混合物；從而
提供干顆粒形式的所述粉末組合物，所述顆粒的平均粒徑約2-30 pm，粒徑多分散性任選約1.1-4.0。溫度，即下述約30-170°C，或甚至高達1卯'C的入口 溫度可影響本發明的制備方法(優選噴霧干燥)。技術人員知道，根據噴霧干燥 設備的類型和釆用的加料速度，噴霧干燥裝置的入口和出口處的噴霧干燥溫 度極為不同。噴霧干燥溫度不是本發明該方面的限制性特征，常規溫度范圍 是約40"C-約160°C。本發明該方面所用的噴霧干燥設備不是本發明的關鍵特 征，該設備可以是本領域任何類型的市售可得或標準的設備。
根據其平均粒徑和/或粒徑多分散性特征，本發明的獸醫疫苗接種干粉組 合物可為鳥類吸入，因此可有效用于家禽，例如任何類型的雞類家禽的預防
性或治療性免疫接種，合適的給藥途徑包括但不限于在所述家禽上方霧化 干粉疫苗接種組合物。
在另一方面，本發明提供用于家禽疫苗接種的干粉組合物，該組合物適合 納入在家禽上方直接霧化的系統而無需重建成研磨溶液，從而能避免疫苗濃 度損失和顆粒凝聚。本發明的該方面不限于本發明上述諸方面的干粉組合物， 還可用于家禽疫苗接種的任何干粉組合物，但對于避免疫苗濃度損失和顆粒 凝聚卻具有相同的有益作用。
本發明的另一方面涉及包含上述用于獸醫疫苗接種，優選家禽疫苗接種的 干粉組合物的疫苗接種系統，例如霧化設備。更具體地說，本發明涉及通過 吸入在家禽中實施疫苗接種的系統，該系統包括
-裝有干粉疫苗接種組合物的小室，所述組合物包含有效量的一種或多種 家禽疫苗和支持量的一種或多種用于所述家禽疫苗的載體，所述干粉組合物 采取平均粒徑為2-30 pm和粒徑多分散性為1.1-4.0的顆粒形式，和
-將所述干粉疫苗接種組合物在所述家禽上方霧化的裝置。
該設備優選包括將所述干粉組合物與氣體一起向家禽噴出的裝置。所述氣 體優選空氣。就優選實施本發明而言，無需利用被鳥類吸入后可能導致呼吸 道問題的特殊推進劑氣體。
本發明還有另一方面涉及在家禽中實施疫苗接種的方法，所述方法包括將 干粉組合物，例如所述組合物在家禽上方霧化。如果該疫苗接種步驟是在2-3 周齡以下家禽中的初次疫苗接種(初免)，所述干粉組合物優選采取平均粒徑為 約10-30 pm，更優選約15-25 ^m，或甚至更優選約20 pm的顆粒形式。如果該疫苗接種是在2-3周齡以上家禽中的次級疫苗接種(加強免疫)，所述干粉組 合物優選采取平均粒徑為約3-9 pm，更優選約5 pm的顆粒形式。
本文所用的"獸醫(特別是家禽)疫苗接種組合物"指含有至少一種蛋白質 或其片段的組合物，將有效量的該組合物給予動物，特別是鳥類后能引起保 護所述動物免患疾病的免疫應答。就在本發明疫苗接種組合物中的應用而言， 獸醫活性物質可適當地包含活的減毒微生物、滅活或重組微生物，例如但不 限于病毒、細菌、支原體或衣原體(chlamydophyla)。
特別適合的疫苗是，例如來自以下微生物的活的、減毒的或滅活的微生物 和重組、亞單位、肽和DNA疫苗
-病毒，例如但不限于，副粘病毒科(例如，新城疫病毒、肺炎病毒)、 正粘病毒科(例如，流感病毒)、冠狀病毒科(例如，傳染性支氣管炎病毒、 火雞冠狀病毒、火雞環曲病毒)、小RNA病毒科(例如，禽腦脊髓炎病毒、 鴨肝炎病毒、火雞肝炎病毒)、呼腸孤病毒科(例如，輪狀病毒)、雙RNA 病毒科(例如，傳染性粘液囊病病毒)、逆轉錄病毒科(例如，禽類白細胞 增生/肉瘤病毒)、星狀病毒科、細小病毒科(例如，鵝細小病毒)、腺病毒 科、皰疹病毒科(例如，禽傳染性喉氣管炎病毒、馬雷克病病毒)、痘病毒 科、肝DNA病毒科(例如，鴨肝炎病毒、火雞肝炎病毒)、環病毒科、乳 多空病毒科(例如，鵝出血性多瘤病毒(Goose Hemorrhagic Polyomavirus))、 杯狀病毒科、披膜病毒科、動脈炎病毒科、黃病毒科、布尼亞病毒科、彈 狀病毒科、纖絲病毒科、沙粒病毒科，
-細菌，例如但不限于，沙門菌屬、彎曲桿菌屬、大腸桿菌、巴斯德菌屬 (禽霍亂)、鴨瘟立默菌(&7wwe〃a fl"ah>ewy^)、鼻腔鳥桿菌 ((9m/,/ oZ>fl"en、m Wz/"o^ac/2ea/e)、 畐ij 又鳥嗜血菌 (i/ewo; /z〃^s paraga〃!'"anwj)、鳥博德特菌CBorc^e〃a aw'wm)(火雞鼻炎)、支原體(特別 是雞敗血支原體(#;;0 /7/"1^0^"http:///";3^"附))、梭狀芽孢桿菌屬、葡萄球菌、 鏈球菌、腸球菌、螺旋體、分枝桿菌和衣原體(Chlamydophila)(鸚鵡熱、 鳥疫)，
-真菌，例如但不限于，曲霉等，和
-寄生蟲，例如但不限于，線蟲、棘頭蟲、球蟲、隱孢子蟲和螺殼鞭毛蟲。以下新城疫病毒株可用于說明本發明特別有用的實施方式
-低毒疫苗，例如但不限于Hitchner-B!、 La Sota、 Clone 30、 V4、 NDW、 12和F，和
-中強毒疫苗，例如但不限于Roakin、 Lukteswar和Komarov 。
以下禽流感毒株可用于說明本發明另一種特別有用的實施方式H5N1亞 洲株。
按照本發明，家禽通過吸入本發明的干粉組合物而得到免疫。例如，雞與 具有所選平均粒徑和/或所選載體組合和/或任選具有所選粒徑多分散性的干 粉組合物粉塵接觸。免疫力的持續時間取決于所選的疫苗接種程序。影響疫 苗接種程序的最重要因素是幼雞中母體免疫力的水平，該水平在農場之間、 批次之間以及每只雞之間極為不同。鑒于該原因，可采用以下一種或多種方 案。通過應用粗噴霧，鳥類要么在大部分易感的2-4周齡作疫苗接種，要么 在1-日齡作疫苗接種。然后在3-4周后再次進行疫苗接種。
噴霧干燥能直接遞送平均粒徑合適和/或粒徑多分散性合適的可分散干粉 顆粒，而無需在噴霧干燥步驟后研磨它們。在此工藝中，液體病毒懸液通過 在熱的干燥氣體介質，例如但不限于空氣中霧化而快速轉化成平均粒徑合適 且平均分布合適的干燥顆粒形式。在幾秒中時間內即可形成氣-水界面區域， 水快速蒸發進而完成干燥。在干燥的早期階段期間，液滴表面維持100%的相 對濕度，表面溫度維持于顯著低于熱空氣溫度的濕球溫度。病毒自身不會接 觸高溫，因而造成得到的粉末制劑具有所需穩定性。當水蒸發時，含病毒的 固體顆粒周圍的空氣早已因攝取水分而冷卻。利用穩定不穩定物質常規使用 的載體還可避免病毒變性，所述載體例如優選還原糖或非還原糖和生物相容 聚合物，以及任選的多元醇、蛋白質或脂質的組合，或它們任何比例的混合 物，如上所述。
技術人員熟知除非提供專門和常規的昂貴生產和/或保存條件，否則不易 實現粉末組合物的完全干燥或者不易長時間維持。因此，本文所用的術語"干 燥"不指完全不含水分的嚴格條件。如果適當地執行所有標準工業注意事項 并采用市售可得的設備，上述噴霧干燥和凍干制備方法在生產時能可再現地 獲得含水量不超過約4重量％,優選不超過約3重量％，更優選不超過約2重量％的粉末組合物。對于將所述粉末組合物納入本發明疫苗接種系統和實施 本發明疫苗接種方法而言，粉末疫苗接種組合物中這種水平的殘留水分含量 完全可以接受。如果在實際使用前常規保存(即，在保存時避免過高的溫度和 /或過高的濕度)，這種干粉疫苗接種組合物的含水量不會隨時間顯著增加，特
別是在保存12周后不會超過約6重量％。
本發明的獸醫疫苗粉末組合物的給藥劑量一般是每只動物約103-108 EID5o，優選劑量范圍是約105-107 EID50。
以下實施例描述了本發明的具體實施方式
，但本發明不限于這些實施例而 受權利要求的限制。
實施例1-通過噴霧干燥制備干粉疫苗接種組合物
利用Mobile Minor噴霧干燥儀將含有4重量％海藻糖和1重量％聚乙烯 吡咯垸酮作為載體以及新城疫病毒(每克固體2.1012 E1D5。)的水溶液噴霧 千燥。在1巴的霧化氣壓下操作1 mm雙流噴嘴。入口溫度設置為160°C，進 料速度為26 ml/分鐘，從而獲得出口溫度為70°C。
評估所得粉末的以下參數
-采用卡爾費歇爾滴定(Karl Fischer titration)評估含水量和水吸收，
-釆用差分掃描量熱法評估熱動力學特性，和
-采用激光散射評估粒徑分布(參見圖1)，所用的設備是馬爾文公司的 Mastersizer S長臺型設備(Mastersizer S long bench version, Malvern)。制備 后所得粉末的即時含水量是3.1重量％， 22'C和42%相對濕度下，在用含 二氧化硅的塞子封閉的玻璃小瓶中保存一周后含水量增加至5.9重量％。 所得物質是玻璃化溫度為65'C的完全無定形物質。如圖1所示，所述干粉 的粒徑多分散性(如上文所述)是1.8，平均粒徑是6 pm。
干燥后立即將等份粉末接種在SPF雞蛋中，培育后采用血凝集檢驗測 定尿囊液中的病毒含量。這顯示每克噴霧干燥粉末可保留2.10"ElDso。
實施例2-比較評估細干粉疫苗和液體疫苗霧化后空氣中的病毒濃度 根據本發明，利用裝有1 mm雙流噴嘴的便攜式小型中試干燥儀(Mobile Minor pilot plant dryer)(入口溫度160°C ，出口溫度70°C ，進料速 度25 ml/分鐘，干燥氣體流速80 kg/小時，霧化氣壓2巴)從水溶液制備含 水量為3.8重量％，粒徑適于家禽次級疫苗接種(即，用于沉積在下氣道中) 的疫苗細干粉。進行噴霧干燥的進料溶液含有蒸餾水配制的3% (w/w)海藻 糖二水合物、1% (w/w)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、 1% (w/w)牛血清白蛋白 (BSA)，每ml進料溶液中加入107EID50 Clone 30疫苗病毒。
出于比較目的，用5 ml蒸餾水重建市售的Clone 30疫苗，將其中的 30 nl再稀釋至5 ml，以實驗性應用細微二級氣溶膠疫苗常用的沃茨爾中 試I型噴霧頭(Walther Pilot I spray-head)將其霧化。
通過激光衍射檢測本發明干粉疫苗的粒徑分布和霧化的比較液體疫苗 的液滴大小分布(噴嘴水平)。結果示于圖2，其中曲線(l)涉及本發明的海 藻糖-PVP-BSA細干粉疫苗，曲線(2)涉及比較性細微液體氣溶膠。本發明 干粉疫苗接種組合物的粒徑多分散性是2.0，其平均粒徑是7pm。比較性 液體氣溶膠的平均液滴大小是24 pm。
在1.3 mS分離室(28'C和40n/。RH)中霧化1 g粉末疫苗和5 ml稀釋的液 體疫苗，霧化后立即用明膠濾膜收集空氣樣品以評估空氣中的病毒濃度 (在10-提領的含胚卵中培育，然后進行血凝集試驗)。
結果示于圖3，其中術語"霧化的病毒劑量"表示如果沒有病毒因沉 積而從空氣中消失或因霧化過程而滅活時病毒的理論劑量，其中列(l)涉及 海藻糖-PVP-BSA細干粉疫苗，列(2)涉及霧化的比較性細微液體疫苗。這 些結果顯示霧化后粉末疫苗立即在空氣中獲得高病毒濃度，該濃度只比理 論霧化濃度略低(從1065降低至1061)。然而，霧化后細微液體疫苗的病毒 滴度因在上述氣候條件(climatic condition)下疫苗液滴蒸發而降低很多(從 1074降低至1034以下)。
實施例3-用平均粒徑為7 um的干粉疫苗接種組合物免疫雞 將實施例2制備和表征的疫苗接種細干粉給予4周齡無特定病原體的
雛雞(即無NCD抗體)，這些雛雞安置在體積為1.3 1113的分離室內。 一組接
受細干粉疫苗， 一組用作未接種疫苗的空白對照。接種疫苗兩周和四周后，采集血樣，通過血凝抑制(HI)試驗評估抗NCD 病毒的抗體。結果示于圖4，其中列(1)涉及海藻糖-PVP-BSA細粉末。接 種疫苗后2周時，本發明的干粉組合物導致充分的免疫應答，其HI滴度 高于通常單次應用低毒NCD疫苗所獲得的HI滴度24 - 26。通過重復檢測 ANOVA設計的統計學分析顯示接種疫苗后2-4周滴度明顯升高。
實施例4-用粗干粉疫苗接種組合物免疫雞
如實施例2所示，從相同的進料水溶液制備含水量為3.3重量％和粒徑 適合于初次疫苗接種(S卩，用于沉積在上氣道中)的疫苗接種粗干粉，但利 用裝有30 pm壓力驅動(piezo-actuated)噴嘴(入口溫度卯。C，出口溫度70 °C ，進料速度30 ml/分鐘，干燥氣體流速25 kg/小時，液滴產生頻率50 kHz) 的噴霧干燥儀。
采用與實施例2(激光衍射)相同的方法和設備評估粒徑分布，結果示于 圖2，其中曲線(3)涉及海藻糖-PVP-BSA粗干粉疫苗。粒徑多分散性是1.2， 平均粒徑是29 pm。
將疫苗給予4周齡無特定病原體的雛雞(即，無NCD抗體)，這些雛雞 安置在體積為1.3 1113的分離室內。 一組接受粗干粉疫苗， 一組用作未接種 疫苗的空白對照。
接種疫苗兩周和四周后，采集血樣，通過血凝抑制(HI)試驗評估抗NCD 病毒的抗體。結果示于圖4，其中列(3)涉及海藻糖-PVP-BSA粗粉末。接 種疫苗后2周時，本發明的干粉組合物導致充分的免疫應答，其HI滴度 落入通常單次應用低毒NCD疫苗所獲得的HI滴度范圍24 - 26。通過重復 檢測ANOVA設計的統計學分析顯示接種疫苗后2-4周滴度明顯升高。與 實施例3的海藻糖-PVP-BSA細粉末相比，明顯較低的免疫應答與疫苗的 沉積部位不同(即，粗粉末沉積在上氣道，而細粉末沉積在下氣道)有關。
權利要求
1. 一種通過吸入用于家禽疫苗接種的干粉組合物，所述組合物含有有效量的家禽疫苗物質和支持量的用于所述家禽疫苗物質的載體，所述載體包含還原糖或非還原糖和生物相容聚合物的組合，所述干粉組合物采取平均粒徑2-30μm和粒徑多分散性1.1-4.0的顆粒形式。
2. 如權利要求1所述用于家禽疫苗接種的干粉組合物，其特征在于，所 述疫苗物質選自病毒、細菌、真菌、寄生蟲或它們的諸部分。
3. 如權利要求2所述用于家禽疫苗接種的干粉組合物，其特征在于，所 述病毒選自副粘病毒科、新城疫病毒、肺炎病毒、正粘病毒科、流感病毒、 冠狀病毒科、傳染性支氣管炎病毒、火雞冠狀病毒、火雞環曲病毒、小RNA 病毒科、禽腦脊髓炎病毒、鴨肝炎病毒、火雞肝炎病毒、呼腸孤病毒科、 輪狀病毒、雙RNA病毒科、傳染性粘液囊病病毒、逆轉錄病毒科、禽類白 細胞增生/肉瘤病毒、星狀病毒科、細小病毒科、鵝細小病毒、腺病毒科、 皰疹病毒科、禽傳染性喉氣管炎病毒、馬雷克病病毒、痘病毒科、肝DNA 病毒科、鴨肝炎病毒、火雞肝炎病毒、環病毒科、乳多空病毒科、鵝出血 性多瘤病毒、杯狀病毒科、披膜病毒科、動脈炎病毒科、黃病毒科、布尼 亞病毒科、彈狀病毒科、纖絲病毒科、沙粒病毒科。
4. 如權利要求1-3中任一項所述用于家禽疫苗接種的干粉組合物，其特征 在于，以所述干粉組合物的重量計，所述載體所占比例是90%-99.999 %。
5. 如權利要求1-4中任一項所述用于家禽疫苗接種的干粉組合物，其特征 在于，所述干粉采取平均粒徑10-30 pm的顆粒形式。
6. 如權利要求1-4中任一項所述用于家禽疫苗接種的干粉組合物，其特征 在于，所述干粉組合物采取平均粒徑3-9)Lim的顆粒形式。
7. 如權利要求1-6中任一項所述用于家禽疫苗接種的干粉組合物，其特征 在于，所述還原糖選自葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、山梨糖、木糖、核 糖、乳糖、麥芽糖、纖維二糖或它們的混合物。
8. 如權利要求1-6中任一項所述用于家禽疫苗接種的干粉組合物，其特征 在于，所述非還原糖選自海藻糖、蔗糖或它們的混合物。
9. 如權利要求1-8中任一項所述用于家禽疫苗接種的干粉組合物，其特征 在于，所述生物相容聚合物選自聚乙烯吡咯垸酮、聚乙烯醇、葡聚糖、化 學改性的葡聚糖、脂族聚酯、聚丙烯酸、角叉聚糖、脫乙酰殼多糖、纖維素 衍生物、菊粉、麥芽糖糊精、聚葡萄糖、聚乙二醇、聚環氧乙烷、聚甲基 丙烯酸酯、淀粉或它們的混合物。
10. 如權利要求1-9中任一項所述用于家禽疫苗接種的干粉組合物，其特征在于，所述載體組合中所述生物相容聚合物與所述還原糖或非還原糖的重量比是1/1到1/8。
11. 如權利要求1-10中任一項所述用于家禽疫苗接種的干粉組合物，其特 征在于，所述載體還包含一種或多種蛋白質和/或多元醇。
12. 如權利要求1-11中任一項所述用于家禽疫苗接種的干粉組合物，其特 征在于，制備時所述干粉組合物的含水量不超過約4重量％。
13. —種制備干粉疫苗接種組合物的方法，所述方法包括噴霧干燥包含疫 苗物質、液體載體和支持量的固體載體的混合物的液相，從而提供平均粒徑為 2-30 pm的顆粒形式的所述干粉疫苗接種組合物，所述固體載體包含還原糖或 非還原糖和生物相容聚合物的組合。
14. 如權利要求13所述的方法，其特征在于，所述疫苗物質選自病毒、 細菌、真菌、寄生蟲或它們的諸部分。
15. 如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述病毒選自副粘病毒 科、新城疫病毒、肺炎病毒、正粘病毒科、流感病毒、冠狀病毒科、傳染 性支氣管炎病毒、火雞冠狀病毒、火雞環曲病毒、小RNA病毒科、禽腦脊 髓炎病毒、鴨肝炎病毒、火雞肝炎病毒、呼腸孤病毒科、輪狀病毒、雙RNA 病毒科、傳染性粘液囊病病毒、逆轉錄病毒科、禽類白細胞增生/肉瘤病毒、 星狀病毒科、細小病毒科、鵝細小病毒、腺病毒科、皰疹病毒科、禽傳染 性喉氣管炎病毒、馬雷克病病毒、痘病毒科、肝DNA病毒科、鴨肝炎病毒、 火雞肝炎病毒、環病毒科、乳多空病毒科、鵝出血性多瘤病毒、杯狀病毒 科、披膜病毒科、動脈炎病毒科、黃病毒科、布尼亞病毒科、彈狀病毒科、 纖絲病毒科、沙粒病毒科。
16. 如權利要求13-15中任一項所述的方法，其特征在于，噴霧干燥在入口溫度范圍是30。C-19(TC下進行。
17. 如權利要求13-16中任一項所述的方法，其特征在于，用適合于提 供粒徑多分散性為1.1-4.0的干粉組合物的噴霧干燥設備進行噴霧干燥。
18. —種通過吸入在家禽中實施疫苗接種的系統，該系統包括 -裝有干粉疫苗接種組合物的小室，所述組合物包含有效量的家禽疫苗和支持量的一種或多種用于所述家禽疫苗的載體，所述家禽疫苗含有疫苗物質， 所述干粉組合物采取平均粒徑為2-30 pm和粒徑多分散性為1.1-4.0的顆粒形 式，和-將所述干粉疫苗接種組合物在所述家禽上方霧化的裝置。
19. 如權利要求18所述用于在家禽中進行疫苗接種的系統，其特征在于， 所述疫苗物質選自病毒、細菌、真菌、寄生蟲或它們的諸部分。
20. 如權利要求19所述在家禽中實施疫苗接種的系統，其特征在于，所 述病毒選自副粘病毒科、新城疫病毒、肺炎病毒、正粘病毒科、流感病毒、 冠狀病毒科、傳染性支氣管炎病毒、火雞冠狀病毒、火雞環曲病毒、小RNA 病毒科、禽腦脊髓炎病毒、鴨肝炎病毒、火雞肝炎病毒、呼腸孤病毒科、 輪狀病毒、雙RNA病毒科、傳染性粘液囊病病毒、逆轉錄病毒科、禽類白 細胞增生/肉瘤病毒、星狀病毒科、細小病毒科、鵝細小病毒、腺病毒科、 皰疹病毒科、禽傳染性喉氣管炎病毒、馬雷克病病毒、痘病毒科、肝DNA病毒科、鴨肝炎病毒、火雞肝炎病毒、環病毒科、乳多空病毒科、鵝出血 性多瘤病毒、杯狀病毒科、披膜病毒科、動脈炎病毒科、黃病毒科、布尼 亞病毒科、彈狀病毒科、纖絲病毒科、沙粒病毒科。
21. 如權利要求18-20中任一項所述在家禽中進行疫苗接種的系統，其特 征在于，所述干粉組合物的含水量不超過約4重量％。
22. 如權利要求18-21中任一項所述在家禽中進行疫苗接種的系統，其特 征在于，所述一種或多種載體選自還原糖、非還原糖、生物相容聚合物、蛋 白質或多元醇。
23. 如權利要求18-22中任一項所述在家禽中進行疫苗接種的系統，其特征 在于，所述一種或多種載體包含還原糖或非還原糖和生物相容聚合物的組合。
24. 如權利要求23所述在家禽中進行疫苗接種的系統，其特征在于，所述組合中所述生物相容聚合物與所述還原糖或非還原糖的重量比是1/1到1/8。
25.如權利要求18-24中任一項所述在家禽中進行疫苗接種的系統，其特 征在于，以所述干粉組合物的重量計，所述一種或多種載體所占比例是 90%-99.999%。
全文摘要
本發明提供通過吸入進行家禽疫苗接種的干粉組合物，所述組合物包含有效量的家禽疫苗物質和支持量的用于所述家禽疫苗物質的載體，所述載體包含還原糖或非還原糖和生物相容聚合物的組合，所述干粉組合物采取平均粒徑為2-30μm和粒徑多分散性為1.1-4.0的顆粒形式。本發明還涉及制備所述干粉組合物的方法和通過吸入進行家禽疫苗接種的系統。
文檔編號A61K39/39GK101415437SQ200780008970
公開日2009年4月22日 申請日期2007年3月15日 優先權日2006年3月15日
發明者C·弗瓦特, E·科巴涅, J·P·萊蒙 申請人:根特大學