人類乳頭瘤病毒(hpv)抗原、疫苗組合物和相關(guān)方法

專利名稱：：人類乳頭瘤病毒(hpv)抗原、疫苗組合物和相關(guān)方法人類乳頭瘤病毒(HPV)抗原、疫苗組合物和相關(guān)方法相關(guān)申請案本申請案涉及并且根據(jù)35USC119(e)主張2006年2月13日申請的U.S.S.N.60/773,374('374申請案)的優(yōu)先權(quán)；'374申請案的全部內(nèi)容以引用的方式并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域：
無
背景技術(shù)：
子宮頸癌是全世界婦女中第二位最常見的癌癥。在發(fā)達國家通過篩查己經(jīng)顯著地降低了這種疾病的發(fā)病率，但是在大多數(shù)婦女還不能接受正規(guī)婦科護理和篩查的國家地區(qū)，子宮頸癌是僅次于乳腺癌的癌癥相關(guān)死亡病因。臨床、分子學(xué)和流行病學(xué)研究已將人類乳頭瘤病毒(HPV)識別為子宮頸癌和子宮頸非典型增生(cervicaldysplasia)的主要原因。幾乎所有子宮頸癌(約99%)都含有高風(fēng)險HPV的基因，最常見的有16、18、31和45型(福雷(Ferlay)等人，1999)。全世界約12百分比(12%)的女性癌癥歸因于子宮頸的HPV感染。每年，在世界范圍內(nèi)診斷出約470,000例子宮頸癌，并且?guī)缀跻话朐馐芗膊≌勰サ膵D女將死亡。據(jù)估計，HPV16是近60%的子宮頸癌的病因，而HPV-18導(dǎo)致另外10%-20%。其他高風(fēng)險類型包括31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68和73型。此外，HPV也可能在某些頭頸部的癌瘤以及更致命的黑素瘤和(或許)其他癌癥中起作用(參見例如，梅林(Mellin)等人，2000,國際癌癥雜志(Internat,J.Cancer),89:300;仲巴赫(Zumbach)等人，2000,國際癌癥雜志(Internat.J.Cancer),85:815;德雷奧(Dreau)等人，2000,外科年報(AnnalsSurgery)，231:664;和索伊尼(Soini)等人，1996,胸腔(Thorax),51:887)。子宮頸非典型增生的當前治療限于去除或破壞子宮頸組織的切除或摘除程序。這些程序具有近90%的有效率，但與發(fā)病率和費用相關(guān)。另外，外科治療僅去除非典型增生的組織，而留下未治療的表現(xiàn)正常的HPV感染組織(貝爾(Bell)等人，2005)。因此希望使用疫苗根除所述感染。青少年在其第一次遭遇HPV之前的預(yù)防性疫苗接種就是針對此目標。一些預(yù)防性疫苗目前在晚期臨床試驗中正在取得進展，得到了令人鼓舞的結(jié)果。由于在感染與癌癥之間有較長的潛伏期，因此就癌癥發(fā)病率而言，預(yù)防性疫苗接種的益處將在數(shù)十年后可見。但是，已經(jīng)感染的個體以及正遭受晚期癌癥的患者也可受益于治療性疫苗接種。針對HPV來防止感染和/或治療惡性疾病的疫苗接種可大大降低HPV相關(guān)癌癥的發(fā)病率和死亡率。因此，仍對開發(fā)便宜的、較大人群可以容易使用的針對HPV的另外的改進疫苗存在需要。另外，開發(fā)能夠阻礙預(yù)先存在的病變和惡性腫瘤的進程并且甚至將其消除的針對HPV的治療性疫苗對受感染折磨的那些患者來說將具有非凡益處。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供人類乳頭瘤病毒(HPV)疫苗和植物中產(chǎn)生的疫苗組分。在一些實施例中，用熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)產(chǎn)生作為融合蛋白質(zhì)形式的一種或一種以上人類乳頭瘤病毒抗原。本發(fā)明另外包含含有HPV抗原的疫苗組合物。在一些實施例中，本發(fā)明HPV疫苗包含至少2種不同HPV抗原。另外，本發(fā)明提供包含至少2種不同人類乳頭瘤病毒(HPV)抗原的人類乳頭瘤病毒(HPV)疫苗。或者或另外，本發(fā)明HPV疫苗可包含一種或一種以上植物組分。另外提供用于產(chǎn)生和使用本發(fā)明的抗原和疫苗組合物的方法。圖1是pET32質(zhì)粒的圖。頂部左邊指示在用于克隆目標抗原的經(jīng)修飾質(zhì)粒中缺乏的T7啟動子與T7終止子之間的區(qū)域。圖2顯示pET-PRACS-Lic-KDEL和pET-PRACS-Lic-VAC構(gòu)筑體從修飾后的pET32載體的產(chǎn)生。圖3是pBI121載體組織的示意圖。圖4是切除P-葡糖苷酸酶(GUS)基因并且添加TMV衍生質(zhì)粒后，pBID4質(zhì)粒從pBI載體衍生的組織示意圖。圖5是E7和E7GGG在地衣多糖酶序列中BglII與HindIII位點之間的的融合和在pBID4載體中的后續(xù)克隆的示意圖。圖6A-D顯示使用抗地衣多糖酶抗體(6A,C)或抗6HIS-E7抗體(6B,D)的表達E7構(gòu)筑體的農(nóng)桿菌滲透植物的免疫印跡分析。圖7A-D顯示使用抗地衣多糖酶抗體(7A,C)或抗6HIS-E7抗體(7B,D)的表達E7構(gòu)筑體的農(nóng)桿菌滲透植物的免疫印跡分析。圖8顯示使用抗地衣多糖酶抗體的表達E7(8A、8B)或E7GGG(8C、8D)構(gòu)筑體的農(nóng)桿菌滲透植物的地衣多糖酶活性分析。圖9A-D的(9A)顯示使用抗地衣多糖酶抗體的表達E7GGG構(gòu)筑體的農(nóng)桿菌滲透植物的免疫印跡分析。(9B-D)顯示來自通過純化程序分離的蛋白質(zhì)部分的庫馬斯染色分析。圖10顯示在來自轉(zhuǎn)基因根的提取物上執(zhí)行的酶譜分析，所述轉(zhuǎn)基因根是從用含有pBID4-Lic-E7-KDEL(泳道l-9)和pBID4-Lic-E7GGG-KDEL構(gòu)筑體(泳道IO、11)的發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的侵染煙草葉外植體獲得；泳道12=150ng地衣多糖酶(正對照)；泳道13=來自用含有pBID4-Lic-E7-KDEL構(gòu)筑體的發(fā)根農(nóng)桿菌來農(nóng)桿菌滲透(agro-infiltrated)的侵染煙草葉的粗提取物。圖IIA-D顯示植物產(chǎn)生的候選疫苗的特性和功效。(11A)顯示E7特異性血清IgG反應(yīng)。數(shù)據(jù)以1:500稀釋血清的405nm下的光學(xué)密度值來呈現(xiàn)。來自個別動物的數(shù)據(jù)連同平均值一起顯示。(11B)顯示來自疫苗接種小鼠的脾細胞的ELISPOT分析。數(shù)據(jù)以每2><105個脾細胞的斑點平均數(shù)量±標準偏差(SD)來呈現(xiàn)。灰色和黑色條分別指經(jīng)或未經(jīng)特定CTLE7肽刺激的細胞。(11C)顯示針對TC-1誘導(dǎo)腫瘤的預(yù)防性疫苗接種。數(shù)據(jù)以無腫瘤小鼠的百分比表示。(11D)顯示針對TC-1誘導(dǎo)腫瘤的治療性疫苗接種。數(shù)據(jù)以無腫瘤小鼠的百分比表示。具體實施方式本發(fā)明涉及適用于制備針對HPV感染的疫苗的人類乳頭瘤病毒(HPV)抗原，和包含可操作連接到熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)的所述HPV抗原的融合蛋白質(zhì)。本發(fā)明涉及產(chǎn)生所提供抗原的方法，包括(但不限于)在植物系統(tǒng)中產(chǎn)生。另外，本發(fā)明涉及載體、融合蛋白質(zhì)、植物細胞、植物和包含本發(fā)明的抗原和融合蛋白質(zhì)的疫苗組合物。另外還提供在個體中誘導(dǎo)針對HPV感染的免疫反應(yīng)的方法，其包含向個體投與本發(fā)明的疫苗組合物。HPV抗原本發(fā)明的人類乳頭瘤病毒(HPV)抗原蛋白質(zhì)包括能夠引發(fā)針對HPV病毒的免疫反應(yīng)的任何免疫原性抗原蛋白質(zhì)或肽。通常，所關(guān)注的免疫原性蛋白質(zhì)包括HPV抗原(例如E6蛋白質(zhì)、E7蛋白質(zhì)等)、其免疫原性部分和/或其免疫原性變異體。根據(jù)本發(fā)明適用的HPV抗原可包括全長HPV蛋白質(zhì)(例如E6、E7等)，或所述蛋白質(zhì)的片段(其中所述片段保留免疫活性)，和/或包含所述全長HPV蛋白質(zhì)或片段的融合蛋白質(zhì)。涉及活體外細胞轉(zhuǎn)化的HPV基因為編碼E6禾Q/或E7的那些基因(比德爾(Bedell)等人，1987,病毒學(xué)雜志(J.Virol)，61:3635)。已提出E6和E7蛋白質(zhì)可能引起細胞轉(zhuǎn)化的機制(帕克(Park)等人，1995,癌癥(Cancer),76:1902，和其中引用的參考文獻)。基于其誘導(dǎo)針對病毒感染的免疫保護反應(yīng)的能力，E7和E6成為產(chǎn)生疫苗的所關(guān)注的主要抗原。另外的HPV抗原也可能適用于產(chǎn)生組合疫苗來改善免疫保護的功效。E6是包含Zn結(jié)合域的小的(約15，000MW)多肽。其轉(zhuǎn)化功能的提示是通過觀察到蛋白質(zhì)結(jié)合p53而提供。p53蛋白質(zhì)是一種熟知的腫瘤抑制基因蛋白質(zhì)，其負調(diào)節(jié)細胞周期進程并因此負調(diào)節(jié)細胞生長和分裂。E6與p53的結(jié)合產(chǎn)生泛素化(ubiquitination)和后一種蛋白質(zhì)的最終降解，所述過程涉及稱為"E6相關(guān)蛋白質(zhì)"的另一種細胞蛋白質(zhì)。因此，表達E6的細胞將具有基礎(chǔ)含量降低的p53。p53含量回應(yīng)DNA破壞而升高。所述增加的含量產(chǎn)生p21(—種細胞周期素依賴性激酶抑制劑)的增強表達，所述蛋白質(zhì)介導(dǎo)細胞周期停滯。所述機制提供具有時間窗的細胞，在所述時間窗內(nèi)，它們可以在DNA復(fù)制之前修復(fù)破壞的DNA，從而將建立破壞/突變。由E6介導(dǎo)的p53的增強周轉(zhuǎn)可防止所述機制的運轉(zhuǎn)。近期，也發(fā)現(xiàn)，E6不僅通過加速降解p53，而且更直接通過阻斷p53與DNA的相互作用來影響細胞周期調(diào)控(托馬斯(Thomas)等人，1995，致癌基因(Oncogene),10:261)。HPVE7癌蛋白(oncoprotein)是一種腫瘤特異抗原并且其涉及惡性進程。E7是一種短壽命蛋白質(zhì)，其通過泛素-蛋白酶體路徑活體外和活體內(nèi)降解(萊因斯坦(Reinstein)等人，2000)。E7蛋白質(zhì)是能夠結(jié)合成視網(wǎng)膜細胞瘤基因產(chǎn)物Rb的小的(約10,000Mw)鋅結(jié)合磷蛋白。Rb是與轉(zhuǎn)錄因子E2F結(jié)合并使轉(zhuǎn)錄因子E2F失活的腫瘤抑制基因。后一因子控制許多生長相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，所述生長相關(guān)基因包括那些編碼胸苷激酶、c-myc、二氫葉酸還原酶和DNA聚合酶a的基因。Rb-E2F復(fù)合物的形成防止后一基因在細胞周期的G0和Gl期中表達，而將其表達限制于S期，在S期中Rb-E2F復(fù)合物經(jīng)受解離，釋放活性轉(zhuǎn)錄因子E2F。Rb-E7復(fù)合物的形成防止Rb-E2F復(fù)合物的形成，造成前S期縮短,即，加速通過細胞周期的進程。在真核表達系統(tǒng)中產(chǎn)生大量序列真正性(sequence-authentic),非融合重組E7蛋白質(zhì)的嘗試實際上失敗了，主要是由于其快速降解(費爾南多(Fernando)等人，1999)。然而，一些以E7為基礎(chǔ)的HPV特異性治療性疫苗目前正處于II期和III期臨床試驗研究之中。初步結(jié)果是有希望的，但仍需要通過結(jié)合能夠刺激有效的細胞介導(dǎo)免疫性的更合適佐劑來進一步改進(弗雷澤(Frazer),2004)。通過觀察到來自高致癌性HPV類型(例如HPV16和18)的E6蛋白質(zhì)對p53具有比來自非致癌類型的相應(yīng)蛋白質(zhì)更高的親和力和來自高致癌類型的E7蛋白質(zhì)對Rb具有比來自非致癌類型的相應(yīng)蛋白質(zhì)更高的親和力，為所述機制的重要性提供了相關(guān)證據(jù)。因此，E6和E7代表選擇性疫苗和抗癌療法的開發(fā)的主要目標。如HPV抗原)的植物細胞和/或植物。本發(fā)明的異源蛋白質(zhì)可為所關(guān)注的任何HPV抗原，包括(但不限于)E6、E7、E6的部分和/或E7的部分。E7和具有一種亞型的經(jīng)修飾E7的全長核酸和蛋白質(zhì)序列提供于SEQIDNO.:1、SEQIDNO.:2、SEQIDNO.:3和SEQIDNO.:4中。雖然本文中提供示范性HPV抗原的序列，但是各種HPV菌株和亞型的另外的E6和E7序列在所屬領(lǐng)域已知并且可例如在GenBank等數(shù)據(jù)庫中識別。另外，E6和E7各自的活性和域也在所屬領(lǐng)域已知。因此，應(yīng)了解，可替代地使用具有E6禾B/或E7的域的免疫原性特征的任何序列。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將很容易能夠產(chǎn)生與所提供抗原具有至少75%、80%、85%或90%或更高的同一性的序列。在某些實施例中，HPV抗原的抗原序列構(gòu)成包括在序列上具有至少95%、96%、97%、98%或更高的同一性的那些蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)或其部分，其中抗原蛋白質(zhì)保留免疫原活性。舉例而言，與HPV抗原具有足夠同一性并保留免疫原性特征的序列，能夠結(jié)合與本文中提供的域(抗原)反應(yīng)的抗體。免疫原性特征常常包括相應(yīng)氨基酸或側(cè)基的三維呈現(xiàn)。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易識別具有適度序列差異的序列(例如，具有邊界差異和/或一些序列替代差異，但仍保留免疫原性特征)。舉例而言，其邊界接近在所指定氨基酸序列的任一端處本文所指定的域邊界(例如，約15個氨基酸、14個氨基酸、13個氨基酸、12個氨基酸、11個氨基酸、IO個氨基酸、9個氨基酸、8個氨基酸、7個氨基酸、6個氨基酸、5個氨基酸、4個氨基酸、3個氨基酸、2個氨基酸或1個氨基酸以內(nèi))的序列可被視為包含根據(jù)本發(fā)明的相應(yīng)域。因此，本發(fā)明涵蓋使用包含近似于指定域的殘基的HPV抗原的序列。舉例而言，E7的域已經(jīng)被工程改造并且被表達為作為本發(fā)明的抗原的順框(in-frame)融合蛋白質(zhì)(參見本文中的實例)。另外，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，具有免疫原性的HPV抗原(例如E6、E7)氨基酸序列的任何域、部分域或區(qū)域均可使用本文中提供的構(gòu)筑體和方法來產(chǎn)生。另外，域或亞域可組合地，分離地和/或連續(xù)地用于產(chǎn)生HPV抗原。4絲穩(wěn)定歪/W雄,録在本發(fā)明的某些方面中，提供融合多肽，其包含可操作連接到熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)的HPV抗原(或其片段或變異體)。本發(fā)明的融合多肽可以在所屬領(lǐng)域己知的任何可用表達系統(tǒng)中產(chǎn)生。在某些實施例中，本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)在植物或其部分(例如，植物、植物細胞、根、芽等)中產(chǎn)生。在人類或動物細胞中天然不可見的酶或其他蛋白質(zhì)尤其適用于本發(fā)明的融合多肽。當融合時對融合產(chǎn)物賦予熱穩(wěn)定性的熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)是適用的。熱穩(wěn)定性允許所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)維持構(gòu)象，并且在室溫下維持所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。這一特征有利于融合多肽容易、時間有效和成本有效的回收。根據(jù)本發(fā)明適用的熱穩(wěn)定酶的代表性家族為葡萄糖苷水解酶(glucanohydrolase)家族。這些酶特異地分裂混合鏈接多糖中鄰近于1,3-p鍵合的1,4-P糖苷鍵(哈恩(Hahn)等人，1994,美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，91:10417)。所述酶可見于燕麥和大麥等谷類中，并且也可見于許多真菌和細菌物種中，包括熱纖梭菌(C.f/zermoce〃wm)(戈登科娃(Goldenkova)等人，2002,分子生物學(xué)(Mol.Biol.)，36:698)。因此，適用于本發(fā)明的融合多肽的示范性熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)包括糖苷酶；示范性熱穩(wěn)定糖苷酶蛋白質(zhì)包括那些由選自以下各項的GenBank登錄號表示的蛋白質(zhì)P29716、P37073、P45798、P38645;P40942;P14002;033830、043097、P54583、P14288、052629、P29094、P4卯67、JC7532、，037、P33558、P05117、P04954、G4J929、033833、P49425、P06279、P45703、P45702、P40943、P09961、Q60042、AAN05438、AAN05437、AAN05440、AAN05439和AAD43138,其各自以引用的方式并入本文。用于本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)中的地衣多糖酶(lichenase)包括熱纖梭菌(Clostridiumthermocellum)P29716、短短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis)P37073和海洋紅嗜熱鹽菌(Phodothermusmarinus)P45798,其各自以引用其GenBank登錄號的方式并入本文。實例中說明的代表性融合蛋白質(zhì)利用從熱纖梭菌分離的經(jīng)修飾地衣多糖酶，但可根據(jù)本發(fā)明類似地利用任何熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)。當設(shè)計根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)和多肽時，理想情況當然是保存抗原的免疫原性。另外，在本發(fā)明的某些方面中理想情況是提供賦予融合蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的構(gòu)筑體。這一特征有利于目標抗原容易、時間有效和成本有效的回收。在某些方面中，所選擇的抗原融合搭配物可提供另外的優(yōu)點，包括對免疫原性的增強、引入多個疫苗抗原決定簇的潛力，但缺乏先前的理想性。2種所述系統(tǒng)包括產(chǎn)生克隆根(clonalroot)和克隆植物系統(tǒng)和其衍生物，以及產(chǎn)生萌芽秧苗系統(tǒng)?？寺≈参锟寺「S持RNA病毒表達載體并且經(jīng)過長時期和多次傳代培養(yǎng)(subculture)在整個根中均勻穩(wěn)定地產(chǎn)生目標蛋白質(zhì)。與植物中(其中目標基因在細胞間移動或長距離移動期間通過重組而消除)對比，在根培養(yǎng)物中，維持了病毒載體的完整性并且所產(chǎn)生目標蛋白質(zhì)隨時間的含量與在初始篩選期間所觀察到的相似。克隆根允許容易地產(chǎn)生用于抗原和疫苗組合物的口服調(diào)配物的物質(zhì)。適用于產(chǎn)生抗原(例如本發(fā)明的抗原蛋白質(zhì))的得自植物的各種克隆實體的產(chǎn)生方法和試劑已在先前描述并且在所屬領(lǐng)域中已知(參見例如，PCT公開案WO05/81905,其以引用的方式并入本文)。克隆實體包括能夠產(chǎn)生抗原(例如本發(fā)明的抗原蛋白質(zhì))的克隆根系、克隆根細胞系、克隆植物細胞系和克隆植物。本發(fā)明另外提供用于在得自各種植物組織(例如根、葉)的克隆細胞系中和得自單細胞(克隆植物)的完整植物中表達抗原多核苷酸和多肽產(chǎn)物的方法和試劑。所述方法通?；谑褂酶鞣N類型的植物病毒載體。舉例而言，本發(fā)明的一個方面提供獲得表達編碼本發(fā)明抗原的多核苷酸的克隆根系的方法，其包含的步驟為(i)將包含編碼本發(fā)明的抗原的多核苷酸的病毒載體引入植物或其部分中；和(ii)從植物產(chǎn)生一種或一種以上的克隆根系。例如，克隆根系可通過用引起發(fā)根形成的農(nóng)桿菌(Agro&arter^m)(例如發(fā)根農(nóng)桿菌(A.r/n'zogen^))感染植物或植物部分(例如收獲的葉片)來產(chǎn)生?？寺「悼梢愿鞣N方式來篩選以識別維持病毒的克隆根系、以高水平表達編碼本發(fā)明的抗原的多核苷酸的克隆根系等。本發(fā)明另外提供克隆根系，例如根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生的克隆根系，并且另外涵蓋使用所述克隆根系表達多核苷酸并產(chǎn)生編碼本發(fā)明的抗原的多肽的方法。本發(fā)明提供產(chǎn)生表達編碼本發(fā)明的抗原的多核苷酸的克隆根細胞系的方法，其包含的步驟為(i)產(chǎn)生克隆根系，其細胞含有基因組包含編碼本發(fā)明的抗原的多核苷酸的病毒載體；(ii)從克隆根系釋放個別細胞；和(iii)在適于根細胞增殖的條件下維持細胞。本發(fā)明提供克隆根細胞系和使用克隆根細胞系表達多核苷酸并產(chǎn)生多肽的方法。在一些實施例中，本發(fā)明提供產(chǎn)生表達編碼本發(fā)明的抗原的多核苷酸的克隆植物細胞系的方法，其包含的步驟為(i)產(chǎn)生克隆根系，其細胞含有基因組包含編碼本發(fā)明的抗原的多核苷酸的病毒載體；(ii)從克隆根系釋放個別細胞；和(iii)在適于植物細胞增殖的條件下在培養(yǎng)物中維持細胞。本發(fā)明提供產(chǎn)生表達編碼本發(fā)明的抗原的多核苷酸的克隆植物細胞系的方法，其包含的步驟為(i)將包含編碼本發(fā)明的抗原的多核苷酸的病毒載體引入維持在培養(yǎng)物中的植物細胞系的細胞中；和(ii)富集含有病毒載體的細胞。例如，富集可通過以下步驟來執(zhí)行(i)從培養(yǎng)物移出一部分細胞；(ii)稀釋所移出的細胞以便降低細胞濃度；(iii)使所稀釋的細胞增殖；和(iv)篩選含有病毒載體的細胞?？寺≈参锛毎悼捎糜诋a(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的HPV抗原。本發(fā)明包括用于產(chǎn)生克隆植物的許多方法，所述克隆植物的細胞含有包含編碼本發(fā)明的抗原的多核苷酸的病毒載體。舉例而言，本發(fā)明提供產(chǎn)生表達編碼本發(fā)明的抗原的多核苷酸的克隆植物的方法，其包含的步驟為(i)產(chǎn)生克隆根系，其細胞含有基因組包含編碼本發(fā)明的抗原的多核苷酸的病毒載體；(ii)從克隆根系釋放個別細胞；和(iii)在適于植物形成的條件下維持所釋放的細胞。本發(fā)明另外提供產(chǎn)生表達編碼本發(fā)明的抗原的多核苷酸的克隆植物的方法，其包含的步驟為(i)產(chǎn)生克隆植物細胞系，其細胞含有基因組包含編碼本發(fā)明的抗原的多核苷酸的病毒載體；和(ii)在適于植物形成的條件下維持細胞。一般而言，根據(jù)本發(fā)明的克隆植物可表達編碼本發(fā)明的抗原的任何多核苷酸。所述克隆植物可用于產(chǎn)生抗原多肽。如上所述，本發(fā)明提供用于在克隆根系、克隆根細胞系、克隆植物細胞系(例如得自葉、莖等的細胞系)中和/或在克隆植物中表達編碼本發(fā)明的抗原的一種或多種多核苷酸的系統(tǒng)。使用植物病毒載體，將編碼本發(fā)明的抗原的多核苷酸引入植物祖細胞中，所述植物病毒載體的基因組包括編碼可操作連接到啟動子(即，在啟動子控制下)的本發(fā)明的抗原的多核苷酸。根據(jù)下文進一步描述的數(shù)種技術(shù)中的任何技術(shù)，從含有病毒的細胞建立克隆根系或克隆植物細胞系。植物病毒載體或其部分可通過感染、通過用病毒轉(zhuǎn)錄物或感染性cDNA克隆的接種、通過電穿孔、通過T-DNA介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移等而引入植物細胞中。以下部分描述用于產(chǎn)生表達編碼本發(fā)明的抗原的多核苷酸的克隆根系、克隆根細胞系、克隆植物細胞系和克隆植物的方法。"根系"與"根細胞系"的區(qū)別在于，根系產(chǎn)生實際根狀結(jié)構(gòu)或根，而根細胞系是由不形成根狀結(jié)構(gòu)的根細胞組成。術(shù)語"系"的使用旨在說明所述系的細胞可增殖并且將遺傳信息傳遞給后代細胞。細胞系的細胞通常在培養(yǎng)物中增殖，而不是那些例如在完整植物中所見的結(jié)構(gòu)的組織化結(jié)構(gòu)的部分。術(shù)語"根系"的使用旨在說明根結(jié)構(gòu)中的細胞可增殖，而不是完整植物的部分。應(yīng)注意，術(shù)語"植物細胞"涵蓋根細胞。但是，為將用于產(chǎn)生根系和根細胞系的本發(fā)明方法與用于直接從非根組織產(chǎn)生植物細胞系的那些方法(與從克隆根系或得自克隆根系的克隆植物產(chǎn)生克隆植物細胞系對比)區(qū)別開來，如本文中所使用的術(shù)語"植物細胞"和"植物細胞系"通常指的是由非根植物組織組成的細胞和細胞系。植物細胞可為例如葉、莖、枝、花部分等。應(yīng)注意，種子可得自如本文中獲得的所產(chǎn)生的克隆植物。所述種子也將含有病毒載體，從所述種子獲得的植物也如此。在所屬領(lǐng)域熟知獲得種子原料的方法(參見例如，美國專利公開案2004/0093643)。，膨本發(fā)明提供用于產(chǎn)生克隆根系的系統(tǒng)，在所述克隆根系中植物病毒載體用以直接表達編碼本發(fā)明的抗原的多核苷酸。根據(jù)各種已知方法中的任何一種方法，將一種或一種以上的包括編碼可操作連接到啟動子的本發(fā)明的抗原的多核苷酸的病毒表達載體引入植物或其部分中。舉例而言，植物葉可用病毒轉(zhuǎn)錄物來接種。載體自身可直接應(yīng)用于植物(例如，通過研磨接種、機械化噴霧接種、真空滲透、粒子轟擊或電穿孔)?；蛘呋蛄硗?，可制備病毒粒子(virion)(例如從已感染的植物制備)，并且可根據(jù)已知技術(shù)應(yīng)用于其他植物。在打算通過將病毒基因組直接應(yīng)用于植物來完成感染的情況下，可使用任何可用技術(shù)來制備所述基因組。舉例而言，根據(jù)本發(fā)明適用的許多病毒都具有ssRNA基因組。ssRNA可在活體內(nèi)或活體外，通過轉(zhuǎn)錄基因組的DNA拷貝或通過復(fù)制RNA拷貝來制備。考慮到易于使用的活體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(例如SP6、T7、網(wǎng)織紅細胞裂解液(reticulocytelysate)等)的方便可得性以及維持RNA載體的DNA拷貝的便利性，希望本發(fā)明的ssRNA載體將常常通過活體外轉(zhuǎn)錄，尤其用T7或SP6聚合酶活體外轉(zhuǎn)錄來制備?？墒褂酶腥拘詂DNA克隆。根據(jù)所屬領(lǐng)域已知的方法，通過使用例如農(nóng)桿菌滲透法(agroinfiltration)，由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移可用以將例如病毒載體(整個病毒基因組或其部分)的病毒核酸轉(zhuǎn)移到植物細胞。可隨后在適于復(fù)制病毒轉(zhuǎn)錄物的條件下維持(例如培養(yǎng)或生長)植物或植物部分。在本發(fā)明的某些實施例中，病毒傳播超出最初接種的細胞，例如從細胞局部傳播到細胞和/或從最初接種的葉系統(tǒng)性傳播進另外的葉中。但是，在本發(fā)明的一些實施例中，病毒不傳播。因此，病毒載體可能含有編碼功能性MP和/或CP的基因，但也可能缺乏所述基因之一或全部。一般而言，將病毒載體引入(感染)植物或其部分的多個細胞中。將病毒載體引入植物中后，收獲葉子。一般而言，可以在引入病毒載體后的任何時間收獲葉子。但是，可能希望在病毒載體被引入植物中后，將植物維持一段時間，例如維持一段足以進行病毒復(fù)制和(視情況)足以使病毒從最初所引入的細胞傳播的時期。例如通過下文進一步所述的已知方法制備克隆根培養(yǎng)物(或多種培養(yǎng)物)。一般而言，任何可用方法都可用以從已引入病毒載體的植物或植物組織制備克隆根培養(yǎng)物。一種所述方法使用存在于某些細菌質(zhì)粒中的基因。這些質(zhì)?？梢娪诟腥径喾N生物體并將DNA轉(zhuǎn)移到多種生物體的各種農(nóng)桿菌物種中。作為一個屬，農(nóng)桿菌可將DNA轉(zhuǎn)移到多種多樣的植物類型，包括許多雙子葉植物和單子葉植物的被子植物物種和裸子植物(參見吉爾文(Gelvin),2003，微生物學(xué)與分子生物學(xué)評論(Microbiol.Mol.Biol.Rev.),67:16，和其中的參考文獻，其全部以引用的方式并入本文)。將植物細胞的遺傳轉(zhuǎn)化的分子基礎(chǔ)從細菌轉(zhuǎn)移并且整合到大的誘導(dǎo)腫瘤的(tumor-inducing,Ti)或發(fā)根(rhizogenic，Ri)的質(zhì)粒駐留在各種農(nóng)桿菌物種內(nèi)部的區(qū)域的植物核基因組中。這一區(qū)域在存在于質(zhì)粒中時被稱為"T區(qū)"，而從質(zhì)粒切除時被稱為"T-DNA"。通常，在天然存在的農(nóng)桿菌感染中，將單股T-DNA分子轉(zhuǎn)移到植物細胞并且最終并入(以雙股形式)基因組中。基于Ti質(zhì)粒的系統(tǒng)被廣泛用于將外來遺傳物質(zhì)引入植物中并用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。用各種農(nóng)桿菌物種感染植物并且轉(zhuǎn)移T-DNA具有許多作用。例如，根癌農(nóng)桿菌(A.mme/ac/e":r)引起冠癭病(crowngalldisease),而發(fā)根農(nóng)桿菌引起發(fā)根在感染部位處的發(fā)育，即一種稱為"發(fā)根病(hairyrootdisease)"的病狀。各根從單一遺傳轉(zhuǎn)化細胞產(chǎn)生。因此，根中的根細胞是克隆的，并且各根代表細胞的一個克隆群體。通過發(fā)根農(nóng)桿菌感染產(chǎn)生的根具有高生長速度和遺傳穩(wěn)定性的特征(吉利(Giri)等人，2000，生物技術(shù)進展(Biotech.Adv.),18:1，和其中的參考文獻，其全部以引用的方式并入本文)。另外，所述根能夠再生遺傳穩(wěn)定的植物(吉利(Giri)等人，2000,同上)。一般而言，本發(fā)明涵蓋能夠從植物細胞誘導(dǎo)根形成的農(nóng)桿菌的任何菌株(例如，任何發(fā)根農(nóng)桿菌菌株)的使用。如上所述，Ri質(zhì)粒的一部分(RiT-DNA)是引起發(fā)根病的原因。雖然將Ri質(zhì)粒的所述部分轉(zhuǎn)移到植物細胞可方便地通過用擁有Ri質(zhì)粒的農(nóng)桿菌感染來完成，但是本發(fā)明涵蓋使用將相應(yīng)區(qū)域引入植物細胞中的數(shù)種其他方法。這樣的方法包括將遺傳物質(zhì)引入植物細胞中的任何可用方法，包括(但不限于)基因槍、電穿孔、PEG介導(dǎo)的DNA吸收、以Ti為基礎(chǔ)的載體等。RiT-DNA的相應(yīng)部分可通過使用病毒載體引入植物細胞中。Ri基因可包括在含有編碼本發(fā)明的抗原的多核苷酸的相同載體中，或包括在不同病毒載體中，所述不同病毒載體可以與包含編碼本發(fā)明的抗原的多核苷酸的載體的類型相同或不同。應(yīng)注意，可能并不需要整個RiT-DNA來用于產(chǎn)生發(fā)根，并且本發(fā)明涵蓋使用RiT-DNA的部分，其限制條件為所述部分含有足以誘導(dǎo)根形成的遺傳物質(zhì)，如所屬領(lǐng)域中已知。另外的遺傳物質(zhì)，例如存在于Ri質(zhì)粒內(nèi)而不存在于T-DNA內(nèi)的基因，可被轉(zhuǎn)移到根據(jù)本發(fā)明的植物細胞，尤其是對于表達產(chǎn)物促進T-DNA整合到植物細胞DNA中的基因而言。為了制備根據(jù)本發(fā)明的某些實施例的克隆根系，在適于感染和轉(zhuǎn)化的條件下，使所收獲的葉部分與發(fā)根農(nóng)桿菌接觸。將葉部分維持在培養(yǎng)物中以允許發(fā)根發(fā)育。各根是克隆的，也就是說，根中的細胞是從被轉(zhuǎn)移了RiT-DNA的單一祖細胞得到。根據(jù)本發(fā)明，所述祖細胞的一部分將含有病毒載體。因此，得自所述祖細胞的根中細胞將含有病毒載體，因為病毒載體將在細胞分裂期間被復(fù)制并傳遞。因此，高比例(例如至少50%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%)、所有(100%)或大體上所有(至少98%)的細胞將含有病毒載體。應(yīng)注意，因為病毒載體被克隆根內(nèi)的子細胞(daughtercell)繼承，所以病毒載體的根內(nèi)移動并不是維持病毒載體遍及整個根所必需的。個別克隆發(fā)根可從葉部分移出并進一步培養(yǎng)。這樣的根在本文中也稱為根系。所分離的克隆根在分離后持續(xù)生長。已使用本發(fā)明的方法產(chǎn)生各種不同的克隆根系。使用含有編碼本發(fā)明的抗原(例如編碼免疫原性肽)的多核苷酸的病毒載體產(chǎn)生了根系。通過免疫印跡法(Westernblot)測試了根系。根系顯示各種不同表達水平的各種多肽。選擇顯示高表達的根系并且進一步培養(yǎng)。隨后再次測試根系并且證明經(jīng)過長時期維持高表達水平，說明了穩(wěn)定性。表達水平可相當于或超過以用來產(chǎn)生克隆根系的相同病毒載體感染的完整植物中的表達。另外，根系的表達穩(wěn)定性優(yōu)于經(jīng)相同病毒載體感染的植物中所獲得的表達穩(wěn)定性。2-3次傳代后，高達80%的所述病毒感染植物回復(fù)到野生型。(所述傳代涉及用轉(zhuǎn)錄物接種植物，使感染(局部或系統(tǒng)性)建立，采集葉樣本和接種隨后測試表達的新鮮植物。)如下文進一步所討論，根系可被大規(guī)模培養(yǎng)用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗原多肽。應(yīng)注意，克隆根系(和得自克隆根系的細胞系)通?？删S持在培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基不包括通常用于培養(yǎng)根和植物細胞的各種化合物，例如植物生長激素，比如生長素(auxin)、細胞分裂素(cytokinin)等。這一特征降低了與組織培養(yǎng)相關(guān)的費用，并且發(fā)明者希望其顯著有利于使用植物生產(chǎn)蛋白質(zhì)的經(jīng)濟可行性。各種方法中的任何一種方法都可用以選擇表達編碼本發(fā)明的HPV抗原的多核苷酸的克隆根。免疫印跡法、ELISA分析等都可用以檢測所編碼的多肽。在如GFP的可檢測標記狀況下，可執(zhí)行如目視法篩選(visualscreen)的替代方法。如果使用包含編碼可選擇標記的多核苷酸的病毒載體，那么可實行適當?shù)倪x擇(例如，葉物質(zhì)和/或從其得到的根可以在適當抗生素或營養(yǎng)條件存在下培養(yǎng)并識別和分離存活的根)。某些病毒載體含有兩種或兩種以上編碼本發(fā)明的抗原的多核苷酸，例如兩種或兩種以上編碼不同多肽的多核苷酸。如果這些多肽之一是可選擇或可檢測的標記，那么通過選擇標記或檢測標記的表達來選擇或檢測的克隆根將具有同時也表達第二種多核苷酸的高概率。對于含有特定多核苷酸的根系的篩選可使用PCR和其他核酸檢測方法來執(zhí)行。或者或另外，通過接種將由于病毒感染而形成局部病變的宿主植物(例如過敏性的宿主植物)，就病毒的存在篩選克隆根系。例如，可將5mg根組織在50pl的磷酸鹽緩沖液中勻化并用以接種煙草植物的單個葉。如果根培養(yǎng)物中存在病毒，那么2到3天內(nèi)，特征病變將在受感染葉上出現(xiàn)。這意味著根系含有攜帶編碼本發(fā)明的抗原的多核苷酸(目標基因)的重組病毒。如果沒有局部病變形成，那么就不存在病毒，并且根系呈陰性被排斥。所述方法具有高的時間和成本有效性。就病毒存在與否進行的最初篩選后，可使含有病毒的根經(jīng)受二次篩選，例如通過免疫印跡法或ELISA來選擇高表達者?？蓱?yīng)用另外的篩選，例如就快速生長、特定培養(yǎng)基中或特定環(huán)境條件下的生長等的篩選。一般而言，這些篩選方法可應(yīng)用于開發(fā)本文中所述的任何克隆根系、克隆根細胞系、克隆植物細胞系和/或克隆植物。如將對所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員而言明顯的，可對用于產(chǎn)生含有病毒載體的克隆根系的本發(fā)明方法的描述進行各種修改。所述修改在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。舉例而言，雖然通常理想的是在引入RiT-DNA基因之前先將病毒載體引入完整植物或其部分中，但是在本發(fā)明的某些實施例中，Ri-DNA是在引入病毒載體之前引入。另外，也可能是將完整植物與發(fā)根農(nóng)桿菌接觸而不是收獲葉子部分并隨后將其暴露給細菌。可以使用從擁有病毒載體的植物或其部分的單細胞產(chǎn)生克隆根系的其他方法(即，不使用發(fā)根農(nóng)桿菌或來自Ri質(zhì)粒的遺傳物質(zhì)的方法)。舉例而言，已知用某些植物激素或植物激素的組合處理而從植物組織產(chǎn)生根。淳^克廣樹#游克廣激應(yīng)^"如上所述，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生克隆根系的方法，其中根系中的細胞含有病毒載體。如所屬領(lǐng)域中所熟知，可從根產(chǎn)生各種不同的細胞系。舉例而言，根細胞系可從使用各種已知方法從根獲得的個別根細胞產(chǎn)生。所述根細胞系可從根內(nèi)的各種不同根細胞類型獲得。一般而言，收獲根物質(zhì)并使其解離(例如，物理和/或酶促消化)來釋放個別根細胞，然后進一步培養(yǎng)。完整的原生質(zhì)體形成通常是不必要的。需要時，根細胞可以極稀的細胞濃度涂布，以便從單一根細胞獲得根細胞系。以此方式得到的根細胞系是含有病毒載體的克隆根細胞系。所述根細胞系因此顯示編碼本發(fā)明的抗原的多核苷酸的穩(wěn)定表達。克隆植物細胞系可以相似方式從克隆根獲得，例如通過在適當植物激素存在下培養(yǎng)所解離的根細胞?？衫煤Y選和連續(xù)幾輪富集來識別以高水平表達編碼本發(fā)明的抗原的多核苷酸的細胞系。但是，如果產(chǎn)生細胞系的克隆根系已經(jīng)以高水平表達，那么所述另外的篩選可能就是不必要的。如在克隆根系的狀況下，克隆根細胞系的細胞是得自含有病毒載體的單一祖細胞，并且因此也將含有病毒載體，因為病毒載體將在細胞分裂期間被復(fù)制并傳遞。因此，高比例(例如至少50%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%)、所有(100%)或大體上所有(至少98%)的細胞將含有病毒載體。應(yīng)注意，因為病毒載體被克隆根細胞系內(nèi)的子細胞繼承，所以病毒載體在細胞間的移動并不是維持病毒載體所必需的?？寺「毎悼扇缦挛乃?，用于產(chǎn)生編碼本發(fā)明的抗原的多核苷酸?？穗x激浙蘇本發(fā)明提供用于產(chǎn)生克隆植物細胞系的方法，在所述克隆植物細胞系中植物病毒載體用以直接表達編碼本發(fā)明的抗原的多核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的方法，將一種或一種以上包括編碼可操作連接到啟動子的本發(fā)明的HPV抗原的多核苷酸的病毒表達載體引入維持在細胞培養(yǎng)物中的植物細胞系的細胞中。來自各種植物類型的許多植物細胞系在所屬領(lǐng)域中已知，可使用其中的任何植物細胞系。新得到的細胞系可根據(jù)適用于實施本發(fā)明的已知方法來產(chǎn)生。病毒載體根據(jù)許多方法中的任何方法引入植物細胞系的細胞中。舉例而言，可制造原生質(zhì)體并隨后將病毒轉(zhuǎn)錄物電穿孔到細胞中。可使用將植物病毒載體引入植物細胞系的細胞中的其他方法。用于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的克隆植物細胞系的方法和適于引入植物細胞(例如原生質(zhì)體)中的病毒載體可如下使用引入病毒載體后，植物細胞系可在組織培養(yǎng)物中維持。在此時間期間，病毒載體可復(fù)制，并且編碼本發(fā)明的抗原的多核苷酸可被表達?？寺≈参锛毎凳抢缤ㄟ^連續(xù)富集方法從培養(yǎng)物得到。舉例而言，可從培養(yǎng)物獲取樣本，視情況稀釋以使細胞濃度較低，并以個別小液滴(droplet)涂于皮氏培養(yǎng)皿中(Petridish)。隨后維持小液滴以允許細胞分裂。應(yīng)了解，小液滴可含有不同數(shù)量的細胞，這取決于培養(yǎng)物的初始密度和稀釋的量。如果希望僅在一輪富集后就獲得表達編碼本發(fā)明的抗原的多核苷酸的克隆細胞系，那么可稀釋細胞以使大多數(shù)小液滴含有O或l個細胞。但是，更有效的方法是選擇濃度以使多個細胞存在于各個小液滴中而隨后篩選小液滴來識別那些含有表達細胞的小液滴。一般而言，可使用任何適當?shù)暮Y選程序。例如，可使用如GFP的可檢測標記的選擇或檢測。可使用免疫印跡法或ELISA分析。個別小液滴(100^1)含有對于執(zhí)行所述分析來說綽綽有余的細胞。執(zhí)行多輪富集來依次分離高表達細胞系。單一克隆植物細胞系(即，得自單一祖細胞的群體)可使用用于單細胞克隆的標準方法，通過進一步限制稀釋來產(chǎn)生。然而，并非必需分離個別克隆系?？梢允褂煤卸鄠€克隆細胞系的群體來表達編碼本發(fā)明的抗原的多核苷酸。一般而言，上文對產(chǎn)生克隆根系所述的某些考慮也適用于產(chǎn)生克隆植物細胞系。例如，可使用含有一種或一種以上編碼本發(fā)明的抗原的多核苷酸的多種病毒載體，以作為多種不同載體的組合。可使用相似的篩選方法。如在克隆根系和克隆根細胞系的狀況下，克隆植物細胞系的細胞是得自含有病毒載體的單一祖細胞，并且因此也將含有病毒載體，因為病毒載體將在細胞分裂期間被復(fù)制并傳遞。因此，高比例(例如至少50%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%)、所有(100%)或大體上所有(至少98%)的細胞將含有病毒載體。應(yīng)注意，因為病毒載體被克隆植物細胞系內(nèi)的子細胞繼承，所以病毒載體在細胞間的移動并不是維持病毒載體所必需的?？寺≈参锛毎悼扇缦挛乃?，用于產(chǎn)生編碼本發(fā)明的抗原的多肽?？藦V潛欽克隆植物可從根據(jù)上文所述的各種方法產(chǎn)生的克隆根、克隆根細胞系和/或克隆植物細胞系來產(chǎn)生。用于從根、根細胞系和植物細胞系，例如本文中所述的克隆根系、克隆根細胞系和克隆植物細胞系產(chǎn)生植物的方法在所屬領(lǐng)域中熟知(參見例如，派瑞斯(Peres)等人，2001，植物細胞、組織和器官培養(yǎng)(PlantCell,Tissue,andOrganCulture),65:37;和本文中其它地方引用的關(guān)于植物分子生物學(xué)和生物技術(shù)的標準參考著作)。本發(fā)明因此提供產(chǎn)生克隆植物的方法，其包含的步驟為(i)根據(jù)上文所述的本發(fā)明方法中的任何方法產(chǎn)生克隆根系、克隆根細胞系或克隆植物細胞系；和(ii)從克隆根系、克隆根細胞系或克隆植物細胞系產(chǎn)生完整植物。克隆植物可根據(jù)標準方法繁殖和生長。如在克隆根系、克隆根細胞系和克隆植物細胞系的狀況下，克隆植物的細胞是得自含有病毒載體的單一祖細胞，并且因此也將含有病毒載體，因為病毒載體將在細胞分裂期間被復(fù)制并傳遞。因此，高比例(例如至少50%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%)、所有(100%)或大體上所有(至少98%)的細胞將含有病毒載體。應(yīng)注意，因為病毒載體被克隆植物內(nèi)的子細胞繼承，所以病毒載體的移動并不是維持病毒載體所必需的。芽和萌芽秧苗植物表達系統(tǒng)適用于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的HPV抗原的各種芽和萌芽秧苗的產(chǎn)生系統(tǒng)和試劑己在先前描述并且在所屬領(lǐng)域中已知(參見例如，PCT公開案WO04/43886，其以引用的方式并入本文)。本發(fā)明另外提供萌芽秧苗(可以是可食用的)，呈含有HPV抗原肽或蛋白質(zhì)的生物質(zhì)(biomass)。在某些方面中，提供直接用于消耗抗原組合物的生物質(zhì)。在一些方面中，在消耗之前，例如通過勻化、粉碎、干燥或提取來加工生物質(zhì)。在某些方面中，從生物質(zhì)純化HPV抗原并將其調(diào)配到醫(yī)藥組合物中。另外提供用于在萌芽秧苗中產(chǎn)生HPV抗原的方法，所述萌芽秧苗可以被消耗或者在活的時候(live)被收獲(例如，蕓苔屬(SraWcagem^)的芽、萌芽秧苗)。在某些方面中，本發(fā)明涉及使種子在封閉的(contained)、可調(diào)控環(huán)境(例如在室內(nèi)、在容器內(nèi)等)中生長成可食用萌芽秧苗。種子可為含有編碼HPV抗原的表達盒(expressioncassette)的遺傳工程改造種子，所述表達通過外源可誘導(dǎo)啟動子來驅(qū)動。可使用各種外源可誘導(dǎo)啟動子，例如可通過光、熱、植物激素、養(yǎng)分等來誘導(dǎo)。在相關(guān)實施例中，本發(fā)明提供在萌芽秧苗中產(chǎn)生HPV抗原的方法，其包含首先使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，用編碼HPV抗原的表達盒將植物轉(zhuǎn)化來產(chǎn)生用于萌芽秧苗的種子原料，其中HPV抗原的表達通過可誘導(dǎo)啟動子來驅(qū)動。轉(zhuǎn)基因種子可從轉(zhuǎn)化植物獲得，在封閉的、可調(diào)控環(huán)境中生長，并且經(jīng)誘導(dǎo)來表達HPV抗原。在一些實施例中，提供涉及用編碼HPV抗原的病毒表達盒感染萌芽秧苗的方法，其中所述表達可通過病毒啟動子或可誘導(dǎo)啟動子的任何啟動子來驅(qū)動。使萌芽秧苗在封閉的、可調(diào)控環(huán)境中生長2到14天，或至少到已獲得用于消耗或收獲的足夠含量的HPV抗原為止。本發(fā)明另外提供用于在萌芽秧苗中產(chǎn)生HPV抗原的系統(tǒng)，其包括氣候控制下的框架單元和含有編碼一種或一種以上HPV抗原的表達盒的萌芽秧苗，其中表達是通過構(gòu)成性或可誘導(dǎo)啟動子來驅(qū)動。本發(fā)明的系統(tǒng)可提供超過不能被控制的戶外環(huán)境或溫室的獨特優(yōu)點。因此，本發(fā)明使生長物能達到誘導(dǎo)HPV抗原的表達的精確時間。它也可大大降低產(chǎn)生HPV抗原的成本。在某些方面中，瞬時轉(zhuǎn)染的芽含有編碼本發(fā)明的HPV抗原的病毒載體序列。使苗生長一段時間以允許芽中產(chǎn)生病毒核酸，接著經(jīng)過一個產(chǎn)生病毒的多個拷貝的生長時期，從而產(chǎn)生抗原。在某些方面中，使含有編碼HPV抗原的轉(zhuǎn)基因的遺傳工程改造種子或胚芽在封閉的、可調(diào)控環(huán)境中生長到萌芽秧苗階段。封閉的、可調(diào)控環(huán)境可以是其中種子可在室內(nèi)生長的框架單元或房間。封閉的、可調(diào)控環(huán)境的所有環(huán)境因素都可被控制。因為芽的生長不需要光，并且照明昂貴，所以可使遺傳工程改造種子或胚芽在缺少光時，在室內(nèi)生長到萌芽秧苗階段。在本發(fā)明的封閉的、可調(diào)控環(huán)境中可調(diào)控的其他環(huán)境因素包括溫度、濕度、水、養(yǎng)分、氣體(例如02或C02含量或空氣循環(huán))、化學(xué)物質(zhì)(如糖和糖衍生物的小分子，或者如植物激素赤霉酸(gibberellicacid)或脫落酸(absisicacid)的激素等)等。根據(jù)本發(fā)明的某些方法，編碼HPV抗原的轉(zhuǎn)基因的表達可通過外源可誘導(dǎo)啟動子來控制。外源可誘導(dǎo)啟動子回應(yīng)外部而不是內(nèi)部刺激來引起轉(zhuǎn)基因表達的增加或降低。許多所述環(huán)境因素可擔(dān)當由遺傳工程改造芽的表達盒所攜帶的轉(zhuǎn)基因的誘導(dǎo)物。啟動子可以是熱可誘導(dǎo)的啟動子，例如熱休克(heat-shock)啟動子。舉例而言，當使用熱休克啟動子時，可簡單地通過升高封閉的環(huán)境的溫度來誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的表達。其他啟動子包括光可誘導(dǎo)啟動子。如果在封閉的可調(diào)控環(huán)境中的燈光始終開啟，那么光可誘導(dǎo)啟動子可以作為構(gòu)成性啟動子來維持?；蛘呋蛄硗猓D(zhuǎn)基因的表達可在發(fā)育期間的特定時間，簡單地通過開啟燈光而啟動。啟動子可以是用以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因表達的化學(xué)可誘導(dǎo)啟動子。根據(jù)所述實施例，化學(xué)物質(zhì)可簡單地通過被霧化或噴霧到種子、胚芽或苗來誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的表達。噴霧和霧化可被精確控制并且被引導(dǎo)到所希望的目標種子、胚芽或苗上。封閉的環(huán)境中沒有可能將化學(xué)物質(zhì)分散而遠離預(yù)期目標的風(fēng)流或氣流，以便化學(xué)物質(zhì)停留在所希望的目標上。根據(jù)本發(fā)明，可選擇誘導(dǎo)表達的時間，以使到收獲時為止萌芽秧苗中的HPV抗原表達最大化。在特定生長階段誘導(dǎo)胚芽中的表達，例如，在發(fā)芽特定天數(shù)后誘導(dǎo)胚芽中的表達，可在收獲時產(chǎn)生HPV抗原的最大合成。舉例而言，在發(fā)芽4天后由啟動子誘導(dǎo)表達可比3天后或5天后由啟動子誘導(dǎo)表達產(chǎn)生更多的蛋白質(zhì)合成。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，最大化表達可通過常規(guī)實驗達到。在一些實施例中，在發(fā)芽約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12天后收獲萌芽秧苗。在表達載體具有構(gòu)成性啟動子以代替可誘導(dǎo)啟動子的狀況下，萌芽秧苗可在其轉(zhuǎn)化后的某個時間被收獲。舉例而言，如果萌芽秧苗在發(fā)育早期，例如在胚芽階段經(jīng)歷病毒轉(zhuǎn)化，那么萌芽秧苗可在表達處于轉(zhuǎn)化后其最大值之時，例如在轉(zhuǎn)化后約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天時被收獲。也可能視種子的發(fā)芽而定，使芽在轉(zhuǎn)化后發(fā)育1、2、3個月或更久。通常，一旦HPV抗原的表達開始，就使種子、胚芽或萌芽秧苗生長直到足夠含量的HPV抗原被表達。在某些方面中，如果所收獲生物質(zhì)被生食(raw)，那么足夠含量是指將對患者提供治療益處的含量。或者或另外，足夠含量為HPV抗原可從生物質(zhì)濃縮或純化并且調(diào)配成在投藥后對患者提供治療益處的醫(yī)藥組合物的含量。通常，所述抗原不是天然中在萌芽秧苗中表達的蛋白質(zhì)。至少，HPV抗原通常是以高于天然中存在于萌芽秧苗中的濃度來表達。一旦HPV抗原的表達被誘導(dǎo)，就使生長持續(xù)直到萌芽秧苗階段，此時收獲萌芽秧苗。萌芽秧苗可在活的時候被收獲。收獲活的萌芽秧苗有幾個優(yōu)點，包括最少的工作量(effort)和最少的破壞(breakage)。本發(fā)明的萌芽秧苗可以使用溶液培養(yǎng)法生長，從而使收獲成為將萌芽秧苗從其培養(yǎng)溶液提起的簡單事件。本發(fā)明的萌芽秧苗的生長不需要土壤，但如果所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員認為必需或是理想的，那么可提供土壤。因為芽可以在無土壤下生長，所以在收獲時不需要清洗萌芽秧苗物質(zhì)。能夠直接從溶液培養(yǎng)環(huán)境收獲萌芽秧苗并且不用洗滌或擦洗將對所收獲物質(zhì)的破壞最小化。植物的破壞和萎蔫(wilting)誘導(dǎo)細胞凋亡。在細胞凋亡期間，某些蛋白水解酶變成活性的，其可降解萌芽秧苗中表達的醫(yī)藥蛋白質(zhì)，產(chǎn)生降低的蛋白質(zhì)治療活性。細胞凋亡誘導(dǎo)的蛋白水解會顯著降低來自成熟植物的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。使用本發(fā)明的方法，直到從植物提取蛋白質(zhì)的時刻才進行收獲，細胞凋亡可得以避免。舉例而言，可在含有蛋白酶抑制劑的緩沖液中將活芽研磨、粉碎或摻合而產(chǎn)生萌芽秧苗生物質(zhì)的漿液。緩沖液可維持在約4'C。在一些方面中，將萌芽秧苗生物質(zhì)風(fēng)干、噴霧干燥、冷凍或冷凍干燥。當在成熟植物中時，一些所述方法，例如風(fēng)干可能造成醫(yī)藥蛋白質(zhì)的活性損失。但是，因為萌芽秧苗非常小而且具有大的表面積與體積比，所以這種情況不太可能發(fā)生。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，使所表達蛋白質(zhì)的蛋白水解最小化的許多生物質(zhì)收獲技術(shù)是可用的并且可應(yīng)用于本發(fā)明。在一些實施例中，萌芽秧苗可食用。在某些實施例中，表達足夠含量的HPV抗原的萌芽秧苗在收獲后(例如，收獲后立即，收獲后最短時期內(nèi))被消耗，以便在消耗萌芽秧苗之前絕對沒有加工發(fā)生。由此，在HPV抗原投與需要治療的患者之前，HPV抗原的任何由收獲誘導(dǎo)的蛋白水解性分解就被最小化。舉例而言，準備被消耗的萌芽秧苗可以直接傳遞給患者?；蛘呋蛄硗猓瑢⑦z傳工程改造種子或胚芽傳遞給需要治療的患者并通過患者生長到萌芽秧苗階段。在一個方面中，向患者或向治療患者的醫(yī)生提供遺傳工程改造萌芽秧苗的供應(yīng)，以便可培育表達某些理想HPV抗原的萌芽秧苗的持續(xù)不斷的原料。這種做法對發(fā)展中國家人群頗有價值，在所述發(fā)展中國家中，無力支付或者無力交付昂貴的醫(yī)藥品。可使本發(fā)明的萌芽秧苗生長的容易性使本發(fā)明的萌芽秧苗對所述的發(fā)展中國家人群尤為理想。封閉的環(huán)境的可調(diào)控性質(zhì)賦予本發(fā)明超過使植物在戶外環(huán)境中生長的優(yōu)點。一般而言，使表達醫(yī)藥蛋白質(zhì)的遺傳工程改造萌芽秧苗在植物中生長比使遺傳工程改造植物生長更快地(因為更幼小時收獲植物)提供醫(yī)藥產(chǎn)物，并且具有較少工作量、風(fēng)險和調(diào)控考慮因素。用于本發(fā)明中的封閉的、可調(diào)控環(huán)境降低或消除了自然界中將植物交叉授粉的風(fēng)險。舉例而言，熱可誘導(dǎo)啟動子可能不會用于戶外，因為室外溫度不可控制。所述啟動子將在室外溫度上升到高于某個水平的任何時間時啟動。相似地，每當室外溫度降低時，啟動子將停止。這樣的溫度變動可能在一天內(nèi)發(fā)生，例如在白天啟動表達而在夜間停止。熱可誘導(dǎo)啟動子(例如本文中描述的那些)甚至實際上不適用于溫室，所述溫室對氣候變動敏感，幾乎達到與戶外相同的程度。遺傳工程改造植物在溫室中的生長十分昂貴。相比之下，在本發(fā)明的系統(tǒng)中，每個變量都可受控制以便每次收獲時都可達到最大表達量。在某些實施例中，本發(fā)明的萌芽秧苗是在托盤(tray)中生長，所述托盤可在萌芽秧苗發(fā)育期間的任何時間加水、噴霧或霧化。舉例而言，托盤可配備一個或一個以上的加水、噴霧、霧化和排水裝置，從而可以在萌芽秧苗發(fā)育期間的特定時間并且以精確量傳遞和/或去除水、養(yǎng)分、化學(xué)物質(zhì)等。例如，種子需要足夠水分來保持其潮濕。過量水分通過托盤中的孔排出到房間地板中的排水溝中。通常適當時，排出水在排放回環(huán)境中之前加以處理以去除有害化學(xué)物質(zhì)。托盤的另一個優(yōu)點是其可容納在極小空間中。因為萌芽秧苗的生長不需要光，所以含有種子、胚芽或萌芽秧苗的托盤可彼此上下垂直緊密堆疊，從而在特別為所述目的而建構(gòu)的框架設(shè)施中提供每單位占地面積較大量的生物質(zhì)。另外，托盤堆疊可以在框架單元內(nèi)排列成水平的行。一旦苗已生長到適于收獲的階段(約2到14天)，就手動地或通過自動裝置(例如傳送帶)將個別苗托盤移入加工設(shè)施中。本發(fā)明的系統(tǒng)獨特之處在于，其提供作為HPV抗原來源的萌芽秧苗生物質(zhì)。無論是直接消耗還是加工成醫(yī)藥組合物形式，都因為萌芽秧苗是在封閉的、可調(diào)控環(huán)境中生長，所以萌芽秧苗生物質(zhì)和/或源自生物質(zhì)的醫(yī)藥組合物均可以低成本提供給消費者。另外，由于萌芽秧苗生長的條件可被控制，因此產(chǎn)物的品質(zhì)和純度具有一致性。本發(fā)明的封閉的、可調(diào)控環(huán)境也回避了EPA的許多安全規(guī)范，可使科學(xué)家不用在戶外生長遺傳工程改造農(nóng)產(chǎn)品。^眾#各種方法可用以轉(zhuǎn)化植物細胞并產(chǎn)生遺傳工程改造萌芽秧苗。用于轉(zhuǎn)化植物的2種可用方法包括根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移和微彈轟擊法(microprojectilebombardment)或電穿孔，所述方法需要在活體外產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物細胞系，接著將細胞系再生到完整植物中。病毒轉(zhuǎn)化是胚芽和萌芽秧苗轉(zhuǎn)化的一種快速更快且成本更低的方法，所述胚芽和萌芽秧苗可以在獲得期望的產(chǎn)物之前無實驗或世代延遲(experimentalorgenerationallag)而被收獲。對所述技術(shù)中的任何技術(shù)而言，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解如何調(diào)整和優(yōu)化傳統(tǒng)上用于植物、種子、胚芽或萌芽秧苗的轉(zhuǎn)化方案。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化表達盒農(nóng)桿菌是革蘭氏陰性家族根瘤菌科(Rhizobiaceae)的代表屬。這一物種是冠癭病和發(fā)根病等植物腫瘤的病因。在以腫瘤為特征的去分化植物組織中，被稱作冠癭堿(opine)的氨基酸衍生物通過農(nóng)桿菌產(chǎn)生并且被植物分解代謝。負責(zé)冠癭堿表達的細菌基因是嵌合表達盒的控制元件的方便來源。根據(jù)本發(fā)明，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)可用以產(chǎn)生僅僅比成熟植物更早收獲的可食用萌芽秧苗?？扇菀椎貞?yīng)用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法來再生表達HPV抗原的萌芽秧苗。一般而言，植物的轉(zhuǎn)化涉及通過用攜帶植物/細菌載體的根癌農(nóng)桿菌共同培育來轉(zhuǎn)化在組織培養(yǎng)物中生長的植物細胞。載體含有編碼HPV抗原的基因。農(nóng)桿菌將載體轉(zhuǎn)移到植物宿主細胞并且隨后使用抗生素處理來消除。選擇表達HPV抗原的轉(zhuǎn)化植物細胞、分化并最終再生到完整小植物(plantlet)中(海倫斯(Hellens)等人，2000,植物分子生物學(xué)(PlantMolBiol),42:819;皮隆斯密茨(Pilon-Smits)等人，1999，植物生理學(xué)(PlantPhysiolog),119:123;巴非爾德(Barfield)等人，1991,植物細胞報告(PlantCellReports),10:308;和里瓦(Riva)等人，1998,生物技術(shù)雜志(J.Biotech)，1(3);每一篇參考文獻以引用的方式并入本文)。適用于本發(fā)明的表達載體包括經(jīng)設(shè)計在植物中操作的編碼HPV抗原的基因(或表達盒)，而伴生序列(companions叫uence)位于表達盒的上游和下游。伴生序列通常具有質(zhì)粒或病毒起源并且向載體提供將DNA從細菌轉(zhuǎn)移到期望植物宿主的必需特征?；镜募毦?植物載體構(gòu)筑體可理想地提供廣泛宿主范圍的原核生物復(fù)制起點、原核生物可選擇標記。合適的原核生物可選擇標記包括針對氨芐青霉素(ampicillin)或四環(huán)素(tetracycline)等抗生素的抗性。載體中可存在所屬領(lǐng)域中熟知的編碼另外的功能的其他DNA序列。農(nóng)桿菌T-DNA序列是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移到植物染色體所必需的。通常去除T-DNA的誘導(dǎo)腫瘤的基因并代之以編碼HPV抗原的序列。保留T-DNA邊界序列，因為它們引發(fā)T-DNA區(qū)域到植物基因組中的整合。如果HPV抗原的表達不易檢測，那么細菌/植物載體構(gòu)筑體可以包括適于確定植物細胞是否已被轉(zhuǎn)化的可選擇標記基因，例如叩tll卡那霉素(kanamycin)抗性基因。在相同或不同細菌/植物載體(Ti質(zhì)粒)上的是Ti序列。Ti序列包括毒力基因(virulencegene)，其編碼一組負責(zé)T-DNA的切除、轉(zhuǎn)移和到植物基因組中的整合的蛋白質(zhì)(謝爾(Schdl),1987，科學(xué)(Science),237:1176)。允許異源序列整合到植物基因組中的其他適用序列可包括用于同源重組的轉(zhuǎn)位子序列(transposonsequence)等。某些構(gòu)筑體包括編碼抗原蛋白質(zhì)的表達盒。在指定轉(zhuǎn)化中可以使用l種、2種或更多種的表達盒。除HPV抗原編碼序列之外，重組表達盒還至少含有以下元件啟動子區(qū)域、植物5'端非翻譯序列、起始密碼子(取決于所表達基因自身是否具有)和轉(zhuǎn)錄與翻譯終止序列。另外，轉(zhuǎn)錄與翻譯終止子可包括在本發(fā)明的表達盒或嵌合基因中。適當時，表達盒中可包括允許蛋白質(zhì)加工和易位的信號分泌序列。已描述了各種啟動子、信號序列和轉(zhuǎn)錄與翻譯終止子(參見例如，勞頓(Lawton)等人，1987,植物分子生物學(xué)(PlantMol.Biol)，9:315;和美國專利5,888,789，以引用的方式并入本文)。另外，抗生素抗性的結(jié)構(gòu)基因通常用作選擇因子(弗雷利(Fraley)等人1983，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA),80:4803,以引用的方式并入本文)。在表達盒5'端和3'端處獨特的限制酶位點允許容易插入預(yù)先存在的載體中。用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、攜帶至少一個T-DNA邊界序列的其他二元載體系統(tǒng)描述在PCT/EP99/07414中，以引用的方式并入本文。體可收獲轉(zhuǎn)化植物的種子、干燥、清潔并且測試其生活力(viability)和期望基因產(chǎn)物的存在和表達。通常在必要時，一旦得以測定，就將種子原料儲存在適當?shù)臏囟取穸?、衛(wèi)生和安全條件下以備用。完整植物可隨后從所培養(yǎng)的原生質(zhì)體再生(參見例如，埃文斯(Evans)等人，植物細胞培養(yǎng)手冊(HandbookofPlantCellCultures),第1巻，麥克米蘭出版公司(MacMillanPublishingCo.),紐約，1983;和瓦希爾(VasilI,R.)(編)，植物細胞培養(yǎng)和體細胞遺傳(CellCultureandSomaticCellGeneticsofPlants),學(xué)術(shù)出版社(Acad.Press)，奧來多(Orlando),第I巻，1984和第III巻，1986，以引用的方式并入本文)。在某些方面中，僅將植物再生到萌芽秧苗階段。在一些方面中，將完整植物再生來產(chǎn)生種子原料，再從種子原料的種子產(chǎn)生萌芽秧苗?？煞蛛x得到原生質(zhì)體并加以培養(yǎng)以得到完整再生植物的所有植物都可通過本發(fā)明來轉(zhuǎn)化以便回收含有所轉(zhuǎn)移基因的完整植物。已知的是，實際上所有植物都可從培養(yǎng)的細胞或組織來再生，包括(但不限于)產(chǎn)生可食用芽的所有主要植物物種。一些適合的植物包括苜蓿(alfalfa)、綠豆(mungbean)、蘿卜(radish)、小麥(wheat)、芥菜(mustard)、菠菜(spinach)、胡蘿卜(carrot)、甜菜(beet)、洋蔥(onion)、大蒜(garlic)、開菜(celery)、大黃(rhubarb)、多葉植物如巻心菜(cabbage)或萵苣(lettuce)、水田芥(watercress)或水芹(cress)、草本類如歐^(parsley)、薄荷(mint)或三葉草(clovers)、花椰菜(cauliflower)、西蘭花(broccoli)、大豆(soybean)、小扁豆(lentils)、可食用的花如向日葵(sunflower)等。再生的方式在不同植物物種之間有所不同。但是，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，通常是先提供含有異源基因拷貝的轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體的懸浮液。形成愈傷組織(callustissue)并且可從愈傷組織誘導(dǎo)形成枝，隨后生根。或者或另外，可從原生質(zhì)體懸浮液誘導(dǎo)胚芽形成。所述胚芽作為天然胚芽發(fā)芽而形成植物。將種子浸漬在水中或用水噴霧種子以使種子的水分含量增加到35-45%之間，引發(fā)發(fā)芽。為了使發(fā)芽進行下去，通常在受控的溫度和氣流條件下，將種子維持在水飽和的空氣中。培養(yǎng)基通常含有各種氨基酸和激素，例如生長素和細胞分裂素。有利的是將谷氨酸和脯氨酸添加到培養(yǎng)基中，尤其對苜蓿等物種而言。枝和根通常同時發(fā)育。有效的再生取決于培養(yǎng)基、基因型和培養(yǎng)史。如果對這3個變量加以控制，那么再生是完全可再現(xiàn)和可重復(fù)的。使從轉(zhuǎn)化植物細胞生長的成熟植物自花授粉并且識別不分離的、純合轉(zhuǎn)基因植物。自交植物產(chǎn)生含有本發(fā)明的抗原編碼序列的種子?？梢允顾龇N子發(fā)芽并生長到萌芽秧苗階段來產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的HPV抗原。在相關(guān)實施例中，本發(fā)明的種子可形成為種子產(chǎn)品并附上說明書出售，所述說明書是關(guān)于如何使苗生長到適當萌芽秧苗階段以用于投藥或收獲到醫(yī)藥組合物中。在一些相關(guān)實施例中，可以從本發(fā)明的自交植物開發(fā)體現(xiàn)期望性狀的雜種或新穎變種。在本發(fā)明中可以通過微彈轟擊法或電穿孔，將DNA片段直接整合到植物細胞的基因組中(參見例如，奇科特(Kikkert)等人，1999,植物組織培養(yǎng)協(xié)會雜志(Plant:J.TissueCult.Assoc),35:43;和貝茨(Bates)，1994，分子生物技術(shù)(Mol.Biotech),2:135)。具體地說，表達本發(fā)明的HPV抗原的載體可通過各種技術(shù)引入植物細胞中。如上所述，載體可包括適用于植物細胞的可選擇標記。載體可包括允許其在第二宿主中選擇和繁殖的序列，例如含有復(fù)制起點和可選擇標記的序列。通常，第二宿主包括細菌和酵母。在一實施例中，第二宿主為細菌(例如，大腸桿菌(Escherichiacoli)，復(fù)制起點是colEl型復(fù)制起點)而可選擇標記為編碼氨芐青霉素抗性的基因。所述序列在所屬領(lǐng)域中熟知并且是市售的(例如，加利福尼亞州帕羅奧多的科隆泰克公司(Clontech,PaloAlto，CA)或加利福尼亞州拉賀亞的斯曲塔基因公司(Stratagene，LaJolla，CA))。本發(fā)明的載體可被修飾成中間植物轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，所述轉(zhuǎn)化質(zhì)粒含有與根癌農(nóng)桿菌載體同源的區(qū)域、來自根癌農(nóng)桿菌的T-DNA邊界區(qū)和上文所述的編碼抗原的核酸或表達盒。其他載體可包括根癌農(nóng)桿菌的無致癌能力的(disarmed)植物腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒。根據(jù)此實施例，本發(fā)明載體的直接轉(zhuǎn)化可涉及通過使用微量移液管機械轉(zhuǎn)移重組DNA來將載體直接微注射到植物細胞中(參見例如，科洛斯維(Crossway),1985,分子基因遺傳學(xué)(Mol.Gen.Genet)，202:179，以引用的方式并入本文)。遺傳物質(zhì)可使用聚乙二醇轉(zhuǎn)移到植物細胞中(參見例如，科雷恩斯(Krens)等人，1982,自然(Nature),296:72)。將核酸引入植物中的另一種方法是利用具有核酸(在小珠?；蛄Ｗ拥幕|(zhì)內(nèi)或在表面上)的小粒子的高速沖擊穿透(highvelocityballisticpenetration)(參見例如，克萊因(Klein)等人，1987,自然(Nature)，327:70;努森(Knudsen)等人，1991,植物(Planta),185:330)。另一種引入方法是原生質(zhì)體與其他實體，即微細胞、細胞、溶酶體或其他可融合脂質(zhì)表面體的融合(參見例如，弗雷利(Fraley)等人，1982，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA),79:1859)。本發(fā)明的載體可通過電穿孔引入植物細胞中(參見例如，弗羅姆(Fromm)等人1985,美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，82:5824)。根據(jù)此項技術(shù)，將植物原生質(zhì)體在含有基因構(gòu)筑體的質(zhì)粒存在下電穿孔。具有高場強度的電脈沖可逆地穿透生物膜，從而允許引入質(zhì)粒。經(jīng)過電穿孔的植物原生質(zhì)體重整細胞壁，分裂并形成植物愈傷組織，愈傷組織可再生而形成本發(fā)明的萌芽秧苗。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，如何利用所述方法來轉(zhuǎn)化植物細胞而后用于產(chǎn)生可食用萌芽秧苗。病毒轉(zhuǎn)化與常規(guī)表達系統(tǒng)類似，可使用植物病毒載體產(chǎn)生全長蛋白質(zhì)，包括全長抗原。根據(jù)本發(fā)明，植物病毒載體可用以在種子、胚芽、萌芽秧苗等中感染并產(chǎn)生抗原，病毒系統(tǒng)可用以表達從短肽到大的復(fù)合蛋白質(zhì)的所有物質(zhì)。具體而言，已描述使用煙草花葉病毒載體(tobamoviralvector)(參見例如，麥考密克(McCormick)等人1999,美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Scl,USA)，96:703;熊谷(Kumagai)等人，2000，基因(Gene)245:169;及維切(Verch)等人，1998，免疫學(xué)方法雜志(/./mmmoZMeAo^r),220:69;每篇參考文獻以引用的方式并入本文)。因此，植物病毒載體具有表達短肽以及大的復(fù)合蛋白質(zhì)的已被證明的能力。在某些實施例中，表達HPV抗原的轉(zhuǎn)基因芽是利用宿主/病毒系統(tǒng)而產(chǎn)生。通過病毒感染產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因芽提供已被證明是安全的轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)來源。舉例而言，芽不含具有動物病原體的污染物。例如不同于煙草，來自可食用芽的蛋白質(zhì)至少在理論上可不經(jīng)純化即用于口服應(yīng)用，因此顯著降低成本。另外，病毒/芽系統(tǒng)提供了一種進行擴大規(guī)模和商業(yè)生產(chǎn)的更簡單、不太昂貴的途徑，因為將轉(zhuǎn)基因引入病毒后，可在幾天內(nèi)生長到商業(yè)規(guī)模。相比之下，在足夠種子或植物物質(zhì)可用于大規(guī)模試驗或商業(yè)化之前，轉(zhuǎn)基因植物可能需要長達5-7年時間。根據(jù)本發(fā)明，植物RNA病毒具有某些優(yōu)點，使其成為有吸引力的用于外來蛋白質(zhì)表達的載體。許多植物RNA病毒的分子生物學(xué)和病理學(xué)已經(jīng)得到充分表征，并且對病毒生物學(xué)、遺傳學(xué)和調(diào)控序列已經(jīng)有相當多的了解。大多數(shù)植物RNA病毒具有小的基因組，并且許多感染性cDNA克隆可用以促進遺傳操作。感染性病毒物質(zhì)一旦進入敏感宿主細胞中，就復(fù)制達到高含量并且快速傳播遍及整個萌芽秧苗(接種后1到10天)。病毒粒子可以容易地并且經(jīng)濟地從受感染的萌芽秧苗組織回收。病毒具有廣泛的宿主范圍，因此可以使用單個構(gòu)筑體來感染數(shù)個敏感物種。所述特征可容易轉(zhuǎn)移到芽。外來序列可以由植物RNA病毒表達，通常是通過以期望序列替換病毒基因之一，通過在病毒基因組中的適當位置插入外來序列，或通過將外來肽與病毒的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)融合。此外，可將所述方法中的任何方法組合以通過病毒生命機能的反式互補作用(trans-complementation)來表達外來序列。許多不同策略可以作為使用煙草花葉病毒(tobaccomosaicvirus,TMV)、苜蓿花葉病毒(alfalfamosaicvirus，A1MV)和其嵌合體在病毒感染的植物中表達外來序列的工具。A1MV的基因組是雀麥花葉病毒科(Bromoviridaefamily)病毒的代表并且由3個基因組RNA(RNA1-3)和亞基因組RNA(RNA4)組成?；蚪MRNA1和2分別編碼病毒復(fù)制酶蛋白質(zhì)P1和2?；蚪MRNA3編碼細胞間移動蛋白質(zhì)P3和外殼蛋白質(zhì)(coatprotein,CP)。CP是從亞基因組RNA4(從基因組RNA3合成)翻譯，并且是開始感染所需要的。研究證明在多種功能中涉及CP，包括基因組活化、復(fù)制、RNA穩(wěn)定性、癥狀形成和RNA衣殼化(RNAencapsidation)(參見例如，波爾(Bol)等人，1971，病毒學(xué)(VJfra&g;y)，46:73;范德沃森(VanDerVossen)等人，1994,病毒學(xué)(WraZogy)202:891;尤斯波夫(Yusibov)等人，病毒學(xué)(WroZogy),208:405;尤斯波夫(Yusibov)等人，1998,病毒學(xué)(WraZogy),242:1;波爾(Bol)等人，(評論，100篇參考文獻(Review,腦refs.)),1999,普通病毒學(xué)雜志(/.Vi'ra/)，80:1089;德格拉夫(DeGraaff),1995,病毒學(xué)(WraZogy)，208:583;賈斯巴(Jaspars)等人，1974,病毒研究進展Wn^，19:37;路赫費爾斯(Loesch-Fries),1985，病毒學(xué)(V!'油gy)，146:177;尼爾曼(Neel匿n)等人，1991,病毒學(xué)(Vif油gy),181:687;尼爾曼(Neeleman)等人，1993，病毒學(xué)(WraZogy)，196:883;范德科利(VanDerKuyl)等人，1991,病毒學(xué)(VJ'rokgy)，183:731;和范德科利(VanDerKuyl)等人，1991,病毒學(xué)(Wrakgy),185:496)。病毒粒子的衣殼化通常是病毒從種子、胚芽或萌芽秧苗的接種部分到未接種部分長距離移動和系統(tǒng)性感染所需的。根據(jù)本發(fā)明，接種可在植物發(fā)育的任何階段發(fā)生。在胚芽和芽中，所接種病毒的傳播應(yīng)當很迅速。A1MV的病毒粒子是通過獨特CP(24kD)來衣殼化，形成不止l種類型的粒子。粒子的尺寸(長度30到60nm和直徑18nm)和形狀(球形、橢圓形或桿狀)取決于衣殼化RNA的尺寸。裝配后，認為A1MVCP的N末端位于病毒粒子的表面上并且似乎不干擾病毒裝配(波爾(Bol)等人，1971，病毒學(xué)(WroZogy),6:73)。另外，在N末端有另外的38氨基酸肽的A1MVCP在活體外形成粒子并且保留生物活性(尤斯波夫(Yusibov)等人，1995,普通病毒學(xué)雜志(/.,77:567)。A1MV具有廣泛的宿主范圍，包括許多農(nóng)業(yè)上有價值的作物植物，包括植物種子、胚芽和芽。總的來說，這些特征使A1MVCP成為優(yōu)良的候選載體分子并且使A1MV成為用于在芽發(fā)育階段，在植物中表達外來序列的有吸引力的候選載體。此外，在從異源載體如TMV表達后，A1MVCP將TMV基因組衣殼化而不干擾病毒感染性(尤斯波夫(Yusibov)等人，1997,美國國家科學(xué)院院刊(ZVoc.淑"ca"c/"腺)，94:5784，以引用的方式并入本文)。這允許將TMV用作與外來序列融合的A1MVCP的載體病毒。TMV(煙草花葉病毒的原型)的基因組由以17.0kDCP衣殼化的單正鏈RNA組成，形成桿狀粒子(長度300nm)。CP是TMV的唯一結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)并且是病毒在受感染宿主中的衣殼化和長距離移動所需的(塞托(Saito)等人，1990,病毒學(xué)(WroZogy)，176:329)。183和126kD蛋白質(zhì)是從基因組RNA翻譯并且為病毒復(fù)制所需(伊斯卡娃(Ishikawa)等人，19S6,核酸研究(M<c.Ac!'A/仏)，14:8291)。30kD蛋白質(zhì)是病毒的細胞間移動蛋白質(zhì)(梅西(Meshi)等人，1987，歐洲分子生物學(xué)雜志(EMfi0/.),6:2557)。移動蛋白質(zhì)和外殼蛋白質(zhì)是從亞基因組mRNA翻譯(亨特(Hunter)等人，1976，自然(Mzmw)，260:759;布魯寧(Bruening)等人，1976,病毒學(xué)(V!'ra一),71:498;和畢奇(Beachy)等人，1976，病毒學(xué)(WroZogy),73:498;每篇參考文獻以引用的方式并入本文)。轉(zhuǎn)化植物組織的其他方法包括轉(zhuǎn)化植物的花。擬南芥(Ara6Wo/^"f/u^'cma)的轉(zhuǎn)化可通過將植物花浸入根癌農(nóng)桿菌的溶液中來達到(柯蒂斯(Curtis)等人，2001,轉(zhuǎn)基因研究(7Va"wem'c),10:363;和秦(Qing)等人，2000，分子育種植物改良的新策略(AfoZecwZar5reedz7zg:Afew5^rafegz'esZw尸/awf/m/rovewze"f),1:67)。纟圣轉(zhuǎn)j七豐直物是在"經(jīng)浸漬"植物所產(chǎn)生的種子群體中形成。在花發(fā)育期間的特定時間點，子房壁中存在孔，根癌農(nóng)桿菌通過所述孔進入子房內(nèi)部。一旦處于子房內(nèi)部，根癌農(nóng)桿菌就增殖并轉(zhuǎn)化個別胚珠(德費克斯(Desfeux)等人，2000，植物生理學(xué)(尸/a"fP/o;w'oZogy),123:895)。轉(zhuǎn)化后的胚珠沿子房內(nèi)種子形成的典型路徑而行?？乖漠a(chǎn)生和分離一般而言，所屬領(lǐng)域中已知的標準方法可用于培養(yǎng)或生長本發(fā)明的植物、植物細胞和/或植物組織(例如克隆植物、克隆植物細胞、克隆根、克隆根系、芽、萌芽秧苗、植物等)，以用于產(chǎn)生抗原。多種培養(yǎng)基和生物反應(yīng)器已被用于培養(yǎng)發(fā)根細胞、根細胞系和植物細胞(參見例如，吉利(Giri)等人，2000，生物技術(shù)進展(fi^ec/z"WAdv.),18:1;勞(Rao)等人，2002，生物技術(shù)進展(fi!'ofec/moZ),20:101;和上述兩者中的參考文獻，全部以引用的方式并入本文)。克隆植物可以任何適合方式生長。在某些實施例中，本發(fā)明的HPV抗原可通過任何己知方法產(chǎn)生。在一些實施例中，HPV抗原是在植物或其部分中表達。可根據(jù)所屬領(lǐng)域中已知的常規(guī)條件和技術(shù)將蛋白質(zhì)分離和純化。所述技術(shù)包括提取、沉淀、色譜法、親和色譜法、電泳等方法。本發(fā)明涉及使用所屬領(lǐng)域中已知和本文中提供的各種植物表達系統(tǒng)中的任何系統(tǒng)(包括本文中所述的病毒植物表達系統(tǒng))的HPV抗原純化和HPV抗原產(chǎn)生可承受的規(guī)模擴大。在本發(fā)明的許多實施例中，希望分離疫苗抗原產(chǎn)物。在本發(fā)明的蛋白質(zhì)是從植物組織或其部分產(chǎn)生，例如從表達它們的根、根細胞、植物、植物細胞產(chǎn)生的情況下，可使用本文中進一步詳述的方法或所屬領(lǐng)域中已知的任何可適用方法來進行從植物物質(zhì)的部分或完整分離的任何分離。在希望從表達它的部分或全部植物細胞或組織分離表達產(chǎn)物的情況下，可使用任何可用的純化技術(shù)。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員熟悉廣泛范圍的分餾和分離程序(參見例如，斯科普斯(Scopes)等人，蛋白質(zhì)純化原理和實施(尸ra的'"P"'wc—j朋dPra"!'ce)，第3—版，杰森(Janson)等人，1993;蛋白質(zhì)純4七原理，高分窮辛方》去禾口/應(yīng)用(Prafe!'"尸K〃yi'ca"ow..Pn'"dpZes,//z'g/z/eso/w"'owMeWoA,a""pp/!'ca"固)，Wiley-VCH,1998;斯普林-維拉(Springer-Verlag),紐約，1993;禾口洛(Roe),蛋白質(zhì)純化技術(shù)(尸rafe/"Amy!'ca"o"rec/m々M^)，牛津大學(xué)出版社(OxfordUniversityPress)，2001;每篇參考文獻以引用的方式并入本文)。常常希望產(chǎn)物的純度超過約50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。關(guān)于適用于從植物組織或植物液純化物質(zhì)的某些方法的討論，參見例如美國專利6,740,740和6,841,659。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員也應(yīng)了解，獲得期望疫苗產(chǎn)物的方法是通過提取?？蓪χ参镂镔|(zhì)(例如根、葉等)進行提取以從殘余生物質(zhì)移出所希望的產(chǎn)物，從而增加產(chǎn)物的濃度和純度。植物可在緩沖溶液中提取。舉例而言，可以一比一的重量比率將植物物質(zhì)轉(zhuǎn)移到一定量的己用例如磷酸鹽緩沖液緩沖的冰冷水中?？砂葱枰砑拥鞍酌敢种苿?。植物物質(zhì)可通過劇烈摻合或研磨同時懸浮于緩沖溶液中來破壞，并且通過過濾或離心去除所提取的生物質(zhì)。溶液中帶有的產(chǎn)物可通過另外的步驟純化或通過冷凍干燥或沉淀轉(zhuǎn)換成干燥粉末。提取可通過加壓(pressing)進行。植物或根可通過在壓力機中加壓或當其通過間隔很近的輥子時碾碎來提取。從碾碎的植物或根榨出的液體根據(jù)所屬領(lǐng)域中熟知的方法收集和加工。通過加壓進行的提取可釋放更濃的產(chǎn)物。但是，產(chǎn)物的總產(chǎn)量可能低于在溶液中提取時的產(chǎn)物。;^欲本發(fā)明提供用于治療用途的藥用抗原蛋白質(zhì)，例如作為用于HPV感染的治療性和/或預(yù)防性治療的疫苗呈活性的抗原蛋白質(zhì)或其免疫原性部分。另外，本發(fā)明提供獸醫(yī)學(xué)用途，因為所述抗原蛋白質(zhì)或其免疫原性部分在獸醫(yī)學(xué)應(yīng)用中為活性的。在某些實施例中，抗原可通過本發(fā)明的植物或其部分(例如根、細胞、芽、細胞系、植物等)來產(chǎn)生。在某些實施例中，所提供的HPV抗原在植物、植物細胞和/或植物組織(例如，芽、萌芽秧苗、根、根培養(yǎng)物、克隆細胞、克隆細胞系、克隆植物等)中表達，并且可直接從植物使用或在用于投與個體的制備中被部分地純化或純化。本發(fā)明提供表達抗原的植物、植物細胞和植物組織，當投藥到有需要的個體時，所述抗原維持醫(yī)藥活性。在某些實施例中，個體包括脊椎動物(例如哺乳動物，比如人類)。根據(jù)本發(fā)明，個體包括獸醫(yī)學(xué)個體，例如牛、綿羊、犬、貓等。在某些方面中，可食用植物或其部分(例如芽、根)以治療有效量經(jīng)口投與個體。在一些方面中，如本文中所述，在醫(yī)藥制劑中提供一種或一種以上HPV抗原。本發(fā)明的疫苗組合物包含一種或一種以上HPV抗原。在某些實施例中，本發(fā)明的至少2種HPV抗原包括在所投與的疫苗組合物中。根據(jù)本發(fā)明，用疫苗抗原治療個體旨在引發(fā)生理效應(yīng)。疫苗蛋白質(zhì)可具有針對病癥或疾病的治愈治療或減輕性質(zhì)，并且可通過投與來改善、減輕、緩解、延遲疾病或病癥的發(fā)作，逆轉(zhuǎn)或減輕疾病或病癥的癥狀或嚴重性。疫苗抗原可具有預(yù)防性質(zhì)并且可用以預(yù)防或延遲疾病的發(fā)作或當所述疾病、病癥或病理性病狀出現(xiàn)時，減輕其嚴重性。通過用根據(jù)本發(fā)明的抗原治療個體而引發(fā)的生理效應(yīng)可包括有效的免疫反應(yīng)以便阻礙被生物體感染。在一些實施例中，本發(fā)明的疫苗通過口服和/或粘膜途徑來傳遞?？诜?或粘膜傳遞具有預(yù)防粘膜組織感染的潛力，而粘膜組織是許多病原體感染的主要入口?？诜?或粘膜傳遞可預(yù)先起動(prime)全身性免疫反應(yīng)。在用于抗原口服投藥的異源表達系統(tǒng)的開發(fā)方面已取得重大進展，所述抗原刺激粘膜免疫系統(tǒng)并且可預(yù)先起動全身性免疫性。但是，先前對傳遞口服疫苗所作的工作已證明為達到功效需要相當大量的抗原。因此，大量目標抗原的經(jīng)濟性生產(chǎn)是產(chǎn)生有效口服疫苗的先決條件。表達包括熱穩(wěn)定抗原在內(nèi)的抗原的植物開發(fā)代表一種針對所述困難而言更現(xiàn)實的方法。本發(fā)明的醫(yī)藥制劑可用多種方式投與個體，例如，經(jīng)口、經(jīng)鼻、經(jīng)腸、不經(jīng)腸、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)、經(jīng)直腸、經(jīng)陰道、局部、經(jīng)眼、經(jīng)肺或通過接觸施用。在某些實施例中，在植物或其部分中表達的HPV抗原，通過將植物直接投與個體而經(jīng)口投與個體。在一些方面中，提取和/或純化在植物或其部分中表達的疫苗蛋白質(zhì)，并且用于制備醫(yī)藥組合物?？赡芟Ｍ{(diào)配所述分離產(chǎn)物用于其預(yù)期用途(例如，調(diào)配為醫(yī)藥劑、疫苗組合物等)。在一些實施例中，希望將產(chǎn)物與表達它們的部分或全部植物組織一起調(diào)配。在想要將產(chǎn)物連同植物物質(zhì)一起調(diào)配的情況下，常常希望利用對相應(yīng)受體(例如人類或其他動物)無毒性的植物。可根據(jù)所屬領(lǐng)域中已知的技術(shù)簡單地收獲并加工相應(yīng)植物組織(例如細胞、根、葉)，同時應(yīng)考慮維持所表達產(chǎn)物的活性。在本發(fā)明的某些實施例中，希望在可食用植物中(以及具體而言，在植物的可食用部分中)表達疫苗抗原以便物質(zhì)可隨后被食用。舉例而言，在疫苗抗原被口服傳遞后(當經(jīng)適當調(diào)配時)為活性的情況下，可能希望在可食用植物部分中產(chǎn)生抗原蛋白質(zhì)，并且將所表達的疫苗抗原連同表達蛋白質(zhì)的部分或全部植物物質(zhì)一起調(diào)配來用于口服傳遞。所提供的疫苗抗原可根據(jù)已知技術(shù)來調(diào)配。例如，可將有效量的疫苗產(chǎn)物連同一種或一種以上有機或無機、液體或固體、醫(yī)藥學(xué)上適合的載劑物質(zhì)一起調(diào)配。根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的疫苗抗原可以采用多種劑型，例如片劑、膠囊、藥片(troch)、分散液、懸浮液、溶液、膠囊錠(gelcap)、丸劑、囊片、乳膏、軟膏、氣霧劑、藥粉包、液體溶液、溶齊U、稀釋劑、表面活性劑、等滲劑、稠化劑或乳化劑、防腐劑和固體結(jié)合劑，只要蛋白質(zhì)的生物活性不被所述劑型破壞即可。一般而言，組合物可包含各種不同的醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑、佐劑或媒劑的任何物質(zhì)或一種或一種以上的所述載劑、佐劑或媒劑的組合。如本文中所使用，術(shù)語"醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑、佐劑或媒劑"包括與醫(yī)藥投藥相容的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細菌和抗真菌劑、等滲劑和延遲吸收的試劑，等?？捎米麽t(yī)藥學(xué)上可接受的載劑的物質(zhì)包括(但不限于)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；纖維素和其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和乙酸纖維素；粉末黃芪膠；麥芽；明膠；滑石；賦形劑，如可可脂和栓劑蠟油劑，如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和黃豆油；二醇，如丙二醇；酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；瓊脂；緩沖劑，如氫氧化鎂和氫氧化鋁；海藻酸；無熱原質(zhì)水；等滲鹽水；林格氏溶液(Ringer'ssolution);乙醇和磷酸鹽緩沖液，以及其他無毒可相容潤滑劑，如月桂基硫酸鈉和硬脂酸鎂，以及根據(jù)調(diào)配物師的判斷可存在于組合物中的著色劑、釋放劑、涂布劑、甜味劑、調(diào)味劑和芳香劑、防腐劑和抗氧化劑(參見雷氏藥學(xué)大全(Remington'sPharmaceuticalSciences),第15版，E.W.馬丁(E.W.Martin),麥克出版公司(MackPublishingCo.)，賓夕法尼亞州伊斯頓(Easton，PA),1975)。舉例而言，可借助于常規(guī)混合?；且峦柚圃?、溶解、冷凍干燥或相似方法，將疫苗抗原產(chǎn)物提供為醫(yī)藥組合物。附加的疫苗組分本發(fā)明的疫苗可另外包括當投與個體時增強疫苗的免疫原性的任何適合佐劑。舉例而言，所述佐劑可包括(而不限于)皂樹皮(2M"Za力^po"an'a,QS)的提取物，包括食物級QS的純化分餾物(purifiedsubfraction)，如QuilA和QS-21，明礬、氫氧化鋁、磷酸鋁、MF59、Malp2、弗氏不完全佐劑(incompleteFreund'sadjuvant);弗氏完全佐齊IJ;3-0-脫酰單磷酸類脂A(3De-O-acylatedmonophosphoryllipidA，3D-MPL)。其他的佐劑可包括免疫調(diào)節(jié)寡核苷酸，例如，WO96/02555中揭示的未甲基化的CpG序列。在提供為TH1細胞反應(yīng)的優(yōu)先刺激物的佐劑時，涵蓋如上文所提及的那些佐劑的不同佐劑的組合。舉例而言，QS21可連同3D-MPL—起調(diào)配。QS21:3D-MPL的比率通常大約為1:10到10:1;1:5到5:1;并且常常大體上是l:l。在一些實施例中，達到最佳協(xié)同作用的范圍是2.5:1到1:1的3D-MPL:QS21。適用于人類疫苗調(diào)配物的純化QS提取物的劑量為每公斤體重0.01mg到10mg。應(yīng)注意，某些熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)(例如地衣多糖酶)自身可以顯示免疫反應(yīng)強化活性，以致所述蛋白質(zhì)無論是與HPV抗原形成融合物還是單獨使用都可視為使用了佐劑。因此，本發(fā)明的疫苗組合物可另外包含一種或一種以上的佐劑。某些疫苗組合物可包含兩種或兩種以上的佐劑。另外，取決于調(diào)配物和投藥途徑，可能在特定調(diào)配物和/或組合中需要某些佐劑。在一些情況下，可能希望通過減慢經(jīng)皮下或肌肉內(nèi)注射的疫苗產(chǎn)物(例如蛋白質(zhì))的一種或一種以上組分的吸收來延長本發(fā)明疫苗的作用。這可通過使用水溶性不好的結(jié)晶或非晶形物質(zhì)的液體懸浮液來達成。產(chǎn)物的吸收速率則取決于其溶解速率，而溶解速率又會取決于尺寸和形式?；蛘呋蛄硗猓唤?jīng)腸投與的產(chǎn)物的延遲吸收通過將產(chǎn)物溶解或懸浮在油媒劑中來完成。儲積注射形式是通過在如聚丙交酯-聚乙交酯等生物可降解聚合物中形成蛋白質(zhì)的微膠囊基質(zhì)來制得?？筛鶕?jù)產(chǎn)物與聚合物的比率和所使用特定聚合物的性質(zhì)來控制釋放速率。生物可降解聚合物的實例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。儲積注射調(diào)配物可通過將產(chǎn)物包埋在與身體組織相容的脂質(zhì)體或微乳液中來制備。替代性聚合物傳遞媒劑可用于口服調(diào)配物。舉例而言，可使用可生物降解、可生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸等?？乖蚱涿庖咴圆糠挚衫缗c聚合物傳遞媒劑組合調(diào)配為微粒。疫苗抗原的經(jīng)腸投與制劑可以固體、半固體、懸浮液或乳液形式引入，并且可與任何醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑如水、懸浮劑和乳化劑混配?？乖山柚诒没虺掷m(xù)釋放形式投與一尤其當作為預(yù)防措施投與時，以便預(yù)防疾病在個體中發(fā)展或改善或延遲已形成的疾病。補充性活性化合物，例如針對待治療的疾病或臨床病狀具有獨立活性的化合物，或增強本發(fā)明化合物的活性的化合物，可被并入組合物中或與組合物一起投與。可使用調(diào)味劑和著色劑。本發(fā)明的疫苗產(chǎn)物(視情況連同植物組織)特別適合作為醫(yī)藥組合物口服投藥?？墒褂每诜后w調(diào)配物，且其可特別適用于小兒科群體。所收獲的植物物質(zhì)可以各種方式(例如風(fēng)干、冷凍干燥、提取等)中的任何一種加工，這取決于期望治療產(chǎn)物的性質(zhì)和其期望形式。如上所述的這些組合物可單獨經(jīng)口攝取或連同食物或飼料或飲料一起攝取。用于口服投藥的組合物包括植物；植物提取物；和從受感染植物純化的蛋白質(zhì)，其是以干燥粉末、食料、水性或非水性溶劑、懸浮液或乳液的形式提供。非水性溶劑的實例為丙二醇、聚乙二醇、植物油、魚油和可注射有機酯。水性載劑包括水、水-醇溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)的不經(jīng)腸媒劑(bufferedmedialparenteralvehicle),包括氯化鈉溶液、林格氏右旋糖溶液、右旋糖加氯化鈉溶液、含有乳糖或不揮發(fā)油的林格氏溶液。干燥粉末的實例包括已經(jīng)被干燥(例如冷凍干燥、風(fēng)干或噴霧干燥)的任何植物生物質(zhì)。舉例而言，植物可通過放入約120華氏度的市售空氣干燥器中直到生物質(zhì)含有小于5重量％水分來風(fēng)干。干燥后的植物可進一步加工為塊體固體，或進一步通過研磨加工成期望篩目尺寸的粉末?；蛘呋蛄硗?，冷凍干燥可用于易受風(fēng)干破壞的產(chǎn)物。產(chǎn)物可通過放入真空干燥器中并在真空下干燥冷凍直到生物質(zhì)含有小于約5重量％水分來冷凍干燥。干燥物質(zhì)可如本文所述進行進一步加工。植物衍生物質(zhì)可作為草本制劑投與或者與一種或一種以上的草本制劑一起投與。適用草本制劑包括液體和固體草本制劑。草本制劑的一些實例包括酊劑，提取物(例如，水性提取物、醇提取物)，煎劑，干燥制劑(例如風(fēng)干、噴霧干燥、冷凍或冷凍干燥)，散劑(例如冷凍千燥粉末)和液體。草本制劑可提供于任何標準傳遞媒劑中，例如膠囊、片劑、栓劑、液體劑型等。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，各種調(diào)配物和傳遞草本制劑的模態(tài)可應(yīng)用于本發(fā)明。本發(fā)明的根系、細胞系、植物、提取物、粉末、干燥制劑和純化蛋白質(zhì)或核酸產(chǎn)物等可呈含或不含一種或一種以上如上所述的賦形劑的封裝形式。如片劑、糖衣丸、膠囊、丸劑和顆粒劑等固體劑型可用包衣和殼層(如腸溶衣)、釋放控制包衣和醫(yī)藥調(diào)配領(lǐng)域中熟知的其他包衣來制備。在所述固體劑型中，活性劑可與至少一種蔗糖、乳糖或淀粉等惰性稀釋劑混合。所述劑型可與正常實施中一樣，包含除惰性稀釋劑以外的附加物質(zhì)，例如壓片潤滑劑和其他壓片助劑，如硬脂酸鎂和微晶纖維素。在膠囊、片劑和丸劑的狀況下，劑型可包含緩沖劑。劑型可視情況含有遮光劑，并且可具有僅在腸道的某一部分中和/或以延遲方式釋放活性成分的組合物?？墒褂玫陌窠M合物的實例包括聚合物質(zhì)和蠟。在一些方法中，表達根據(jù)本發(fā)明的HPV抗原的植物或其部分或其生物質(zhì)是作為醫(yī)療食物經(jīng)口投與。這樣的可食用組合物一般通過生食(raw)來消耗(固體形式)或通過飲用來消耗(液體形式)。植物物質(zhì)可不經(jīng)先前的加工步驟直接攝取或在最小程度的烹調(diào)制備后攝取。舉例而言，疫苗蛋白質(zhì)可在可直接食用的芽中表達。例如，疫苗抗原在苜蓿芽、綠豆芽或菠菜或萵苣葉芽等中表達。在一實施例中，植物生物質(zhì)可經(jīng)過加工并且攝取加工步驟后所回收的物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明適用的加工方法是食品或詞料工業(yè)中普遍使用的方法。所述方法的最終產(chǎn)物通常包括相當大量的經(jīng)表達抗原并且可被方便地食用或飲用。最終產(chǎn)物可與其他食物或飼料形式，如鹽、載劑、增香劑、抗生素等一起混合，并且以固體、半固體、懸浮液、乳液或液體形式來消耗。所述方法可包括保鮮步驟，例如巴氏滅菌法、烹煮或添加保鮮劑和防腐劑。任何植物都可在本發(fā)明中使用并經(jīng)過加工來產(chǎn)生可食用或可飲用的植物物質(zhì)。HPV抗原在植物衍生制劑中的量可通過所屬領(lǐng)域中標準的方法來測試，例如，凝膠電泳、ELISA或免疫印跡分析，使用對產(chǎn)物特異的探針或抗體。所述測定可用以標準化被攝取的疫苗抗原蛋白質(zhì)的量。舉例而言，可測定并調(diào)節(jié)疫苗抗原的量，例如，通過將具有不同含量的產(chǎn)物的產(chǎn)物批次混合以使打算通過飲用或食用來攝取一劑的物質(zhì)的量可被標準化。但是，本發(fā)明的封閉的、可調(diào)控環(huán)境應(yīng)當使對進行所述標準化程序的需要最小化。在植物細胞或組織中產(chǎn)生并且被個體食用的疫苗蛋白質(zhì)可優(yōu)選通過消化系統(tǒng)吸收。攝取僅被最低程度加工的植物組織的一個優(yōu)點是提供蛋白質(zhì)在植物細胞中的封裝或螯合。因此，產(chǎn)物可在達到內(nèi)臟或腸之前受到至少一些保護以避免在上消化道中消化，并且較高比例的活性產(chǎn)物將可用于吸收。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可治療性或預(yù)防性投與。組合物可用以治療或預(yù)防疾病。舉例而言，可治療遭受疾病或有發(fā)展HPV感染風(fēng)險的任何個體。應(yīng)了解，在尚未被診斷出具有疾病的任何癥狀的情況下，個體可被視為有發(fā)展疾病的風(fēng)險。舉例而言，如果已知個體已暴露于HPV感染，或?qū)⒁┞队贖PV感染，處于具有暴露于HPV感染的相對高風(fēng)險的情況之下，那么個體將被視為有發(fā)展疾病的風(fēng)險。類似地，如果個體的家庭成員、朋友或配偶巳被診斷具有HPV感染，那么所述個體可視為有發(fā)展疾病的風(fēng)險。用于口服投藥的液體劑型包括(但不限于)醫(yī)藥學(xué)上可接受的乳液、微乳液、溶液、懸浮液、糖漿和酏劑。除活性劑外，液體劑型還可含有通常用于所屬領(lǐng)域中的惰性稀釋劑，如水或其他溶劑，增溶劑和乳化劑，如乙醇，異丙醇，碳酸乙酯，乙酸乙酯，芐醇，苯甲酸芐酯，丙二醇，1,3-丁二醇，二甲基甲酰胺，油劑(尤其是棉籽油、落花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)，甘油，四氫糠醇，聚乙二醇和山梨聚糖的脂肪酸酯，和其混合物。除惰性稀釋劑外，口服組合物還可包括佐劑，如潤濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、調(diào)味劑和芳香劑。用于直腸或陰道投藥的組合物可為栓劑或保留灌腸劑，其可通過將本發(fā)明的組合物與適用無刺激性賦形劑或載劑，如可可脂、聚乙二醇或栓劑蠟混合來制備，所述賦形劑或載劑在環(huán)境溫度下是固體但在體溫下是液體并且因此在直腸或陰道腔中熔融并釋放活性蛋白質(zhì)。用于本發(fā)明疫苗組合物的局部、透粘膜或透皮投藥的劑型包括軟膏、糊劑、乳膏、洗劑、凝膠、粉末、溶液、噴霧、吸入劑或貼片。將活性劑或其制劑在無菌條件下與醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑和任何所需防腐劑或可能需要的緩沖劑一起混合。對透粘膜或透皮投藥來說，可將適于打算穿透的屏障的穿透劑用于調(diào)配物中。所述穿透劑通常在所屬領(lǐng)域中已知，并且對透粘膜投藥來說，包括例如，清潔劑、膽汁鹽和夫西地酸(fusidicacid)衍生物。透粘膜投藥可通過使用鼻噴霧或栓劑來完成。對透皮投藥來說，可將抗原或其免疫原性部分調(diào)配成通常在所屬領(lǐng)域中已知的軟膏、油膏劑、凝膠或乳膏。眼用調(diào)配物、滴耳劑和滴眼劑涵蓋在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。另外，本發(fā)明涵蓋使用透皮貼片，其具有向身體提供疫苗蛋白質(zhì)受控傳遞的附加優(yōu)點。所述劑型可通過將疫苗產(chǎn)物懸浮或分配在適當介質(zhì)中來制得。吸收增強劑可用以增加疫苗蛋白質(zhì)穿過皮膚的通量。速率可通過提供速率控制膜或通過將疫苗蛋白質(zhì)分散在聚合物基質(zhì)或凝膠中來控制。本發(fā)明的組合物以達到期望結(jié)果所必需的量和時間來投與。在本發(fā)明的某些實施例中，醫(yī)藥組合物的"治療有效量"是對治療、減弱或預(yù)防個體的疾病有效的量。因此，如本文中所使用的"對治療、減弱或預(yù)防疾病有效的量"指的是醫(yī)藥組合物治療、減弱或預(yù)防任何個體的疾病的無毒但足夠的量。舉例而言，"治療有效量"可以是治療、減弱或預(yù)防感染(例如病毒感染、HPV感染)等的量。所需要的精確量可根據(jù)不同個體而變化，其取決于個體的物種、年齡和一般健康狀態(tài)，疾病的階段，特定醫(yī)藥混合物，其投藥模式，等。本發(fā)明的炭疽(anthrax)抗原，包括表達抗原的植物和/或其制劑，可以便于投藥和提供劑量均一性的劑量單元形式來調(diào)配。如本文中所使用的表達"劑量單元形式"指的是適于待治療患者的疫苗組合物的物理上離散的單元。然而應(yīng)了解，本發(fā)明組合物總的每日用法由主治醫(yī)師在合理的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)決定。用于任何特定患者或生物體的具體治療有效劑量取決于各種因素，包括感染的嚴重性或感染的風(fēng)險；所使用特定化合物的活性；所使用的特定組合物；患者的年齡、體重、一般健康狀態(tài)、性別，患者的飲食，患者的藥物動力學(xué)狀況，投藥時間，投藥途徑和所使用特定化合物的排出速率；治療持續(xù)時間；與所使用疫苗組合物組合或同時使用的藥物；和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中熟知的類似因素。應(yīng)了解，本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可用于組合療法(例如組合疫苗療法)，也就是說，醫(yī)藥組合物可與一種或一種以上其他期望疫苗接種程序同時，在其之前或在其之后投與。采用組合方案的療法(例如，疫苗、HPV感染的治療性治療)的特定組合應(yīng)當考慮期望治療劑和/或程序與打算達到的期望治療效果的相容性。應(yīng)了解，所使用的療法和/或疫苗可對相同病癥達到期望效果(例如，本發(fā)明的化合物可與另一HPV疫苗同時投與)，或者它們可達到不同效果。在某些實施例中，疫苗組合物包含至少2種HPV抗原。舉例而言，某些疫苗組合物可包含至少2種本發(fā)明的HPV抗原(例如，本發(fā)明的含有HPV16的E7域和HPV18的E7域的抗原)。在一些方面中，所述組合疫苗可包括一種包含HPV抗原的熱穩(wěn)定融合蛋白質(zhì)；在一些方面中，提供兩種或兩種以上包含HPV抗原的熱穩(wěn)定融合蛋白質(zhì)。在某些實施例中，多種抗原將得自相同菌株的HPV，并且可包括得自不同蛋白質(zhì)的抗原。在一些實施例中，多種抗原將得自相同菌株的HPV并且可包括得自相同蛋白質(zhì)(例如，相同蛋白質(zhì)的不同域)的抗原。在某些實施例中，多種抗原將得自不同菌株的HPV，并且可包括得自不同蛋白質(zhì)的抗原。其他組合涵蓋使用得自不同菌株和相同蛋白質(zhì)的多種抗原。涵蓋上述示范性組合的變化和/或組合。舉例而言，在一些實施例中，將來自不同菌株的1個E7域、2個E7域或3個E7域組合來構(gòu)成本發(fā)明的疫苗組合物。在利用組合疫苗的情況下，應(yīng)了解，HPV抗原的任何組合可用于所述組合。試劑盒在一態(tài)樣中，本發(fā)明提供醫(yī)藥包裝或試劑盒，其在一個或一個以上容器中包括產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的HPV抗原的活萌芽秧苗、克隆實體或植物，或含有疫苗的制劑、提取物或醫(yī)藥組合物，并且填充了一種或一種以上所述的本發(fā)明醫(yī)藥組合物成分。在某些實施例中，醫(yī)藥包裝或試劑盒包括另外的被批準的治療劑(例如HPV抗原、HPV疫苗)以用作組合療法。所述容器視情況附有關(guān)于管理醫(yī)藥產(chǎn)品的制造、使用或銷售的政府機構(gòu)指定形式的公告，所述公告反映政府機構(gòu)關(guān)于用于人類投藥的制造、使用或銷售的批準情況。提供包括治療試劑的試劑盒。作為一個非限制性實例，HPV疫苗可提供為口服調(diào)配物并作為療法投與?；蛘呋蛄硗猓琀PV疫苗可提供在可注射調(diào)配物中用于投藥。醫(yī)藥劑量或說明書因此可提供在試劑盒中用于投與遭受HPV感染或有HPV感染風(fēng)險的個體。隨后的代表性實例旨在幫助說明本發(fā)明，而不打算，也不應(yīng)被解釋為限制本發(fā)明的范圍。實際上，對所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，本發(fā)明的各種修改和除本文中顯示和描述的那些實施例以外的許多其他實施例，將從本文的全部內(nèi)容，包括隨后的實例和對本文中引用的科學(xué)和專利文獻的參考而變得明顯。以下實例含有適于在各種實施例和其等效物中實施本發(fā)明的信息、范例和指導(dǎo)。范例實賄,娛遂茇滯溝貧沐游產(chǎn)全從人類乳頭瘤病毒產(chǎn)生抗原序列出于安全性考慮，使用Quikchange定位突變試劑盒(斯曲塔基因公司(Stratagene))，使被克隆到pQE30(pQE30-E7)中BamHI/Pstl限制位點之間的HPV16E7致癌基因(K02718，西多夫(Seedorf)等人，1985,病毒學(xué)(Virology),145:181)突變，以產(chǎn)生質(zhì)粒pQE30-E7GGG。如為引入突變所設(shè)計的正向和反向"快速多核苷酸液相色譜法"純化引物的粗體寡核苷酸所指示，分別將3個點突變引入E7基因的pRB結(jié)合位點中5,-CAACAAgAgACAACTgg,TCTCTACgs，gTTATgg76gCAATTAAATgACAgC-Cys24>GlyGlu265，-gCTgTCATTTAATTgCCCATAACCgTAgAgACCAgTTgTCTCTggTTgC-3，Glu2^5^1ycy's24義GiyAsp21^Gly所引入的突變產(chǎn)生E7蛋白質(zhì)序列中3個氨基酸的取代D21G(Asp21>Gly)、C24G(Cys24>Gly)、E26G(Glu26〉Gly)，消除了E7蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化潛力。表示為E7GGG的所得基因的真實性通過測序確認。HPV16E7(K02718，西多夫(Seedorf)等人，同上)(SEQIDNO,:l)ATGCATGGAGATACACCTACATTGCATGAATATATGTTAGATTTGCAACCAGAGACAACTGATCTCTACTGTTATGAGCAATTAAATGACAGCTCAGAGGAGGAGGATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACCGGACAGAGCCCATTACAATATTCTAACCTTTTGTTGCAAGTGTGACTCTACGCTTCGGTTGTGCGTACAAAGCACACACGTAGACATTCGTACTTTGGAAGACCTGTTAATGGGCACACTAGGAATTGTGTGCCCCATCTGTTCTCAGAAACCATAAE7(SEQIDNO.:2):MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYN1VTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGrVCPICSQKPHPV16E7GGG(SEQIDNO.:3):Asp21>Gly>GlyatgcatggagatacacctacattgcatgaatatatgttagatttgcaaccagagacaactggtctctacggttatgggcaattaaatgacagctcagaggaggaggatgaaatagatggtccagctggacaagcagaaccggacagagcccattacaatattgtaaccttttgttgcaagtgtgactctacgcttcggttgtgcgtacaaagcacacacgtagacattcgtactttggaagacctgttaatgggcacactaggaattgtgtgccccatctgttctcagaaaccataaE7GG(SEQIDNO.:4):mhgdtptlheymldlqpettglygygqlndsseeedeidgpagqaepdrahynivtfcckcdstlrlcvqsthvdirtledllmgtlgivcpicsqkp熱穩(wěn)定載體構(gòu)筑體的產(chǎn)生全長天然熱纖梭菌地衣多糖酶LicB依次由前導(dǎo)肽(Lp)、N末端部分(A)、表面環(huán)(1)、C末端部分(C)、Pro-Thr盒和纖維小體結(jié)合域(C-BD)組成。我們將Lp、Pro-Thr盒和C-BD編碼序列從LicB編碼基因去除，循環(huán)排列(circularlypermutated)分子以顛倒N末端和C末端(穆斯曲克(Musiychuk)等人，2007，流感和其他呼吸道病毒(InfluenzaandOtherRespiratoryViruses),1:1)，并且在新的N末端和C末端以及在表面環(huán)(1)中并入用于克隆目標序列的獨特限制性核酸內(nèi)切酶位點。驗證了所得工程改造載體分子序列并且指定為LicKM。SE(3IDNO.:5:ggatccttaattaaaatgggaggttcttatccatataagtctggtgagtatagaactaagtctrtctttggatatggttattatgaagttaggatgaaggctgcaaagaacgttggaattgtttcttctttctttacttatactggaccatctgataacaacccatgggatgagattgatattgagtttcttggaaaggatactactaaggttcaattcaactggtataagaatggtgttggtggaaacgagtatcttcataaccttggatttgatgcttctcaagattttcatacttatggttttgagtggagaccagattatattgatttttatgttgatggaaagaaggtttatagaggtactagaaacattccagttactcctggaaagattatgatgaatctttggccaggaattggtgttgatgaatggcttggtagatatgatggaagaactccacttcaagctgagtatgagtatgttaagtattatccaaacggtagatctgaattcaagcttgttgttaatactccatttgttgctgttttctctaactttgattcttctcaatgggaaaaggctgattgggctaacggttctgtttttaactgtgtttggaagccatctcXagttactttttctaacggaaagatgattcttactttggatagagagtatgtcgaccatcatcatcatcatcattgactcgagctcSE(3IDNO.:6:MGGSYPYKSGEYRTKSFFGYGYYEVRMKAAKNVGIVSSFFTYTGPSDNNPWDEIDIEFLGKDTTKVQFNWYKNGVGGNEYLHNLGFDASQDFHTYGFEWRPDYIDFYVDGKKVYRGTRNIPVTPGKIMMNLWPGIGVDEWLGRYDGRTPLQAEYEYVKYYPNGRSEFKLWNTPFVAVFSNFDSSQWEKADWANGSVFNCVWKPSQVTFSNGKMILTLDREYVDH朋HHH對于某些構(gòu)筑體，我們將LicKM的N末端和C末端的PRla信號肽和KDEL序列工程改造。這些構(gòu)筑體的核酸和氨基酸序列如SEQEDNO.:7和SEQIDNO.:8所示。SEQIDNO.:7:GGATCCTTAATTAAAATGGGATTTGTTCTCTTTTCACAATTGCCTTCATTTCTTCTTGTCTCTACACTTCTCTTATTCCTAGTAATATCCCACTCTTGCCGTGCCCAAAATGGAGGTTCTTATCCATATAAGTCTGGTGAGTATAGAACTAAGTCTTTCTTTGGATATGGTTATTATGAAGTTAGGATGAAGGCTGCAAAGAACGTTGGAATTGTTTCTTCTTTCTTTACTTATACTpGACCATCTGATAACAACCCATGGGATGAGATTGATATTGAGTTTCTTGGAAAGGATACTACTAAGGTTCAATTCAACTGGTATAAGAATGGTGTTGGTGGAAACGAGTATCTTCATAACCTTGGATTTGATGCTTCTCAAGATTTTCATACTTATGGTITTGAGTGGAGACCAGATTATATTGATTTTTATGTTGATGGAAAGAAGGTTTATAGAGGTACTAGAAACATTCCAGTTACTCCTGGAAAGATTATGATGAATCTTTGGCCAGGAATTGGTGTTGATGAATGGCTTGGTAGATATGATGGAAGAACTCCACTTCAAGCTGAGTATGAGTATGTTAAGTATTATCCAAACGGTAGATCTGAATTCAAGCTTGTTGTTAATACTCCATTTGTTGCTGTTTTCTCTAACTTTGATTCTTCTCAATGGGAAAAGGCTGATTGGGCTAACGGTTCTGJIT11AACTGTGTTTGGAAGCCATCTCAAGTTACTTTTTCTAACGGAAAGATGATTCTTACTTTGGATAGAGAGTATGTCGACCATCATCATCATCATCATAACJGATGAACTTTGACTCGAGCTCSE(JIDNO.:8:MGFVLFSQLPSFLLVSTLLLFLVISHSCRAQNGGSYPYKSGEYRTKSFFGYGYYEVRMKAAKNVGIVSSFFTYTGPSDNNPWDEIDIEFLGKDTTKVQFNWYKNGVGGNEYLHNLGFDASQDFHTYGFEWRPDYIDFYVDGKKVYRGTRNIPVTPGKIMMNLWPGIGVDEWLGRYDGRTPLQAEYEYVKYYPNGRSEFKLVVNTPFVAVFSNFDSSQWEKADWANGSVFNCVWKPSQVTFSNGKMILTLDREYVDHHHHHHKDEL重組抗原構(gòu)筑體的產(chǎn)生我們使用得自pBR322質(zhì)粒的pET表達載體，通過工程改造來利用T7噬菌體基因10促進高水平轉(zhuǎn)錄和翻譯的特征。經(jīng)噬菌體編碼的RNA聚合酶對T7啟動子序列高度特異，而這些T7啟動子序列很少在T7噬菌體基因組以外的基因組中遇到(圖1)。已使用pET-32將E7和E7GGG構(gòu)筑體融合到修飾后的地衣多糖酶序列的巳被克隆到所述載體中的環(huán)區(qū)域中。將具有上游序列PR-1A(病原體相關(guān)蛋白質(zhì)1A)、具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(KDEL)或空泡保留序列(VAC)和下游His6標記的地衣多糖酶基因的催化結(jié)果域克隆到修飾后pET-32載體(其中已切除T7啟動子與T7終止子之間的區(qū)域)中Pacl與Xhol位點之間。如此獲得pET-PRACS-LicKM-KDEL和pET-PRACS-LicKM-VAC(圖2)。將DNA片段E7或E7GGG亞克隆到LicKM的環(huán)(1)部分中以在正確的閱讀框中得到融合物用于翻譯。詹2,鍵資微織沐游產(chǎn)全將目標抗原構(gòu)筑體LicKM-E7或LicKM-E7GGG個別地亞克隆到所選的病毒載體(pBI-D4)中。pBI-D4是一種pBIl-21衍生的二元載體，其中編碼大腸桿菌(3-D-葡糖苷酸酶(GUS)的報告基因已被"多位點接頭(polylinker)"替換，在XbaI與SacI位點之間，已克隆TMV衍生的載體(圖3)。pBI-D4是一種以TMV為基礎(chǔ)的構(gòu)筑體，其中待表達的外來基因(例如，目標抗原(例如LicKM-E7、LicKM-E7GG))替換TMV的外殼蛋白質(zhì)(CP)基因。病毒保留TMV126/183kDa基因、移動蛋白質(zhì)(MP)基因和CP亞基因組mRNA啟動子(sgp)，所述啟動子延伸到CP開放閱讀框(ORF)中。用于CP的起始密碼子己突變。病毒缺乏CP并且因此不能通過韌皮部移動遍及宿主植物。然而，病毒感染的細胞間移動保留功能性，并且病毒可以此方式緩慢移動到上部葉。多克隆位點(PacI-PmeI-AgeI-XhoI)已在sgp的末端被工程改造用于表達外來基因，并且后面接著TMV3'非翻譯區(qū)(NTR)。35S啟動子融合在病毒序列的5'端。載體序列位于pBI121的BamHI與Sacl位點之間。將錘頭狀核糖核酸酶置于病毒序列的3'端(陳(Chen)等人，2003，分子育種(Mol.Breed.),11:287)。所述構(gòu)筑體包括編碼LicKM-E7或E7GGG的序列與編碼來自煙草PR-la蛋白質(zhì)的信號肽(一種6xHis標記)的序列和ER保留錨定序列KDEL或空泡分選序列的融合(圖4)。對于含有編碼PRACS-LicKM-E7-KDEL、PRACS-LicKM-E7VAC、PRACS-LicKM-E7GGG-KDEL和PRACS-LicKM-E7GGG-VAC的序列的構(gòu)筑體，將編碼DNA作為Pacl-Xhol片段引入pBI-D4中。隨后驗證核苷酸序列，跨越最終表達構(gòu)筑體的亞克隆接點(圖5)。潛激產(chǎn)主浙拔嚴主產(chǎn)潛激游農(nóng)^f慮滲遂可利用通過農(nóng)桿菌滲透達到的農(nóng)桿菌介導(dǎo)瞬時表達系統(tǒng)(特蓬(Turpen)等人，1993，病毒學(xué)方法雜志(J.Virol.Methods),42:227)。用含有為表達LicKM-E7或LicKM-E7GGG而工程改造的病毒載體的發(fā)根農(nóng)桿菌滲透侵染煙草(M的健康葉。用構(gòu)筑體pBI-D4-PRACS-LicKM-E7-KDEL、pBI-D4-PRACS-LicKM-E7VAC、pBI-D4-PRACS-LicKM-E7GGG-KDEL禾BpBI-D4-PRACS-LicKM-E7GGG-VAC轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌菌株A4(ATCC43057)或根癌農(nóng)桿菌(GV3103)。使農(nóng)桿菌培養(yǎng)物生長并且按所述來誘導(dǎo)(卡皮拉(Kapila)等人，1997，植物科學(xué)(尸/a^Sc!')122:1-01)。在28°C下，在具有25(xg/ml卡那霉素(kanamycin)的YEB(5g/l牛肉膏、1g/l酵母膏、5g/1蛋白胨、5g/l蔗糖、2mMMgS04)中，使2ml起子培養(yǎng)物(starter-culture)(從新鮮菌落拾取)生長過夜。將起子培養(yǎng)物l:500稀釋到500ml具有25ng/ml卡那霉素、10mM2-(4-嗎啉基)乙烷磺酸(MES)pH5.6、2mM另外的MgS04禾卩20乙酰丁香酮(acetosyringone)的YEB中。隨后在28。C下，使稀釋后的培養(yǎng)物生長過夜，達到約1.7的O.D.600。在3,000xg下將細胞離心15分鐘并且重新懸浮于MMA培養(yǎng)基(MS鹽、10mMMESpH5.6、20g/1蔗糖、200uM乙酰丁香酮)中達到2.4的O.D.600,在室溫下保持1小時，并用于農(nóng)桿菌滲透。使用不帶針的一次性注射器，用農(nóng)桿菌懸浮液注射侵染煙草葉。滲透后6天，收獲所滲透的葉。克隆根和克隆根系產(chǎn)生將矮牽牛(Pemw'flAy&rWa)葉在0.1%NH4C1中滅菌并在無菌dH20中洗滌6次，獲得1cmxlcm大的葉外植體。用刀輕微損壞外植體的abacsial側(cè)，并且與含有pBID4-LicKM-E7-KDEL或pBID4-LicKM-E7GGG-KDEL的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株A4共同培養(yǎng)。用農(nóng)桿菌過夜培養(yǎng)物(O.D.600nm=0.8-1)將外植體培養(yǎng)2分鐘，所述農(nóng)桿菌過夜培養(yǎng)物在4'C下以3000rpm離心10'，并在20mM乙酰丁香酮的存在下重新懸浮于MMA培養(yǎng)基中，達到最終O.D.600nm=0.5。培養(yǎng)結(jié)束時，在無菌紙上干燥外植體并且在1%葡萄糖和20mM乙酰丁香酮的存在下轉(zhuǎn)移到0.8%瓊脂MS培養(yǎng)板上。將培養(yǎng)板用Parafilm封口并在室溫下保持2天。隨后在500mg/1頭孢噻肟(Cefotaxim，Cif)、100mg/l特美汀(Timentin，Tim)和25mg/1卡那霉素存在下，將外植體轉(zhuǎn)移到MS培養(yǎng)板上。5周后，從以含有pBID4-LicKM-E7-KDEL和pBID4-LicKM-E7GGG-KDEL構(gòu)筑體的發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的矮牽牛葉外植體獲得轉(zhuǎn)基因根產(chǎn)生。從用pBID4-LicKM-E7-KDEL構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化獲得比用pBID4-LicKM-E7GGG-KDEL構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化更多的根。酶譜分析揭示，E7和E7GGG嵌合蛋白質(zhì)在所測試的矮牽牛轉(zhuǎn)基因根中表達。所述表達與地衣多糖酶活性相關(guān)。與融合蛋白質(zhì)有關(guān)的活性帶顯示比地衣多糖酶對照更高的分子量和在農(nóng)桿菌感染后由植物表達的產(chǎn)物的相同分子量，確認完整融合產(chǎn)物的存在。轉(zhuǎn)化后，可切下發(fā)根并在固體、不含激素的K3培養(yǎng)基上放成一行。4到6天后，將生長最活躍的根分離并且轉(zhuǎn)移到半固體(0.4%瓊脂)K3培養(yǎng)基。在22'C下，在黑暗中培養(yǎng)所選的根，并且每6周對克隆系進行分離和傳代培養(yǎng)?？赏ㄟ^評估地衣多糖酶活性分析和免疫印跡分析來篩選根和/或克隆系是否存在目標抗原表達。,趣資諸產(chǎn)生在感染后4、5、6和7天收獲100mg侵染煙草經(jīng)滲透葉片物質(zhì)樣品。收獲后立即分析新鮮組織的蛋白質(zhì)表達，或者在-8(TC下收集新鮮組織用于制備后續(xù)粗植物提取物或用于融合蛋白質(zhì)純化。將新鮮樣品以1/3w/v比率(1ml/0.3g的組織)重新懸浮在冷PBSlx+蛋白酶抑制劑(Roche)中并且用pestel研磨。在SDS凝膠加載緩沖液中將勻漿物煮5分鐘，并且隨后通過在4'C下以12.000rpm離心5分鐘來凈化。將上清液轉(zhuǎn)移到新試管中，并且在12呢SDS-PAGE上分離20W、1pl或其稀釋液并且通過免疫印跡分析(使用抗His6-E7小鼠或兔抗地衣多糖酶多克隆抗體)和/或通過酶譜分析進行分析，以評估指示功能性地衣多糖酶活性的水解活性。酶譜分析是一種用于測量酶活性的電泳法。這一方法基于浸漬有一種可在培養(yǎng)時期期間由溶解的酶所降解的底物的十二垸基硫酸鈉凝膠。凝膠的染色將酶活性展現(xiàn)為暗紅色背景上的白色帶。在特定范圍內(nèi)，所述帶強度可與所加載酶的量線性相關(guān)。如果融合蛋白質(zhì)中的E7蛋白質(zhì)電泳遷移率對應(yīng)于11kD的理論MW(地衣多糖酶MW為約28kD)，那么用含有質(zhì)粒pBID4-LicKM-E7-KDEL的根癌農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌滲透的侵染煙草植物中的E7表達會產(chǎn)生對應(yīng)于嵌合蛋白質(zhì)LicKM-E7-KDEL的分子量(約39kD)的特定帶(圖6A-D)。用含有pBID4-LicKM-E7-VAC質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌滲透的侵染煙草植物表達嵌合蛋白質(zhì)LicKM-E7-VAC。不過所展現(xiàn)的帶是雙重的。這一雙重帶可能代表嵌合蛋白質(zhì)內(nèi)存在適當加工的和未加工的空泡信號序列(圖6A-D)。在兩種農(nóng)桿菌菌株中，經(jīng)證明最好的表達構(gòu)筑體是擁有KDEL序列的構(gòu)筑體，其己被選用于大規(guī)模產(chǎn)生表達E7(或E7GGG)與地衣多糖酶的融合物的植物組織。對E7GGG嵌合蛋白質(zhì)可獲得相同表達結(jié)果(圖7A)。酶譜分析揭示，E7和E7GGG嵌合蛋白質(zhì)的表達與地衣多糖酶活性相關(guān)，說明上述蛋白質(zhì)在地衣多糖酶催化域的環(huán)中的融合不削弱酶活性。與融合蛋白質(zhì)有關(guān)的活性帶顯示比地衣多糖酶對照更高的分子量，確認完整融合產(chǎn)物的存在。從用含有pBID4-LicKM-E7-KDEL、pBID4-LicKM-E7GGG-KDEL的根癌農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌滲透的侵染煙草植物獲得的提取物顯示活性帶，而-VAC構(gòu)筑體產(chǎn)生較小程度的活性(圖8A-D)。E7-LicKM-KDEL和E7-LicKM-VAC融合物的表達從感染后第4天到第7天恒定在高水平并且穩(wěn)定(只是在第5天似乎稍微更高)，但是發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的表達從第6天到第7天急劇下降。我們決定在感染后第5天來收獲以避免蛋白質(zhì)降解。粗提取物中表達的嵌合蛋白質(zhì)LicKM-E7-KDEL和LicKM-E7GGG-KDEL的定量通過免疫印跡法，在手動滲透的組織上和在真空滲透的組織上進行(圖7B、C)。粗提取物中的表達的估算產(chǎn)率是至少400pg嵌合蛋白質(zhì)LicKM-E7-KDEL和LicKM-E7GGG-KDEL/g組織(相應(yīng)于100jag的E7或E7GGG蛋白質(zhì)/g組織)?？乖募兓瘜碜杂煤衟BID4-LicKM-E7-KDEL和pBID4-LicKM-E7GGG-KDEL構(gòu)筑體的重組根癌農(nóng)桿菌滲透的植物的葉勻化。具有"不含EDTA"蛋白酶抑制劑(Roche)和TritonX-1001%的提取緩沖液以3體積w/v的比率來使用，并且在4'C下?lián)u動30分鐘。通過在4'C下，以每IO分鐘9000xg離心來凈化提取物。使上清液依次通過Mira布過濾，在4'C下，以20.000xg離心30',并且通過0.45(im過濾器來過濾，之后色譜純化。通過使用IMAC("固定金屬親和色譜法"，通用醫(yī)療集團(GEHealth)),在室溫下，在重力下將經(jīng)His標記的LicKM-E7-KDEL和LicKM-E7GGG-KDEL嵌合蛋白質(zhì)純化。在非變性條件下執(zhí)行純化。將蛋白質(zhì)收集為0.5ml餾分，將其統(tǒng)一，添加20mMEDTA,在4'C下針對PBSIX透析過夜并且通過SDS-PAGE分析。或者，將餾分隨后收集在一起，添加20mMEDTA，在4°C下針對NaH2P0410mM透析過夜并且通過陰離子交換色譜法純化。對于LICKM-E7-KDELELICKM-E7GGG-KDEL純化，使用陰離子交換Q瓊脂糖速流柱(anionexchangecolumnQSepharoseFastFlow)(安發(fā)瑪西亞生物技術(shù)公司(AmershamPharmaciaBiosciences))。在12%聚丙烯酰胺凝膠上分離LICKM-E7-KDELELICKM-E7GGG-KDEL親和或離子交換純化的嵌合蛋白質(zhì)的樣品，接著庫馬斯染色。所分離的蛋白質(zhì)也通過電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并且通過免疫印跡分析(使用多克隆抗地衣多糖酶抗體和接著用抗兔IgG辣根過氧化酶結(jié)合抗體)來分析。通過免疫印跡法，使用pAba-地衣多糖酶(圖9A)和pAba-抗His6(數(shù)據(jù)未圖示)來分析在透析后收集的餾分。通過所表達的嵌合蛋白質(zhì)維持His-tag并且所純化蛋白質(zhì)的最終濃度已通過軟件評估(圖9A、B)。從40g所滲透的組織，將各6.5mg的LicKM-E7-KDEL和LicKM-E7GGG-KDEL嵌合蛋白質(zhì)純化，最終產(chǎn)率為163嵌合蛋白質(zhì)/g組織(約50pg的E7或E7GGG蛋白質(zhì)/g組織，其中E7和E7GGG蛋白質(zhì)的分子量是完整融合物的約1/4)。由純化方案得到的結(jié)果如圖9C、D中所示。^資嚴絲發(fā)秀目標抗原的產(chǎn)生和表征進行初始免疫原性研究來測定植物產(chǎn)生的LicKM-E7-KDEL和LicKM-E7GGG-KDEL是否可在腹膜內(nèi)免疫的小鼠中誘導(dǎo)特異性血清IgG,和所誘導(dǎo)的抗體是否可結(jié)合表達E7的細胞。研究如上所述使用從侵染煙草的經(jīng)農(nóng)桿菌滲透的葉富集的LicKM-E7-KDEL和LicKM-E7GGG-KDEL來純化。簡單地說，使用Quikchange定位突變試劑盒(加利福尼亞州拉賀亞的斯曲塔基因公司(Stratagene,LaJolla,CA))使HPV16E7致癌基因(GenBank登錄號K02718)突變，以得到在E7的pRB結(jié)合位點中具有以下氨基酸取代的E7GGG:D21G、C24G和E26G(賽穆爾(Smahel)等人，2001，病毒學(xué)(Virology),281:231)。將編碼HPV16E7和E7GGG的序列克隆為LicKM的順框內(nèi)部融合物以獲得LicKM-E7和LicKM-E7GGG。所述融合物包括在其N末端的煙草(M'coriaMato6acwn)PRla蛋白質(zhì)的信號序列，和6xHis標記，接著是在其C末端的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留信號KDEL。在植物表達載體pBID4中克隆融合物(穆斯曲克(Musiychuk)等人，2007，流感和其他呼吸道病毒(InfluenzaandOtherRespiratoryViruses)，1:1，待出版(inpress))以得至ljpBID4-LicKM-E7和pBID4-LicKM-E7GGG。將各構(gòu)筑體引入發(fā)根農(nóng)桿菌菌株A4中并且將所得細菌接種到侵染煙草中。滲透后5到7天，通過親和色譜法純化目標抗原。LicKM-E7和LicKM-E7GGG的估算產(chǎn)率是每公斤新鮮葉組織大致400mg并且LicKM的估算產(chǎn)率是每公斤大致1g。通過SDS-PAGE分析表征所純化的目標抗原，顯示所預(yù)測的尺寸化蛋白質(zhì)為28kD(LicKM)、39kD(LicKM-E7)禾P39kD(LicKM-E7GGG)(圖9B)。為了提供對照物質(zhì)，相似地在侵染煙草中產(chǎn)生LicKM。通過免疫印跡法，使用對LicKM和E7特異的抗體驗證植物表達的蛋白質(zhì)的抗原性。通過密度測定法，使用GeneTools軟件(英國劍橋的合成基因公司(Syngene))將樣品定量。免疫原性研究為評估植物產(chǎn)生的目標抗原的功效，用目標抗原將4到8周大的雌性C57BL/6小鼠(意大利科摩的査士睿華(CharlesRiver;Como,Italy))免疫。對于預(yù)防性研究，在第0、14、28、42和76天，在有或無QuilA佐劑(10嗎/小鼠)下，每組10只小鼠皮下接受40嗎的LicKM-E7或LicKM-E7GGG(分別相等于大致10pg的E7或E7GGG)。在各次投藥當天從動物收集血清樣品并且通過ELISA評估E7特異抗體的存在。在第49天，各組中犧牲2只動物以評估細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。隨后通過用5xl0"個表達E7的TC-1腫瘤細胞的皮下注射向所有剩余的動物攻毒(林(Lin)等人，1996，癌癥研究(CancerResearch),56:21)。為了表征免疫反應(yīng)，如先前所述(弗蘭哥尼(Franconi)等人，2002，癌癥研究(CancerResearch),62:3654),執(zhí)行ELISA、ELISPOT和自發(fā)延遲型過敏性(spontaneousdelayed-typehypersensitivity,DTH)分析。對治療性研究而言，在第O、15、30、45和60天，在有或無QuilAU0^ig/小鼠)時，用5xl(^個表達E7的TC-l腫瘤細胞將每組8到10只小鼠皮下接種，3天后用40LicKM-E7或LicKM-E7GGG皮下免疫。對預(yù)防性和治療性研究而言，在有或無QuiA時，向?qū)φ談游锿杜c10jug大腸桿菌產(chǎn)生的E7或E7GGG或植物產(chǎn)生的LicKM。腫瘤生長通過每周兩次觸診來監(jiān)視。在所述研究期間，觀察動物痛苦、腹瀉、死亡的潛在病征或可從目標抗原的投藥得到的其他臨床病征。為了測試植物產(chǎn)生的LicKM-E7和LicKM-E7GGG的免疫原性和預(yù)防潛力，用目標抗原將動物免疫。在佐劑存在下，用LicKM-E7或LicKM-E7GGG或用大腸桿菌產(chǎn)生的E7或E7GGG將所有動物免疫，建立特異IgG反應(yīng)(圖11A)，但是在缺少佐劑時，LicKM融合物不誘導(dǎo)顯著的體液反應(yīng)(圖11A)。因為CD8+細胞毒性T細胞具有在抗癌反應(yīng)中作為效應(yīng)物的公認作用，所以通過￡0501來研究￡7特異。08+T細胞的誘導(dǎo)。在佐劑存在下，在用LicKM-E7或LicKM-E7GGG疫苗接種的小鼠中檢測到高數(shù)量的分泌IFNy的細胞，而在用大腸桿菌產(chǎn)生的E7或E7GGG疫苗接種的小鼠中發(fā)現(xiàn)較低數(shù)量的E7特異CD8+細胞，而在LicKM疫苗接種的小鼠中沒有檢測到分泌IFNy的細胞(圖11B)。LicKM融合物和大腸桿菌產(chǎn)生的抗原在缺少佐劑時誘導(dǎo)低的，但明顯量的斑點，而LicKM融合物得到更高數(shù)量的ELISPOT計數(shù)(圖IIB)。已確立，HPV特異CD8+T細胞針對用表達E7的腫瘤攻毒具有保護性(弗雷澤(Frazer)，2004，自然評論(NatureReviews),4:46)。因此，通過用TC-1細胞攻毒疫苗接種的小鼠來評估通過植物產(chǎn)生的E7候選疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的抗腫瘤活性。在佐劑存在下，LicKM-E7和LicKM-E7GGG各自在100%的動物中引發(fā)腫瘤保護，而大腸桿菌產(chǎn)生的E7或E7GGG分別在807。和607。的小鼠中誘導(dǎo)保護(圖11C)。在缺少佐劑時用LicKM-E7免疫的動物的80%被保護(圖IIC)。在缺少佐劑時用LicKM-E7GGG或大腸桿菌產(chǎn)生的抗原免疫的動物的20%被保護(圖11C)。在用LicKM免疫的動物中沒有觀察到保護(圖IIC)。為測試LicKM-E7和LicKM-E7GGG針對表達HPV16E7的腫瘤的治療活性，將已用表達E7的TC-1細胞接種的動物隨后用LicKM、LicKM-E7或LicKM-E7GGG，或用大腸桿菌產(chǎn)生的E7或E7GGG來免疫。用LicKM免疫的所有動物在4周內(nèi)發(fā)展腫瘤，而用LicKM-E7或LicKM-E7GGG加佐劑來治療的那些動物在研究持續(xù)時間保留為無腫瘤的(IO周)。用大腸桿菌產(chǎn)生的E7或E7GGG加佐劑的免疫分別在40免和60%的動物中抑制腫瘤生長(圖11D)。在缺少佐劑時，LicKM融合物抑制腫瘤生長，在接受LicKM-E7(80%)的動物中觀察到相對LicKM-E7GGG(60%)的更大保護，并且用大腸桿菌產(chǎn)生的E7或E7GGG治療的動物的20%保留為無腫瘤的(圖IID)。針對與HPV相關(guān)的疾病的發(fā)展的保護大部分歸因于細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。DTH反應(yīng)被認為是表示抗原特異性細胞激素介導(dǎo)的發(fā)炎，尤其涉及Thl型細胞激素。因為LicKM-E7顯示比LicKM-E7GGG針對表達E7的腫瘤更大的治療活性，所以我們在用LicKM-E7或大腸桿菌產(chǎn)生的E7疫苗接種的小鼠中評估對E7的DTH反應(yīng)。在用LicKM-E7蛋白質(zhì)(甚至在缺少佐劑時)疫苗接種的小鼠中觀察到抗原特異性DTH反應(yīng)(表1)。所述反應(yīng)超過在用大腸桿菌產(chǎn)生的E7疫苗接種的小鼠中觀察到的反應(yīng)。用LicKM免疫小鼠不顯示顯著的耳朵腫脹，證明LicKM載體分子不誘導(dǎo)發(fā)炎反應(yīng)。表l.延遲型過敏性<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>*將耳朵腫脹報告為來自每組5只小鼠的經(jīng)攻毒與未經(jīng)攻毒對照耳朵之間的厚度差異(△)的平均值(耳朵增厚mm值x10—2)。權(quán)利要求1.一種分離抗原，其包含與熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)融合的人類乳頭瘤病毒(HPV)的組分；其中所述HPV組分包含至少一個選自由以下組成的群組的域來自HPV16的E7、來自HPV18的E7、來自HPV16的E6和來自HPV18的E6、來自HPV16的E7的片段、來自HPV18的E7的片段、來自HPV16的E6的片段和來自HPV18的E6的片段。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離抗原，其中所述HPV組分由來自HPV16的E7組成。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的分離抗原，其中所述HPV組分由來自HPV18的E7組成。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離抗原，其中所述HPV組分由SEQIDNO.:2或SEQIDNO.:4組成。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離抗原，其中所述熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)包含修飾后的地衣多糖酶(lichenase)蛋白質(zhì)序列。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離抗原，其中所述地衣多糖酶的編碼序列已被優(yōu)化來用于植物中的蛋白質(zhì)表達。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離抗原，其中所述地衣多糖酶蛋白質(zhì)序列包含地衣多糖酶的N末端域、C末端域和表面環(huán)域。8.根據(jù)權(quán)利要求l所述的分離抗原，其中與地衣多糖酶融合的所述HPV組分是N末端融合蛋白質(zhì)、C末端融合蛋白質(zhì)或表面環(huán)插入融合蛋白質(zhì)中的任何一種蛋白質(zhì)。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離抗原，其中所述HPV組分包含至少2個獨立地選自由以下組成的群組的域來自HPV16的E7、來自HPV18的E7、來自HPV16的E6和來自HPV18的E6、來自HPV16的E7的片段、來自HPV18的E7的片段、來自HPV16的E6的片段和來自HPV18的E6的片段。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的分離抗原，其中所述第一HPV組分包含來自HPV16的E7并且所述第二HPV組分包含來自HPV18的E7。11.一種疫苗組合物，其包含抗原和醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑，所述抗原包含與熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)融合的人類乳頭瘤病毒(HPV)的組分；其中所述HPV組分包含至少一個選自由以下組成的群組的域來自HPV16的E7、來自HPV18的E7、來自HPV16的E6和來自HPV18的E6、來自HPV16的E7的片段、來自HPV18的E7的片段、來自HPV16的E6的片段和來自HPV18的E6的片段；并且其中所述組合物能夠在投與個體后引發(fā)免疫反應(yīng)。12.根據(jù)權(quán)利要求ll所述的疫苗組合物，其中所述HPV組分由來自HPV16的E7組成。13.根據(jù)權(quán)利要求ll所述的疫苗組合物，其中所述HPV組分由來自HPV18的E7組成。14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的疫苗組合物，其中所述HPV組分由SEQIDNO.:2或SEQIDNO.:4組成。15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的疫苗組合物，其中所述熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)包含修飾后的地衣多糖酶蛋白質(zhì)序列。16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的疫苗組合物，其中所述地衣多糖酶的編碼序列已被優(yōu)化用于植物中的蛋白質(zhì)表達。17.根據(jù)權(quán)利要求11所述的疫苗組合物，其中所述地衣多糖酶蛋白質(zhì)序列包含地衣多糖酶的N末端域、C末端域和表面環(huán)域。18.根據(jù)權(quán)利要求ll所述的疫苗組合物，其中與地衣多糖酶融合的所述HPV組分是N末端融合蛋白質(zhì)、C末端融合蛋白質(zhì)或表面環(huán)插入融合蛋白質(zhì)中的任何一種蛋白質(zhì)。19.根據(jù)權(quán)利要求11所述的疫苗組合物，其中所述HPV組分包含至少2個獨立地選自由以下組成的群組的域來自HPV16的E7、來自HPV18的E7、來自HPV16的E6和來自HPV18的E6、來自HPV16的E7的片段、來自HPV18的E7的片段、來自HPV16的E6的片段和來自HPV18的E6的片段。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的疫苗組合物，其中所述第一HPV組分包含來自HPV16的E7并且所述第二HPV組分包含來自HPV18的E7。21.根據(jù)權(quán)利要求11所述的疫苗組合物，其另外包含第二抗原，其中所述組合物能夠在投與動物后引發(fā)免疫反應(yīng)。22.根據(jù)權(quán)利要求11所述的疫苗組合物，其中所述第二抗原包含與熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)融合的人類乳頭瘤病毒(HPV)的組分和醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑；其中所述第一抗原的所述HPV組分包含至少一個選自由以下組成的群組的域來自HPV16的E7、來自HPV18的E7、來自HPV16的E6和來自HPV18的E6、來自HPV16的E7的片段、來自HPV18的E7的片段、來自HPV16的E6的片段和來自HPV18的E6的片段，并且所述第二抗原的所述HPV組分包含至少一個不同于所述第一抗原的選自由以下組成的群組的域來自HPV16的E7、來自HPV18的E7、來自HPV16的E6和來自HPV18的E6、來自HPV16的E7的片段、來自HPV18的E7的片段、來自HPV16的E6的片段和來自HPV18的E6的片段；并且其中所述組合物能夠在投與個體后引發(fā)免疫反應(yīng)。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的疫苗組合物，其中所述第一抗原的所述HPV組分包含至少一個選自由來自HPV16的E7和來自HPV16的E7的片段組成的群組的域，并且所述第二抗原的所述HPV組分包含至少一個不同于所述第一抗原的選自由來自HPV18的E7和來自HPV18的E7的片段組成的群組的域。24.根據(jù)權(quán)利要求11所述的疫苗組合物，其中所述抗原是在選自轉(zhuǎn)基因植物和瞬時表達所述抗原的植物的植物中產(chǎn)生。25.根據(jù)權(quán)利要求11所述的疫苗組合物，其中所述組合物包含來自植物細胞、植物、種子、果實或其提取物的純化、部分純化或未純化的抗原。26.根據(jù)權(quán)利要求ll所述的疫苗組合物，其另外包含疫苗佐劑。27.根據(jù)權(quán)利要求ll所述的疫苗組合物，其中所述佐劑包含明礬、MF59、MALP2和皂苷。28.—種包含至少2種抗原的疫苗組合物，每種抗原都包含人類乳頭瘤病毒(HPV)的組分，其中所述抗原中的至少一種抗原另外包含熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)，其中所述組合物能夠在投與個體后引發(fā)免疫反應(yīng)。29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的疫苗組合物，其中至少2種抗原包含HPV的組分，每一者獨立地包含至少一個選自由以下組成的群組的域來自HPV16的E7、來自HPV18的E7、來自HPV16的E6和來自HPV18的E6、來自HPV16的E7的片段、來自HPV18的E7的片段、來自HPV16的E6的片段和來自HPV18的E6的片段和其組合；并且其中所述組合物能夠在投與個體后引發(fā)免疫反應(yīng)。30.—種在個體中誘導(dǎo)針對人類乳頭瘤病毒(HPV)感染的保護性免疫反應(yīng)的方法，其包含向個體投與有效量的抗HPV疫苗組合物，其中所述投藥足以刺激所述個體產(chǎn)生抗原特異性抗體或剌激所述個體的細胞免疫反應(yīng)；從而誘導(dǎo)保護性免疫反應(yīng)；a.其中所述疫苗組合物包含抗原，所述抗原包含與熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)融合的人類乳頭瘤病毒(HPV)的組分；并且b.其中所述HPV組分包含至少一個選自由以下組成的群組的域來自HPV16的E7、來自HPV18的E7、來自HPV16的E6和來自HPV18的E6、來自HPV16的E7的片段、來自HPV18的E7的片段、來自HPV16的E6的片段和來自HPV18的E6的片段。31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述組合物是經(jīng)口、鼻內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或肌肉內(nèi)投與。32.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中通過供給植物細胞而向所述個體經(jīng)口投與所述組合物。33.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述個體是人類。34.—種產(chǎn)生抗原蛋白質(zhì)的方法，所述抗原蛋白質(zhì)包含與熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)融合的人類乳頭瘤病毒(HPV)的組分，所述方法包含a.制備核酸構(gòu)筑體，其編碼與熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)融合的人類乳頭瘤病毒(HPV)的抗原組分；b.用步驟a的所述核酸構(gòu)筑體來轉(zhuǎn)化細胞；和c.在有利于表達所述抗原蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)所述細胞；d.從而產(chǎn)生所述抗原蛋白質(zhì)；e.其中所述抗原的所述HPV組分包含至少一個選自由以下組成的群組的域來自HPV16的E7、來自HPV18的E7、來自HPV16的E6和來自HPV18的E6、來自HPV16的E7的片段、來自HPV18的E7的片段、來自HPV16的E6的片段和來自HPV18的E6的片段。35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述HPV組分由來自HPV16的E7組成。36.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述HPV組分由來自HPV18的E7組成。37.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述HPV組分由選自由SEQIDNO.:1和SEQNO.:3組成的群組的核苷酸序列編碼。38.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述HPV組分由SEQIDNO.:2或SEQIDNO.:4組成。39.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)包含修飾后的地衣多糖酶蛋白質(zhì)序列。40.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述地衣多糖酶的編碼序列已被優(yōu)化用于植物中的蛋白質(zhì)表達。41.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述地衣多糖酶蛋白質(zhì)序列包含地衣多糖酶的N末端域、C末端域和表面環(huán)域。42.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中與地衣多糖酶融合的所述HPV組分是N末端融合蛋白質(zhì)、C末端融合蛋白質(zhì)或表面環(huán)插入融合蛋白質(zhì)中的任何一種蛋白質(zhì)。43.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述HPV組分包含至少2個域，每個域獨立地包含至少一個選自由以下組成的群組的域來自HPV16的E7、來自HPV18的E7、來自HPV16的E6和來自HPV18的E6、來自HPV16的E7的片段、來自HPV18的E7的片段、來自HPV16的E6的片段和來自HPV18的E6的片段和其組合。44.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述抗原蛋白質(zhì)的表達處于病毒啟動子的控制之下。45.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述核酸構(gòu)筑體另外包含載體核酸序列。46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述載體是二元載體。47.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述核酸構(gòu)筑體另外包含編碼病毒蛋白質(zhì)的序列。48.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述細胞是植物細胞。49.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述植物細胞選自由苜蓿(alfalfa)細胞、蘿卜(radish)細胞、芥菜(mustard)細胞、綠豆(mungbean)細胞、西蘭花(broccoli)細胞、水田芥(watercress)細胞、大豆(soybean)細胞、小麥(wheat)細胞、向日葵(sunflower)細胞、巻心菜(cabbage)細胞、三葉草(clover)細胞、矮牽牛(petunia)細胞、番茄(tomato)細胞、馬鈴薯(potato)細胞、煙堿(nicotine)細胞、菠菜(spinach)細胞和小扁豆(lentil)細胞組成的群組。50.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述抗原蛋白質(zhì)是在克隆根細胞中產(chǎn)生。51.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述抗原蛋白質(zhì)是在萌芽秧苗中產(chǎn)生。52.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其另外包含回收所產(chǎn)生的部分純化或純化抗原蛋白質(zhì)。53.—種分離核酸構(gòu)筑體，其包含編碼與熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)融合的人類乳頭瘤病毒(HPV)的組分的核酸序列；其中所述HPV組分包含至少一個選自由以下組成的群組的域來自HPV16的E7、來自HPV18的E7、來自HPV16的E6和來自HPV18的E6、來自HPV16的E7的片段、來自HPV18的E7的片段、來自HPV16的E6的片段和來自HPV18的E6的片段和其組合。54.根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離核酸構(gòu)筑體，其中所述HPV組分由來自HPV16的E7、來自HPV16的E6或來自HPV16的E7的片段或來自HPV16的E6的片段組成。55.根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離核酸構(gòu)筑體，其中所述HPV組分由來自HPV18的E7、來自HPV18的E6或來自HPV18的E7的片段或來自HPV18的E6的片段組成。56.根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離核酸構(gòu)筑體，其中所述HPV組分由SEQIDNO.:2或SEQIDNO.:4組成。57.根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離核酸構(gòu)筑體，其中所述熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)包含修飾后的地衣多糖酶蛋白質(zhì)序列。58.根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離核酸構(gòu)筑體，其中所述地衣多糖酶的編碼序列已被優(yōu)化用于植物中的蛋白質(zhì)表達。59.根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離核酸構(gòu)筑體，其中所述地衣多糖酶蛋白質(zhì)序列包含地衣多糖酶的N末端域、C末端域和表面環(huán)域。60.根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離核酸構(gòu)筑體，其中與地衣多糖酶融合的所述HPV組分是N末端融合蛋白質(zhì)、C末端融合蛋白質(zhì)或表面環(huán)插入融合蛋白質(zhì)中的任何一種蛋白質(zhì)。61.根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離核酸構(gòu)筑體，其中所述HPV組分包含至少2個域，每個域獨立地包含至少一個選自由以下組成的群組的域來自HPV16的E7、來自HPV18的E7、來自HPV16的E6和來自HPV18的E6、來自HPV16的E7的片段、來自HPV18的E7的片段、來自HPV16的E6的片段和來自HPV18的E6的片段和其組合。62.根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離核酸構(gòu)筑體，其中所述HPV組分包含SEQIDNO.:1或SEQIDNO.:3。63.根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離核酸構(gòu)筑體，其另外包含載體核酸序列。64.根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離核酸構(gòu)筑體，其另外包含病毒啟動子核酸序列。65.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中所述載體是二元載體。66.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其另外包含編碼病毒蛋白質(zhì)的核酸序列。67.—種細胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求52所述的核酸構(gòu)筑體。68.根據(jù)權(quán)利要求66所述的宿主細胞，其為植物細胞。69.根據(jù)權(quán)利要求66所述的宿主細胞，其選自由苜蓿細胞、蘿卜細胞、芥菜細胞、綠豆細胞、西蘭花細胞、水田芥細胞、大豆細胞、小麥細胞、向日葵細胞、巻心菜細胞、三葉草細胞、矮牽牛細胞、番茄細胞、馬鈴薯細胞、煙堿細胞、菠菜細胞和小扁豆細胞組成的群組。70.—種植物，其包含根據(jù)權(quán)利要求52所述的核酸構(gòu)筑體，其中所述植物能夠產(chǎn)生所述抗原蛋白質(zhì)。71.根據(jù)權(quán)利要求69所述的植物，其選自由苜蓿、蘿卜、芥菜、綠豆、西蘭花、水田芥、大豆、小麥、向日葵、巻心菜、三葉草、矮牽牛、番茄、馬鈴薯、煙堿、菠菜和小扁豆組成的群組。72.根據(jù)權(quán)利要求69所述的植物，其為選自蕓苔屬(Brassicagenus)、煙草屬(Nicotianagenus)和矮牽牛屬(Petuniagenus)的屬。全文摘要本發(fā)明涉及免疫學(xué)和蛋白質(zhì)工程的交叉領(lǐng)域，并且尤其涉及適用于預(yù)防人類乳頭瘤病毒(HPV)感染的抗原和疫苗。本發(fā)明提供重組蛋白質(zhì)抗原、組合物和產(chǎn)生以及使用所述抗原和疫苗組合物的方法。文檔編號A61K39/00GK101395174SQ200780008072公開日2009年3月25日申請日期2007年2月13日優(yōu)先權(quán)日2006年2月13日發(fā)明者瓦季姆·梅特,維達季·尤西波夫申請人:美國弗勞恩霍夫股份有限公司