專利名稱:尋常魚鱗病、特異反應性和其他病癥的預防/治療的制作方法
尋常魚鱗病、特異反應性和其他病癥的預防/治療發明領域本發明涉及尋常魚鱗病(IV)、特異反應性和潛在地其他與聚絲蛋白基 因序列中功能失去突變相關的病癥的預防/治療。該預防/治療基于試劑的 使用,所述試劑能使宿主的翻譯系統連讀聚絲蛋白基因的突變等位基因中 存在的無義突變。發明背景尋常魚鱗病(IV; OMIM# 146700)是人類最普遍的角質化遺傳病癥和最 常見的單基因病癥之一。最廣泛提及的發生率數字是1/250,該數字基于 對6051名健康的英國學童的調查'。IV與特異反應性體質的關系得到了 充分確定;37-50。/。患有IV的人具有特異反應性體質,具體地特異反應性 皮炎(濕疹)''15,且相反之,大約8%特異反應性皮炎患者具有典型的IV 特征L 16。IV的表型特征包括掌超線性,毛發角化病和最明顯見于下腹部、手臂 和腿部的細小鱗屑2。聚絲蛋白(絲聚集蛋白)在角質層形成中十分重要 "。濾泡內表皮顆粒層中的透明角蛋白顆粒主要由400 kDa蛋白聚絲蛋白 原(profilaggrin)組成。在獨特的短N末端結構域之后,大部分聚絲蛋白原 分子由324個氨基酸聚絲蛋白序列的10-12個重復序列組成6。隨著顆粒 細胞的末端分化,聚絲蛋白原通過蛋白水解裂解為 37kDa聚絲蛋白肽和 含有S100樣轉結合結構域的N末端結構域。聚絲蛋白迅速聚集為角蛋白 細胞骨架,從而顆粒細胞瓦解為扁平的無核鱗片。該濃縮的細胞骨架在角 質化細胞包膜(CCE)形成過程中通過轉谷氨酰胺酶而交聯。CCE是皮膚最 外面的屏障層,其不僅防止水分流失,而且還阻止過敏原和傳染性病原體 的進入7。因此,聚絲蛋白是促進表皮分化和維持屏障功能的關鍵蛋白質。免疫印跡研究顯示聚絲蛋白在IV患者的皮膚和/或角質形成細胞中缺 乏或明顯減少8—,另外,在一些患有IV的個體中證明了減少的聚絲蛋白 mRNA11。隱性小鼠突變體,絮片狀尾部具有人類IV的組織學和超 結構標記12,并且獲得了與鼠科聚絲蛋白基因座(F丄C^的強烈遺傳連鎖17' 18。盡管生化分析顯示了力,純合體中的缺陷性聚絲蛋白原操作,但是迄 今尚未鑒定在F丄G基因中的任何基因組突變。本發明人揭示了編碼聚絲蛋白的基因中的某些功能失去突變,而且隨 繼的聚絲蛋白減少/損失與IV和其他病癥如特異反應性皮炎(濕疹)、哮喘、 銀屑病和/或變態反應的發展相關。該工作是多篇處于印刷中的論文(Smith F. J. D.等,2006; Palmer C. N, A.等,2006)和共同未決的專利申請GB0525492.5的主題。除通過基因治療應用的潛在治療外,如果利用為克 服至少一些鑒定的聚絲蛋白突變而設計的小分子藥物能治療IV,則將是理想的。因此,本發明的目的包括提供用于預防和/或治療IV和其他相關病癥 的手段。發明概述本發明部分基于本發明人關于某些試劑容許連讀聚絲蛋白基因中功 能失去突變的能力的工作。本發明的第一個方面提供能夠連讀聚絲蛋白基因中功能失去突變的 試劑用于制備用于治療IV和/或相關疾病藥物的用途。在另一方面,提供了治療IV和/或其他相關疾病的方法,該方法包括 向受試者施用能夠連讀聚絲蛋白基因中功能失去突變的試劑。應該意識到本發明能夠治療IV和/或治療易發展IV的動物受試者,尤 其是人類受試者。另外,由于嚴重或輕微形式的IV和其他疾病的聯系, 該治療可以用于可能易患有或患有特異反應性皮炎(濕疹)、哮喘、銀屑 病或變態反應,如接觸型變態反應和食物變態反應(例如,花生變態反應) 的受試者。關于皮膚病癥,低水平的聚絲蛋白表達能夠導致輕微和/或亞臨 床疾病的發展。這樣,本發明還可以涉及預防和/或治療所述輕微和/或亞 臨床形式疾病。的確,許多皮膚病癥是未確診的,且這樣的治療被更多地 認為是美容治療。因此,本發明還延伸到任何這樣的美容治療中。
能夠被克服的功能失去突變通常是無義突變。這樣的突變典型地是單堿基修飾,所述單堿基修飾導致過早終止密碼子的產生(即,TGA, TAG 或TAA)。盡管本發明人已經在聚絲蛋白基因中鑒定了大量導致功能失去 的突變,但是一種突變特別導致符合讀框地生成過早終止密碼子。該突變 是在F丄G基因的位置1501處的1個堿基取代。該突變是1501OT (從起 始ATG開始編號),其導致胞苷被胸苷取代,且相應的在位置501處精氨 酸變為終止密碼子(R501X)的氨基酸改變。由于該突變發生在第一個聚 絲蛋白重復序列中并且導致終止密碼子的產生,所以不產生聚絲蛋白肽的 功能拷貝。盡管,本發明人已經鑒定了聚絲蛋白基因中的其他突變,但是 該突變是迄今為止在歐洲高加索人群中最為常見的,且本發明優選的方面 是克服該突變。受試者可以是任何需要預防性或治療性處理的受試者,且適宜地,可 以是新生兒或甚至胎兒。然而,受試者可以處于生命的任何階段,且因此 包括新生兒、兒童和成年人。存在大量已知的能夠誘導連讀無義突變的試劑。 一類試劑是某些氨基 糖苷類抗生素,包括慶大霉素、巴龍霉素、新霉素和妥布霉素(BidouL.等, 基因治療(Gene Therapy) 11: 619-627, 2004; Howard MT.,等神經學年 刊(AnnNe醫l) ,55:422-426,2004)。另一類包括負霉素的試劑記述在US2005/0014835中,將其引入作為 參考。最終的突變tRNA能夠作為無義突變阻抑制子生成。這些從突變的 tRNA基因中生成,所述突變的tRNA基因導致生成這樣的tRNA,所述 tRNA具有改變的反密碼子因而它們具有連讀由無義突變產生的密碼子的 能力。這記述在例如Panchal RG等,人類基因治療(Human Gene Therapy), 10:2209-2219 (1999)中。除上述經鑒定的試劑外,可能存在其他合適的突變阻抑制子,且本發 明還提供了鑒定阻抑制子的方法。因此,在另一個方面,提供了測試試劑連讀無義突變能力的方法,該方面包括下列步驟a) 提供突變聚絲蛋白基因/報道基因構建體;b) 使測試試劑和所述構建體相接觸;和C)檢查該測試試劑是否能夠影響突變聚絲蛋白基因的連讀和報道基 因的表達。任何合適的己鑒定的試劑能夠用于治療iv和/或本文所提及的其他相 關疾病,或實際上任何由無義突變引起的疾病/遺傳病癥。應該意識到所述構建體應該受到適當的轉錄控制元件如啟動子和終 止子序列的控制。而且,該構建體中存在包含內部無義序列的聚絲蛋白核 酸序列。無需使用完整的聚絲蛋白核酸序列,僅需要一部分。適宜地,聚絲蛋白核酸序列可以是10-1000bp的長度,更優選地15-200bp的長度。典型的突變聚絲蛋白基因/報道基因構建體包括符合讀框地與3'報道 基因序列相連接的5,突變聚絲蛋白核酸序列。照這樣,為了實現任何的報 道基因序列表達,必須連讀位于5'聚絲蛋白序列中的無義/終止密碼子。優選的構建體還包括另外的聚絲蛋白序列5'的陽性對照報道基因。如 應該意識到地,全部序列符合讀框地彼此連接。對于這樣的構建體,提供 了5'陽性對照報道基因,因此使用者可以確保該構建體適當地發揮功能。 如果沒有發生聚絲蛋白基因連讀,則只有該陽性報道基因提供可檢測到的 信號。然而,如果發生聚絲蛋白序列的連讀,該陽性對照報道基因和聚絲 蛋白序列的3'報道基因兩者均提供可檢測到的信號。備選地,該陽性報道 基因可以在單獨啟動子的控制下存在于構建體中,或該陽性報道基因可以 由單獨的共轉染質粒所編碼。對于報道基因或陽性對照報道基因的使用而言合適的報道基因是技 術人員所熟知的,且包括例如螢光素酶基因,P半乳糖苷酶基因,熒光基 因諸如綠色熒光蛋白等,氯霉素乙酰轉移酶,|3-葡糖醛酸糖苷酶等。此外, 從不同生物體物種能夠獲得特定基因的不同形式。特別優選的構建體包括作為陽性對照報道基因的海腎螢光素酶基因, 突變聚絲蛋白核酸序列和作為報道基因的螢火蟲螢光素酶基因,其受到利 用例如HSV-TK啟動子和SV40-多聚A終止子信號的適當地轉錄控制,如 示意性顯示于圖l中。然而,可以設想許多其他適合的構建體,且報道基 因可以是當其表達時,僅容許細胞在特定生長培養基中存活的報道基因。通過本領域技術人員熟知的技術可以進行任何具體的報道基因表達
第一輪篩選后,合適地,可以通過測試從患有與無義突變相關疾病的 患者獲得的細胞或細胞系上的試劑,而測試任何可能有用的試劑,從而確 定/確證該試劑能夠導致連讀突變。
應該意識到該方法可以在本領域中已知的基于細胞的或無細胞的系 統中進行。
現在進一步通過實施例并參考附圖描述本發明,它們顯示
圖1顯示用于檢驗聚絲蛋白無義突變連讀試劑的構建體。A:通過2bp
的缺失從pRL-TK中的/ -/wc突變的TAA終止密碼子,和與F丄G和Z-i:wc 符合讀框地插入的J^al位點;B:克隆到pSP-luc+NF的iVcoI位點中的 凡G寡核苷酸盒;C:從突變的ATG密碼子用于減少"滲漏的"(leaky) 表達。
圖2顯示用于克隆進入pSP-luc+的FLG寡核苷酸盒;
圖3顯示TR3構建體來自染色體6p22.1的人Arg (CGA) tRNA基
因;
圖4顯示TR4B構建體來自染色體15q26.1的人tRNA-Arg(TCG)基
因;
圖5顯示預測的TR3和TR4B阻抑制子tRNA的二級結構,其顯示了 突變的反密碼子環。用粗體顯示反密碼子環,且標記了容許該環與TGA 密碼子配對的G〉A突變。所示堿基是由DNA所預測的,而不說明轉錄后 修飾;
圖6顯示聚絲蛋白R501X突變的連續(a)用pRLF-FLG-WT或pRLF-FLG-501X報道基因質粒瞬時轉染表皮細胞系293的連讀。轉染后48小時, 按照制造商的方案溶解細胞并利用Promega雙螢光素酶測定系統測定螢 光素酶。
未轉染的細胞不提供海腎或螢火蟲信號。含有野生型聚絲蛋白序列的 陽性對照構建體pRLF-FLG-WT提供陽性海腎和螢火蟲信號。相反地, pRL-FLG-501X構建體提供同等的海腎信號但在缺乏任何連讀試劑的情況 下,不提供可檢測到的螢火蟲信號。這證明pRLF-FLG-501X構建體不是 "滲漏的",且因此適合于檢驗或連讀試劑。
(b)用含有人聚絲蛋白基因片段的pRLF-FLG-501X共報道基因瞬時
轉染293細胞系,所述人聚絲蛋白基因片段攜帶符合讀框地克隆在海腎和
螢火蟲螢光素酶之間的R501X突變。
以針對海腎螢光素酶活性進行了標準化的螢火蟲螢光素酶活性測量 連讀活性。進行了四次重復閱讀并進行平均。阻抑制子tRNAs TR3和 TR4BsupTGA容許聚絲蛋白R501X無義突變的連讀。慶大霉素以劑量依 賴的形式,容許聚絲蛋白R501X突變的連讀。
圖7顯示慶大霉素在來自尋常魚鱗病個體(FLG R501X純合體)的角 質形成細胞中誘導聚絲蛋白的重新表達。
原代角質形成細胞在無血清KGM中生長,并通過從低(0.09mM)向高 鈣培養基(1.89mM)中的轉移誘導其分層(分化)。利用甲醇/丙酮固定培養 物,并通過間接免疫熒光利用了針對人聚絲蛋白重復序列的Novocastm單 克隆抗體15C10對培養物迸行染色。利用1 mg/ml DAPI (4,6-聯脒-2-苯基 吲哚)復染細胞核;(a)正常對照角質形成細胞在分化后表達聚絲蛋白,(b) R501X純合體角質形成細胞在分化后不表達聚絲蛋白,(c)R501X純合體 角質形成細胞在600 ^g/ml慶大霉素的存在下(用藥物培養96小時),在 分化后表達聚絲蛋白;和
圖8顯示慶大霉素處理后來自R501X患者的聚絲蛋白表達。在器官培 養中,用600 ^g/ml慶大霉素培養來自患有明顯尋常魚鱗病的R501X純合 體患者的皮膚活組織切片物質96小時,恢復聚絲蛋白表達(箭頭)。培養 后,活組織切片用福爾馬林固定,石蠟包埋,并利用Novocastm抗人聚絲 蛋白重復單克隆抗體15C10,以免疫過氧化物酶檢測對其進行免疫組化處
理;A:未處理的活組織切片;B慶大霉素處理
方法和結果
實施例l:用于檢驗連讀試劑的共報道基因構建體
將對應于人聚絲蛋白基因堿基數1480- 1523的寡核苷酸盒,(F丄G; 從ATG起始密碼子開始編號編碼序列;Genbank登記號NM—002016.1 ), 克隆到唯一的Wco I限制性位點中,該位點在質粒載體pSP-luc+NF (Promega)中跨越螢火蟲螢光素酶基因(/:z^c)的ATG密碼子。圖2中顯示 的寡核苷酸盒具有增加的突出端,其對應于iVco I的黏性末端。這些盒對
應于含有密碼子501的人F丄G基因區域,即普通的R501X突變位點。形 成了野生型和R501X突變形式。通過DNA測序,鑒定并核實了具有處于 正確方向的插入物的克隆。插入F丄G盒后,通過利用下列引物的位點定 向誘變將ATG密碼子,即/-丄1^基因最初的起始密碼子,突變為AGG精 氨酸密碼子,所述引物是FLmutl 5'AGG CAT TCA GCC AGG GTC ACC GAC GCC 3'禾卩FLmut2 5' GGC GTC GGT GAC CCT GGC TGA ATG CCT 3' (Stratagene快變系統(Stratagene QuikChange system))。這是為了防止 最初起始密碼子的可能使用,其可能甚至在含有TGA或其他終止密碼子 的F丄G盒的存在下,導致螢火蟲螢光素酶的"滲漏"表達。通過DNA測 序證實克隆。將這些克隆命名為pSP-R501和pSP-X501,其分別對應于野 生型和突變形式。
通過缺失2bp (TA)突變質粒載體pRL-TK(Promega)中的海腎螢光素 酶基因(iMw)的TAA終止密碼子。這是利用下列引物的位點定向誘變 完成的,所述引物是pRL.M15'TCAAAAATGAACAAATTCTAGAGC GGC C 3'禾卩pRL.M2 5' GGC CGC TCT AGA ATT TGT TCA TTT TTG A 3' (Stratagene快變系統(Stratagene QuikChange system))。對突變的克隆(命 名為pRL-Ml)進行了完全測序。
為了制備完整的共報道基因構建體,從pSP-R501和pSP-X501中切下 含有完整FLG-/-£wc融合基因的Mze I - ^Z)a I片段。將這些克隆到pRL-Ml
的唯一Z&al位點中,這是可能的,其原因在于iW7el和^)fll具有相容的
黏性末端。通過DNA測序,選擇具有正確方向的野生型和R501X突變克 隆。將野生型和R501X突變共報道基因構建體分別命名為pRLF-FLG-WT 和pRLF-FLG-501X (圖1)。
實施例2:產生人阻抑制子tRNA基因以用于TGA無義突變
人類基因組包括大量CGA-精氨酸t-RNA基因。這些是非常緊密的基 因,且含有RNA聚合酶III的基因內啟動子(LewinB.,在基因VII(Genes VII),牛津大學出版社(Oxford University Press) ,2000,第624-626頁)。 在目前人類基因組的集合(HG17; http:〃genome.ucsc.edu)中鑒定出這些基 因中的兩種,為方便將其命名為TR3和TR4B,并由正常人對照DNA對 它們進行擴增。TR3位于染色體6p22.1上,且TR4B位于染色體15q26.1 上。具體地,利用引物TR3.F 5' CGA TGC AGA CAA TAT GCA GA 3'和 TR3.R 5' CTA AGC CTA CAA AAC CGA AA 3',將TR3基因作為668bp的 片段進行擴增,其對應于人類基因組HG17集合中堿基編號 chr6:26,407,555-26,408,284。利用引物TR4B.F 5' GAC TTC TGG GTG GGC TCT CC 3'和TR4B.R 5' CCC TCC CTC TCC ACT TTC CT 3',將TR4B基 因作為465bp的片段進行擴增。該片段對應于人類基因組HG17集合中堿 基編號chrl5:87,679,164- 87,679,628。利用高保真PCR系統(羅氏(Roche)) 和下列條件((94°C 2分鐘)xl; (94°C 30秒,X°C 30秒,72°C 60秒) x35; (72°C 5分鐘)xl)進行了PCR。對于TR3,退火溫度X:55"C;對 于TR4B, X=58°C。將這些片段克隆到pCR2.1載體(InVitrogen)中,并 對一些克隆進行測序從而獲得不含PCR的克隆人為產物的每種構建體的 克隆。圖3和4中顯示了標有注釋的完整構建體序列。圖5中顯示了對由 此生成的tRNA分子所預測的二級結構。對這些tRNA基因的反密碼子環 進行了突變,從而使這些識別TGA終止密碼子而非CGA精氨酸密碼子, 即從5'TCG3'到5'TCA3'突變基因中的反密碼子環。在TR3基因中,這 對應于突變G351A,'從引物TR3.F的第一個堿基開始任意編號(見上)。 在TR4B中,該突變對應于G180A,從引物TR4B.F的第一個堿基開始編 號(見上)。
實施例3: F丄G連讀的雙螢光素酶測定
通過利用Fugene-6系統(羅氏(Roche)),在96孔板中將共報道基因 構建體pRLF-FLG-WT和pRLF-FLG-501X瞬時轉染到293細胞(轉化的 人腎上皮細胞系)中,而對它們進行測試。轉染后48小時,對細胞使用 雙螢光素酶測定系統(Promega),所述系統檢測特異性螢光素酶信號,其對 應于海腎和螢火蟲螢光素酶報道基因。對野生型共報道基因, pRLF-FLG-WT,獲得了海腎和螢火蟲螢光素酶的強信號,如圖6a所示。 相反地,對pRLF-FLG-501X構建體,僅獲得了海腎信號,顯示出存在于 該構建體中F丄G盒內的R501X過早終止密碼子突變導致螢火蟲螢光素酶 表達的完全喪失(圖6a)。
實施例4: FLG無義突變的連讀測定
利用具有濃度范圍0-2000嗎/ml慶大霉素的pRLF-FLG-501X,如上所 述在96孔板中進行了 293細胞的瞬時轉染。利用pRLF-FLG-WT平行地 進行了陽性對照轉染。如上所述,利用雙螢光素酶測定系統(Promega)測量 聚絲蛋白無義突變連讀活性。圖6b顯示慶大霉素以劑量依賴的方式,容 許R501X過早終止密碼子突變的連讀,該試驗中最大連讀發生在濃度為 2000嗎/ml時。作為使用氨基糖苷進行R501X突變的連讀的備選,測試了 人阻抑制子轉移RNA (tRNA)種類TR3supTGA和TR4BsupTGA (見實 施例2)。利用Fugene-6瞬時轉染系統(羅氏(Roche)),將這些共轉染到如 上所述具有pRLF-FLG-501X報道基因質粒的293細胞中。這顯示出所測 試的兩種阻抑制子tRNA種類均提供強連讀信號(圖6b)。
實施例5:角質形成細胞培養物中聚絲蛋白表達的再活化
建立了來自患有嚴重IV個體的原代角質形成細胞培養物,已經顯示 出所述個體是對聚絲蛋白R501X突變的純合體,正如Smith FJD等,自然 遺傳學(Nature Genetics ) 2006,印刷中所述。正常原代角質形成細胞不 表達聚絲蛋白到可測量的水平,其原因在于后者是晚分化特異性蛋白。然 而,通過將培養物轉移到高鈣培養基中,可以誘導這些細胞表達聚絲蛋白, 這導致角質形成細胞的層化和分化,從而引起聚絲蛋白的表達(Smith FJD 等,2006,印刷中)。正常對照角質形成細胞的分化引起聚絲蛋白原在充分 層化的細胞集落中表達(圖7)。利用間接免疫熒光,使用了針對人聚絲蛋 白重復肽中表位的單克隆抗體15C10 (Novocastra)對蛋白質進行染色。相 反,來自R501X純合體患者的充分層化的培養物未能表達聚絲蛋白原(圖 7,也見SmithFJD等,2006中,印刷中)。然而,當用600嗎/ml慶大霉素 處理來自R501X純合體患者的分化的培養物時,發現充分層化的細胞集 落在96小時,以與正常對照相當的水平表達聚絲蛋白原(圖7)。而且, 聚絲蛋白原以細胞質顆粒的形式存在,與對照角質形成細胞中觀察到的那 些相當。因此,慶大霉素能夠在培養的細胞中促進R501X聚絲蛋白突變 的連讀。 實施例6:器官培養中表皮聚絲蛋白表達的再活化在添加或減去600pg/ml慶大霉素的Dulbecco改良Eagle培養基中, 在培養物中培養3mm立方體的皮膚活組織切片材料4天,該材料來自患 有明顯IV的聚絲蛋白R501X/R501X純合體患者。培養后,固定并包埋該 活組織切片材料以進行組織學和免疫組化。當用針對人聚絲蛋白重復肽中 表位的單克隆抗體15C10 (Novacastra)染色時,未處理的活組織切片完全是 陰性的(圖8),這與對聚絲蛋白無效突變純合性相一致(Smith FJD等,自 然遺傳學(Nature Genetics)論文,2006,印刷中)。相反,用慶大霉素培養 過的活組織切片材料顯示出顆粒細胞層的強烈染色(圖8)。由于純合或混 合雜合聚絲蛋白無效突變,所以缺乏可通過組織學鑒定的透明角質顆粒是 嚴重IV的標記(SmithFJD等,自然遺傳學(Nature Genetics)論文,2006, 印刷中)。顯著地,用慶大霉素處理于此觀察到的聚絲蛋白染色的恢復引起 透明角質顆粒的重新出現(圖8)。此外,在顆粒層中較高的一些細胞中, 其中聚絲蛋白染色特別強烈,觀察到其細胞形態變得更加扁平(圖8)。因 此,恢復的蛋白質表達表現出促進正確的表皮終止分化,這與聚絲蛋白蛋 白功能的完全恢復相一致。參考文獻1. Wells,R.S.和KerrCB,英國醫學雜志(BrMedJ.) ,1:947-949(1966).2. Judge, M.R., McLean, W.H.I. & Munro, C.S.角質化病癥(Disorders of keratinization).在Rook皮膚醫學教科書(i ooA:'s rexAooA o/Dermato/ogy) 中,巻2 (Bums, T., Breathnach, S., Cox, C. & Griffiths, C.編輯)34.54-34.56 (Blackwell科學出版社(Blackwell Scientific Publishing),牛津(Oxford), 2004).3. Steinert, P.M., Cantieri, J.S., Teller, D.C., Lonsdale匿Eccles, J.D. & Dale, B. A.特異性與中間體絲相互作用的陽離子蛋白種類的表征(Characterization of a class of cationic proteins that specifically interact with intermediate filaments).國家科學研究院學刊(尸rac Ato"cad5W)78, 4097-4101 (1981). 4. Dale, B.A., Resing, K.A. & Lonsdale-Ecccles, J.D.聚絲蛋白角蛋白絲相 關蛋白 (Filaggrin : a keratin filament associated protein).紐約禾斗學石if究院 年報(Ann. NY Acad. Sci) 455, 330-342 (1985).5. Listwan, P. & Rothnagd, J.A.角蛋白集束蛋白(Keratin bundling proteins). 細胞生物學方法(Me /7oACe〃所o/) 78,817-27(2004).6. Gan, S.Q., McBride, O.W., Idler, W. W., Markova, N. & Steinert, P.M.人類 聚絲蛋白原基因的構造、結構和多態性(Organization, structure, and polymorphisms of the human profilaggrin gene).生物化學(Biochemistry) 29, 9432-40(1990).7. Candi, E., Schmidt, R. & Mdino, G.角質化包膜皮膚中的細胞死亡模式 (The cornified envelope: a model of cell death in the skin).分子細胞生物學自然綜述(Nat Rev Mol Cell Biol) 6,328-40(2005).8. Fleckman, P" Holbrook, K.A., Dale, B.A. & Sybert, V.P.培養自患有尋常 魚鱗病受試者的角質形成細胞在表型上是異常的(Keratinocytes cultured from subjects with ichthyosis vulgaris are phenotypically abnormal).皮膚病 學研究雜志(J Invest Dermatol) 88,640-5 (1987).9. Perm Penabad, C.等,聚絲蛋白表達在層狀魚鱗病中的分化模式 (Differential patterns of filaggrin expression in lamellar ichthyosis).英國皮膚病學雜志(Br J Dermatol) 139,958-64(1998).10. Sybert, V.P., Dale, B.A. & Holbrook, K.A.尋常魚鱗病聚絲蛋白合成中 與缺乏透明角質蛋白顆粒相關的缺陷的鑒定(ichthyosis vulgaris : identification of a defect in synthesis of filaggrin correlated with an absence of keratohyaline granules).皮膚病學研究雜志(J Invest Dermatol) 84,191-4 (簡).11. Nirunsuksiri, W., Zhang, S,H. & Fleckman, P.培養自患有尋常魚鱗病受 試者的角質形成細胞中聚絲蛋白原mRNA降低的穩定性和雙等位基因, 同等表達(Reduced stability and bi- allelic, coequal expression of profilaggrin mRNA in keratinocytes cultured from subjects with ichthyosis vulgaris).皮膚 病學研究雜志(J Invest Dermatol) 110,854-61 (1998).12. Presland,R.B.等,絮狀尾部(ft/ft)小鼠中正常聚絲蛋白原和聚絲蛋白的 缺失聚絲蛋白缺陷性皮膚疾病尋常魚鱗病的動物模型(Loss of normal profilaggrin and filaggrin in flaky tail (ft/ft) mice: an animal model for the filaggrin-deficient skin disease ichthyosis vulgaris).皮膚病學研究雜志(J Invest Dermatol) 115,1072-81 (2000).13. Smith, F.J.D.等,"聚絲蛋白基因中的功能失去突變導致尋常魚鱗病"("Loss-of-function mutations in the filaggrin gene cause ichthyosis vulgaris"), 自然遺傳學(Nature Genetics) ,2006,印刷中.14. Palmer C.N.A.等,"表皮屏障蛋白聚絲蛋白的單倍性不足是哮喘和特 異反應性皮炎的主要誘病因素"("Haploinsufficiency for the epithelial barrier protein filaggrin is a major predisposing factor for asthma and atopic dermatitis"), 已遞交.15. Presland, R.B.等,人類聚絲蛋白原的N末端結構域在表皮分化過程中 特異性蛋白水解性分裂的證據(Evidence for specific proteolytic cleavage of the N- terminal domain of human profilaggrin during epidermal differentiation).皮膚病學研究雜志(J Invest Dermatol) 108,170-8 (1997).16. Ishida-Yamamoto, A., Takahashi, H., Presland, R.B., Dale, B. A. & Iizuka, H.在正常人類皮膚和兜甲蛋白角皮病中,聚絲蛋白原N末端結構域向具 有片斷DNA的角質形成細胞核中的遷移(Translocation of profilaggrin N-terminal domain into keratinocytes nuclei with fragmented DNA in normal human skin and loricrin keratoderma).實驗室研究(Lab Invest) 78, 1245-53 (1998).17. Lane, P. W.家鼠連鎖群XVI中的兩種新突變。絮片狀尾部和varitint-waddler-J。 (Two new mutations in linkage group XVI of the house mouse-Flaky tail and varitint-waddler-J. )遺傳論雜志(J7/ered) 63, 135-40 (1972).18. Rothnagd, J. A.等,小鼠兜甲蛋白基因的表征聚絲蛋白原和染色體3 上的層狀尾部和軟皮毛突變基因座的聯接(Characterization of the mouse loricrin gene: linkage with profilaggrin and the flaky tail and soft coat mutant loci on chromosome 3).基因組(Genomics) 23,450-6(1994).
權利要求
1. 一種試劑用于制備用于治療IV和/或相關疾病的藥物的用途,所述試劑能夠賦予在聚絲蛋白基因中連讀功能失去突變的能力。
2. —種預防或治療IV和/或其他相關疾病的方法,其包括向受試者施 用試劑的步驟,所述試劑能夠賦予在聚絲蛋白基因中連讀功能失去突變的 能力。
3. 按照權利要求2的方法,其中認為所述方法是美容治療。
4. 按照以上權利要求中任一項的用途或方法,其中所述功能失去突變 是無義突變。
5. 按照權利要求4的用途或方法,其中所述突變是1501OT(從起始 ATG開始編碼),其導致胞苷被胸苷所取代和相應的在位置501處精氨酸 變為終止密碼子(R501X)的氨基酸改變。
6. 按照以上權利要求中任一項方法的用途,其中所述受試者是新生 兒、兒童或成年人。
7. 按照以上權利要求中任一項的用途或方法,其中所述試劑是氨基糖 苷類抗生素。
8. 按照權利要求7的用途或方法,其中所述氨基糖苷是慶大霉素、巴 龍霉素、新霉素或妥布霉素。
9. 按照權利要求l-6中任一項的用途或方法,其中所述試劑是負霉素 或突變tRNA。
10. —種測試試劑連讀無義突變能力的方法,其包括下列步驟a) 提供突變聚絲蛋白基因/報道基因構建體;b) 使測試試劑和所述構建體相接觸;和c) 檢査所述測試試劑是否能夠影響突變聚絲蛋白基因的連讀和報道基因的表達。
11. 按照權利要求10的方法,其中所述聚絲蛋白核酸序列長度為 10-1000 bp。
12. 按照權利要求10或11的方法,其中突變聚絲蛋白基因/報道基因 構建體包含與3,報道基因序列符合讀框地連接的5'突變聚絲蛋白核酸序 列。
13. 按照權利要求12的方法,其中所述構建體還包括另外的聚絲蛋白 序列5'陽性對照報道基因。
14. 按照權利要求13的方法,其中所述報道基因是螢光素酶基因,(3-半乳糖苷酶基因,熒光基因諸如綠色熒光蛋白等,氯霉素乙酰轉移酶,卩-葡糖醛酸糖苷酶等。
15. 按照權利要求14的方法,其中所述構建體示意性地顯示于圖1中。
全文摘要
本發明涉及預防/治療尋常魚鱗病(IV)、特異反應性和潛在地其他與聚絲蛋白基因序列中功能失去突變相關的病癥。該預防/治療基于試劑的使用,該試劑能使宿主翻譯系統連讀聚絲蛋白基因突變等位基因中存在的無義突變。
文檔編號A61K48/00GK101400697SQ200780008788
公開日2009年4月1日 申請日期2007年1月17日 優先權日2006年1月18日
發明者威廉姆·亨利·歐文·麥克萊恩, 弗朗西斯·簡·多羅西·史密斯 申請人:敦提大學校董事會