兩性自組裝蛋白質在配制低水溶性的有效物質中的用途的制作方法

專利名稱：兩性自組裝蛋白質在配制低水溶性的有效物質中的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及兩性自組裝蛋白質在配制低水溶性的有效物質中的用途。

背景技術：
DE 10059213A1描述了通過在含蛋白質的保護膠體中分散活性物質、絮凝以及分離覆蓋保護膠體的活性物質并轉變成干粉來生產水不溶的或低水溶性的活性物質的固體制劑的方法。將酪蛋白和牛膠原蛋白、豬膠原蛋白以及魚膠原蛋白作為優選的保護膠體。
DE 102004057587A1描述低水溶性活性物質和來自單細胞生物的蛋白質材料的混合物的水性分散液及從其中制成的干粉。
發明目的 到目前為止，配制水不溶的或低水溶性的活性物質和有效物質的方法無法滿足對活性物質，特別是配制用于化妝品和制藥的活性物質的所有要求，如熱穩定性、氧化穩定性和耐光性、機械穩定性與毒性的可接受性。
因此，本發明旨在提供允許配制低水溶性活性物質的方法，而且比現有技術提供的已知方法能更好地滿足上述標準。


發明內容
在第一個實施方案中，本發明涉及兩性自組裝蛋白質在配制低水溶性有效物質中的用途。兩親性自組裝蛋白質適于作為低水溶性的疏水性活性物質的配制佐劑。由于其兩親性的分子特征，這些蛋白質在水溶液中能穩定疏水性活性物質。這些蛋白質的自組裝特征使其呈現更高的分子量結構，并因此持久地包裹疏水性活性物質。
本發明另外提供生產有效物質制劑的方法，其中 (i)低水溶性有效物質與兩親性自組裝蛋白質在共同分散相中混合在一起，和 (ii)然后相分離成富含蛋白質和有效物質的相，以及缺乏蛋白質和有效物質的相。
隨后可將富含蛋白質和有效物質的相硬化并作為機械穩定的含有效物質的蛋白質微粒分離，如果合適，進行干燥。
(i)兩親性自組裝蛋白質 兩親性自組裝蛋白質由氨基酸特別是20種天然形成的氨基酸構成的多肽組成。氨基酸也可被修飾，如乙酰基化、糖基化、法尼基化。
適用于配制低水溶性有效物質的兩親性自組裝蛋白質是那些可形成蛋白質微粒的蛋白質。蛋白質微粒具有球形構造，平均粒子直徑從0.1至100μm特別是從0.5至20μm，優選從1至5μm并且特別優選從2至4μm。
蛋白質微粒可優選通過下述方法制備 蛋白質溶于第一溶劑。可用于此處的溶劑，例如鹽水溶液。具體而言，濃度高于2M，特別是高于4M，而且特別優選高于5M的高濃度鹽溶液是合適的，其離子比鈉離子和氯離子具有更顯著的離液序列高的特征。這種鹽溶液的實例是6M的硫氰酸胍或9M的溴化鋰。此外，有機溶劑也可用于溶解蛋白質。具體而言，氟化醇、環烴類或有機酸是合適的。其實例是六氟異丙醇、環己烷和蟻酸。蛋白質微粒的制備可在上述溶劑中進行。或者，該溶劑也可由另外的溶劑代替，例如，經過透析或稀釋的低濃度鹽溶液(c<0.5M)。溶解的蛋白質終濃度應在0.1至100mg/ml。該方法進行的溫度通常是0-80℃，優選5-50℃并且特別優選10-40℃。
當使用水溶液時，這些也可與緩沖液混合，優選pH范圍為4-10，特別優選5-9，尤其特別優選6-8.5。
通過加入添加劑來誘導相分離。此處在溶劑和添加劑的混合物中形成乳化的富含蛋白質相。由于表面效應，乳化的富含蛋白質的液滴呈現圓形。通過溶劑、添加劑和蛋白質濃度的選擇，調節蛋白質微粒的平均直徑在0.1μm與100μm之間。
可用的添加劑是一方面易與第一溶劑混合，并且另一方面能誘導富含蛋白質相形成的所有物質。如果微粒形成在有機溶劑中進行，用于該用途的適宜有機物質應該比溶劑的極性低，例如甲苯。在水溶液中，其離子比鈉離子和氯離子具有更顯著的離液序列高特征的鹽(如硫酸銨、磷酸鉀)可用作添加劑。基于蛋白質溶液，取決于添加劑的性質，添加劑的最終濃度應在以重量計1％與50％之間。
富含蛋白質的液滴通過硬化固定，其圓形狀保留。這里，固定是基于強的分子間相互作用的發展。相互作用的類型可以是非共價的，如由于分子間β-折疊葉狀晶體的形成，或共價的，如由于化學交聯。硬化可以作為由于添加劑和/或由于添加另外合適物質的結果而發生。硬化發生溫度在0℃與80℃之間，優選在5℃與60℃之間。
另外的物質可以是化學交聯劑。此處化學交聯劑應理解為由至少兩種化學反應基團通過連接鍵結合而成的分子。其實例是巰基反應基團(如順丁烯二酰亞胺、吡啶二硫化物、α-鹵代乙酰類、乙烯基砜、硫酸烷基砜(sulfatoakyl sulfones)(優選硫酸乙基砜)、胺反應基團(如琥珀酰亞胺酯、碳化二亞胺、羥甲基膦、酰亞胺酯、PFP酯、乙醛、異硫氰酸酯等)、羧基反應基團(如胺等)、羥基反應基團(如異氰酸鹽酯等)、非選擇性基團(如芳基疊氮化物等)和光可活化基團(如全氟苯基疊氮化物等)。這些反應基團與存在于蛋白質中的胺、硫醇、羧基或羥基基團可形成共價鍵。
穩定化的微粒用另外適當的溶劑沖洗，如水，然后通過本領域技術人員公認的方法進行干燥，如凍干法、接觸干燥或噴霧干燥。使用掃描電子顯微鏡檢查微粒形成與否。
適宜生產蛋白質微粒的是在水溶液中主要以固有無折疊形式存在的蛋白質。這種狀態可以通過計算實現，例如，依據形成IUpred項目基礎的運算法則(http://iupred.enzim.hu/index.html；The Pairwise Energy ContentEstimated from Amino Acid Composition Discriminates between Foldedand Intrinsically Unstructured Proteins；Zsuzsanna Dosztányi、VeronikaCsizmók、Péter Tompa和István Simon；J.Mol.Biol.(2005)347，827-839)。當對于超過50％的氨基酸殘基依照該運算法則計算出值>0.5時，可以認定為主要以固有無折疊狀態存在(預測類型長無序性)。
用于配制低水溶性有效物質的另外合適的蛋白質是絲蛋白。在下文中，這些應理解為指包含高度重復氨基酸序列并且在動物中和當分泌時以流體形式儲存的那些蛋白質，纖維形成是作為剪切或旋轉的結果(Craig，C.L.(1997)Evolution of arthropod silks.Annu.Rev.Entomol.42231-67)。
用于配制低水溶性有效物質的特別合適的蛋白質是能夠從蜘蛛中以其原有形式被分離的蛛絲蛋白。特別合適的蛋白質是能從蜘蛛的“主壺腹”腺分離的絲蛋白。
優選的絲蛋白是來自十字圓蛛(Araneus diadematus)“主壺腹”腺的ADF3和ADF4(Guerette等人，Science 272，5258112-5(1996))。
用于配制低水溶性有效物質的同樣合適的蛋白質是從天然絲蛋白衍生的并且在原核或真核表達系統中使用基因工程方法異源產生的天然或合成蛋白質。原核表達生物的非限定性實例是大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)等。真核表達生物的非限定性實例是酵母，如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、畢赤酵母(Pichia pastoris)等，絲狀真菌，如黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、構巢曲霉(Aspgrgillus nidulans)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、頂頭孢產黃青霉(Acremonium chrysogenum)等，哺乳動物細胞，如HeLa細胞、COS細胞、CHO細胞等，昆蟲細胞，如Sf9細胞、MEL細胞等。
用于配制低水溶性有效物質特別優選的是基于天然絲蛋白重復單位的合成蛋白。除合成的重復絲蛋白序列外，這些可另外包含一個或多個天然非重復絲蛋白序列(Winkler和Kaplan，J Biotechnol 7485-93(2000))。
用于配制低水溶性有效物質的合成的絲蛋白中，優選基于天然蛛絲蛋白的重復單位的合成蛛絲蛋白。除合成的重復蛛絲蛋白序列外，這些可另外包括一個或多個天然非重復蛛絲蛋白序列。
在合成蛛絲蛋白中，所謂的C16蛋白質是參考(Huemmerich等人Biochemistry，43(42)13604-13612(2004))而提及。該蛋白質具有如SEQ IDNO1所示的多肽序列。除在SEQ ID NO1所示的多肽序列外，也優選該序列的特定的功能當量物、功能衍生物及鹽。
依據本發明，“功能當量物”也可以特別理解為突變體，其在上述氨基酸序列中至少有一個序列位點上的氨基酸與明確提到的氨基酸不同，但卻具有包裝低水溶性有效物質有義突變體。
“功能當量物”因此包括由一個或多個氨基酸添加、取代、缺失和/或顛倒可獲得的突變體，所述改變可發生在任何序列位點，假如它們形成帶有依據本發明的特性譜的突變體。功能等價也特別存在于當突變體和未改變的多肽之間反應模式是定性相符時。
從上述意義上，“功能當量物”也是所述多肽的“前體”并且也是多肽的“功能衍生物”和“鹽”。
此處，“前體”是具有或不具有期望的生物活性的多肽的天然或合成前體。
合適的氨基酸取代的實例見下表 原始基團 取代實例 Ala Ser Arg Lys Asn Gln；His Asp Glu Cys Ser Gln Asn Glu Asp Gly Pro His Asn；Gln Ile Leu；Val Leu Ile；Val Lys Arg；Gln；Glu Met Leu；Ile Phe Met；Leu；Tyr Ser Thr Thr Ser Trp Tyr Tyr Trp；Phe Val Ile；Leu 依據本發明，“鹽”應理解為指羧基基團的鹽和根據本發明的蛋白質分子氨基的酸加成鹽。可以本身已知的方式制備羧基基團的鹽，包括無機鹽，如鈉、鈣、銨、鐵和鋅鹽，以及含有有機堿基的鹽，如胺，如三乙醇胺、精氨酸、賴氨酸、哌啶等。本發明同樣提供酸加成鹽，如含有無機酸如鹽酸或硫酸的鹽，以及含有有機酸如乙酸和草酸的鹽。
借助已知技術在功能性氨基酸側基或在其N或C末端同樣也可制備依據本發明的多肽的“功能衍生物”。該類型的衍生物包括，例如通過與氨、或與伯胺或仲胺反應獲得的羧酸基團的脂肪酸酯、羧酸基團的酰胺，與酰基反應制備的游離氨基的N-酰基衍生物，或與酰基反應制備的游離羥基的O-酰基衍生物。
(ii)低水溶性有效物質 在下文中，術語低水溶性有效物質、疏水性有效物質、疏水性活性物質以及效應分子可同義的使用。在下文中，術語低水溶性有效物質用來指20℃時水中溶解度以重量計小于5％，優選以重量計小于1％，特別優選以重量計小于0.5％，極其優選以重量計小于0.1％的那些化合物。
合適的低水溶性有效物質是染料，特別是在下表中指出的那些物質 特別有利的染料是在下面列表中列出的可溶于油的或可分散在油中的化合物。染料索引號(CIN)見Rowe Colour Index，第三版，Society of Dyersand Colourists，Bradford，England，1971。
另外優選的效應分子是脂肪酸，特別是具有烷基支鏈的飽和脂肪酸，特別是優選支鏈花生酸，如18-甲基花生酸。
另外優選的效應分子是類胡蘿卜素。依據本發明，類胡蘿卜素應理解為指下列化合物及其酯化的或糖基化的衍生物β-胡蘿卜素、番茄紅素、葉黃素、蝦紅素、玉米黃質、隱黃質、茜草黃質、斑蝥黃、胭脂樹橙、β-阿樸-4-胡蘿卜素醛、β-阿樸-8-胡蘿卜素醛、β-阿樸-8-胡蘿卜酸乙酯、鏈孢紅素、海膽酮、金盞花紅素、紫黃質、圓酵母素、圓酵母紅素，單獨地或作為混合物。優選使用的類胡蘿卜素是β-胡蘿卜素、番茄紅素、葉黃素、蝦紅素、玉米黃質、茜草黃質和斑蝥黃。
另外優選的效應分子是維生素，特別是類維生素A及其酯。
本發明的內容中，類維生素A指維生素A醇(視黃醇)及其衍生物，例如維生素A醛(視黃醛)、維生素A酸(視黃酸)和維生素A酯(如視黃醇乙酸酯、視黃醇丙酸酯和棕櫚酸視黃酯)。此處術語視黃酸包括所有反式視黃酸以及13-順式視黃酸。術語視黃醇和視黃醛優選包括所有反式化合物。依據本發明用于制劑的優選類維生素A是所有反式視黃醇，下面稱作視黃醇。
另外優選的效應分子是來自A、C、E和F族的維生素、維他命原以及維生素前體，尤其是3，4-脫氫視黃醇、β-胡蘿卜素(維生素A的維他命原)、抗壞血酸的棕櫚酸酯、生育酚，特別是α-生育酚及其酯，如乙酸酯、煙酸酯、磷酸鹽和琥珀酸鹽，以及維生素F，其中已知的必需脂肪酸，尤其是亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸。
另外優選的效應分子是來自維生素E族的親脂性的、溶于油的抗氧化劑，即生育酚及其衍生物、沒食子酸酯、類黃酮和類胡蘿卜素，以及丁羥基甲苯/苯甲醚。
另外優選的效應分子是硫辛酸及其合適的衍生物(鹽、酯、糖、核苷酸、核苷、肽和脂質)。
另外優選的效應分子是UV光保護過濾物。這些應理解為指能吸收紫外線并以長波輻射如熱的形式再次釋放吸收的能量的有機物質。
可利用的溶于油的UV-B過濾物，例如下面所示的物質 3-苯亞甲基樟腦及其衍生物，如3-(4-甲基苯亞甲基)樟腦；4-氨基苯甲酸衍生物，優選2-乙基己基4-(二甲氨基)苯甲酸酯、2-辛基4-(二甲氨基)苯甲酸酯和戊基4-(二甲氨基)苯甲酸酯；肉桂酸的酯，優選2-乙基己基4-甲氧基肉桂酸辛酯、丙基4-甲氧基肉桂酸辛酯、異戊基4-甲氧基肉桂酸辛酯、異戊基4-甲氧基肉桂酸辛酯、2-乙基己基2-氰基-3-苯基肉桂酸辛酯(奧克立林)；水楊酸的酯，優選2-乙基己基水楊酸酯、4-異丙苯甲基水楊酸酯、三甲基環己基水楊酸酯(homomenthyl salicylate)；苯甲酮衍生物，優選2-羥基-4-甲氧基苯甲酮、2-羥基-4-甲氧基-4′-甲基苯甲酮、2，2′-二羥-4-甲氧基苯甲酮；苯亞甲基丙二酸的酯，優選雙-2-乙基己基4-甲氧基苯甲酮；三嗪衍生物，例如，2，4，6-三苯胺基-(對-羰-2′-乙基-1′-己氧基)-1，3，5-三嗪(三苯胺三嗪)和雙辛基氨基三嗪酮(

HEB)；丙烷-1，3-二酮，例如，1-(4-叔丁基)-3-(4′-甲氧基苯基)丙烷-1，3-二酮。
特別優選肉桂酸酯的應用，優選2-乙基己基4-甲氧基肉桂酸辛酯、異戊基4-甲氧基肉桂酸辛酯、2-乙基己基2-氰基-3-苯基肉桂酸辛酯(奧克立林)。
此外，優選苯甲酮衍生物的應用，特別是2-羥基-4-甲氧基苯甲酮、2-羥基-4-甲氧基-4′-甲基苯甲酮、2，2′-二羥-4-甲氧基苯甲酮、以及丙烷-1，3-二酮的應用，如1-(4-叔丁基)-3-(4′-甲氧基苯基)丙烷-1，3-二酮。
考慮的典型UV-A過濾物是 苯甲酰基甲烷的衍生物，例如，1-(4′-叔丁基苯基)-3-(4′-甲氧基苯基)丙烷-1，3-二酮，4-叔丁基-4′-甲氧基聯苯甲酰甲烷或1-苯基l-3-(4′-異丙基苯基)丙烷-1，3-二酮；苯甲酮的氨羥基取代衍生物，例如，N，N-二乙基氨羥基苯甲酰-正-苯甲酸己酯。
UV-A和UV-B過濾物當然也可以混合物來使用。
合適的UV過濾物列于下表中。
除上述兩類初級光保護物質之外，也可能使用抗氧化劑類型的二級光保護制劑，其干擾UV放射物透入皮膚時觸發的光化學反應鏈。其典型實例是生育酚(維生素E)和溶于油的抗壞血酸衍生物(維生素C)。
依據本發明，所述化合物的適宜衍生物(鹽、酯、糖、核苷酸、核苷、肽和脂質)可用作效應分子。
另外優選的是所謂的過氧化物分解劑，即可分解過氧化物的化合物，特別優選分解脂質過氧化物。這些可理解為包括有機物質，如5-羥基嘧啶衍生物和3-羥基吡啶衍生物以及丙丁酚。
此外，所述過氧化物分解劑優選是描述于專利申請WO/0207698和WO/03059312中的物質，對其內容，此處明確作出參考，優選其中描述的含硼或含氮化合物，其能夠將過氧化物或氫過氧化物還原成相應的醇而沒有自由基轉變產物的形成。空間位阻胺也可用于該用途。
另一類是抗刺激劑，其在由UV光損傷的皮膚上具有抗炎癥效果。這些物質是例如沒藥醇、葉綠醇和植烷三醇。
另一類低水溶性效應物質是可用于作物保護，如除草劑、殺蟲劑和殺真菌劑的活性物質。
另外適合作為低水溶性有效物質的是用于制藥學上用途的活性物質，特別是那些用于口服用途的活性物質。不論醫學指征，依據本發明的方法原則上可用于大量活性物質。
適宜用于藥物的低水溶性活性物質的實例列于下表。
(iii)疏水性活性物質的配制 低水溶性活性物質的配制可使用兩親性自組裝蛋白質以多種方式來制備。可將低水溶性、疏水性的活性物質包裝在蛋白質微粒中或以通過蛋白質包被的膠體分散方式來穩定，其可實現于如微粉化樣品組(batch)中。疏水性的活性物質的配制可通過包被在微粒中來進行。該過程包括兩個步驟。第一步，將疏水性的活性物質和兩親性自組裝蛋白質溶解于共同相中。為此，活性物質和蛋白質可由溶劑或溶劑混合物直接溶解。備選地，可首先將活性物質和蛋白質溶解于不同溶劑中然后將溶液混合起來，因而再次形成共同相。共同相可以是分子性分散相或膠體性分散相。
疏水性活性物質和蛋白質不能溶解于共同溶劑或溶劑混合物中時，在不同溶劑中溶解疏水性活性物質和蛋白質以及后續混合這兩種溶液是特別有效的。這樣通過該過程，將溶解在合適溶劑中的活性物質稀釋于活性物質不能溶解的另一種溶劑中，也可制備疏水性活性物質的膠體分散溶液。
因為蛋白質通常是易溶于水的，優選的是對水溶液以及水和易混合于水的有機溶劑的混合物起作用。
合適的、易混合于水的溶劑的實例是醇，如甲醇、乙醇和異丙醇，氟化醇，如六氟異丙醇和三氟乙醇，烷酮，如丙酮，以及亞砜，例如二甲基亞砜，或甲酰胺，如二甲基甲酰胺，或其它有機溶劑，例如四氫呋喃和氰甲烷或N-甲基-2-吡咯酮。通常，可能對可溶解蛋白質的溶劑或溶劑混合物起作用。合適溶劑的實例是氟化醇，例如六氟異丙醇或三氟乙醇，離子流體，如EMIM乙酸酯，離液序列高的鹽的水溶液，如尿素、鹽酸胍和硫氰酸胍，或有機酸，如蟻酸，以及這些溶劑與其它有機溶劑的混合物。可與針對蛋白質的溶劑混合的溶劑的實例尤其是醇，如甲醇、乙醇和異丙醇，烷酮，如丙酮，亞砜，如二甲基亞砜，甲酰胺，如二甲基甲酰胺，鹵代烷，如二氯甲烷，以及另外的有機溶劑，如四氫呋喃。
在微粒中配制疏水性活性物質的第二步是將相分離成缺乏蛋白質和活性物質的相以及富含蛋白質和活性物質繼而硬化的相。此處將疏水性活性物質摻入蛋白質的組裝形式。由于相分離過程中的表面效應，優選形成圓形蛋白質結構，即所謂的微粒。
相分離是優選通過將易溶鹽的水溶液加入到蛋白質與疏水性活性物質的混合物中來誘導。合適的易溶鹽由霍夫邁斯特系列描述。硫酸銨和磷酸鉀是特別合適的。這些溶液的加入可由簡單混合、逐滴添加或經由透析來進行。
疏水性活性物質和蛋白質之間的相互作用主要是基于它們的疏水特性，然而也可涉及氫鍵、離子間相互作用、范德華作用。可將疏水性活性物質結合到表面、摻入微粒或另外同時以兩種方法與微粒相連。疏水性活性物質與微粒的結合可由在溶解的活性物質的組裝混合物中的消耗來確定。活性物質的濃度可由其特征的定量分析來確定。因此，例如通過光度測定方法可分析光吸收活性物質的結合。為此，如在制劑混合物中微粒的著色或缺乏蛋白質和活性物質的相的去色通過測定有色活性物質的吸收值來確定。使用這些方法，也可確定微粒中活性物質含量高的程度。
作為由于蛋白酶對微粒的降解或通過合適溶劑對微粒的溶解結果而在合適溶劑中由于解吸附作用發生從微粒中釋放活性物質。針對解吸附作用的合適溶劑是所有可溶解活性物質的溶劑或溶劑混合物。合適的蛋白酶可作為工業級蛋白酶以靶向方式加入到蛋白質微粒的懸浮液中，或自然發生于效應分子期望的活性位點，例如皮膚蛋白酶、消化道蛋白酶，如胃或腸蛋白酶，或微生物釋放的蛋白酶。可溶解微粒的溶劑如氟化醇，例如六氟異丙醇或三氟乙醇，離子流體，如EMIM乙酸酯，離液序列高的鹽的水溶液，如尿素、鹽酸胍和硫氰酸胍，或有機酸，如蟻酸，以及這些溶劑與其它有機溶劑的混合物。例如通過活性物質的電荷密度和微粒的大小和/或其體積與表面積的比率可調節效應分子的釋放比率和動力學。
低水溶性活性物質的配制也可通過其膠體分散溶液的穩定性來實現，例如通過微粉化。
本發明還提供使用所述兩親性自組裝蛋白質生產的蛋白質微粒或例如由微粉化生產的膠體分散蛋白質制劑，在藥物、化妝品、農作物保護產品、食品和動物飼料的貯存、運輸或釋放活性物質中的用途。在這一情況中，蛋白質微粒另外提供用來如保護包裝的活性物質免受環境影響，例如，氧化過程或UV射線，或免受由于與產品的其它成分反應而造成的破壞，或免受某些蛋白酶的降解。活性物質可從蛋白質微粒或膠體分散蛋白質制劑中通過解吸附作用、蛋白水解性降解、靶向釋放或緩慢釋放或這些機制的組合來釋放。
優選在用于經口施用的藥物中隨其配制的蛋白質微粒和活性物質。在這一情況中，經由胃的過程中可增加活性成分的穩定性，因為在本文通常的情況下沒有蛋白質微粒的蛋白水解引起的降解發生。然后在腸內從經口施用的包含活性物質的微粒中釋放活性物質。蛋白質微粒和其中包埋的藥物活性物質的局部應用也是可能的。蛋白質微粒的降解和從中引起的活性物質的釋放然后由存在于皮膚和/或表皮層上的蛋白酶來調節。
在藥品、食品和動物飼料以及農作物保護產品中，含有所述的兩親性自組裝蛋白質的活性物質的制劑還可導致活性物質生物利用率的增加。在活性物質的蛋白質微粒或膠體分散制劑中使用所述兩親性自組裝蛋白質來包裝藥物的活性物質也可導致活性物質更能克服血腦屏障或促進經由腸黏膜的吸收。
通過膠囊化和/或包埋在蛋白質微粒中可保護農作物保護產品免受沖洗。可由蛋白質微粒中的包裝或經由膠體分散制劑，例如，通過使用兩親性自組裝蛋白質的微粉化混合物來確定更好吸收和/或具有更好生物利用率的某種活性物質微粒大小。
通過改變所述兩親性自組裝蛋白質的氨基酸序列和/或通過與附加的蛋白質或多肽序列的融合，可能產生特異性識別某些表面如皮膚、毛發、葉片、根部或腸表面或血管表面和/或由這些表面或存在的受體來識別和結合的結構。
結果，可能使配制含有所述兩親性自組裝蛋白質的活性物質對于期望的活性位點和/或改善活性物質的吸收更加有效。如果將其包裝在以與在消化道中結合到細胞(如黏膜細胞)某些表面標記的蛋白質融合和/或連接的形式附加存在的蛋白質微粒中，可增加藥物活性物質或食品和動物飼料中的活性物質的生物利用率。這些蛋白質如來自羅伊乳桿菌(Lactobacillusreuteri)的MapA蛋白質或膠原結合蛋白質CnBP(Miyoshi等人，2006，Biosci.Biotechnol.Biochem.701622-1628)或來自其它微生物，主要是天然的腸胃細菌叢的功能性相當的蛋白質。所述的結合蛋白介導微生物吸附到細胞表面。由于結合蛋白與所述兩親性自組裝蛋白質接合和/或融合，從中形成的包含活性物質的蛋白質微粒將以更具靶向性的方式到達相應的吸附位點和/或在這些位點停留更長的時間，從而延長和改進活性物質的釋放和吸收。
此外，通過改變所述兩親性自組裝蛋白質的氨基酸序列用于活性物質配制和/或與附加蛋白質或多肽序列的融合，可能將活性物質以靶向方式導入到期望的活性位點以便因此達到如特異性更高、活性物質消耗或活性物質劑量更低，或速度更快或效果更為明顯。
實施例 實施例1 從THF和THF/異丙醇在微粒中包裝β-胡蘿卜素并且通過蛋白質水解釋放 β-胡蘿卜素溶液的制備 通過將80mg β-胡蘿卜素和16mg生育酚溶解于10g THF中來制備原液。然后通過對應于表1.1的稀釋從該保存液中制備溶液1-4。
所有溶液使用前現配并在稀釋后立即使用。
表1.1β-胡蘿卜素溶液 通過直接添加磷酸鉀而在微粒中包裝β-胡蘿卜素 為將β-胡蘿卜素包裝進C16蛋白質微粒，首先制備C16蛋白質和β-胡蘿卜素的共同相。為此，每次將500μl溶于5mM、pH 8磷酸鉀中的10mg/ml C16蛋白質的溶液與50μl或100μl的β-胡蘿卜素溶液混合(溶液1-4)(表1.2)。在來自THF/異丙醇的含β-胡蘿卜素的樣品組情況下(樣品組1-4)，獲得橙色分散液；在來自THF的含β-胡蘿卜素的樣品組情況下(樣品組5-8)，獲得黃色分散液。
為了通過相分離誘導C16蛋白質微粒形成，將1000μl的1M、pH 8.0磷酸鉀溶液加入每一樣品組中(表1.2)。于室溫孵育15分鐘后，將樣品組離心分離成包含β-胡蘿卜素的C16蛋白質微粒的顯著著色沉淀和無色上清液。所用β-胡蘿卜素因此在相位分離過程中完全轉移到微粒中。分離掉無色上清液。然后將沉淀用蒸餾水沖洗兩次并重新分散。
C16蛋白質微粒經再分散后，在來自THF/異丙醇包含β-胡蘿卜素溶液的樣品組情況下(樣品組1-4)，獲得橙色分散液；并且在來自THF包含β-胡蘿卜素溶液的樣品組情況下(樣品組5-8)，獲得黃色分散液。

表1.2通過加入1M磷酸鉀溶液在C16蛋白質微粒中從THF和THF/異丙醇包裝β-胡蘿卜素 通過對磷酸鉀透析而在C16蛋白質微粒中包裝β-胡蘿卜素 備選地向β-胡蘿卜素和C16蛋白質的共同相中直接添加磷酸鉀，相分離也可通過對1M磷酸鉀透析來進行。由于透析在透析管中完成，與直接添加磷酸鉀溶液相比，每次吸取10倍體積的樣品組(表1.3)。

表1.3通過對1M磷酸鉀溶液透析而在C16蛋白質微粒中從THF和THF/異丙醇包裝β-胡蘿卜素 為此，將C16溶液(10mg/ml于5mM、pH 8.0磷酸鉀中)與特定的β-胡蘿卜素溶液混合然后將混合物立即放入透析管并且對1M磷酸鉀溶液透析。透析過夜后，將微粒分散液從管中移出并離心分離成無色上清液和著色沉淀。同樣在向C16蛋白質和β-胡蘿卜素的共同相中直接添加磷酸鉀的情況下，C16蛋白質以蛋白質微粒的形式定量結合β-胡蘿卜素。分離并棄掉無色上清液。隨后沉淀用蒸餾水沖洗兩次然后重新分散。
蛋白質微粒經再分散后，在來自THF/異丙醇的包含β-胡蘿卜素溶液的樣品組情況下(樣品組1-4)，獲得橙色分散液；并且在來自THF的包含β-胡蘿卜素溶液的樣品組情況下(樣品組5-8)，獲得黃色分散液(

圖1)。
圖1來自THF和THF/異丙醇的具有β-胡蘿卜素的C16蛋白質微粒在水中的分散液。從左至右樣品組D1-D4(THF/異丙醇)和樣品組D5-D8(THF)。在C16蛋白質微粒中β-胡蘿卜素的含量引用為基于C16蛋白質微粒重量的以重量計的百分數。
為了來自THF和THF/異丙醇的再生包含β-胡蘿卜素的C16蛋白質微粒的不同著色，在更大范圍內重復樣品組D4和D5(表1.4)。再次從THF獲得含β-胡蘿卜素的黃色C16蛋白質微粒，并且從THF/異丙醇獲得含β-胡蘿卜素的橙色C16蛋白質微粒(圖2)。
表1.4通過對1M磷酸鉀溶液透析從THF和THF/異丙醇在C16蛋白質微粒中包裝β-胡蘿卜素 圖2來自THF/異丙醇(以重量計0.9％的β-胡蘿卜素，樣品組G1，左)和THF(以重量計0.3％的β-胡蘿卜素，樣品組G2，右)的包含β-胡蘿卜素的C16蛋白質微粒的分散液。
通過蛋白酶K的消化作用將β-胡蘿卜素從C16蛋白質微粒中釋放 為說明C16蛋白質微粒中的β-胡蘿卜素可通過蛋白質水解釋放，將200μl溶于水的微粒分散液G1和G2與500μl的5M、pH 8.0磷酸鉀混合。然后加入5μl蛋白酶K(羅氏(Roche)，19.45mg/ml)并且將混合物于室溫孵育過夜。每次使用的對照是無蛋白酶K的C16蛋白質微粒分散液的混合物。過夜孵育后，將混合物離心。蛋白酶存在時，消化C16蛋白質微粒并且釋放β-胡蘿卜素。離心后，沒有可見沉淀。上清液高度著色。無蛋白酶時，可將完整的C16蛋白質微粒離心除去。可觀察到顯著著色的沉淀。上清液無色。
圖3通過蛋白酶K消化C16蛋白質微粒分散液。A)無蛋白酶的來自THF/異丙醇的包含β-胡蘿卜素的C16蛋白質微粒(以重量計百分之0.9的β-胡蘿卜素，樣品組G1)，B)有蛋白酶的來自THF/異丙醇的包含β-胡蘿卜素的C16蛋白質微粒(以重量計0.9％的β-胡蘿卜素，樣品組G1)，C)無蛋白酶的來自THF的包含β-胡蘿卜素的C16蛋白質微粒(以重量計0.3％的β-胡蘿卜素，樣品組G2)；D)有蛋白酶的來自THF的包含β-胡蘿卜素的C16蛋白質微粒(以重量計0.3％的β-胡蘿卜素，樣品組G2)。
實施例2 含β-胡蘿卜素的微粒的穩定性以及通過蛋白水解消化從微粒中釋放β-胡蘿卜素 通過使用在人體胃部和/或腸內起作用的不同蛋白酶來處理含β-胡蘿卜素的C16蛋白質微粒，目的是說明作為用于藥物有效物質的存儲、運輸和/或傳遞系統的蛋白質微粒的適宜性。
為制備含有β-胡蘿卜素的C16蛋白質微粒，將80mg β-胡蘿卜素和16mg維生素E溶解于10ml THF中并且然后用90ml異丙醇稀釋。然后將部分該溶液與10體積的C16蛋白質溶液混合(10mg/ml于5mM、pH 8磷酸鉀緩沖液中)。然后將混合物與2體積的1M、pH 8磷酸鉀緩沖液混合。將產生的含β-胡蘿卜素的C16蛋白質微粒通過離心獲得，并且通過用水沖洗沉淀物來去除剩余的游離β-胡蘿卜素。
20mg含β-胡蘿卜素的C16蛋白質微粒用2ml人造胃液(6.4mg胃蛋白酶、80mM HCl、4mg NaCl)或2ml人造腸液I(20mg胰酶、0.45M、pH 7.5磷酸鈉、0.9mM牛磺膽酸鈉)或2ml人造腸液II(20mg胰酶、0.45M、pH 7.5磷酸鈉、6mM牛磺膽酸鈉)進行重懸，并于37℃振蕩(140rpm)孵育0、1、2、6、24和48h。未被蛋白水解而降解的C16蛋白質微粒經由600nm處懸浮液的散射來測定(圖4)。然后通過離心獲得完整的C16蛋白質微粒，并且通過445nm處吸收值的測定來分析上清液中β-胡蘿卜素的含量(圖5)。
由于用含胃蛋白酶的人造胃液處理，甚至在48h后，才剛剛降解C16蛋白質微粒(圖4)并因此釋放β-胡蘿卜素(圖5)。反之，用含胰酶的人造腸液I和I處理，在僅僅6h內實際上完全降解C16蛋白質微粒(圖4)并且釋放存在的β-胡蘿卜素(圖5)。因此，C16蛋白質微粒在經過人體胃部時耐受住而沒有顯著降解并且由于腸道中的蛋白水解降解而只釋放結合的效應物質。
圖4通過分析600nm處的光吸收值來測定完整的C16蛋白質微粒。
圖5通過分析445nm處的光吸收值來測定從C16蛋白質微粒中釋放的β-胡蘿卜素。
實施例3 C16蛛絲蛋白的微粉化 將2g的晶體狀番茄紅素和0.4g的α-生育酚溶解于500g THF中。在室溫條件下，活性物質溶液以2.42g/分鐘的流速與在5mM磷酸鉀緩沖液(pH8)中0.2g/l的C16蛋白質組成的流速為25.4g/分鐘的水溶液不斷混合。在THF/水混合物中混合形成的活性物質微粒具有103nm的微粒大小。2h后，用C16蛋白質處理的樣品(圖6B)與未處理樣品(圖6A)相比可見明顯的分散穩定性。甚至在幾天后，含C16蛋白質的番茄紅素分散液顯示出穩定性，然而未處理的番茄紅素分散液很大程度上絮凝(圖7)。將由于C16蛋白質穩定的某些番茄紅素分散液濃縮成含量為0.28％的固體。這樣，干燥的番茄紅素很難分散。備選地，由C16蛋白質穩定的番茄紅素分散液用330mM磷酸鉀處理(混合物中的終濃度)并干燥。得到易于分散的番茄紅素粉末。
圖6用C16蛛絲蛋白配制番茄紅素。混合后(黑色圖)和混合后2h(紅色圖)的未處理的番茄紅素樣品(A)和用C16蛋白質處理的番茄紅素樣品的光吸收值(B)。
圖7用C16蛛絲蛋白配制番茄紅素。混合后約30天時未處理的番茄紅素分散液(左)與C16蛋白質穩定的番茄紅素分散液(右)的比較。
實施例4 從異丙醇在微粒中包裝吡唑草胺并通過蛋白質水解釋放 可將低水溶性的植物活性物質包裝在制備自兩親性自組裝蛋白質的蛋白質微粒中，然后從其中釋放。為此，所選的非限定性實例是除草劑活性物質吡唑草胺。
500μl的含10mg/ml C16蛋白質的磷酸鉀溶液(5mM、pH 8.0)與100μl吡唑草胺溶液(50mg/ml于異丙醇中)混合。通過加入1ml的1M磷酸鉀緩沖液(pH 8.0)來誘導C16蛋白質微粒的形成。混合物于室溫孵育1h，然后在20000×g下離心10分鐘。沉淀用5ml雙蒸水沖洗兩次然后凍干。不含C16蛋白質的同樣的混合物作為對照。
用磷酸鉀沉淀后，于C16蛋白質和吡唑草胺的混合物中形成微粒。這些與那些含C16蛋白質但不含活性物質的標準混合物是在形態學上相當的。在C16吡唑草胺混合物中，沒有可見的吡唑草胺晶體。另一方面，在不含C16蛋白質的吡唑草胺混合物中形成了大量活性物質晶體。這說明C16蛋白質在水性磷酸鉀緩沖液存在下對吡唑草胺的結晶化具有明顯的抑制效應。
C16蛋白質沉淀或C16微粒形成后上清液中吡唑草胺濃度的測定顯示，大約90％的活性物質在蛋白質微粒中以包裝形式和/或以與其連接的形式存在。每次約20％的活性物質存在于沖洗上清液中。
凍干的含吡唑草胺的C16蛋白質微粒于37℃在1ml 10mM Tris緩沖液、0.1％ SDS、100μg蛋白酶K中進行蛋白水解消化1h。離心10分鐘(20000×g)后的混合物中剩余的活性物質晶體在500μl異丙醇中溶解。在蛋白酶消化的上清液中檢測到約使用量的11％的吡唑草胺。活性物質晶體再溶解到含有約使用量的35％的吡唑草胺的異丙醇中。
活性物質分布的分析(在λ＝215nm處的吸光度測定)

實施例5 蛋白質微粒中視黃醇的包裝和穩定化 可將對于如氧自由基、UV等的影響不穩定的低水溶性的或水不溶的活性物質包裝在制備自兩親性自組裝蛋白質的蛋白質微粒中。它們也可繼而從其中再次釋放。此外，活性物質配制和/或包裝在蛋白質微粒中可保護其免受有害影響和由此引起的降解。為說明這些，所選的非限定性實例是活性物質視黃醇，將其包裝在C16蛋白質微粒中，并在空氣、均勻攪動數小時攪動起泡。在不同時間點上，取出樣品并且在THF萃取后量化剩余的視黃醇。
研究表5.1中所示的樣品組。為此，首先將異丙醇中視黃醇-THF溶液稀釋，然后與水性C16蛋白質溶液混合，然后在樣品組1的情況下，通過加入1M磷酸鉀溶液來誘導C16蛋白質微粒形成。由于陽離子的存在，如經由C16蛋白質包裝樣品組中的磷酸鉀，原則上有助于增加游離溶解的視黃醇或以微粒形式出現的視黃醇的氧化，將154mM氯化鈉溶液加入到含和不含C16蛛絲蛋白的對照中，但其中沒有誘導C16蛋白質微粒形成(參見Fisher等，1972，Biochem.J.132259-270)。樣品組孵育在用塑料蓋子封閉的玻璃容器中進行，在磁力攪拌器上攪拌并且經由套管連續起泡達7h。取樣時每次取出4×300μl，通過計算，在其各自中應存在9.38μg最大量的視黃醇。移除后，將包裝樣品組的C16微粒離心分離，并且得到的視黃醇用1.5ml THF萃取并通過325nm處的吸光度測定來定量。在沒有C16微粒的樣品組情況下，將1.5ml THF直接加入到300μl樣品中，混合樣品并且離心以實現相分離。然后出現在THF相上層的視黃醇同樣借助于325nm處的吸光度測定來定量。
表5.1用于量化C16蛛絲蛋白介導的視黃醇氧化穩定性的多種樣品組。
在含有C16蛛絲蛋白的樣品組中(樣品組1-包裝在C16微粒中，樣品組2-可溶性C16)，與不含C16蛋白質的對照相比，觀察到在大氣中氧氣存在下視黃醇的顯著穩定性(表5.2；圖8)。然而樣品組2中視黃醇的量也在5至7h后顯著降低，已將活性成分包裝進C16微粒的樣品組1中，甚至在7h后也可檢測到超過70％的完整視黃醇(表5.2；圖8)。因此，C16微粒中視黃醇的包裝看來是合適的方法，通過該方法可起到抵抗氧自由基誘導的降解的穩定作用。在1ml 5mM、pH 8磷酸鉀緩沖液中，利用蛋白酶K(2.25 U)通過蛋白水解來降解裝載視黃醇的C16微粒，可以釋放出活性成分。
表5.2C16制劑樣品組中視黃醇穩定性的測定。
圖8C16制劑樣品組中作為孵育時間的函數的視黃醇穩定性的測定。
為確定C16微粒對活性物質的最大裝填密度，在包裝樣品組中使用不同量的視黃醇(參見樣品組1)。此處針對活性物質使用的溶劑是專用的THF。然后通過加入1M磷酸鉀緩沖液(pH 8.0)來誘導C16蛋白質微粒形成。樣品組在10℃孵育1h，然后在20000×g下離心10分鐘。形成的沉淀用蒸餾水沖洗兩次。然后通過用2ml THF沖洗C16蛋白質微粒來溶解掉活性物質并且借助于325nm處吸光度測定來進行定量(參見表5.3)。結果顯示，本試驗中視黃醇的最大負荷密度大約是1.9mg每5mg所用C16蛋白質(表5.3)。在對C16微粒定量沉淀的情況下，視黃醇活性物質濃度或裝填密度相應為約38％。

表5.3量化包裝在5mg C16微粒中并且從中再次釋放的視黃醇。
實施例6 從THF在微粒中包裝布洛芬(ibuprofen)并由蛋白質水解釋放 可將低水溶性的或水不溶的藥物活性物質包裝在制備自兩親性自組裝蛋白質的蛋白質微粒中。然后它們也可從其中再次釋放。另外，通過蛋白質微粒中活性物質的配制和/或包裝可保護其免受有害影響，例如，某些蛋白酶或強酸性pH值以及從中引起的降解。更好吸收和/或具有更好生物利用率的某種活性物質微粒大小或活性物質結構可由蛋白質微粒中活性物質的包裝和/或經由使用兩親性自組裝蛋白質的微粉化樣品組來確定。為說明這些，選擇活性物質布洛芬[(RS)-2-(4-異丁苯基)丙酸]作為非限定性實例。
500μl含10mg/ml C16蛋白質的磷酸鉀溶液(5mM、pH 8.0)與100μl布洛芬溶液(5mg/ml于異丙醇中)混合。通過加入1ml 1M磷酸鉀緩沖液(pH 8.0)來誘導C16蛋白質微粒形成。樣品組于室溫孵育1h并然后以20000×g離心10分鐘。沉淀用5ml雙蒸水沖洗兩次。
用磷酸鉀沉淀后，微粒形成于C16蛋白質和布洛芬的樣品組中。這些與那些含C16蛋白質但不含活性物質的標準樣品組在形態學術語上是相當的。在該樣品組中將布洛芬包裝進C16蛋白質微粒是定量完成的，并且這是誘導微粒形成后在上清液中借助于吸光度測定可檢測到布洛芬的原因。由于在1ml的5mM、pH 8磷酸鉀緩沖液中利用蛋白酶K(2.25 U)非特異性蛋白水解來降解裝載布洛芬的C16微粒，釋放出活性成分。
在含胃蛋白酶的樣品組中(類似于實施例2)，裝載布洛芬的C16蛋白質微粒的蛋白水解消化未能導致活性物質的釋放。在含胰酶的樣品組中(類似于實施例2)，布洛芬裝載的C16蛋白質微粒的處理導致活性物質的釋放。因此，C16微粒可提供保護以抵抗胃部蛋白酶和胃中常見的極其酸性pH值。然而，腸內條件下的釋放是可能的。C16微粒因此適合，尤其是經口施用的、在腸內吸收的或有效的并且在經過胃部時將被保護的活性物質的包裝和配制。
序列表
<110>巴斯夫歐洲公司
<120>兩性自組裝蛋白質在配制低水溶性的有效物質中的用途
<130>PF58768
<160>1
<170>PatentIn版本3.1
<210>1
<211>576
<212>PRT
<213>合成
<400>權利要求
1.兩親性自組裝蛋白質在配制低水溶性有效物質中的用途。
2.權利要求1的用途，其中兩親性自組裝蛋白質是形成微粒的蛋白質。
3.權利要求1的用途，其中兩親性自組裝蛋白質是固有無折疊蛋白質。
4.權利要求1的用途，其中兩親性自組裝蛋白質是絲蛋白。
5.權利要求1的用途，其中兩親性自組裝蛋白質是蛛絲蛋白。
6.權利要求1的用途，其中兩親性自組裝蛋白質是C16蛛絲蛋白。
7.權利要求1至6的用途，其中所用有效物質是藥物活性成份。
8.權利要求1至6的用途，其中所用有效物質是農作物保護活性成分。
9.權利要求1至6的用途，其中所用有效物質是用于皮膚和頭發的化妝品的活性成分。
10.生產有效物質制劑的方法，其中
(i)低水溶性有效物質與兩親性自組裝蛋白質在共同的分散相中混合在一起，和
(ii)然后進行相分離形成富含蛋白質和有效物質的相，和缺乏蛋白質和有效物質的相。
11.權利要求10的方法，其中相分離(ii)通過易溶的鹽實現。
12.權利要求10的方法，其中工作溫度在5和50℃之間。
13.權利要求10至12的方法，其中將富含蛋白質和有效物質的相硬化和作為機械穩定的含有效物質的蛋白質微粒分離，且如果合適進行干燥。
14.化妝品制劑，其包含已用至少一種兩親性自組裝蛋白質配制的低水溶性有效物質，連同另外的化妝品輔劑。
15.藥物制劑，其包含已用至少一種兩親性自組裝蛋白質配制的低水溶性有效物質，連同另外的藥物輔劑。
16.農用化學品制劑，其包含已用至少一種兩親性自組裝蛋白質配制的低水溶性有效物質，連同另外的農用化學品輔劑。
全文摘要
本發明涉及兩親性自組裝蛋白質在配制低水溶性有效物質中的用途。
文檔編號A61K47/42GK101370481SQ200780003088
公開日2009年2月18日 申請日期2007年1月19日 優先權日2006年1月20日
發明者B·利布曼, M·費爾, D·許梅里希, I·馬丁, M·布蘭茨, A·普托克, T·沙伊貝爾 申請人:巴斯夫歐洲公司