專利名稱：：苦豆子提取物及其生產方法和應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及從植物中提取的提取物及其生產方法和應用的
技術領域：
，是一種苦豆子提取物及其生產方法和應用。技術背景病毒感染是人類最常見的疾病之一，其癥狀可以從不顯性感染直至危及生命，由于缺乏有效的治療手段，病毒性疾病成為人類健康的巨大的威脅。流感病毒是引起流感的主要病原體，其傳染性強，致病力高，機體感染后往往會導致多系統的損害。由于目前還沒有能有效預防和控制流感病毒感染的手段，每年的流感流行嚴重危害著人類的健康，并由此造成巨大的社會負擔和經濟損失。由于流感病毒的基因突變率很高，人類無法通過注射疫苗獲得持久的免疫力。呼吸道合胞病毒和副流感病毒是引起嬰幼兒下呼吸道嚴重感染的重要病原，目前尚無有效的疫苗。腺病毒主要引起人呼吸道和眼部感染，通過疫苗接種預防感染仍存在許多問題，目前無有效的治療藥物。愛滋病毒是引起愛滋病的病因，人體感染后免疫功能被逐漸破壞，最終繼發危及生命的各類并發癥。到目前為止，愛滋病疫苗的研制還沒有取得突破性的進展。因為所有病毒均依賴宿主細胞進行復制和增殖，它們一方面干擾宿主細胞的代謝，一方面又與宿主共存亡，所以既能有效地殺滅病毒，同時又能使人體細胞免受傷害是現代科學還有待解決的難題。目前在國際上已得到公認的幾種廣譜抗病毒藥如干擾素、利巴韋林等，對流感病毒、副流感病毒、合胞病毒等呼吸道病毒均有抑制活性，齊多夫定和拉米夫定對愛滋病毒有明顯的抑制作用，但這些西藥在臨床使用中還存在一些無法克服的問題，如適應癥有限，療效不理想、副作用大或易產生耐藥性等。可以說到目前為止，國際上還沒有一種理想的抗病毒藥物上市，而預防性疫苗的研究狀況也不容樂觀。此外，現有的抗病毒西藥價格較高，限制了它們在臨床的廣泛使用，很多患者因負擔不起昂貴的藥費而得不到有效的治療。所以說病毒性疾病的防治是世界醫學領域的重大難題之一，特別是流感、愛滋病等，更是人類難以有效控制的世界性瘟疫。因此，開發高效廣譜的抗病毒藥物是國際醫藥學界迫切需要取得突破的科研課題。與西藥相比，中藥在治療病毒性疾病方面有其獨到之處，不僅對病毒本身具有抑制作用，還可以通過調節機體的免疫功能控制疾病的發展，幫助人體對抗病毒的侵害。因此中藥抗病毒研究在國際上越來越受重視。目前，從苦豆子及其同屬植物苦參中制備提取物的現有技術都是針對生物堿類進行純化，其工藝流程復雜，使用多種有機溶媒萃取生物堿藥材經乙醇回流提取后，提取液作酸化處理，用20%的苯類溶劑提取生物堿；分出的酸水層堿化后，用20%的苯或氯仿或乙酸乙酯萃取生物堿；再將所得的萃取液合并轉入10%的硫酸水溶液中，使生物堿成鹽轉入酸水中，收集酸水液作為總堿液(公開號CN1273870A的中國專利文獻公開了發明名稱為"苦豆子總堿液的制備工藝"的技術)；或者用苯、乙醚、環己烷、氯仿等溶媒分別萃取不同生物堿再合并(公開號CN1368502A的中國專利文獻公開了發明名稱為"苦豆子總堿的制備工藝"的技術)；或用稀鹽酸滲漉提取，滲漉液通過陽離子樹脂交換，樹脂晾干后用20%的氨水堿化，將堿化樹脂用氯仿回流提取生物堿，再將生物堿用95%的乙醇溶解精制苦參總堿(中國新醫藥2003年第2巻第六期公開了署名為邵方曉等的"苦參總堿浸膏提取工藝的研究")。這些生產方法工序復雜、生產成本高，提取物所含有效成分單一(僅為生物堿類)，產品含量可控性差；另外大量使用苯、氯仿等毒性較大的有機溶劑，不僅回收再利用難，而且對人員和環境危害大，不適合規模化生產。
發明內容本發明提供了一種苦豆子提取物及其生產方法和應用。該苦豆子提取物同時含有苦豆子中的生物堿類成分和黃酮類成分。該方法克服了上述現有技術之不足，生產工藝可靠，并特別解決了現有技術成本高、對人員和環境危害大的問題。本發明首次提出了弱極性大孔吸附樹脂在苦豆子提取物生產方法中的應用。該苦豆子提取物特別能應用于制備廣譜抗病毒藥物。本發明的技術方案之一是通過以下方式得到的一種苦豆子提取物，其含有50%至70%的生物堿類成分和10%至20%的黃酮類成分。下面是對上述技術方案之一的進一步優化和/或選擇該苦豆子提取物按下述步驟得到第一步，將苦豆子的種子或全草以水或乙醇粗提，其中，水粗提為將苦豆子的種子或全草加8倍量至12倍量水，在8(TC至10(TC下提取兩次，每次2小時至3小時，過濾，合并濾液；乙醇粗提為將苦豆子的種子或全草加8倍量至12倍量30%至70%的乙醇，在6(TC至8(TC提取兩次，每次2小時至3小時，過濾，合并濾液；第二步，將上述濾液濃縮后加相當于濃縮液體積1倍量至6倍量的無水乙醇，放置沉淀12小時至72小時，濾除沉淀得到乙醇溶液；第三步，將上述乙醇溶液濃縮后以氫氧化鈉和/或氨水調節PH值為7至14，上大孔吸附樹脂層析柱吸附；第四步，以相當于2至5個層析柱體積的去離子水沖洗上述層析柱，再以30%至90%的乙醇為洗脫劑洗脫層析柱，洗脫劑的用量相當于2至8個層析柱體積，流速為2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液并合并；第五步，將上述乙醇洗脫液在8(TC至10(rC下濃縮成流浸膏，再在6(TC至8(TC下真空干燥，即得到所需的苦豆子提取物。本發明的技術方案之二是通過以下方式得到的一種苦豆子提取物的生產方法按下述步驟進行第一步，將苦豆子的種子或全草以水或乙醇粗提；第二步，加乙醇沉淀粗提物中的雜質；第三步，以弱極性大孔吸附樹脂吸附粗提物中的提取物；第四步，用乙醇從大孔吸附樹脂上洗脫提取物得到洗脫液;第五步，將洗脫液濃縮回收乙醇得到苦豆子提取物；其中，弱極性大孔吸附樹脂選用HPD400、HPD500、D-201、D-301、AB-8等型號的弱極性大孔吸附樹脂中的一種。下面是對上述技術方案之二的進一步優化和/或選擇在上述第一步中，將苦豆子的種子或全草加8倍量至12倍量水在8(TC至10(rC下提取兩次，每次2小時至3小時，過濾，合并濾液。在上述第一步中，將苦豆子的種子或全草力n8倍量至12倍量50。/。至90。/。的乙醇在6(TC至8(rC提取兩次，每次2小時至3小時，過濾，合并濾液。在上述第二步中，將濾液濃縮后加相當于濃縮液體積1倍量至6倍量的無水乙醇，放置沉淀12小時至72小時，濾除沉淀得到乙醇溶液。在上述第三步中，將乙醇溶液濃縮后以氫氧化鈉和/或氨水調節PH值為7至14，上大孔吸附樹脂層析柱吸附。在上述第四步中，以相當于2至5個層析柱體積的去離子水沖洗層析柱，再以30%至90%的乙醇為洗脫劑洗脫層析柱，洗脫劑的用量相當于2至8個層析柱體積，流速為2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液并合并。在上述第五步中，將乙醇洗脫液在8(TC至10(rC下濃縮成流浸膏，并回收乙醇，在6(TC至8(TC下真空干燥，即得到所需的苦豆子提取物。本發明的技術方案之三是通過以下方式得到的弱極性大孔吸附樹脂在苦豆子提取物生產方法中的應用。下面是對上述技術方案之三的進一步優化和/或選擇上述所用弱極性大孔吸附樹脂可為D-201、D-301、HPD400、HPD500、AB-8等型號的弱極性大孔吸附樹脂中的一種。本發明的技術方案之四是通過以下方式得到的上述苦豆子提取物應用于制備廣譜抗病毒藥物。下面是對上述技術方案之四的進一步優化和/或選擇上述苦豆子提取物用于制備針對流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等呼吸道病毒或/和愛滋病毒的廣譜抗病毒藥物。本發明所得苦豆子提取物不僅含有50%至70%的生物堿類成分，還含有10%至20%的黃酮類成分。該苦豆子提取物的生產方法采用了弱極性大孔吸附樹脂吸附分離技術，能同時富集苦豆子粗提物中的生物堿類成分和黃酮類成分，工藝可靠，所得提取物有效成分含量穩定。該生產方法所需設備簡單，使用的材料安全環保，并可通過樹脂再生和乙醇回收反復利用，處理方法均簡單易行。由于主要工業材料可循環利用，因而該生產方法的生產成本比現有技術大大降低，同時又解決了用氯仿、苯等溶劑萃取純化生物堿所存在的溶劑損耗大、回收困難、生產成本高、對人員和環境危害大等問題。本發明生產方法比現有技術更適合于產業化。本發明所得苦豆子提取物經實驗研究表明具有顯著的抗流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒及愛滋病毒作用，且毒性較低。該苦豆子提取物可用于制備治療流感和愛滋病等病毒性疾病的廣譜抗病毒藥物。具體實施例方式本發明不受下述實施例的限制，可根據上述本發明的技術方案和實際情況來確定具體的實施方式。下面結合實施例對本發明作進一步論述實施例l:苦豆子種子加8倍量水10(TC煮提兩次，每次2小時，過濾，合并濾液，濃縮至原體積的一半，加1倍量無水乙醇放置沉淀12小時，濾除沉淀，濾液濃縮后以氫氧化鈉調節PH值為7，上大孔吸附樹脂層析柱，待上樣液全部吸附后，以5個層析柱體積去離子水沖洗層析柱，再以70%、80%、90%的乙醇進行梯度洗脫，每濃度乙醇用量為8個層析柱體積，流速為2個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合并后8(TC濃縮成流浸膏，6(TC真空干燥，即得苦豆子提取物。弱極性大孔吸附樹脂為D-201、D-301、HPD400、HPD500、AB-8牌號的弱極性大孔吸附樹脂中的一種。實施例2:苦豆子種子加10倍量水10(TC煮提兩次，每次2小時，過濾，合并濾液，濃縮至原體積的一半，力n2倍量無水乙醇放置沉淀24小時，濾除沉淀，濃縮后以氫氧化鈉調節PH值為9，上大孔吸附樹脂層析柱，待上樣液全部吸附后，以3個層析柱體積的去離子水沖洗層析柱，再以50%、60%、70%的乙醇進行梯度洗脫，每濃度乙醇用量為5個層析柱體積，流速為3個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合并后8(TC濃縮成流浸膏，6(TC真空干燥，即得苦豆子提取物。弱極性大孔吸附樹脂為D-201、D-301、HPD400、HPD500、AB-8牌號的弱極性大孔吸附樹脂中的一種。實施例3:苦豆子種子加12倍量水10(TC煮提兩次，每次2小時，過濾，合并濾液，濃縮至原體積的一半，力n3倍量無水乙醇放置沉淀48小時，濾除沉淀，濃縮后以氫氧化鈉調節PH值為11，上大孔吸附樹脂層析柱，待上樣液全部吸附后，以2個層析柱體積的去離子水沖洗層析柱，再以30%、40%、50%的乙醇進行梯度洗脫，每濃度乙醇用量為3個層析柱體積，流速為5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合并后8(TC濃縮成流浸膏，6(TC真空干燥，即得苦豆子提取物。弱極性大孔吸附樹脂為D-201、D-301、HPD400、HPD500、AB-8牌號的弱極性大孔吸附樹脂中的一種實施例4:苦豆子種子加8倍量30。/。的乙醇8(TC煮提兩次，每次3小時，過濾，合并濾液，濃縮至原體積的一半，力n4倍量無水乙醇放置沉淀24小時，濾除沉淀，濃縮后以氨水調節PH值為12，上大孔吸附樹脂層析柱，待上樣液全部吸附后，以5個層析柱體積的去離子水沖洗層析柱，再以70%、80%、90%的乙醇進行梯度洗脫，每濃度乙醇用量為5個層析柱體積，流速2個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合并后8(TC濃縮成流浸膏，6(TC真空干燥，即得苦豆子提取物。弱極性大孔吸附樹脂為D-201、D-301、HPD400、HPD500、AB-8牌號的弱極性大孔吸附樹脂中的一種。實施例5:苦豆子種子加10倍量50。/。的乙醇8(TC煮提兩次，每次3小時，過濾，合并濾液，濃縮至原體積的一半，力n5倍量無水乙醇放置沉淀48小時，濾除沉淀，濃縮后以氨水調節PH值為13，上大孔吸附樹脂層析柱，待上樣液全部吸附后，以3個層析柱體積的去離子水沖洗層析柱，再以50%、60%、70%的乙醇進行梯度洗脫，每濃度乙醇用量為3個層析柱體積，流速為3個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合并后8(TC濃縮成流浸膏，6(TC真空干燥，即得苦豆子提取物。弱極性大孔吸附樹脂為D-201、D-301、HPD400、HPD500、AB-8牌號的弱極性大孔吸附樹脂中的一種。實施例6:苦豆子種子加12倍量70。/。的乙醇8(TC煮提兩次，每次3小時，過濾，合并濾液，濃縮至原體積的一半，力n6倍量無水乙醇放置沉淀72小時，濾除沉淀，濃縮后以氨水調節PH值為14，上大孔吸附樹脂層析柱，待上樣液全部吸附后，以2個層析柱體積的去離子水沖洗層析柱，再以分別以30%、40%、50%的乙醇進行梯度脫，每濃度乙醇用量為2個層析柱體積，流速為5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合并后8(TC濃縮成流浸膏，6(TC真空干燥，即得苦豆子提取物。弱極性大孔吸附樹脂為D-201、D-301、HPD400、HPD500、AB-8牌號的弱極性大孔吸附樹脂中的一種。實施例7:苦豆子全草加8倍量水10(TC煮提兩次，每次3小時，過濾，合并濾液，濃縮至原體積的一半，力ni倍量無水乙醇放置沉淀12小時，濾除沉淀，濃縮后以氫氧化鈉調節PH值為7，上大孔吸附樹脂層析柱，待上樣液全部吸附后，以5個層析柱體積的去離子水沖洗層析柱，再以70%、80%、90%的乙醇進行梯度洗脫，每濃度乙醇用量為8個層析柱體積，流速2個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合并后8(TC濃縮成流浸膏，6(TC真空干燥，即得苦豆子提取物。弱極性大孔吸附樹脂為D-201、D-301、HPD400、HPD500、AB-8牌號的弱極性大孔吸附樹脂中的一種。實施例8:苦豆子全草加10倍量水10(TC煮提兩次，每次3小時，過濾，合并濾液，濃縮至原體積的一半，力n2倍量無水乙醇放置沉淀24小時，濾除沉淀，濃縮后以氫氧化鈉調節PH值為9，上大孔吸附樹脂層析柱，待上樣液全部吸附后，以3個層析柱體積的去離子水沖洗層析柱，再以50%、60%、70%的乙醇進行梯度洗脫，每濃度乙醇用量為5個層析柱體積，流速3個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合并后8(TC濃縮成流浸膏，(TC真空干燥，即得苦豆子提取物。弱極性大孔吸附樹脂為D-201、D-301、HPD400、HPD500、AB-8牌號的弱極性大孔吸附樹脂中的一種。實施例9:苦豆子全草加12倍量水10(TC煮提兩次，每次3小時，過濾，合并濾液，濃縮至原體積的一半，力n3倍量無水乙醇放置沉淀48小時，濾除沉淀，濃縮后以氫氧化鈉調節PH值為11，上大孔吸附樹脂層析柱，待上樣液全部吸附后，以2個層析柱體積的去離子水沖洗層析柱，再以30%、40%、50%的乙醇進行梯度洗脫，每濃度乙醇用量為3個層析柱體積，流速為5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合并后8(TC濃縮成流浸膏，6(TC真空干燥，即得苦豆子提取物。弱極性大孔吸附樹脂為D-201、D-301、HPD400、HPD500、AB-8牌號的弱極性大孔吸附樹脂中的一種。實施例10:苦豆子全草加8倍量30。/。的乙醇8(TC煮提兩次，每次2小時，過濾，合并濾液，濃縮至原體積的一半，力n4倍量無水乙醇放置沉淀24小時，濾除沉淀，濃縮后以氨水調節PH值為12，上大孔吸附樹脂層析柱，待上樣液全部吸附后，以2個層析柱體積的去離子水沖洗層析柱，再以70%、80%、90%的乙醇進行梯度洗脫，每濃度乙醇用量為5個層析柱體積，流速為2個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合并后8(TC濃縮成流浸膏，6(TC真空干燥，即得苦豆子提取物。弱極性大孔吸附樹脂為D-201、D-301、HPD400、HPD500、AB-8牌號的弱極性大孔吸附樹脂中的一種。實施例ll:苦豆子全草加10倍量50。/。的乙醇8(TC煮提兩次，每次2小時，過濾，合并濾液，濃縮至原體積的一半，力n5倍量無水乙醇放置沉淀48小時，濾除沉淀，濃縮后以氨水調節PH值為13，上大孔吸附樹脂層析柱，待上樣液全部吸附后，以3個層析柱體積的去離子水沖洗層析柱，再以50%、60%、70%的乙醇進行梯度洗脫，每濃度乙醇用量為3個層析柱體積，流速為3個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合并后8(TC濃縮成流浸膏，6(TC真空干燥，即得苦豆子提取物。弱極性大孔吸附樹脂為D-201、D-301、HPD400、HPD500、AB-8牌號的弱極性大孔吸附樹脂中的一種。實施例12:苦豆子全草加12倍量70。/。的乙醇8(TC煮提兩次，每次2小時，過濾，合并濾液，濃縮至原體積的一半，力n6倍量無水乙醇放置沉淀72小時，濾除沉淀，濃縮后以氨水調節PH值為14，上大孔吸附樹脂層析柱，待上樣液全部吸附后，以2個層析柱體積的去離子水沖洗層析柱，再以30%、40%、50%的乙醇進行梯度洗脫，每濃度乙醇用量為2個層析柱體積，流速為5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合并后8(TC濃縮成流浸膏，6(TC真空干燥，即得苦豆子提取物。弱極性大孔吸附樹脂為D-201、D-301、HPD400、HPD500、AB-8牌號的弱極性大孔吸附樹脂中的一種。實施例13，對上述實施例1至12所得苦豆子提取物進行總生物堿含量的測定:精密稱取干燥至恒重的苦參堿對照品3.5毫克，置50毫升容量瓶中，加無水乙醇40毫升，密塞超聲10分鐘，放冷后加無水乙醇至刻度，搖勻，即得O.07毫克/毫升的對照品溶液，精密量取該對照品溶液0、1、2、3、4、5毫升分別置20毫升的具塞試管中，水浴加熱揮盡乙醇，每管各加pH值7.6的溴麝香草酚藍溶液2毫升，密塞振搖2分鐘，每管再加氯仿6毫升、蒸餾水5毫升，密塞劇烈振搖5分鐘，靜置2小時后分取氯仿層，加無水硫酸鈉0.5克，振搖1分鐘，精密吸取上清液2.5毫升置10毫升容量瓶中，加氯仿至刻度，搖勻。以第一份溶液作為空白，于415納米處測定吸收度，以濃度(C)對吸收度(A)進行回歸，得回歸方程。分別精密稱取上述實施例1至12所得苦豆子提取物樣品100毫克，置100毫升容量瓶中，力陽0%的乙醇80毫升，超聲10分鐘，放冷，力陽0%的乙醇至刻度，搖勻；取該溶液2.5毫升置25毫升容量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻，得到濃度為O.l毫克/毫升的樣品溶液。精密量取樣品溶液l毫升，置20毫升具塞試管中，水浴加熱揮盡乙醇，力npH值7.6的溴麝香草酚藍溶液2毫升，密塞振搖2分鐘，加氯仿6毫升、蒸餾水5毫升，密塞劇烈振搖5分鐘，靜置2小后分取氯仿層，加無水硫酸鈉0.5克，振搖l分鐘，精密吸取上清液2.5毫升置10毫升容量瓶中，加氯仿至刻度，搖勻，于415納米處測定樣品溶液的吸收度，代入上述回歸方程，計算得上述實施例1至12所得苦豆子提取物樣品中總生物堿的含量都在50%至70%的范圍內。實施例14，對上述實施例1至12所得苦豆子提取物進行總黃酮含量的測定:精密稱取干燥至恒重的蘆丁對照品25.16毫克，置50毫升的容量瓶中，力的0%乙醇40毫升，置水浴上微熱使溶解，放冷，力的0%乙醇至刻度，搖勻，得到濃度為0.5032毫克/毫升的對照品溶液。精密量取該對照品溶液O、0.2、0.4、0.6、0.8、l.O毫升，分別置10毫升的容量瓶中，各加60%乙醇至5毫升，力卩10%亞硝酸鈉溶液0.3毫升，混勻，放置6分鐘，然后再加入10%硝酸鋁溶液0.3毫升，搖勻，放置6分鐘，最后再加入lmol/L氫氧化鈉溶液4毫升，加蒸餾水至刻度，搖勻，放置15分鐘，以第l份溶液為對照，于500納米處測定吸收度，以吸收度和濃度進行回歸，得回歸方程為。分別精密稱取上述實施例l至12所得苦豆子提取物樣品1.0g，置100毫升的容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻，得濃度為10毫克/毫升的樣品溶液，精密量取該樣品溶液l毫升，置10毫升的容量瓶中，力的0%的乙醇至5毫升，再加10%的亞硝酸鈉溶液0.3毫升，混勻，放置6分鐘，加入10%硝酸鋁溶液0.3毫升，搖勻，放置6分鐘，再加入lmol/L氫氧化鈉溶液4毫升，加蒸餾水至刻度，搖勻，放置15分鐘，另取l毫升蒸餾水與樣品溶液按同法處理，并以該溶液為對照溶液，在500納米處測定樣品溶液的吸收度，代入上述回歸方程求出苦豆子提取物樣品溶液的濃度，計算上述實施例1至12所得苦豆子提取物樣品中總黃酮的含量都在10%至20%的范圍內。在本發明中首次提出弱極性大孔吸附樹脂在苦豆子提取物生產方法中的應用。特別是所用弱極性大孔吸附樹脂最好為D-201、D-301、HPD400、HPD500、AB-8等型號的弱極性大孔吸附樹脂中的一種。將上述實施例所得一種新型的天然藥物抓苦豆子提取物進行藥效學試驗，其過程和結果如下試驗例l:本發明苦豆子提取物對5種呼吸道病毒致細胞病變的抑制作用。實驗目的考察苦豆子提取物樣品對流感甲、乙型流感病毒、l型副流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒3型的抑制活性。實驗原理分別以狗腎傳代細胞(MDCK)為流感病毒和副流感病毒的宿主，人宮頸癌細胞(Hela)為合胞病毒和腺病毒的宿主，通過觀察樣品對病毒引起細胞病變程度(CPE)的抑制作用，判斷苦豆子提取物是否具有抗病毒作用。材料和方法1、病毒株流感甲型病毒(H;jN2亞型粵防72243株)，流感乙型病毒(濟防97-13株)，l型副流感病毒(HVJ-1)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒3型(A3)分別購自中國預防醫學科學院病毒學研究所及兒科研究所。2、樣品本發明所得苦豆子提取物；陽性對照藥利巴韋林，浙江康裕藥業有限公司生產，批號960501。3、方法與結果樣品對MDCK細胞毒性的測定苦豆子提取物用培養液作2倍稀釋，取2000微克/毫升至62.5微克/毫升6個濃度，加到接種MDCK和Hela細胞并已長成單層的培養板中，100微升/L，每濃度4個復孔，同時設細胞對照。將培養板置37'C、5%(]02條件培養四天，每日觀察細胞生長情況，以細胞不出現明顯退變的最小稀釋倍數為最大無毒濃度(TCQ)。并按Reed-Muench法計算50。/。有毒濃度(TC50)。表l樣品對培養細胞的TCo和TC5Q藥液原液微克/毫升TCo微克/毫升TC5o微克/毫升本發明所得苦豆子提取物2000250925.6利巴韋林100>100樣品對病毒致細胞病變的影響實驗設細胞對照組、病毒對照組和不同稀釋度的給藥組，每組4個平行孔。取已長成單層的MDCK細胞，接種流感甲型病毒10—s(50。/。細胞培養感染量CCID5o的15倍)、流感乙型病毒10—2(CCID5o的30倍)，于37'C吸附2小時后傾去病毒液，以不含血清的維持液洗細胞表面2次。細胞對照組、病毒對照組加等體積的維持液，給藥組分別加入不同稀釋度的藥物。37°C、5%(]02條件培養，每日觀察細胞病變情況，細胞病變程度按六級標準判斷(一無病變；±:細胞病約占整個單層的10%以下；1:細胞病變約占整個單層的25%以下；2:細胞病變約占整個單層的50%以下；3:細胞病變約占整個單層的75%以下；4:細胞病變約占整個單層的75%以上)。當病毒對照組細胞病變為4時記錄實驗結果。按Reed-Muench法計算半數有效濃度EC50，并計算樣品的選擇指數TI(TC50/EC50)。測試結果見下表苦豆子提取物對呼吸道病毒抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>根據選擇指數TI(TI越大，抗病毒作用越強)的計算結果可以苦豆子提取物在體外細胞培養中對甲型流感病毒和呼吸道合胞病毒的抗病毒作用與西藥利巴韋林相當，對乙型流感病毒、l型副流感病毒、腺病毒3型的抗病毒作用優于利巴韋林。由于利巴韋林是國際公認的廣譜抗病毒藥，本實驗結果說明苦豆子提取物對流感病毒等呼吸道病毒有廣譜抗病毒作用。試驗例2:本發明苦豆子提取物在小鼠口服的半數致死量測定取昆明小鼠，雌雄各半，體重18克至22克，經預試驗獲得100%死亡到0%死亡的劑量范圍，在此范圍內設5個劑量組，劑量比為0.88，每組10只。各組給藥劑量和死亡情況見下表<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>以改良寇氏法計算苦豆子提取4勿的半數致死量LD5o為689毫克/千克，95%可信限為607毫克/千克至788毫克/千克；結果表明該苦豆子提取物口服給藥毒性較低。試驗例3:本發明苦豆子提取物對流感病毒致小鼠死亡的保護作用測定流感病毒鼠肺適應株FMi的毒力，取感染后15天內小鼠死亡率在90%以上的濃度作為實驗濃度。取昆明種小鼠(1921g)，隨機分為正常對照組、病毒感染對照組、陽性藥對照組和不同劑量的苦豆子提取物樣品給藥組，每組10只。除正常對照組外，各組小鼠以乙醚吸入法麻醉，流感病毒鼠肺適應株FM!以上述實驗濃度感染小鼠。樣品分別以LD5o的1/50、1/100、1/150、1/200、1/400等劑量給藥，觀察記錄小鼠死亡情況，找出使50%以上動物存活的劑量(認為其療效不低于ED50)，計算樣品的治療指數TI(LD50/ED50)。結果，苦豆子提取物LD5o的l/150劑量(4.6毫克/千克)可使52%的動物存活，認為本發明苦豆子提取物的治療指數為不低于150。在新藥篩選中，一般樣品在動物實驗中的治療指數大于2即認為有繼續開發的價值。實驗結果表明本發明苦豆子提取物對小鼠流感病毒性肺炎有顯著的治療作用。試驗例1和試驗例3的結果說明該苦豆子提取物可用于制備抗流感病毒等呼吸道病毒的藥物。試驗例4:本發明苦豆子提取物在人類嗜T淋巴細胞病毒I型感染的T細胞系MT-4細胞中對愛滋病毒HIV-1P24抗原的抑制作用MT-4細胞懸液計數，用100CCID5o的HIV-lIIIB感染細胞，在37。C，5%(]02培養箱中吸附1.5小時。用無血清的1640培養液洗去未吸附病毒，用培養液將感染病毒的細胞配成2X1(^個細胞/毫升，接種于96孔細胞培養板內，每孔100微升；再分別加入3倍稀釋的樣品溶液和5倍稀釋的陽性對照藥齊多夫定(AZT)溶液100微升。每個稀釋度重復3個孔，同時設細胞對照組和病毒對照組。培養板置于37。C、5%(]02飽和濕度培養箱內培養。4天后吸出上清，-20卩凍存，待測HIV-1P24抗原滴度。細胞加MTT染色測藥物對細胞的毒性。MTT染色測定細胞毒性:每孔加5毫克/毫升MTT10微升染色，37°C、5%(]02飽和濕度培養箱內培養4小時后，每孔加入100微升50。/。DMF-17%TritonX-IOO脫色液，37。C過夜，酶標儀上波長為570納米處測定0D值，計算藥物半數有毒濃度(CC50)。測定樣品在細胞培養內抑制HIV-1P24抗原的EC5o:將凍存的感染病毒的MT-4上清液融化后進行稀釋，按預實驗結果調整稀釋比例。按照HIV-1P24抗原檢測試劑盒說明測定HIV-1P24抗原滴度，加樣組與病毒對照組比較，計算樣品的EC5o及選擇指數TI(CC50/EC50)，結果見下表樣品CC50(yg/毫升)EC50(yg/毫升)TI苦豆子提取物960.50.611574.6齊多夫定14.00.00851647本實驗中陽性對照藥齊多夫定為目前國際上公認有效的抗愛滋病毒藥物，其對HIV-1P24抗原的抑制結果CC50、EC5o及TI值符合文獻報道，說明本實驗數據可信。苦豆子提取物對HIV-1P24抗原的選擇指數TI接近齊多夫定，說明該苦豆子提取物可用于制備抗愛滋病毒藥物。綜上所述，以國內目前篩選抗病毒藥常用的細胞模型和動物模型對本發明苦豆子提取物進行體內外抗病毒實驗研究，結果表明本發明苦豆子提取物在培養細胞中對甲型流感病毒(粵防72243株)，乙型流感病毒(濟防97-13株)、l型副流感病毒(HVJ-1)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒3型(A3)有明顯的抑制作用，且本發明苦豆子提取物對上述病毒的選擇指數均大于已上市的抗流感病毒西藥利巴韋林(注選擇指數越大表明藥物在細胞實驗中的抗病毒作用越強)；本發明苦豆子提取物口服對小鼠流感病毒性肺炎模型具有明顯的保護作用，使半數動物存活的給藥劑量即半數有效劑量為4.6毫克/千克；另測定本發明苦豆子提取物給小鼠口服的半數致死量為689毫克/千克；半數致死量與半數有效劑量的比值即本發明苦豆子提取物在動物實驗中的抗病毒治療指數為150，故認為該苦豆子提取物的開發前景良好(注治療指數越大表明在動物實驗中的治療作用越好，通常治療指數大于2即被認為是有開發前景的藥物)。另外，選擇目前最常用的篩選外源性抗愛滋病藥物的細胞系人類嗜T淋巴細胞病毒I型感染的T細胞系(MT.4細胞系)對該苦豆子提取物進行抗愛滋病毒作用的研究，以愛滋病病毒(HIV-1IIIB株)感染MT.4細胞，并加入不同濃度的苦豆子提取物溶液，檢測細胞培養上清液中的HIV-1P24抗原滴度，根據苦豆子提取物對HIV-1P24抗原的抑制作用的選擇指數大小判斷其對愛滋病毒的抑制作用(選擇指數越大，說明抗愛滋病毒作用越強)。結果本發明苦豆子提取物在MT.4細胞培養中對愛滋病病毒(HIV-1IIIB株)有明顯的抑制作用，對愛滋病毒HIV-1P24抗原抑制作用的選擇指數為1574.6，而已上市的抗愛滋病西藥齊多夫定選擇指數為1647，二者在細胞實驗中抗愛滋病毒作用強度相當，說明該苦豆子提取物可同時作為抗愛滋病毒藥物應用。因此，本發明苦豆子提取物可用于制備針對流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等呼吸道病毒和愛滋病毒的廣譜抗病毒藥物。權利要求1、一種苦豆子提取物，其特征在于含有50％至70％的生物堿類成分和10％至20％的黃酮類成分。全文摘要一種苦豆子提取物及其生產方法和應用。該苦豆子提取物含有生物堿類成分和黃酮類成分。該生產方法按第一步水或乙醇粗提、第二步用乙醇沉淀雜質、第三步用大孔吸附樹脂吸附粗提物中的提取物；第四步用溶劑洗脫得到提取物的洗脫液、第五步將洗脫液濃縮回收乙醇得到苦豆子提取物。本發明能同時富集苦豆子粗提物中的生物堿類成分和黃酮類成分，工藝可靠，提取物中生物堿類成分和黃酮類成分的含量穩定；其生產成本大大降低，并解決了現有技術對人員和環境危害大等問題，更適合于產業化。本發明所得苦豆子提取物經實驗研究表明具有顯著的抗流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒以及愛滋病毒作用，且口服毒性較低，可應用于制備廣譜抗病毒藥物。文檔編號A61P31/14GK101129455SQ20071020175公開日2008年2月27日申請日期2007年9月18日優先權日2007年9月18日發明者燕劉,楊巧麗,雪王,顧政一,華黃申請人:新疆維吾爾自治區藥物研究所