一種復方斑蝥口服制劑的質量控制方法

專利名稱：一種復方斑蝥口服制劑的質量控制方法
技術領域：
本發明涉及一種復方斑蝥口服制劑的質量控制方法，屬于對藥品進行質量控制的技術領域。
背景技術：
惡性腫瘤是一種嚴重危害人類健康的疾病，幾十年來人類一直在不斷的研究和開發新的藥物以有效的抑制惡性腫瘤的生長。在研究過程中，有效的篩選出具有抗腫瘤作用的藥物就顯得尤為重要。復方斑蝥口服制劑由斑蝥、人參、黃芪、刺五加、三棱、半枝蓮、莪術、山茱萸、女貞子、熊膽粉、甘草共十一味藥物制備而成，具有破血消瘀，攻毒蝕瘡的作用，主要用于原發性肝癌、肺癌、直腸癌、惡性淋巴瘤、婦科惡性腫瘤等疾病。其中“復方斑蝥膠囊”在國家衛生部藥品標準中藥成方制劑第十七冊有記載。但是經過研究發現，現有復方斑蝥制劑存在著質量控制標準簡單，產品質量不易控制等缺點。半枝蓮、山茱萸、女貞子等為復方斑蝥制劑中有效成分，而現有制劑質量標準沒有將其薄層鑒別方法收入其中；對人參和黃芪兩味藥材的薄層鑒別中，展開劑的選擇不夠理想，造成放置時間較長，操作不便，并且由于操作環境等因素影響，導致在鑒別過程中分離度不好，斑點顯色不夠清晰；氯仿毒性較大，為國家列出的二類溶劑，現有制劑提取工藝是用氯仿進行浸提，而在質量標準中沒有嚴格要求控制其限度。另外，現有制劑質量標準對復方斑蝥制劑中有效成分黃芪和斑蝥素的含量沒有建立準確有效的測定方法。故現有質量控制方法不能有效控制復方斑蝥口服制劑的質量，從而將影響該制劑的臨床療效。但是如何制定科學合理的質量控制方法，有效控制這種口服制劑的質量，從而確保其臨床療效，是本領域技術人員必須考慮的問題。

發明內容
本發明的目的在于提供一種復方斑蝥口服制劑的質量控制方法，該口服制劑包括膠囊劑、片劑、顆粒劑。本發明針對現有技術的不足，對復方斑蝥口服制劑的質量控制方法進行了研究，增加了黃芪和斑蝥素的含量測定以及半枝蓮、山茱萸、女貞子的薄層鑒別項目，增加了氯仿殘留量的檢查，并對人參和黃芪兩味藥材的薄層鑒別方法進行了改進，對展開劑以及薄層板的厚度進行選擇，優化了鑒別方法，提高了這種復方斑蝥口服制劑的質量控制標準，從而保證了該制劑的臨床療效。
本發明所述復方斑蝥口服制劑是這樣構成的按照重量組份計算它主要由斑蝥4-12、人參10-30、黃芪50-150、刺五加50-150、三棱16-48、半枝蓮60-180、莪術16-48、山茱萸20-60、女貞子20-60、熊膽粉0.4-1.2和甘草10-30制備而成。其制備方法為以上十一味，除熊膽粉外，人參、山茱萸、女貞子、半枝蓮粉碎成細粉，過篩，備用；斑蝥用氯仿浸泡提取1-5次，每次16-48ml，浸泡48-96小時，合并提取液，回收氯仿，濃縮至稠膏狀；其余黃芪等五味加水煎煮1-5次，每次0.5-5小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度約為1.00-1.40(60-100℃)；熊膽粉加80℃水溶解后，加入上述稠膏、濃縮液及人參等細粉，攪勻，在100℃以下烘干，粉碎成細粉，加入輔料，用常規方法制成膠囊劑、片劑或顆粒劑。本制劑中可加入輔料，也可不加入輔料。
本發明所述質量控制方法主要包括性狀、鑒別、檢查以及含量測定項目中的部分或全部；其中鑒別包括對制劑中人參、黃芪、半枝蓮、山茱萸和女貞子的薄層色譜鑒別；檢查包括水分、氯仿殘留量以及其他常規項目；含量測定是對制劑中黃芪和斑蝥中所含斑蝥素的含量測定。
人參和黃芪的鑒別方法是以人參皂苷Rg1對照品及黃芪甲苷對照品為對照，以三氯甲烷∶甲醇∶水＝5-50∶2-20∶0.5-10的下層溶液為展開劑的薄層色譜法；半枝蓮的鑒別方法是以半枝蓮對照藥材為對照，以甲苯∶甲酸乙酯∶甲酸＝2-20∶1-9∶1-9為展開劑的薄層色譜法；山茱萸的鑒別方法是以馬錢苷對照品為對照，以甲苯∶丙酮∶無水乙醇∶甲酸＝1-9∶5-50∶0.5-10∶0.1-0.9為展開劑的薄層色譜法；女貞子的鑒別方法是以女貞子對照藥材為對照，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝10-50∶1-9∶0.1-0.9為展開劑的薄層色譜法；氯仿殘留量的檢查方法是以氯仿對照品為對照的氣相色譜法；黃芪的含量測定方法是以黃芪甲苷對照品為對照，以乙腈∶水＝10-90∶90-10為流動相的高效液相色譜法；斑蝥中所含斑蝥素的含量測定方法是以斑蝥素對照品為對照的氣相色譜法。
所述鑒別方法包括以下項目的部分或全部(1)取膠囊劑、片劑或顆粒劑，研細，置索氏提取器中，加適量氯仿，置水浴中回流提取，棄去氯仿液，取出濾筒，晾干，待氯仿揮盡，再置索氏提取器中，加適量甲醇，置水浴中回流提取，回收甲醇至干，殘渣加氫氧化鈉溶液使溶解，轉至分液漏斗中，再用水洗滌容器，轉移至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇提取，提取液用水洗滌，分取正丁醇液，蒸干，殘渣用水溶解，轉移至中性氧化鋁柱上，先用氯仿洗脫，棄去氯仿洗脫液，再用甲醇洗脫，洗脫液于水浴上蒸干，殘渣加甲醇使溶解，作為供試品溶液；另取人參皂苷Rg1對照品及黃芪甲苷對照品，加甲醇溶解，作為對照品溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液及對照品溶液，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷∶甲醇∶水＝5-50∶2-20∶0.5-10的下層溶液為展開劑(必要時控制濕度)，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置200-500nm紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；(2)取膠囊劑、片劑或顆粒劑，研細，加乙醚加熱回流，放冷，濾過，棄去濾液，藥渣加甲醇加熱回流，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇溶解，作為供試品溶液；另取半支蓮對照藥材，同法制成對照藥材溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液及對照藥材溶液，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯∶甲酸乙酯∶甲酸＝2-20∶1-9∶1-9為展開劑，展開，取出，晾干；置200-500nm紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；(3)取膠囊劑、片劑或顆粒劑，研細，加甲醇，加熱回流，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇適量溶解，加于中性氧化鋁柱上，用甲醇洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇使溶解，作為供試品溶液；另取馬錢苷對照品，加甲醇溶解，作為對照品溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液及對照品溶液，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上(點成帶狀)，以甲苯∶丙酮∶無水乙醇∶甲酸＝1-9∶5-50∶0.5-10∶0.1-0.9為展開劑，展開，取出，晾干；噴以10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點清晰；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；(4)取膠囊劑、片劑或顆粒劑，研細，加乙酸乙酯，超聲，濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇溶解，作為供試品溶液；另取女貞子對照藥材，同法制成對照藥材溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液及對照藥材溶液，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝10-50∶1-9∶0.1-0.9為展開劑，展開，取出，晾干；噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。
更具體的鑒別方法包括以下項目的部分或全部(1)取膠囊劑、片劑或顆粒劑各2-5g，研細，置索氏提取器中，加適量氯仿，置水浴中回流提取1-3小時，棄去氯仿液，取出濾筒，晾干，待氯仿揮盡，再置索氏提取器中，加適量甲醇，置水浴中回流提取2-6小時，回收甲醇至干，殘渣加5％氫氧化鈉溶液1-10ml使溶解，轉至分液漏斗中，再用1-10ml水分1-3次洗滌容器，轉移至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇提取2-6次，每次2-20ml，合并正丁醇液，用水洗滌1-3次，每次1-10ml，分取正丁醇液，蒸干，殘渣用0.4-1.2ml水分1-5次溶解，轉移至2g、干法裝柱、直徑1cm、長25cm、100～200目的中性氧化鋁柱上，先用10-50ml氯仿洗脫，棄去氯仿洗脫液，再用70％甲醇10-40ml洗脫，洗脫液于水浴上蒸干，殘渣加甲醇0.5-2ml使溶解，作為供試品溶液；另取人參皂苷Rg1對照品及黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1ml各含0.5-2mg的混合溶液，作為對照品溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液5-20μl，對照品溶液2-10μl，分別點于450-550μm厚的同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷∶甲醇∶水＝5-50∶2-20∶0.5-10的下層溶液為展開劑(必要時控制濕度)，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置200-500nm紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；(2)取膠囊劑、片劑或顆粒劑1-4g，研細，加乙醚10-40ml，加熱回流10-50分鐘，放冷，濾過，棄去濾液，藥渣加甲醇10-40ml，加熱回流10-50分鐘，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇0.5-2ml溶解，作為供試品溶液；另取半支蓮對照藥材0.5-2g，同法制成對照藥材溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液、對照藥材溶液各2-20μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯∶甲酸乙酯∶甲酸＝2-20∶1-9∶1-9為展開劑，展開，取出，晾干；置200-500nm紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；(3)取膠囊劑、片劑或顆粒劑1-5g，研細，加50％甲醇10-50ml，加熱回流0.5-2小時，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加50％甲醇適量溶解，加于4g、100～200目的中性氧化鋁柱上，用40％甲醇20-80ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇0.5-2ml使溶解，作為供試品溶液；另取馬錢苷對照品，加甲醇制成每1ml含0.5-2mg的溶液，作為對照品溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液、對照品溶液各5-20μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上(點成帶狀)，以甲苯∶丙酮∶無水乙醇∶甲酸＝1-9∶5-50∶0.5-10∶0.1-0.9為展開劑，展開，取出，晾干；噴以10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點清晰；供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；(4)取膠囊劑、片劑或顆粒劑1-5g，研細，加乙酸乙酯10-40ml，超聲10-30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇0.5-2ml溶解，作為供試品溶液；另取女貞子對照藥材0.2-2g，同法制成對照藥材溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液、對照藥材溶液各2-20μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝10-50∶1-9∶0.1-0.9為展開劑，展開，取出，晾干；噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。
氯仿殘留量的檢查方法為照氣相色譜法測定柱長30m、內徑0.25mm、膜厚0.25μm的彈性石英毛細管柱Rtx-5，以5％苯基-甲基硅氧烷為固定相；程序升溫初始溫度60℃，保持5min，以每分鐘30℃的速率升溫至180℃，保持5min；FID檢測器；進樣口溫度200℃；檢測器溫度250℃；分流比10∶1；線速度30cm/sec；氫氣流量40mL/min；空氣流量400mL/min；采用頂空進樣氣化室溫度為100-120℃，加熱25-40min，進樣針溫度110-120℃，傳輸管溫度110-130℃；理論板數以氯仿峰計算應不低于5000；精密稱取氯仿對照品，加75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，即得對照品溶液；取裝量差異項下的膠囊劑、片劑或顆粒劑，精密稱定，置具塞試管中，精密加入75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，密塞，振搖，離心，取上清液，即得供試品溶液；分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液于頂空瓶中，軋蓋，于頂空爐中高溫平衡一段時間后，分別取頂空瓶中飽和氣體注入氣相色譜儀測定；本口服制劑中，氯仿殘留量不得過0.006％。
更具體的氯仿殘留量的檢查方法為照氣相色譜法測定柱長30m、內徑0.25mm、膜厚0.25μm的彈性石英毛細管柱Rtx-5，以5％苯基-甲基硅氧烷為固定相；程序升溫初始溫度60℃，保持5min，以每分鐘30℃的速率升溫至180℃，保持5min；FID檢測器；進樣口溫度200℃；檢測器溫度250℃；分流比10∶1；線速度30cm/sec；氫氣流量40mL/min；空氣流量400mL/min；采用頂空進樣氣化室溫度為100-120℃，加熱25-40min，進樣針溫度110-120℃，傳輸管溫度110-130℃；理論板數以氯仿峰計算應不低于5000；精密稱取氯仿對照品，加75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，制成每1mL含10-30μg的溶液，即得對照品溶液；取裝量差異項下的膠囊劑、片劑或顆粒劑，取內容物約0.5-2.0g，精密稱定，置具塞試管中，精密加入75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)5-20ml，密塞，振搖1-5min，離心，取上清液，即得供試品溶液；分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各1-4ml于20ml頂空瓶中，軋蓋，于頂空爐中110℃平衡20-50min后，分別取頂空瓶中飽和氣體0.5-2.0ml注入氣相色譜儀測定；本口服制劑中，氯仿殘留量不得過0.006％。
所述含量測定方法包括以下項目的部分或全部(1)黃芪 照高效液相色譜法測定色譜柱為C18或C4或C8柱，以乙腈∶水＝10-90∶90-10為流動相；流速0.5-1.0ml/min；柱溫30-60℃；蒸發光散射檢測器漂移管溫度為80-100℃；霧化氣體為空氣，流速為1.5-3.0L/min；理論板數按黃芪甲苷峰計算應不低于3000；精密稱取黃芪甲苷對照品，加甲醇溶解，搖勻，即得對照品溶液；取裝量差異項下的膠囊劑、片劑或顆粒劑，精密稱定，置索氏提取器中，加2％氫氧化鉀甲醇溶液，加熱回流，提取液蒸干，殘渣加水使溶解后轉移至分液漏斗中，用乙酸乙酯提取；加水洗滌，棄去乙酸乙酯液，合并水液，用水飽和的正丁醇提取；提取后用氨試液洗滌，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水適量使溶解，轉移至D101型大孔吸附樹脂柱上，用水洗脫，棄去水液，再用70％乙醇洗脫，收集洗脫液，蒸干，用甲醇溶解并轉移至量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過，即得供試品溶液；分別精密吸取對照品溶液1-10μl和2-20μl、供試品溶液2-20μl注入液相色譜儀測定含量；本口服制劑中，膠囊劑中含黃芪以黃芪甲苷C41H68O14計，不得少于0.08mg/g；片劑中含黃芪以黃芪甲苷C41H68O14計，不得少于0.08mg/g；顆粒劑中含黃芪以黃芪甲苷C41H68O14計，不得少于0.01mg/g；(2)斑蝥素 照氣相色譜法測定玻璃色譜柱1-2m×3mm id，OV-17固定液的涂漬量為1.5％，擔體Shimalite W(AW-DMCS)80-100目；FID檢測器，進樣口溫度230-250℃；檢測器溫度230-250℃；柱溫為150-160℃；理論板數按斑蝥素峰計算應不低于1000；取斑蝥素對照品，精密稱定，加氯仿溶解，搖勻，即得對照品溶液；取裝量差異項下的膠囊劑、片劑或顆粒劑，精密稱定，置燒杯中，加入氯化鈉氫氧化鈉溶液，再加入丙酮，超聲，放冷，加入濃鹽酸，攪拌，靜置，放冷，抽濾，用少量水洗滌殘渣，合并濾液，濾液用氯仿萃取，氯仿液置50℃水浴上揮至少量(整個操作過程中不得將氯仿揮干)，再加氯仿定容，搖勻，即得供試品溶液；分別精密量取對照品溶液與供試品溶液各0.5-5μl，注入氣相色譜儀測定含量；本口服制劑中，膠囊劑中含斑蝥素C10H12O4為0.025-0.180mg/g；片劑中含斑蝥素C10H12O4為0.025-0.180mg/g；顆粒劑中含斑蝥素C10H12O4為0.003-0.018mg/g。
更具體的含量測定方法包括以下項目的部分或全部(1)黃芪 照高效液相色譜法測定色譜柱為C18或C4或C8柱，以乙腈∶水＝10-90∶90-10為流動相；流速0.5-1.0ml/min；柱溫30-60℃；蒸發光散射檢測器漂移管溫度為80-100℃；霧化氣體為空氣，流速為1.5-3.0L/min；理論板數按黃芪甲苷峰計算應不低于3000；精密稱取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1ml含0.05-0.5mg的溶液，即得對照品溶液；取裝量差異項下的膠囊劑、片劑或顆粒劑，研細，取約0.5-2g，精密稱定，置索氏提取器中，加2％氫氧化鉀甲醇溶液50-100ml，加熱回流4-6小時，提取液蒸干，殘渣加水10-40ml使溶解后轉移至分液漏斗中，用乙酸乙酯提取1-3次，每次10-40ml；合并乙酸乙酯液，加水10-20ml洗滌；棄去乙酸乙酯液，合并水液，用水飽和的正丁醇提取3-5次，每次20-60ml；合并正丁醇提取液，用氨試液20-60ml洗滌1-2次，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水適量使溶解，轉移至內徑1.5cm、長12cm的D101型大孔吸附樹脂柱上，用水30-70ml洗脫，棄去水液，再用70％乙醇60-100ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，用甲醇溶解并轉移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液；分別精密吸取對照品溶液1-10μl和2-20μl、供試品溶液2-20μl注入液相色譜儀測定含量；本口服制劑中，膠囊劑中含黃芪以黃芪甲苷C41H68O14計，不得少于0.08mg/g；片劑中含黃芪以黃芪甲苷C41H68O14計，不得少于0.08mg/g；顆粒劑中含黃芪以黃芪甲苷C41H68O14計，不得少于0.01mg/g；
(2)斑蝥素 照氣相色譜法測定玻璃色譜柱1-2m×3mm id，OV-17 50％甲基-50％苯基聚硅氧烷固定液的涂漬量為1.5％，擔體Shimalite W(AW-DMCS)80-100目；FID檢測器，進樣口溫度230-250℃；檢測器溫度230-250℃；柱溫為150-160℃；理論板數按斑蝥素峰計算應不低于1000；取斑蝥素對照品，精密稱定，加氯仿制成每1ml含30-50μg的溶液，即得對照品溶液；取裝量差異項下的膠囊劑、片劑或顆粒劑內容物，研細，取約1-3g，精密稱定，置100ml燒杯中，加入氯化鈉-氫氧化鈉溶液30-50ml，再加入0.5-2ml丙酮，功率250w、頻率20kHz下超聲20-50分鐘，放冷，加入2-8ml濃鹽酸，攪拌，靜置，放冷，抽濾，用少量水洗滌殘渣，合并濾液，濾液用氯仿萃取2-4次，每次30-40ml，合并氯仿液，置50℃水浴上揮至1～2ml(整個操作過程中不得將氯仿揮干)，再加氯仿定容至3ml，搖勻，即得供試品溶液；分別精密量取對照品溶液與供試品溶液各0.5-5μl，注入氣相色譜儀測定含量；本口服制劑中，膠囊劑中含斑蝥素C10H12O4為0.025-0.180mg/g；片劑中含斑蝥素C10H12O4為0.025-0.180mg/g；顆粒劑中含斑蝥素C10H12O4為0.003-0.018mg/g。
本發明所述質量控制方法包括性狀對于膠囊劑，內容物為黃綠色至棕褐色的粉末，味微苦回甜；對于片劑，產品為薄膜衣片，除去薄膜衣后顯黃綠色至棕褐色，味微苦回甜；對于顆粒劑，產品為棕黃色至深褐色的顆粒；味甜；鑒別(1)取膠囊劑、片劑或顆粒劑，研細，置索氏提取器中，加適量氯仿，置水浴中回流提取，棄去氯仿液，取出濾筒，晾干，待氯仿揮盡，再置索氏提取器中，加適量甲醇，置水浴中回流提取，回收甲醇至干，殘渣加氫氧化鈉溶液使溶解，轉至分液漏斗中，再用水洗滌容器，轉移至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇提取，提取液用水洗滌，分取正丁醇液，蒸干，殘渣用水溶解，轉移至中性氧化鋁柱上，先用氯仿洗脫，棄去氯仿洗脫液，再用甲醇洗脫，洗脫液于水浴上蒸干，殘渣加甲醇使溶解，作為供試品溶液；另取人參皂苷Rg1對照品及黃芪甲苷對照品，加甲醇溶解，作為對照品溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液及對照品溶液，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷∶甲醇∶水＝5-50∶2-20∶0.5-10的下層溶液為展開劑(必要時控制濕度)，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置200-500nm紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；(2)取膠囊劑、片劑或顆粒劑，研細，加乙醚加熱回流，放冷，濾過，棄去濾液，藥渣加甲醇加熱回流，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇溶解，作為供試品溶液；另取半支蓮對照藥材，同法制成對照藥材溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液及對照藥材溶液，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯∶甲酸乙酯∶甲酸＝2-20∶1-9∶1-9為展開劑，展開，取出，晾干；置200-500nm紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；(3)取膠囊劑、片劑或顆粒劑，研細，加甲醇，加熱回流，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇適量溶解，加于中性氧化鋁柱上，用甲醇洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇使溶解，作為供試品溶液；另取馬錢苷對照品，加甲醇溶解，作為對照品溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液及對照品溶液，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上(點成帶狀)，以甲苯∶丙酮∶無水乙醇∶甲酸＝1-9∶5-50∶0.5-10∶0.1-0.9為展開劑，展開，取出，晾干；噴以10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點清晰；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；(4)取膠囊劑、片劑或顆粒劑，研細，加乙酸乙酯，超聲，濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇溶解，作為供試品溶液；另取女貞子對照藥材，同法制成對照藥材溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液及對照藥材溶液，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝10-50∶1-9∶0.1-0.9為展開劑，展開，取出，晾干；噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；檢查水分 不得過15.0％；氯仿殘留量 照氣相色譜法測定柱長30m、內徑0.25mm、膜厚0.25μm的彈性石英毛細管柱Rtx-5，以5％苯基-甲基硅氧烷為固定相；程序升溫初始溫度60℃，保持5min，以每分鐘30℃的速率升溫至180℃，保持5min；FID檢測器；進樣口溫度200℃；檢測器溫度250℃；分流比10∶1；線速度30cm/sec；氫氣流量40mL/min；空氣流量400mL/min；采用頂空進樣氣化室溫度為100-120℃，加熱25-40min，進樣針溫度110-120℃，傳輸管溫度110-130℃；理論板數以氯仿峰計算應不低于5000；精密稱取氯仿對照品，加75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，即得對照品溶液；取裝量差異項下的膠囊劑、片劑或顆粒劑，精密稱定，置具塞試管中，精密加入75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，密塞，振搖，離心，取上清液，即得供試品溶液；分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液于頂空瓶中，軋蓋，于頂空爐中高溫平衡一段時間后，分別取頂空瓶中飽和氣體注入氣相色譜儀測定；本口服制劑中，氯仿殘留量不得過0.006％；其他 本發明的膠囊劑、片劑或顆粒劑應符合中國藥典關于膠囊劑、片劑或顆粒劑項下的有關規定；
含量測定(1)黃芪 照高效液相色譜法測定色譜柱為C18或C4或C8柱，以乙腈∶水＝10-90∶90-10為流動相；流速0.5-1.0ml/min；柱溫30-60℃；蒸發光散射檢測器漂移管溫度為80-100℃；霧化氣體為空氣，流速為1.5-3.0L/min；理論板數按黃芪甲苷峰計算應不低于3000；精密稱取黃芪甲苷對照品，加甲醇溶解，搖勻，即得對照品溶液；取裝量差異項下的膠囊劑、片劑或顆粒劑，精密稱定，置索氏提取器中，加2％氫氧化鉀甲醇溶液，加熱回流，提取液蒸干，殘渣加水使溶解后轉移至分液漏斗中，用乙酸乙酯提取；加水洗滌，棄去乙酸乙酯液，合并水液，用水飽和的正丁醇提取；提取后用氨試液洗滌，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水適量使溶解，轉移至D101型大孔吸附樹脂柱上，用水洗脫，棄去水液，再用70％乙醇洗脫，收集洗脫液，蒸干，用甲醇溶解并轉移至量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過，即得供試品溶液；分別精密吸取對照品溶液1-10μl和2-20μl、供試品溶液2-20μl注入液相色譜儀測定含量；本口服制劑中，膠囊劑中含黃芪以黃芪甲苷C41H68O14計，不得少于0.08mg/g；片劑中含黃芪以黃芪甲苷C41H68O14計，不得少于0.08mg/g；顆粒劑中含黃芪以黃芪甲苷C41H68O14計，不得少于0.01mg/g；(2)斑蝥素 照氣相色譜法測定玻璃色譜柱1-2m×3mm id，OV-17固定液的涂漬量為1.5％，擔體Shimalite W(AW-DMCS)80-100目；FID檢測器，進樣口溫度230-250℃；檢測器溫度230-250℃；柱溫為150-160℃；理論板數按斑蝥素峰計算應不低于1000；取斑蝥素對照品，精密稱定，加氯仿溶解，搖勻，即得對照品溶液；取裝量差異項下的膠囊劑、片劑或顆粒劑，精密稱定，置燒杯中，加入氯化鈉氫氧化鈉溶液，再加入丙酮，超聲，放冷，加入濃鹽酸，攪拌，靜置，放冷，抽濾，用少量水洗滌殘渣，合并濾液，濾液用氯仿萃取，氯仿液置50℃水浴上揮至少量(整個操作過程中不得將氯仿揮干)，再加氯仿定容，搖勻，即得供試品溶液；分別精密量取對照品溶液與供試品溶液各0.5-5μl，注入氣相色譜儀測定含量；本口服制劑中，膠囊劑中含斑蝥素C10H12O4為0.025-0.180mg/g；片劑中含斑蝥素C10H12O4為0.025-0.180mg/g；顆粒劑中含斑蝥素C10H12O4為0.003-0.018mg/g。
申請人經研究發現，采用以下質量控制方法將更容易控制復方斑蝥口服制劑的質量，更利于保證該制劑的臨床療效。故所述質量控制方法還可包括性狀對于膠囊劑，內容物為黃綠色至棕褐色的粉末，味微苦回甜；對于片劑，產品為薄膜衣片，除去薄膜衣后顯黃綠色至棕褐色，味微苦回甜；對于顆粒劑，產品為棕黃色至深褐色的顆粒；味甜；鑒別(1)取膠囊劑、片劑或顆粒劑各2-5g，研細，置索氏提取器中，加適量氯仿，置水浴中回流提取1-3小時，棄去氯仿液，取出濾筒，晾干，待氯仿揮盡，再置索氏提取器中，加適量甲醇，置水浴中回流提取2-6小時，回收甲醇至干，殘渣加5％氫氧化鈉溶液1-10ml使溶解，轉至分液漏斗中，再用1-10ml水分1-3次洗滌容器，轉移至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇提取2-6次，每次2-20ml，合并正丁醇液，用水洗滌1-3次，每次1-10ml，分取正丁醇液，蒸干，殘渣用0.4-1.2ml水分1-5次溶解，轉移至2g、干法裝柱、直徑1cm、長25cm、100～200目的中性氧化鋁柱上，先用10-50ml氯仿洗脫，棄去氯仿洗脫液，再用70％甲醇10-40ml洗脫，洗脫液于水浴上蒸干，殘渣加甲醇0.5-2ml使溶解，作為供試品溶液；另取人參皂苷Rg1對照品及黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1ml各含0.5-2mg的混合溶液，作為對照品溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液5-20μl，對照品溶液2-10μl，分別點于450-550μm厚的同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷∶甲醇∶水＝5-50∶2-20∶0.5-10的下層溶液為展開劑(必要時控制濕度)，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置200-500nm紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；(2)取膠囊劑、片劑或顆粒劑1-4g，研細，加乙醚10-40ml，加熱回流10-50分鐘，放冷，濾過，棄去濾液，藥渣加甲醇10-40ml，加熱回流10-50分鐘，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇0.5-2ml溶解，作為供試品溶液；另取半支蓮對照藥材0.5-2g，同法制成對照藥材溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液、對照藥材溶液各2-20μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯∶甲酸乙酯∶酸＝2-20∶1-9∶1-9為展開劑，展開，取出，晾干；置200-500nm紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；(3)取膠囊劑、片劑或顆粒劑1-5g，研細，加50％甲醇10-50ml，加熱回流0.5-2小時，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加50％甲醇適量溶解，加于4g、100～200目的中性氧化鋁柱上，用40％甲醇20-80ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇0.5-2ml使溶解，作為供試品溶液；另取馬錢苷對照品，加甲醇制成每1ml含0.5-2mg的溶液，作為對照品溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液、對照品溶液各5-20μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上(點成帶狀)，以甲苯∶丙酮∶無水乙醇∶甲酸＝1-9∶5-50∶0.5-10∶0.1-0.9為展開劑，展開，取出，晾干；噴以10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點清晰；供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；(4)取膠囊劑、片劑或顆粒劑1-5g，研細，加乙酸乙酯10-40ml，超聲10-30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇0.5-2ml溶解，作為供試品溶液；另取女貞子對照藥材0.2-2g，同法制成對照藥材溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液、對照藥材溶液各2-20μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝10-50∶1-9∶0.1-0.9為展開劑，展開，取出，晾干；噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；檢查水分 不得過15.0％；氯仿殘留量 照氣相色譜法測定柱長30m、內徑0.25mm、膜厚0.25μm的彈性石英毛細管柱Rtx-5，以5％苯基-甲基硅氧烷為固定相；程序升溫初始溫度60℃，保持5min，以每分鐘30℃的速率升溫至180℃，保持5min；FID檢測器；進樣口溫度200℃；檢測器溫度250℃；分流比10∶1；線速度30cm/sec；氫氣流量40mL/min；空氣流量400mL/min；采用頂空進樣氣化室溫度為100-120℃，加熱25-40min，進樣針溫度110-120℃，傳輸管溫度110-130℃；理論板數以氯仿峰計算應不低于5000；精密稱取氯仿對照品，加75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，制成每1mL含10-30μg的溶液，即得對照品溶液；取裝量差異項下的膠囊劑、片劑或顆粒劑，取內容物約0.5-2.0g，精密稱定，置具塞試管中，精密加入75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)5-20ml，密塞，振搖1-5min，離心，取上清液，即得供試品溶液；分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各1-4ml于20ml頂空瓶中，軋蓋，于頂空爐中110℃平衡20-50min后，分別取頂空瓶中飽和氣體0.5-2.0ml注入氣相色譜儀測定；本口服制劑中，氯仿殘留量不得過0.006％；其他 本發明的膠囊劑、片劑或顆粒劑應符合中國藥典關于膠囊劑、片劑或顆粒劑項下的有關規定；含量測定(1)黃芪 照高效液相色譜法測定色譜柱為C18或C4或C8柱，以乙腈∶水＝10-90∶90-10為流動相；流速0.5-1.0ml/min；柱溫30-60℃；蒸發光散射檢測器漂移管溫度為80-100℃；霧化氣體為空氣，流速為1.5-3.0L/min；理論板數按黃芪甲苷峰計算應不低于3000；精密稱取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1ml含0.05-0.5mg的溶液，即得對照品溶液；取裝量差異項下的膠囊劑、片劑或顆粒劑，研細，取約0.5-2g，精密稱定，置索氏提取器中，加2％氫氧化鉀甲醇溶液50-100ml，加熱回流4-6小時，提取液蒸干，殘渣加水10-40ml使溶解后轉移至分液漏斗中，用乙酸乙酯提取1-3次，每次10-40ml；合并乙酸乙酯液，加水10-20ml洗滌；棄去乙酸乙酯液，合并水液，用水飽和的正丁醇提取3-5次，每次20-60ml；合并正丁醇提取液，用氨試液20-60ml洗滌1-2次，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水適量使溶解，轉移至內徑1.5cm、長12cm的D101型大孔吸附樹脂柱上，用水30-70ml洗脫，棄去水液，再用70％乙醇60-100ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，用甲醇溶解并轉移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液；分別精密吸取對照品溶液1-10μl和2-20μl、供試品溶液2-20μl注入液相色譜儀測定含量；本口服制劑中，膠囊劑中含黃芪以黃芪甲苷C41H68O14計，不得少于0.08mg/g；片劑中含黃芪以黃芪甲苷C41H68O14計，不得少于0.08mg/g；顆粒劑中含黃芪以黃芪甲苷C41H68O14計，不得少于0.01mg/g；(2)斑蝥素 照氣相色譜法測定玻璃色譜柱1-2m×3mm id，OV-17 50％甲基-50％苯基聚硅氧烷固定液的涂漬量為1.5％，擔體Shimalite W(AW-DMCS)80-100目；FID檢測器，進樣口溫度230-250℃；檢測器溫度230-250℃；柱溫為150-160℃；理論板數按斑蝥素峰計算應不低于1000；取斑蝥素對照品，精密稱定，加氯仿制成每1ml含30-50μg的溶液，即得對照品溶液；取裝量差異項下的膠囊劑、片劑或顆粒劑內容物，研細，取約1-3g，精密稱定，置100ml燒杯中，加入氯化鈉氫氧化鈉溶液30-50ml，再加入0.5-2ml丙酮，功率250w、頻率20kHz下超聲20-50分鐘，放冷，加入2-8ml濃鹽酸，攪拌，靜置，放冷，抽濾，用少量水洗滌殘渣，合并濾液，濾液用氯仿萃取2-4次，每次30-40ml，合并氯仿液，置50℃水浴上揮至1～2ml(整個操作過程中不得將氯仿揮干)，再加氯仿定容至3ml，搖勻，即得供試品溶液；分別精密量取對照品溶液與供試品溶液各0.5-5μl，注入氣相色譜儀測定含量；本口服制劑中，膠囊劑中含斑蝥素C10H12O4為0.025-0.180mg/g；片劑中含斑蝥素C10H12O4為0.025-0.180mg/g；顆粒劑中含斑蝥素C10H12O4為0.003-0.018mg/g。
以上所用的氯化鈉氫氧化鈉溶液是在1mol/L氫氧化鈉溶液100mL中加入氯化鈉2g，攪拌、溶解而成的。
本發明質量控制方法是經過大量的篩選試驗得到的最佳方案，以下實驗研究為本發明的優選過程一、黃芪含量測定方法的研究因黃芪甲苷紫外吸收較差，屬末端吸收，若用紫外檢測器檢測，則其靈敏度低，干擾大，重現性較差，尤其對于復方制劑，測定其含量更加困難。近幾年來，有使用HPLC-ELSD法測定黃芪甲苷含量的文獻報道，其靈敏度、穩定性及重現性均能符合含量測定的要求。本試驗參考了文獻資料中的實驗條件，并結合《中國藥典》關于黃芪藥材中黃芪甲苷的含量測定方法對色譜條件作了適當的調整，理論塔板數(N)按黃芪甲苷峰計算在3000以上。
(一)供試品溶液制備方法研究1、提取方法的確定方法1取藥品，研細，置索氏提取器中，加1％的氫氧化鈉乙醇溶液，于水浴加熱提取，水浴蒸干提取液，加水，微熱使溶解，置分液漏斗中加二氯甲烷提取，棄二氯甲烷液，水溶液用乙醚提取，棄乙醚液，水溶液用水飽和的正丁醇提取，正丁醇溶液用水洗滌，棄水層，再以1％磷酸二氫鉀溶液洗滌，棄水層，將正丁醇提取液置水浴蒸干，殘渣加甲醇溶解，并定量轉移至量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，即得。
方法2取藥品，研細，取細粉置索氏提取器中，加甲醇加熱回流提取，甲醇液蒸干，殘渣加水，微熱使溶解，水液用水飽和正丁醇提取，正丁醇液用2％的氫氧化鉀溶液洗滌，棄去堿液，再用正丁醇飽和水洗滌，棄去水液，正丁醇層蒸干，殘渣加甲醇使溶解，并定量轉移至量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，即得。
方法3取藥品，研細，取細粉加甲醇，超聲，倒出上清液過濾，殘渣加甲醇超聲，過濾，合并過濾液，蒸干，殘渣加水溶解，用二氯甲烷提取，水液用水飽和正丁醇提取，正丁醇液用氨試液洗滌，棄去氨試液，蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉移至容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，即得。
方法4取藥品，研細，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇，放置過夜，再加甲醇適量，加熱回流，提取液回收溶劑并蒸干，殘渣加水，微熱使溶解，水液用水飽和正丁醇提取；正丁醇液用氨試液洗滌，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水，微熱使溶解，放冷，通過D101型大孔吸附樹脂柱(內徑1.5cm，長12cm)，用水洗脫，棄去水液，再用30％乙醇洗脫，棄去洗脫液，繼用70％乙醇洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇使溶解，并定量轉移至量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，即得。
方法5取藥品，研細，精密稱定，置索氏提取器中，加2％的氫氧化鉀甲醇溶液，加熱回流，提取液蒸干，殘渣加水使溶解后轉移至分液漏斗中，用乙酸乙酯提取；乙酸乙酯液加水洗滌；合并水液，用水飽和正丁醇提取；正丁醇提取液用氨試液洗滌，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水使溶解，放冷，通過D101型大孔吸附樹脂柱(內徑1.5cm，長12cm)，用水洗脫，棄去水液，再用70％乙醇洗脫，收集洗脫液，蒸干，用甲醇溶解并轉移至量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，即得。

根據試驗結果可知，采用方法5制備供試品溶液，黃芪甲苷提取完全，操作簡便，而方法一、方法二和方法三的提取率較低，殘渣較多，在轉移定容時不好操作，同時樣品的雜質干擾較大，方法四在用30％乙醇洗滌時含量有損失，通過比較選擇方法五進行方法學考察后，證實了該方法的可靠性，故選擇此種方法。
2、提取時間的考察取樣品6份，分別稱取約1g，精密稱定，置索氏提取器中，加2％的氫氧化鉀甲醇溶液70ml，索氏提取時間每兩份分別為3小時，4小時，6小時，照本發明質量控制方法中黃芪含量測定項下供試品溶液的制備方法制備，通過測定，結果表明提取4小時與6小時的結果很接近，而3小時的結果相差很大，因此選擇提取時間為4-6小時，即可把黃芪甲苷提取完全。見下表。
提取時間的考察

3、正丁醇提取次數的考察取樣品6份，分別稱取約1g，精密稱定，照本發明質量控制方法中黃芪含量測定項下供試品溶液的制備方法制備(用水飽和的正丁醇分別提取2次、3次、4次、5次)，通過測定，結果表明第二次提取不完全，差別很大，第4次的正丁醇提取液中還有少量的黃芪甲苷，而第5次的正丁醇液中黃芪甲苷已少于0.01％。因此將正丁醇的提取次數定為3-5次，最優提取次數為4次。見下表。
提取次數的考察

(二)流動相的選擇流動相1以甲醇、乙酸乙酯溶液不同比例的混合溶液為流動相。
流動相2以甲醇和水不同比例的混合溶液為流動相。
流動相3以乙腈和水不同比例的混合溶液為流動相。
結果以乙腈∶水＝10-90∶90-10為流動相；陰性樣品色譜圖在黃芪甲苷位置處無假陽性峰，黃芪甲苷和相近的雜質峰分離完全(分離度＞1.5)，即在該條件下黃芪甲苷與其他組分峰達到基線分離。最佳流動相為乙腈∶水＝36∶64。
(三)線性關系的考察精密吸取對照品儲備液1ml至10ml、1ml至5ml、10ml至25ml、3ml至5ml的量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，即可。然后分別精密吸取上述對照品溶液及貯備液各10μl注入液相色譜儀，測定其峰面積，并以峰面積值A的自然對數(LNA)為縱坐標，進樣量C的自然對數(LNC)為橫坐標，得回歸方程為LNA＝1.5525LNC+16.324，r＝0.9994。以峰面積A的自然對數(LNA)對進樣量C的自然對數(LNC)作圖，得一直線，其結果表明在0.4064～4.064μg范圍內，黃芪甲苷的線性關系良好。見下表。
黃芪甲苷線性關系考察

(四)重復性試驗取同一樣品6份，每份約1g，精密稱定，照本發明質量控制方法中黃芪含量測定項下供試品溶液的制備方法制備，分別精密吸取對照品溶液5μl和10μl、供試品溶液10μl進樣，記錄色譜圖，計算含量，6份樣品的黃芪甲苷含量測定平均值為0.4118mg/g，RSD為0.5％，說明重復性良好。見下表。
重復性試驗

(五)回收率試驗取已知含量的樣品(平均含量0.4118mg/g)6份，每份約0.5g，精密稱定，置索氏提取器中，分別精密加入黃芪甲苷對照品溶液(0.2392mg/ml)1ml，照本發明質量控制方法中黃芪含量測定項下供試品溶液的制備方法制備，制作加樣回收供試品溶液。測定黃芪甲苷含量，測得平均加樣回收率為97.86％，RSD為1.1％，結果表明，本方法具有良好的加樣回收率。見下表。
回收率試驗

(六)重現性試驗取藥品，分別由小組不同的人取樣照本發明質量控制方法中黃芪含量測定項下供試品溶液的制備方法制備，分別精密吸取對照品溶液5μl和10μl、供試品溶液10μl進樣，記錄色譜圖，計算含量，三份藥品的黃芪甲苷含量平均值分別為0.4203mg/g、0.4127mg/g、0.3946mg/g，RSD％分別為0.3％、0.3％、0.2％，說明重現性良好。見下表。
重現性試驗

(七)范圍考察根據藥物中黃芪甲苷的含量限度，其含量小于1％，考察的范圍為±50％。供試品的制備照本發明質量控制方法中黃芪含量測定項下供試品溶液的制備方法制備，分別精密吸取10μl注入液相色譜儀，記錄峰面積，計算含量。見下表。
范圍考察

測定結果表明，在范圍的兩個極端其測試結果能夠達到要求。
(八)耐用性試驗1.穩定性實驗 取藥品，按本發明所述質量控制方法中黃芪含量測定項下供試液的制備方法制備供試液，分別于0，2，4，6，8，12h分別測定樣品中黃芪甲苷的峰面積值。RSD％為0.2％，結果表明樣品溶液在12h內穩定。
穩定性實驗


2.不同色譜柱比較 將同一樣品在不同色譜柱下測定其含量進行比較。見下表。
不同色譜柱

3.流動相組成比例變化比較 將同一樣品在不同流動相組成比例下測定其含量進行比較。見下表。
不同流動相組成比例

4.不同柱溫比較 將同一樣品在不同柱溫下測定其含量進行比較。見下表。
不同柱溫

(九)樣品測定 用本發明所述質量控制方法中黃芪含量測定項下供試品溶液的制備方法制備10批共20份樣品，測其黃芪甲苷含量。見下表。
樣品中黃芪甲苷測定試驗

二、斑蝥素含量測定方法的研究因斑蝥素為本發明制劑中抗癌的有效成份，而本發明制劑中很多藥味是以藥材細粉直接入藥，在用一般的回流、超聲提取時，雜質較多，為將制劑中斑蝥素提取完全且除去過多的雜質，對其進行了方法學研究。
(一)供試品溶液制備方法研究1、提取方法的確定方法一取藥物研細，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入三氯甲烷，置水浴上回流，放冷，濾過，殘渣加三氯甲烷繼續回流，放冷，濾過，合并濾液，置水浴上揮干，殘渣用三氯甲烷溶解，轉移定容至容量瓶中，搖勻，即得。
方法二取藥物研細，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入三氯甲烷，置水浴上回流，放冷，濾過，殘渣加少量三氯甲烷洗滌，合并濾液，自然揮干，用氯化鈉-氫氧化鈉溶液洗滌殘渣，再用鹽酸調pH至1～2，濾過，濾液用三氯甲烷萃取，氯仿液自然揮干，殘渣加三氯甲烷溶解，并轉移定量至量瓶中，搖勻，即得。
方法三取藥物研細，精密稱定，置燒杯中，加入氯化鈉-氫氧化鈉溶液，超聲處理，放冷，用鹽酸調pH至1～2，抽濾，用少量水洗滌殘渣，合并濾液，用三氯甲烷萃取，氯仿液自然揮干，殘渣加三氯甲烷溶解，并轉移定量至量瓶中，搖勻，即得。
方法四取藥物研細，精密稱定，置燒杯中，加入氯化鈉-氫氧化鈉溶液，超聲，放冷，加入濃鹽酸，攪拌，靜置，放冷，抽濾，用少量水洗滌殘渣，合并濾液，用三氯甲烷萃取(若在提取過程中出現乳化現象時，為了不損失斑蝥素含量，須在提取完后將乳化層離心，分取氯仿液)，合并氯仿液，置50℃水浴揮至約1～2ml，再用氯仿定容至3ml，搖勻，即得。
結果通過上述四種方法的多次試驗比較，方法一提取的雜質較多；方法二重現性差，同時提取率也較低；方法三與方法四樣品經處理后雜質少，提取率高，但方法三在氯仿提取液自然揮干后存在兩個問題第一，氯仿自然揮干后，會析出少量水，導致定容不準，影響測定結果；第二，氯仿自然揮干后，同時會造成斑蝥素含量損失，導致重現性差。而在方法四中，樣品是用50℃水浴上揮至約1～2ml便可克服以上兩個問題，經多次試驗，重現性好。故將供試品提取方案選定為方法四。
2、提取溶劑體積的確定取藥物，照本發明質量控制方法中斑蝥素含量測定項下供試品溶液的制備方法制備，比較提取溶劑氯化鈉氫氧化鈉溶液(取1mol/L氫氧化鈉溶液100mL與氯化鈉2g，攪拌，溶解)為20ml、30ml、50ml的三種方法。見下表。
提取溶劑體積的比較

通過試驗結果的比較，溶劑體積在30ml、50ml時能夠將斑蝥素提取完全，故采用體積為30-50ml的提取溶劑，優選30ml。
3、提取時間的確定取藥物，照本發明質量控制方法中斑蝥素含量測定項下供試品溶液的制備方法制備，比較超聲20min，30min，40min，60min四種方法。見下表。
提取時間的比較

通過試驗結果的比較，超聲時間在30-40分鐘時可將斑蝥素完全提取出來，故采用超聲30-40min，優選30min。
4、蒸發水浴溫度的確定取藥物，照本發明質量控制方法中斑蝥素含量測定項下供試品溶液的制備方法制備，比較用40℃，50℃，55℃，60℃來揮發氯仿液至1～2ml的四種方法。見下表。
蒸發水浴溫度的比較

通過試驗結果的比較，證明用50℃水浴來揮發氯仿既不損失斑蝥素含量，又能將水份揮去，故本發明采用50℃水浴來揮發氯仿。
5、提取溶劑的確定取藥物，照本發明質量控制方法中斑蝥素含量測定項下供試品溶液的制備方法制備，比較提取溶劑為氯仿和二氯甲烷兩種方法。見下表。
提取溶劑體積的比較

通過比較試驗結果，證明氯仿能夠將斑蝥素提取完全，而二氯甲烷提取率較低。故本發明采用氯仿為提取溶劑。
(二)專屬性試驗供試品溶液的制備照本發明質量控制方法中斑蝥素含量測定項下供試品溶液的制備方法制備。
陰性樣品溶液的制備取不含斑蝥的陰性樣品，同供試品溶液制備方法制備。
在選定的色譜條件下，分別吸取斑蝥素對照品溶液、供試品溶液和缺斑蝥陰性樣品溶液2μl注入氣相色譜儀。斑蝥素的保留時間約為12min，陰性樣品在對照品位置無干擾峰，樣品中斑蝥素峰與其它雜質峰分離度均大于1.5，理論塔板數按斑蝥素峰計算大于1000。
(三)線性關系的考察精密稱取斑蝥素對照品12.10mg，置50ml容量瓶中，加氯仿溶解并稀釋定容至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。再分別精密吸取對照品貯備液適量，加氯仿制成0.121mg/ml、0.0605mg/ml、0.0484mg/ml、0.0242mg/ml、0.0121mg/ml的對照品溶液。然后分別精密吸取上述對照品溶液各2μl注入氣相色譜儀，測定其峰面積，并以峰面積值(A)對進樣量(C)進行回歸，得標準曲線方程為A＝6127836.8097C+4767.9444，r＝0.9998；擬合至原點方程為A＝6142992.3864C，r＝0.9998。結果表明在0.0242μg～0.484μg范圍內，斑蝥素線性關系良好。見下表。
斑蝥素線性關系考察

將同一樣品峰面積(577921)分別代入上兩方程計算，所得值的RSD％為0.3％，因此可以用外標一點法計算。
(四)重復性試驗取樣品，分別精密稱取6份，每份約2g，照本發明質量控制方法中斑蝥素含量測定項下供試品溶液的制備方法制備，分別精密吸取2μl進樣，記錄色譜圖，計算含量，6份樣品斑蝥素含量測定平均值為55.03μg/g，RSD％為1.63％，說明重復性良好。見下表。
重復性試驗

(五)準確度試驗采用加樣回收率試驗。取已知含量的樣品6份，每份約1g，精密稱定，置100ml燒杯中，分別加入氯化鈉-氫氧化鈉溶液(取1mol/L氫氧化鈉溶液100mL與氯化鈉2g，攪拌，溶解)30ml，再分別精密加入斑蝥素對照品溶液(48.4μg/ml)1ml，照本發明質量控制方法中斑蝥素含量測定項下供試品溶液的制備方法制備回收率供試品溶液。由于斑蝥素對照品溶液是使用氯仿作為溶劑，因氯仿與氯化鈉氫氧化鈉混合溶液不互溶，導致提取及抽濾步驟中存在不易操作性，因此在加樣回收率試驗中將斑蝥素對照品溶液的配制改用丙酮作為溶劑。經比較，以氯仿或丙酮為溶劑配制的斑蝥素對照品峰面積基本一致。
對照品溶液的配制精密稱取斑蝥素對照品0.01210g于50ml量瓶中，加丙酮溶解并稀釋至刻度，搖勻。再精密量取10ml于50ml量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻，即得(C＝48.4μg/ml)。
試驗方法取已知含量的樣品6份，每份約1g，精密稱定，置100ml燒杯中，分別加入氯化鈉-氫氧化鈉溶液(取1mol/L氫氧化鈉溶液100mL與氯化鈉2g，攪拌，溶解)30ml，再分別精密添加斑蝥素對照品溶液(C＝48.4μg/ml，丙酮為溶劑)1ml，照本發明質量控制方法中斑蝥素含量測定項下供試品溶液的制備方法制備回收率供試品溶液，分別精密吸取2μl進樣，記錄色譜圖，計算含量，測得平均加樣回收率為100.45％，RSD％為2.37％。結果表明，本方法具有良好的加樣回收率。見下表。
回收率試驗

(六)重現性試驗取樣品，分別在實驗室由不同的人照本發明質量控制方法中斑蝥素含量測定項下供試品溶液的制備方法制備，分別精密吸取2μL進樣，記錄色譜，計算含量，三份樣品的含量平均值分別為77.74μg/g、52.92μg/g、55.80μg/g，RSD％分別為1.81％、2.03％、0.22％，說明重現性良好。見下表。
重現性試驗

(七)范圍考察根據本發明中斑蝥素的含量限度，其含量小于1％，考察的范圍為±50％。取樣品，分別精密稱取4份，兩份約1g、兩份約3g，照本發明質量控制方法中斑蝥素含量測定項下供試品溶液的制備方法制備，分別精密吸取2μl進樣，記錄色譜圖，計算含量，4份樣品斑蝥素含量測定平均值為54.09μg/g，RSD為1.91％，與重復性樣品含量(55.03μg/g)相對標準偏差為1.22％，說明范圍試驗良好。見下表。
范圍考察

(八)耐用性試驗1.穩定性實驗取復方斑蝥口服制劑，照本發明質量控制方法中斑蝥素含量測定項下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，分別于0，2，4，8，12h精密吸取2μL注入氣相色譜儀，測定樣品中斑蝥素峰面積值。RSD％為0.3％，結果表明樣品溶液在12h內穩定。見下表。
穩定性實驗


2.不同氣相色譜儀、不同色譜柱比較 將同一樣品在不同色譜柱下測定其含量進行比較。兩種不同條件測得含量平均值為55.80mg/g，RSD％為0.22％。見下表。
不同色譜柱

注“A”為色譜柱以聚乙二醇20M及甲基硅橡膠(SE-30)為固定液，涂布濃度分別為10％和5％，1∶1混合裝柱；超純氮氣(55KPa)，氫氣(50ml/min)，空氣(500ml/min)；柱溫155℃；進樣口溫度240℃；FID檢測器，檢測器溫度240℃；威瑪瓏工作站；“B”為色譜柱用聚苯基甲基硅氧烷(5％苯基)毛細管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；N2為載氣，線速度24mL/min；分流比10∶1；氫氣流量40.0ml/min；空氣流量400.0ml/min；柱溫135℃；氣化室溫度240℃；FID檢測器，檢測器溫度240℃；GCSolution工作站。
(九)樣品測定用本發明質量控制方法中斑蝥素含量測定項下供試品溶液的制備方法制備12批，共24份樣品，測其斑蝥素含量。見下表。
樣品測定試驗

三、人參、黃芪薄層鑒別研究以人參皂苷Rg1對照品及黃芪甲苷對照品鑒別制劑中人參、黃芪藥材供試品溶液制備方法一取藥品，研細，置索氏提取器中，加適量氯仿，置水浴中回流提取，棄去氯仿液，取出濾筒，晾干，待氯仿揮盡，再置索氏提取器中，加適量甲醇，置水浴中回流提取，回收甲醇至干，殘渣加氫氧化鈉溶液使溶解，轉至分液漏斗中，再用水洗滌容器，轉移至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇提取，提取液用水洗滌，分取正丁醇液，蒸干，殘渣用水溶解，轉移至氧化鋁柱上(中性氧化鋁100～200目，2g，干法裝柱，直徑1cm，長25cm)，先用氯仿洗脫，棄去氯仿洗脫液，再用甲醇洗脫，洗脫液于水浴上蒸干，殘渣加甲醇使溶解，作為供試品溶液；同法制備缺人參及黃芪的陰性供試液。
供試品溶液制備方法二取藥品，研細，加適量氯仿，超聲提取，棄去氯仿液，待氯仿揮盡，加適量甲醇，超聲提取，回收甲醇至干，殘渣加氫氧化鈉溶液使溶解，轉至分液漏斗中，再用水洗滌容器，轉移至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇提取，提取液用水洗滌，分取正丁醇液，蒸干，殘渣用水溶解，轉移至氧化鋁柱上用氯仿洗脫，洗脫液于水浴上蒸干，殘渣加甲醇使溶解，作為供試品溶液；同法制備缺人參及黃芪的陰性供試液。
展開劑選擇分別以氯仿、乙酸乙酯、甲醇、水不同比例的混合溶液；三氯甲烷、甲醇、水不同比例的混合溶液；氯仿、乙酸乙酯、水不同比例的混合溶液為展開劑。
薄層板的厚度選擇厚度500μm以上；厚度500μm以下。
點樣量選擇分別以點樣量為供試品8μl，對照品4μl；點樣量為供試品10μl，對照品5μl進行選擇。
結果采用方法一制備供試品溶液，以三氯甲烷∶甲醇∶水＝5-50∶2-20∶0.5-10為展開劑，其分離度好，斑點顯色清晰，陰性對照無干擾，方法重現性好。以氯仿∶乙酸乙酯∶甲醇∶水為展開劑，放置時間較長，操作不便；而且若操作環境的濕度較大也會造成斑點分離效果不好，重現性較差，通過多次試驗，認為可將點樣后的薄層板置于65℃左右的烘箱中加熱10～15min或用5ml硫酸置于展開缸另一側中來控制濕度；同時薄層板的厚度也是一個重要因素，經多次試驗，該鑒別需要用厚板(500μm以上)才能達到好的展開效果；人參中是用人參Re和Rg1的總量大于0.30％來控制藥材含量，采用點樣量為供試品8μl，對照品4μl會出現二者中含量較低者的斑點模糊；另外，供試品處理步驟較多，也易造成損失。故最佳展開劑為三氯甲烷∶甲醇∶水＝13∶7∶2，薄層板的厚度500μm以上，點樣量為供試品10μl，對照品5μl時，鑒別效果最佳。
四、半枝蓮薄層鑒別研究以半枝蓮對照品鑒別制劑中半枝蓮藥材供試品溶液制備方法一取藥品，研細，加乙醚，加熱回流，放冷，濾過，棄去濾液，藥渣加甲醇，加熱回流，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇使溶解，作為供試品溶液；同法制備缺半枝蓮的陰性供試液。
供試品溶液制備方法二取藥品，研細，加三氯甲烷，超聲提取，濾過，棄去濾液，藥渣加甲醇，超聲提取，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇使溶解，作為供試品溶液；同法制備缺半枝蓮的陰性供試液。
展開劑選擇分別以甲苯、甲酸乙酯、甲酸不同比例的混合溶液；環己烷、乙酸乙酯不同比例的混合溶液；苯和甲酸乙酯不同比例的混合溶液；環己烷、甲酸不同比例的混合溶液為展開劑。
結果采用方法一制備供試品溶液，以甲苯∶甲酸乙酯∶甲酸＝2-20∶1-9∶1-9為展開劑，其分離度好，斑點顯色清晰，陰性對照無干擾，方法重現性好，專屬性強。最佳展開劑為甲苯∶甲酸乙酯∶甲酸＝9∶5∶3。
五、山茱萸薄層鑒別研究方法一取藥物，研細，加乙酸乙酯，超聲處理，濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇使溶解，作為供試品溶液；同法制備缺山茱萸的陰性供試液。另取熊果酸對照品加無水乙醇配制成1mg/ml的溶液作為對照品溶液。以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝20∶4∶0.5為展開劑，展開，取出，晾干，以10％的硫酸乙醇溶液為顯色劑。
結果陰性樣品有干擾。
方法二取藥物，研細，加甲醇，加熱回流，濾過，棄去濾液。殘渣加乙酸乙酯，超聲處理，濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇使溶解，作為供試品溶液；同法制備缺山茱萸的陰性供試液。取山茱萸對照藥材，同法制備對照藥材溶液。以環己烷∶氯仿∶乙酸乙酯＝20∶5∶8為展開劑，展開，取出，晾干，以10％的硫酸乙醇溶液為顯色劑。
結果陰性樣品有干擾。
方法三取藥物，研細，加甲醇，超聲處理，濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇∶氯仿＝3∶2的混合溶液使溶解，作為供試品溶液；同法制備缺山茱萸的陰性供試液。另取山茱萸對照藥材，同法制備對照藥材溶液。以環己烷∶丙酮∶乙酸乙酯＝10∶4∶2為展開劑，展開，取出，晾干，以10％的硫酸乙醇溶液為顯色劑。
結果陰性樣品有干擾。
由于山茱萸與女貞子中均含有熊果酸和齊墩果酸，會造成陰性干擾，因此考慮選用山茱萸中特有的馬錢苷進行鑒別。
以馬錢苷對照品鑒別制劑中山茱萸藥材供試品溶液制備方法一取藥物，研勻，加50％甲醇，加熱回流，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加50％甲醇適量溶解，加于中性氧化鋁柱(100～200目，4g)上，用40％甲醇洗脫。收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇使溶解，作為供試品溶液；同法制備缺山茱萸的陰性供試液。
供試品溶液制備方法二取藥物，研勻，加50％甲醇，超聲處理，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加50％甲醇適量溶解，加于中性氧化鋁柱(100～200目，4g)上，用40％甲醇洗脫。收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇使溶解，作為供試品溶液；同法制備缺山茱萸的陰性樣品溶液。
展開劑選擇分別以甲苯、乙酸乙酯、甲酸不同比例的混合溶液；
甲苯、丙酮、無水乙醇、濃氨不同比例的混合溶液；甲苯、丙酮、無水乙醇、甲酸不同比例的混合溶液；環己烷、丙酮、乙酸乙酯不同比例的混合溶液；環己烷、氯仿、乙酸乙酯不同比例的混合溶液為展開劑。
結果采用方法一制備供試品溶液，以甲苯∶丙酮∶無水乙醇∶甲酸＝1-9∶5-50∶0.5-10∶0.1-0.9為展開劑，其分離度好，斑點顯色清晰，陰性對照無干擾，方法重現性好。另外，點樣狀為帶狀比點樣狀為圓點的效果好。最佳展開劑為甲苯∶丙酮∶無水乙醇∶甲酸＝4∶16∶2∶0.5。采用前三種方法對山茱萸進行薄層鑒別，其鑒別結果分離度不好，斑點顯色不清晰，陰性有干擾。
六、女貞子薄層鑒別研究以女貞子對照藥材鑒別制劑中女貞子藥材供試品溶液制備方法一取藥物，研勻，加甲醇，加熱回流，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇∶三氯甲烷＝3∶2的混合溶液使溶解，作為供試品溶液；同法制備缺女貞子的陰性供試液。
供試品溶液制備方法二取藥物，研細，加水煎煮，濾過，濾液濃縮，用稀鹽酸調pH至2～3，以乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加乙酸乙酯使溶解，作為供試品溶液；同法制備缺女貞子的陰性供試液。
供試品溶液制備方法三取藥物，研細，加水煎煮，濾過，濾液蒸干。殘渣加無水乙醇∶三氯甲烷＝3∶2的混合溶液使溶解，作為供試品溶液；同法制備缺女貞子的陰性供試液。
供試品溶液制備方法四取藥物，研細，加甲醇加熱回流，濾過，棄去濾液，殘渣加乙酸乙酯，超聲，濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇使溶解，作為供試品溶液；同法制備缺女貞子的陰性供試液。
供試品溶液制備方法五取藥物，研細，加乙酸乙酯，超聲，濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇使溶解，作為供試品溶液；同法制備缺女貞子陰性供試液。
展開劑選擇分別以環己烷、丙酮、乙酸乙酯不同比例的混合溶液；甲苯、乙酸乙酯、甲酸不同比例的混合溶液；石油醚、乙酸乙酯、甲酸不同比例的混合溶液為展開劑。
結果前四種方法的陰性樣品有干擾。方法五處理的樣品效果較好，陰性無干擾。故最終采用方法五制備供試品溶液，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝10-50∶1-9∶0.1-0.9為展開劑，其分離度好，斑點顯色清晰，陰性對照無干擾，方法重現性好，鑒別專屬性強。最佳展開劑為甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝20∶4∶0.5。
七、熊膽粉的薄層鑒別研究熊膽粉為處方中的貴重藥材，理應進行控制，特對其作如下薄層鑒別研究方法一取藥物，加10％的氫氧化鈉溶液，加蓋微沸。放冷，過濾，濾液滴加稀鹽酸至pH 2～3，轉至分液漏斗中，用乙酸乙酯提取，合并提取液，蒸干，殘渣加乙醇使溶解，作為供試品溶液；同法制備缺熊膽粉的陰性供試液。
方法二取藥物，加10％的氫氧化鈉溶液，置電爐上微沸。放冷，過濾，濾液滴加稀鹽酸至pH 2～3，轉至分液漏斗中，用乙酸乙酯提取，合并提取液，蒸干，殘渣加乙醇使溶解，作為供試品溶液；同法制備缺熊膽粉的陰性供試液。
方法三取藥物，加10％的氫氧化鈉，超聲使溶解，120℃加熱水解。放冷，過濾，濾液滴加稀鹽酸至pH 2～3，轉至分液漏斗中，用乙酸乙酯提取兩次，合并提取液，蒸干，殘渣加乙醇使溶解，作為供試品溶液；同法制備缺熊膽粉的陰性供試液。
方法四取藥物，加水加熱攪拌使其充分溶解，靜置，放冷，濾過。濾液用乙醚振搖提取，棄去乙醚層，水層加20％的氫氧化鈉于水浴加熱水解(隨時補充蒸發的水)。放冷，滴加稀鹽酸至pH 2～3，轉至分液漏斗中，用乙酸乙酯提取，合并提取液，蒸干，殘渣加乙醇使溶解，作為供試品溶液；同法制備缺熊膽粉的陰性供試液。
方法五取藥物，加乙醇振搖提取，合并乙醇提取液，濾過，濾液置水浴上蒸干。殘渣加20％的氫氧化鈉轉移至適當容器中，至水浴中水解。放冷，滴加鹽酸至PH 2～3，轉至分液漏斗中，用乙酸乙酯提取，合并提取液，蒸干，殘渣加甲醇使溶解，作為供試品溶液；同法制備缺熊膽粉的陰性供試液。
展開劑選擇分別以異辛烷、乙醚、冰醋酸、正丁醇、水不同比例的混合溶液；異辛烷、乙酸乙酯、冰醋酸不同比例的混合溶液為展開劑。
結果分別用10％的硫酸乙醇溶液、10％的磷鉬酸乙醇溶液顯色，在與對照品(熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸、豬去氧膽酸和膽酸的混合對照品)相應的位置上，斑點不清晰，其他雜質顏色很深，干擾較大。在熒光下觀察，雜質也對主要斑點影響很大。
參照萬應膠囊中熊膽粉的鑒別方法。其供試品的取樣量為1.8g，通過對本制劑中熊膽粉的量進行換算，得出本發明口服制劑的取樣量約為20-25g，取樣量過大，而且樣品處理過程復雜，易造成損失；另外，本發明口服制劑中藥味較多，共有11味，會造成較大干擾，因此具不可操作性，無法對熊膽粉制定鑒別方法。
八、氯仿殘留量的檢查方法研究本發明中斑蝥藥材在提取工藝中是用氯仿浸提的，而氯仿毒性較大，為國家列出的二類溶劑，在藥品中是嚴格要求控制其限度的，2005版藥典二部附錄中規定藥品中的氯仿殘留量應控制在0.006％。為此申請人對本發明制劑中氯仿殘留量的檢查進行了方法學驗證，該方法專屬性強，靈敏度高，能有效控制制劑中的氯仿殘留量。
(1)儀器與試藥儀器 島津GC-2010氣相色譜儀；FID檢測器；RESTEC Rtx-5石英毛細管氣相色譜柱(30m×0.25mm×0.25μm)；GC-Solution工作站；GCH-300氫氣發生器；GCB-2000全自動空氣源；DANI HSS 86.50頂空進樣裝置；AE200分析天平。
試劑和試藥 氯仿為色譜純，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)為分析純。
(2)專屬性試驗A.色譜條件色譜柱彈性石英毛細管柱(柱長30m，內徑0.25mm，膜厚度0.25μm)Rtx-5(5％苯基-甲基硅氧烷為固定相)；程序升溫初始溫度60℃，保持5min，以每分鐘30℃的速率升溫至180℃，保持5min；FID檢測器；進樣口溫度200℃；檢測器溫度250℃；載氣高純氮；分流比10∶1；線速度30cm/sec；氫氣流量40mL/min；空氣流量400mL/min。采用頂空進樣氣化室溫度為110℃，加熱30min，進樣針溫度115℃，傳輸管溫度120℃。
B.頂空條件選擇以75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)為溶劑時，較低的溫度不能使氯仿達到充分飽和，檢出靈敏度較低，分別將爐溫設定為90℃、100℃、110℃和120℃，平衡30min，結果顯示，110℃時相同對照品檢出峰面積最高，而90℃檢出峰面積最低，故選110℃作為最佳爐溫。同時也比較了相同爐溫下平衡20min、30min、45min、60min之間的差異，結果表明平衡20min不能達到充分飽和，而45min和60min則可能因為平衡時間較長而發生氣體泄露，因為30min峰面積最大，故最終選擇平衡最佳時間為30min。
C.專屬性試驗精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品各2ml于20ml頂空瓶中，軋蓋，于頂空爐中110℃平衡30min后進樣，記錄色譜圖。從色譜圖可以看出，氯仿峰的保留時間為3.121min，與溶劑及陰性樣品中的其它峰都達到完全分離，分離度大于2.0，氯仿峰的理論塔板數為112150，故確定理論板數以氯仿峰計算應不低于5000。
(3)對照品溶液的制備取氯仿對照品適量，加75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)制成每1ml含15μg的溶液，即得。
(4)供試品溶液的制備方法一取樣品于20ml頂空瓶中，精密稱定，精密加入水，軋蓋，振搖均勻，即得。
方法二取樣品于具塞試管中，精密稱定，精密加入水，密塞，振搖，離心，精密量取上清液于20ml頂空瓶中，軋蓋，即得。
方法三取樣品于具塞試管中，精密稱定，精密加入50％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，密塞，振搖，離心，精密量取上清液于20ml頂空瓶中，軋蓋，即得。
方法四取樣品于具塞試管中，精密稱定，精密加入75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，密塞，振搖，離心，精密量取上清液于20ml頂空瓶中，軋蓋，即得。
方法五取樣品于具塞試管中，精密稱定，精密加入N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，密塞，振搖，離心，精密量取上清液于20ml頂空瓶中，軋蓋，即得。
在按以上五種方法處理樣品的同時，對照品也用相對應的溶劑進行配制，并進行了回收率試驗。通過比較以上五種方法，回收率試驗只有以75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)為溶劑時能達到要求，但以純N，N-二甲基甲酰胺(DMF)為溶劑的氯仿對照品峰面積很小，檢測靈敏度低。故確定供試品處理方法為取樣品于具塞試管中，精密稱定，精密加入75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，密塞，振搖，離心，精密量取上清液于20ml頂空瓶中，軋蓋，即得。
(5)線性關系考察精密稱取氯仿對照品0.1089g，加75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解稀釋至25ml，即得對照品貯備液。分別精密吸取3ml、5ml、1ml、3ml、1ml、2ml，加75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)分別稀釋2500倍、2500倍、250倍、250倍、25倍、25倍，得濃度分別為0.0052272mg/ml，0.008712mg/ml，0.017424mg/ml，0.052272mg/ml，0.17424mg/ml，0.34848mg/ml的對照品溶液，再分別精密量取2ml放入頂空瓶中，軋蓋，于頂空爐中110℃平衡30min后進樣，記錄色譜圖。以對照品溶液(mg/ml)為橫坐標，以峰面積為縱坐標進行線性回歸。回歸方程為y＝51031.5714x-0.8098，r＝0.9999。結果表明氯仿在5.2272μg～348.48μg范圍內具有良好的線性關系。見下表氯仿殘留量線性關系考察


將同一對照品峰面積(871.6)分別代入以上兩方程計算，所得值的RSD％為0.1％，因此可以用外標一點法計算。
(6)精密度考察分別精密量取對照品溶液(C＝17.424μg/ml)2ml放入頂空瓶中，軋蓋，于頂空爐中110℃平衡30min后進樣，記錄色譜圖。6份對照品平均峰面積為889.3，RSD％為2.2％，說明精密度良好。見下表精密度試驗

(7)穩定性考察分別于0、2、4、8、12時精密量取氯仿對照品溶液(C＝14.25μg/ml)2ml放入頂空瓶中，軋蓋，于頂空爐中110℃平衡30min后進樣，記錄色譜圖。測得氯仿平均峰面積為725.3，RSD％為5.4％，根據藥典規定，該偏差在規定范圍內。結果表明穩定性良好。見下表穩定性考察

(8)重復性考察分別取通過本發明所述復方斑蝥口服制劑的制備方法制備的復方斑蝥膠囊1.0g于10ml具塞試管中，精密加入75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)10ml，振搖3min，離心，精密量取上清液2ml放入頂空瓶中，軋蓋，于頂空爐中110℃平衡30min后進樣，記錄色譜圖。結果樣品中都未檢出氯仿。結果見下表重復性考察

(9)準確度考察用回收率來驗證。分別取通過本發明所述復方斑蝥口服制劑的制備方法制備的復方斑蝥膠囊1.0g于10ml具塞試管中，精密加入氯仿對照品溶液(C＝17.424μg/ml)10ml，振搖3min，離心，精密量取上清液2ml放入頂空瓶中，加蓋，于頂空爐中110℃平衡30min后進樣，記錄色譜圖。測得平均加樣回收率為98.3％，RSD％為3.0％，結果表明，本方法具有良好的加樣回收率。結果見下表(A對＝859.4)準確度考察

(10)重現性考察分別取3個批次樣品，按本發明所述質量控制方法測定其中的氯仿殘留量，結果三批樣品中有兩批未檢出氯仿，檢出氯仿的一批樣品平均值為0.001066％，RSD％為6.43％，該偏差在允許范圍內，說明該方法重現性良好。見下表(C檢對＝13.12μg/ml A檢對＝962.2 C質對＝14.91μg/ml A質對＝1160.8)
表6重現性考察 (11)范圍考察根據本發明制劑中氯仿殘留量的限度要求(不得高于0.006％)，考察的范圍為±50％。分別取藥品0.5g和1.5g，照本發明所述質量控制方法中氯仿殘留量檢查方法測定氯仿殘留量，結果在范圍的兩個極端都未檢出，并能夠達到所述要求。見下表范圍考察 (12)樣品測定精密稱取樣品1.0g，置10ml具塞試管中，精密加入75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)10ml，振搖3min，離心，精密量取上清液2ml于頂空瓶中，軋蓋，放入頂空爐中110℃平衡30min，進樣。按下式計算樣品中氯仿殘留量。
按以上方法測定10份復方斑蝥口服制劑中氯仿殘留量，結果見下表(氯仿對照品濃度C＝14.91μg/ml，峰面積A平均＝1160.8)氯仿殘留量測定
以上結果可以看出，10份復方斑蝥口服制劑中有5份未檢出氯仿，有5份檢出，其含量也在國家規定的范圍內。該方法專屬性強，靈敏度高，能有效控制制劑中的氯仿殘留量。
故將本發明質量控制方法中檢查項下氯仿殘留限度定為氯仿殘留量不得過0.006％。
與現有技術相比，本發明質量控制方法補充建立了黃芪和斑蝥中斑蝥素的含量測定項目以及半枝蓮、山茱萸、女貞子的薄層鑒別項目，增加了氯仿殘留量的檢查，并對人參和黃芪兩味藥材的薄層鑒別方法進行了改進，對展開劑以及薄層板的厚度進行了選擇，優化了鑒別方法，其精密度高，重現性好，穩定性好，回收率高，測量結果準確，提高了復方斑蝥口服制制劑的質量控制標準，可有效地控制產品質量，從而確保其臨床療效。
具體實施例方式以下通過實施例進一步說明本發明，但不作為對本發明的限制。
本發明的實施例1復方斑蝥膠囊劑的質量控制方法包括性狀其內容物為黃綠色至棕褐色的粉末，味微苦回甜。
鑒別(1)取膠囊劑內容物3.5g，置索氏提取器中，加適量氯仿，置水浴中回流提取2小時，棄去氯仿液，取出濾筒，晾干，待氯仿揮盡，再置索氏提取器中，加適量甲醇，置水浴中回流提取4小時，回收甲醇至干，殘渣加5％氫氧化鈉溶液5ml使溶解，轉至分液漏斗中，再用5ml水分2次洗滌容器，轉移至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇提取4次(10ml、5ml、5ml、5ml)，合并正丁醇液，用水洗滌2次，每次5ml，分取正丁醇液，蒸干，殘渣用0.8ml水分3次溶解，轉移至中性氧化鋁柱(100～200目，2g，干法裝柱，直徑1cm，長25cm)上，先用30ml氯仿洗脫，棄去氯仿洗脫液，再用70％甲醇25ml洗脫，洗脫液于水浴上蒸干，殘渣加甲醇1ml使溶解，作為供試品溶液；另取人參皂苷Rg1對照品及黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作為對照品溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液10μl，對照品溶液5μl，分別點于同一硅膠G薄層板(厚500μm)上，以三氯甲烷∶甲醇∶水＝13∶7∶2的下層溶液為展開劑(必要時控制濕度)，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置365nm紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。
(2)取膠囊劑內容物2g，加乙醚20ml，加熱回流30分鐘，放冷，濾過，棄去濾液，藥渣加甲醇20ml，加熱回流30分鐘，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1ml溶解，作為供試品溶液；另取半支蓮對照藥材1g，同法制成對照藥材溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液、對照藥材溶液各5μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯∶甲酸乙酯∶甲酸＝9∶5∶3為展開劑，展開，取出，晾干；置365nm紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。
(3)取膠囊劑內容物3g，加50％甲醇30ml，加熱回流1小時，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加50％甲醇適量溶解，加于中性氧化鋁柱(100～200目，4g)上，用40％甲醇50ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇1ml使溶解，作為供試品溶液；另取馬錢苷對照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液、對照品溶液各10μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上(點成帶狀)，以甲苯∶丙酮∶無水乙醇∶甲酸＝4∶16∶2∶0.5為展開劑，展開，取出，晾干；噴以10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點清晰；供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。
(4)取膠囊劑內容物3g，加乙酸乙酯20ml，超聲15min，濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇1ml溶解，作為供試品溶液；另取女貞子對照藥材0.5g，同法制成對照藥材溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液、對照藥材溶液各5μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝20∶4∶0.5為展開劑，展開，取出，晾干；噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。
檢查水分 不得過15.0％。
氯仿殘留量 照氣相色譜法測定色譜條件與系統適用性試驗 彈性石英毛細管柱(柱長30m，內徑0.25mm，膜厚度0.25μm)Rtx-5(5％苯基-甲基硅氧烷為固定相)；程序升溫初始溫度60℃，保持5min，以每分鐘30℃的速率升溫至180℃，保持5min；FID檢測器；進樣口溫度200℃；檢測器溫度250℃；分流比10∶1；線速度30cm/sec；氫氣流量40mL/min；空氣流量400mL/min；采用頂空進樣氣化室溫度為110℃，加熱30min，進樣針溫度115℃，傳輸管溫度120℃；理論板數以氯仿峰計算應不低于5000。
對照品溶液的制備精密稱取氯仿對照品，加75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，制成每1mL含15μg的溶液，即得。
供試品溶液的制備取裝量差異項下的膠囊劑內容物約1.0g，精密稱定，置具塞試管中，精密加入75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)10ml，密塞，振搖3min，離心，取上清液，即得。
測定法 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各2ml于20ml頂空瓶中，軋蓋，于頂空爐中110℃平衡30min后，分別取頂空瓶中飽和氣體1ml注入氣相色譜儀測定，即得。
本膠囊劑中，氯仿殘留量不得過0.006％。
其他 本發明膠囊劑應符合中國藥典關于膠囊劑項下的有關規定。
含量測定(1)黃芪 照高效液相色譜法測定以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈∶水＝36∶64為流動相；流速0.7ml/min；柱溫40℃；蒸發光散射檢測器漂移管溫度為90℃；霧化氣體為空氣，流速為2.2L/min；理論板數按黃芪甲苷峰計算應不低于3000；精密稱取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，即得對照品溶液；取裝量差異項下的膠囊劑，研細，取約1g，精密稱定，置索氏提取器中，加2％氫氧化鉀甲醇溶液70ml，加熱回流4小時，提取液蒸干，殘渣加水20ml使溶解后轉移至分液漏斗中，用乙酸乙酯提取2次，每次20ml；合并乙酸乙酯液，加水15ml洗滌；棄去乙酸乙酯液，合并水液，用水飽和的正丁醇提取4次，每次40ml；合并正丁醇提取液，用氨試液40ml洗滌1次，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水適量使溶解，轉移至D101型大孔吸附樹脂柱(內徑1.5cm，長12cm)上，用水50ml洗脫，棄去水液，再用70％乙醇80ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，用甲醇溶解并轉移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液；分別精密吸取對照品溶液5μl和10μl、供試品溶液10μl注入液相色譜儀測定含量；本膠囊劑中含黃芪以黃芪甲苷(C41H68O14)計，不得少于0.12mg/g。
(2)斑蝥素 照氣相色譜法測定玻璃色譜柱1-2m×3mm id，OV-17(50％甲基-50％苯基聚硅氧烷)固定液的涂漬量為1.5％，擔體Shimalite W(AW-DMCS)80-100目；FID檢測器，進樣口溫度240℃；檢測器溫度240℃；柱溫為155℃；理論板數按斑蝥素峰計算應不低于1000；取斑蝥素對照品，精密稱定，加氯仿制成每1ml含40μg的溶液，即得對照品溶液；取裝量差異項下的膠囊劑內容物，研細，取約2g，精密稱定，置100ml燒杯中，加入氯化鈉氫氧化鈉溶液(取1mol/L氫氧化鈉溶液100mL與氯化鈉2g，攪拌，溶解)30ml，再加入1ml丙酮，超聲(功率250w，頻率20kHz)30分鐘，放冷，加入5ml濃鹽酸，攪拌，靜置，放冷，抽濾，用少量水洗滌殘渣，合并濾液，濾液用氯仿萃取3次，每次30ml，合并氯仿液，置50℃水浴上揮至1～2ml(整個操作過程中不得將氯仿揮干)，再加氯仿定容至3ml，搖勻，即得供試品溶液；分別精密量取對照品溶液與供試品溶液各2μl，注入氣相色譜儀測定含量；本膠囊劑中含斑蝥素(C10H12O4)為0.028-0.160mg/g。
本發明的實施例2復方斑蝥片劑的質量控制方法包括性狀產品為薄膜衣片，除去薄膜衣后顯黃綠色至棕褐色，味微苦回甜。
鑒別(1)取片劑3g，研細，置索氏提取器中，加適量氯仿，置水浴中回流提取2小時，棄去氯仿液，取出濾筒，晾干，待氯仿揮盡，再置索氏提取器中，加適量甲醇，置水浴中回流提取3小時，回收甲醇至干，殘渣加5％氫氧化鈉溶液3ml使溶解，轉至分液漏斗中，再用3ml水分2次洗滌容器，轉移至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇提取3次，每次10ml，合并正丁醇液，用水洗滌2次，每次3ml，分取正丁醇液，蒸干，殘渣用0.6ml水分2次溶解，轉移至中性氧化鋁柱(100～200目，2g，干法裝柱，直徑1cm，長25cm)上，先用20ml氯仿洗脫，棄去氯仿洗脫液，再用70％甲醇20ml洗脫，洗脫液于水浴上蒸干，殘渣加甲醇0.8ml使溶解，作為供試品溶液；另取人參皂苷Rg1對照品及黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1ml各含0.8mg的混合溶液，作為對照品溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液15μl，對照品溶液8μl，分別點于同一硅膠G薄層板(厚450μm)上，以三氯甲烷∶甲醇∶水＝20∶10∶5的下層溶液為展開劑(必要時控制濕度)，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置300nm紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。
(2)取片劑2.5g，研細，加乙醚25ml，加熱回流20分鐘，放冷，濾過，棄去濾液，藥渣加甲醇25ml，加熱回流20分鐘，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇0.8ml溶解，作為供試品溶液；另取半支蓮對照藥材0.8g，同法制成對照藥材溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液、對照藥材溶液各10μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯∶甲酸乙酯∶甲酸＝10∶5∶5為展開劑，展開，取出，晾干；置300nm紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。
(3)取片劑2g，研細，加50％甲醇20ml，加熱回流1.2小時，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加50％甲醇適量溶解，加于中性氧化鋁柱(100～200目，4g)上，用40％甲醇35ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇0.8ml使溶解，作為供試品溶液；另取馬錢苷對照品，加甲醇制成每1ml含0.8mg的溶液，作為對照品溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液、對照品溶液各12μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上(點成帶狀)，以甲苯∶丙酮∶無水乙醇∶甲酸＝5∶25∶5∶0.5為展開劑，展開，取出，晾干；噴以10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點清晰；供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。
(4)取片劑2g，研細，加乙酸乙酯25ml，超聲20min，濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇0.8ml溶解，作為供試品溶液；另取女貞子對照藥材1g，同法制成對照藥材溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液、對照藥材溶液各10μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝30∶5∶0.5為展開劑，展開，取出，晾干；噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。
檢查水分 不得過15.0％。
氯仿殘留量 照氣相色譜法測定彈性石英毛細管柱(柱長30m，內徑0.25mm，膜厚度0.25μm)Rtx-5(5％苯基甲基硅氧烷為固定相)；程序升溫初始溫度60℃，保持5min，以每分鐘30℃的速率升溫至180℃，保持5min；FID檢測器；進樣口溫度200℃；檢測器溫度250℃；分流比10∶1；線速度30cm/sec；氫氣流量40mL/min；空氣流量400mL/min；采用頂空進樣氣化室溫度為105℃，加熱35min，進樣針溫度110℃，傳輸管溫度115℃；理論板數以氯仿峰計算應不低于5000；精密稱取氯仿對照品，加75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，制成每1mL含20μg的溶液，即得對照品溶液；取裝量差異項下的片劑約1.2g，精密稱定，置具塞試管中，精密加入75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)12ml，密塞，振搖2min，離心，取上清液，即得供試品溶液；分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各2.5ml于20ml頂空瓶中，軋蓋，于頂空爐中110℃平衡35min后，分別取頂空瓶中飽和氣體1.2ml注入氣相色譜儀測定；本片劑中，氯仿殘留量不得過0.006％。
其他 本發明片劑應符合中國藥典關于片劑項下的有關規定。
含量測定(1)黃芪 照高效液相色譜法測定以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈∶水＝50∶50為流動相；流速0.6ml/min；柱溫45℃；蒸發光散射檢測器漂移管溫度為85℃；霧化氣體為空氣，流速為2.0L/min；理論板數按黃芪甲苷峰計算應不低于3000；精密稱取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得對照品溶液；取裝量差異項下的片劑，研細，取約1.2g，精密稱定，置索氏提取器中，加2％氫氧化鉀甲醇溶液75ml，加熱回流5小時，提取液蒸干，殘渣加水25ml使溶解后轉移至分液漏斗中，用乙酸乙酯提取2次，每次25ml；合并乙酸乙酯液，加水12ml洗滌；棄去乙酸乙酯液，合并水液，用水飽和的正丁醇提取4次，每次30ml；合并正丁醇提取液，用氨試液30ml洗滌2次，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水適量使溶解，轉移至D101型大孔吸附樹脂柱(內徑1.5cm，長12cm)上，用水40ml洗脫，棄去水液，再用70％乙醇70ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，用甲醇溶解并轉移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液；分別精密吸取對照品溶液3μl和8μl、供試品溶液8μl注入液相色譜儀測定含量；本片劑中含黃芪以黃芪甲苷(C41H68O14)計，不得少于0.08mg/g。
(2)斑蝥素 照氣相色譜法測定玻璃色譜柱1-2m×3mm id，OV-17(50％甲基-50％苯基聚硅氧烷)固定液的涂漬量為1.5％，擔體Shimalite W(AW-DMCS)80-100目；FID檢測器，進樣口溫度235℃；檢測器溫度235℃；柱溫為150℃；理論板數按斑蝥素峰計算應不低于1000；取斑蝥素對照品，精密稱定，加氯仿制成每1ml含35μg的溶液，即得對照品溶液；取裝量差異項下的片劑，研細，取約1.5g，精密稱定，置100ml燒杯中，加入氯化鈉-氫氧化鈉溶液(取1mol/L氫氧化鈉溶液100mL與氯化鈉2g，攪拌，溶解)40ml，再加入1.2ml丙酮，超聲(功率250w，頻率20kHz)35分鐘，放冷，加入4ml濃鹽酸，攪拌，靜置，放冷，抽濾，用少量水洗滌殘渣，合并濾液，濾液用氯仿萃取3次，每次35ml，合并氯仿液，置50℃水浴上揮至1～2ml(整個操作過程中不得將氯仿揮干)，再加氯仿定容至3ml，搖勻，即得供試品溶液；分別精密量取對照品溶液與供試品溶液各1μl，注入氣相色譜儀測定含量；本片劑中含斑蝥素(C10H12O4)為0.025-0.180mg/g。
本發明的實施例3復方斑蝥顆粒劑的質量控制方法包括性狀產品為棕黃色至深褐色的顆粒；味甜。
鑒別(1)取顆粒劑4g，研細，置索氏提取器中，加適量氯仿，置水浴中回流提取2小時，棄去氯仿液，取出濾筒，晾干，待氯仿揮盡，再置索氏提取器中，加適量甲醇，置水浴中回流提取5小時，回收甲醇至干，殘渣加5％氫氧化鈉溶液7ml使溶解，轉至分液漏斗中，再用7ml水分2次洗滌容器，轉移至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇提取5次，每次15ml，合并正丁醇液，用水洗滌2次，每次7ml，分取正丁醇液，蒸干，殘渣用1.0ml水分4次溶解，轉移至中性氧化鋁柱(100～200目，2g，干法裝柱，直徑1cm，長25cm)上，先用40ml氯仿洗脫，棄去氯仿洗脫液，再用70％甲醇30ml洗脫，洗脫液于水浴上蒸干，殘渣加甲醇1.5ml使溶解，作為供試品溶液；另取人參皂苷Rg1對照品及黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1ml各含1.5mg的混合溶液，作為對照品溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液12μl，對照品溶液6μl，分別點于同一硅膠G薄層板(厚550μm)上，以三氯甲烷∶甲醇∶水＝40∶15∶8的下層溶液為展開劑(必要時控制濕度)，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置400nm紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。
(2)取顆粒劑3g，研細，加乙醚30ml，加熱回流40分鐘，放冷，濾過，棄去濾液，藥渣加甲醇30ml，加熱回流40分鐘，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1.5ml溶解，作為供試品溶液；另取半支蓮對照藥材1.5g，同法制成對照藥材溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液、對照藥材溶液各15μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯∶甲酸乙酯∶甲酸＝15∶7∶4為展開劑，展開，取出，晾干；置400nm紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。
(3)取顆粒劑4g，研細，加50％甲醇40ml，加熱回流1.5小時，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加50％甲醇適量溶解，加于中性氧化鋁柱(100～200目，4g)上，用40％甲醇65ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇1.5ml使溶解，作為供試品溶液；另取馬錢苷對照品，加甲醇制成每1ml含1.5mg的溶液，作為對照品溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液、對照品溶液各15μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上(點成帶狀)，以甲苯∶丙酮∶無水乙醇∶甲酸＝7∶40∶8∶0.7為展開劑，展開，取出，晾干；噴以10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點清晰；供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。
(4)取顆粒劑4g，研細，加乙酸乙酯30ml，超聲25min，濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇1.5ml溶解，作為供試品溶液；另取女貞子對照藥材1.5g，同法制成對照藥材溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液、對照藥材溶液各15μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝40∶7∶0.8為展開劑，展開，取出，晾干；噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。
檢查水分 不得過15.0％。
氯仿殘留量 照氣相色譜法測定彈性石英毛細管柱(柱長30m，內徑0.25mm，膜厚度0.25μm)Rtx-5(5％苯基甲基硅氧烷為固定相)；程序升溫初始溫度60℃，保持5min，以每分鐘30℃的速率升溫至180℃，保持5min；FID檢測器；進樣口溫度200℃；檢測器溫度250℃；分流比10∶1；線速度30cm/sec；氫氣流量40mL/min；空氣流量400mL/min；采用頂空進樣氣化室溫度為115℃，加熱30min，進樣針溫度120℃，傳輸管溫度125℃；理論板數以氯仿峰計算應不低于5000；精密稱取氯仿對照品，加75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，制成每1mL含25μg的溶液，即得對照品溶液；取裝量差異項下的顆粒劑約1.5g，精密稱定，置具塞試管中，精密加入75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)15ml，密塞，振搖4min，離心，取上清液，即得供試品溶液；分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各3ml于20ml頂空瓶中，軋蓋，于頂空爐中110℃平衡40min后，分別取頂空瓶中飽和氣體1.5ml注入氣相色譜儀測定；本顆粒劑中，氯仿殘留量不得過0.006％。
其他 本發明顆粒劑應符合中國藥典關于顆粒劑項下的有關規定。
含量測定(1)黃芪 照高效液相色譜法測定以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈∶水＝60∶40為流動相；流速0.8ml/min；柱溫50℃；蒸發光散射檢測器漂移管溫度為95℃；霧化氣體為空氣，流速為2.5L/min；理論板數按黃芪甲苷峰計算應不低于3000；精密稱取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1ml含0.3mg的溶液，即得對照品溶液；取裝量差異項下的顆粒劑，研細，取約1.5g，精密稱定，置索氏提取器中，加2％氫氧化鉀甲醇溶液80ml，加熱回流5小時，提取液蒸干，殘渣加水30ml使溶解后轉移至分液漏斗中，用乙酸乙酯提取2次，每次30ml；合并乙酸乙酯液，加水17ml洗滌；棄去乙酸乙酯液，合并水液，用水飽和的正丁醇提取4次，每次50ml；合并正丁醇提取液，用氨試液50ml洗滌2次，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水適量使溶解，轉移至D101型大孔吸附樹脂柱(內徑1.5cm，長12cm)上，用水60ml洗脫，棄去水液，再用70％乙醇90ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，用甲醇溶解并轉移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液；分別精密吸取對照品溶液8μl和15μl、供試品溶液15μl注入液相色譜儀測定含量；本顆粒劑中含黃芪以黃芪甲苷(C41H68O14)計，不得少于0.01mg/g。
(2)斑蝥素 照氣相色譜法測定玻璃色譜柱1-2m×3mm id，OV-17(50％甲基-50％苯基聚硅氧烷)固定液的涂漬量為1.5％，擔體Shimalite W(AW-DMCS)80-100目；FID檢測器，進樣口溫度245℃；檢測器溫度245℃；柱溫為160℃；理論板數按斑蝥素峰計算應不低于1000；取斑蝥素對照品，精密稱定，加氯仿制成每1ml含45μg的溶液，即得對照品溶液；取裝量差異項下的顆粒劑，研細，取約2.5g，精密稱定，置100ml燒杯中，加入氯化鈉-氫氧化鈉溶液(取1mol/L氫氧化鈉溶液100mL與氯化鈉2g，攪拌，溶解)45ml，再加入1.5ml丙酮，超聲(功率250w，頻率20kHz)40分鐘，放冷，加入6ml濃鹽酸，攪拌，靜置，放冷，抽濾，用少量水洗滌殘渣，合并濾液，濾液用氯仿萃取3次，每次35ml，合并氯仿液，置50℃水浴上揮至1～2ml(整個操作過程中不得將氯仿揮干)，再加氯仿定容至3ml，搖勻，即得供試品溶液；分別精密量取對照品溶液與供試品溶液各3μl，注入氣相色譜儀測定含量；本顆粒劑中含斑蝥素(C10H1204)為0.003-0.018mg/g。
本發明的實施例4復方斑蝥制劑的質量控制方法可以包括性狀對于膠囊劑，內容物為黃綠色至棕褐色的粉末，味微苦回甜；對于片劑，產品為薄膜衣片，除去薄膜衣后顯黃綠色至棕褐色，味微苦回甜；對于顆粒劑，產品為棕黃色至深褐色的顆粒；味甜。
鑒別(1)取膠囊劑、片劑或顆粒劑各2g，研細，置索氏提取器中，加適量氯仿，置水浴中回流提取1小時，棄去氯仿液，取出濾筒，晾干，待氯仿揮盡，再置索氏提取器中，加適量甲醇，置水浴中回流提取2小時，回收甲醇至干，殘渣加5％氫氧化鈉溶液lml使溶解，轉至分液漏斗中，再用1ml水洗滌容器，轉移至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇提取2次，每次2ml，合并正丁醇液，用水洗滌1次，每次1ml，分取正丁醇液，蒸干，殘渣用0.4ml水1次溶解，轉移至2g、干法裝柱、直徑1cm、長25cm、100～200目的中性氧化鋁柱上，先用10ml氯仿洗脫，棄去氯仿洗脫液，再用70％甲醇10ml洗脫，洗脫液于水浴上蒸干，殘渣加甲醇0.5ml使溶解，作為供試品溶液；另取人參皂苷Rg1對照品及黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1ml各含0.5mg的混合溶液，作為對照品溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液5-20μl，對照品溶液2-10μl，分別點于同一硅膠G薄層板(厚450μm)上，以三氯甲烷∶甲醇∶水＝5∶20∶0.5的下層溶液為展開劑(必要時控制濕度)，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置200nm紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。
(2)取膠囊劑、片劑或顆粒劑1g，研細，加乙醚10ml，加熱回流10分鐘，放冷，濾過，棄去濾液，藥渣加甲醇10ml，加熱回流10分鐘，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇0.5ml溶解，作為供試品溶液；另取半支蓮對照藥材0.5g，同法制成對照藥材溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液、對照藥材溶液各2μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯∶甲酸乙酯∶甲酸＝2∶9∶1為展開劑，展開，取出，晾干；置200nm紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。
檢查水分 不得過15.0％。
其他 本發明的膠囊劑、片劑或顆粒劑應符合中國藥典關于膠囊劑、片劑或顆粒劑項下的有關規定。
含量測定斑蝥素 照氣相色譜法測定玻璃色譜柱1-2m×3mm id，0V-17(50％甲基-50％苯基聚硅氧烷)固定液的涂漬量為1.5％，擔體Shimalite W(AW-DMCS)80-100目；FID檢測器，進樣口溫度230℃；檢測器溫度230℃；柱溫為150℃；理論板數按斑蝥素峰計算應不低于1000；取斑蝥素對照品，精密稱定，加氯仿制成每1ml含30μg的溶液，即得對照品溶液；取裝量差異項下的膠囊劑、片劑或顆粒劑內容物，研細，取約1g，精密稱定，置100ml燒杯中，加入氯化鈉氫氧化鈉溶液(取1mol/L氫氧化鈉溶液100mL與氯化鈉2g，攪拌，溶解)30ml，再加入0.5ml丙酮，超聲(功率250w，頻率20kHz)20分鐘，放冷，加入2ml濃鹽酸，攪拌，靜置，放冷，抽濾，用少量水洗滌殘渣，合并濾液，濾液用氯仿萃取2次，每次30ml，合并氯仿液，置50℃水浴上揮至1～2ml(整個操作過程中不得將氯仿揮干)，再加氯仿定容至3ml，搖勻，即得供試品溶液；分別精密量取對照品溶液與供試品溶液各0.5μl，注入氣相色譜儀測定含量；本口服制劑中，膠囊劑中含斑蝥素(C10H12O4)為0.025-0.180mg/g；片劑中含斑蝥素(C10H12O4)為0.025-0.180mg/g；顆粒劑中含斑蝥素(C10H12O4)為0.003-0.018mg/g。
本發明的實施例5復方斑蝥制劑的質量控制方法可以包括性狀對于膠囊劑，內容物為黃綠色至棕褐色的粉末，味微苦回甜；對于片劑，產品為薄膜衣片，除去薄膜衣后顯黃綠色至棕褐色，味微苦回甜；對于顆粒劑，產品為棕黃色至深褐色的顆粒；味甜。
鑒別(1)取膠囊劑、片劑或顆粒劑5g，研細，加50％甲醇10ml，加熱回流0.5小時，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加50％甲醇適量溶解，加于中性氧化鋁柱上，用40％甲醇20ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇0.5ml使溶解，作為供試品溶液；另取馬錢苷對照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作為對照品溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液、對照品溶液各5μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上(點成帶狀)，以甲苯∶丙酮∶無水乙醇∶甲酸＝1∶50∶0.5∶0.9為展開劑，展開，取出，晾干；噴以10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點清晰；供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。
(2)取膠囊劑、片劑或顆粒劑1g，研細，加乙酸乙酯10ml，超聲10min，濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇0.5ml溶解，作為供試品溶液；另取女貞子對照藥材0.2g，同法制成對照藥材溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液、對照藥材溶液各2μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝10∶9∶0.1為展開劑，展開，取出，晾干；噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。
檢查水分 不得過15.0％。
其他 本發明的膠囊劑、片劑或顆粒劑應符合中國藥典關于膠囊劑、片劑或顆粒劑項下的有關規定。
含量測定黃芪 照高效液相色譜法測定色譜柱為C4柱，以乙腈∶水＝10∶90為流動相；流速0.5ml/min；柱溫30℃；蒸發光散射檢測器漂移管溫度為80℃；霧化氣體為空氣，流速為1.5L/min；理論板數按黃芪甲苷峰計算應不低于3000；精密稱取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1ml含0.05mg的溶液，即得對照品溶液；取裝量差異項下的膠囊劑、片劑或顆粒劑，研細，取約0.5g，精密稱定，置索氏提取器中，加2％氫氧化鉀甲醇溶液50ml，加熱回流4小時，提取液蒸干，殘渣加水10ml使溶解后轉移至分液漏斗中，用乙酸乙酯40ml提取1次，乙酸乙酯液加水10ml洗滌；棄去乙酸乙酯液，合并水液，用水飽和的正丁醇提取3次，每次20ml；合并正丁醇提取液，用氨試液20ml洗滌1次，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水適量使溶解，轉移至D101型大孔吸附樹脂柱上，用水30ml洗脫，棄去水液，再用70％乙醇60ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，用甲醇溶解并轉移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液；分別精密吸取對照品溶液1μl和2μl、供試品溶液2μl注入液相色譜儀測定含量；本口服制劑中，膠囊劑中含黃芪以黃芪甲苷(C41H68O14)計，不得少于0.08mg/g；片劑中含黃芪以黃芪甲苷(C41H68O14)計，不得少于0.08mg/g；顆粒劑中含黃芪以黃芪甲苷(C41H68O14)計，不得少于0.01mg/g。
本發明的實施例6復方斑蝥制劑的質量控制方法可以包括性狀對于膠囊劑，內容物為黃綠色至棕褐色的粉末，味微苦回甜；對于片劑，產品為薄膜衣片，除去薄膜衣后顯黃綠色至棕褐色，味微苦回甜；對于顆粒劑，產品為棕黃色至深褐色的顆粒；味甜。
鑒別取膠囊劑、片劑或顆粒劑5g，研細，加乙酸乙酯40ml，超聲30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇2ml溶解，作為供試品溶液；另取女貞子對照藥材2g，同法制成對照藥材溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液、對照藥材溶液各20μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝50∶1∶0.9為展開劑，展開，取出，晾干；噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。
檢查水分 不得過15.0％。
氯仿殘留量 照氣相色譜法測定彈性石英毛細管柱(柱長30m，內徑0.25mm，膜厚度0.25μm)Rtx-5(5％苯基-甲基硅氧烷為固定相)；程序升溫初始溫度60℃，保持5min，以每分鐘30℃的速率升溫至180℃，保持5min；FID檢測器；進樣口溫度200℃；檢測器溫度250℃；分流比10∶1；線速度30cm/sec；氫氣流量40mL/min；空氣流量400mL/min；采用頂空進樣氣化室溫度為100℃，加熱25min，進樣針溫度110℃，傳輸管溫度110℃；理論板數以氯仿峰計算應不低于5000；精密稱取氯仿對照品，加75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，制成每1mL含10μg的溶液，即得對照品溶液；取裝量差異項下的膠囊劑、片劑或顆粒劑，取內容物約0.5g，精密稱定，置具塞試管中，精密加入75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)5ml，密塞，振搖1min，離心，取上清液，即得供試品溶液；分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各1ml于20ml頂空瓶中，軋蓋，于頂空爐中110℃平衡20min后，分別取頂空瓶中飽和氣體0.5ml注入氣相色譜儀測定；本口服制劑中，氯仿殘留量不得過0.006％。
其他 本發明的膠囊劑、片劑或顆粒劑應符合中國藥典關于膠囊劑、片劑或顆粒劑項下的有關規定。
含量測定(1)黃芪 照高效液相色譜法測定色譜柱為C8柱，以乙腈∶水＝90∶10為流動相；流速1.0ml/min；柱溫60℃；蒸發光散射檢測器漂移管溫度為100℃；霧化氣體為空氣，流速為3.0L/min；理論板數按黃芪甲苷峰計算應不低于3000；精密稱取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，即得對照品溶液；取裝量差異項下的膠囊劑、片劑或顆粒劑，研細，取約2g，精密稱定，置索氏提取器中，加2％氫氧化鉀甲醇溶液100ml，加熱回流6小時，提取液蒸干，殘渣加水40ml使溶解后轉移至分液漏斗中，用乙酸乙酯提取3次，每次10ml；合并乙酸乙酯液，加水20ml洗滌；棄去乙酸乙酯液，合并水液，用水飽和的正丁醇提取5次，每次60ml；合并正丁醇提取液，用氨試液60ml洗滌2次，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水適量使溶解，轉移至D101型大孔吸附樹脂柱(內徑1.5cm，長12cm)上，用水70ml洗脫，棄去水液，再用70％乙醇100ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，用甲醇溶解并轉移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液；分別精密吸取對照品溶液10μl和20μl、供試品溶液20μl注入液相色譜儀測定含量；本口服制劑中，膠囊劑中含黃芪以黃芪甲苷(C41H68O14)計，不得少于0.08mg/g；片劑中含黃芪以黃芪甲苷(C41H68O14)計，不得少于0.08mg/g；顆粒劑中含黃芪以黃芪甲苷(C41H68O14)計，不得少于0.01mg/g。
(2)斑蝥素 照氣相色譜法測定玻璃色譜柱1-2m×3mm id，OV-17(50％甲基-50％苯基聚硅氧烷)固定液的涂漬量為1.5％，擔體Shimalite W(AW-DMCS)80-100目；FID檢測器，進樣口溫度250℃；檢測器溫度250℃；柱溫為160℃；理論板數按斑蝥素峰計算應不低于1000；取斑蝥素對照品，精密稱定，加氯仿制成每1ml含50μg的溶液，即得對照品溶液；取裝量差異項下的膠囊劑、片劑或顆粒劑內容物，研細，取約3g，精密稱定，置100ml燒杯中，加入氯化鈉氫氧化鈉溶液(取1mol/L氫氧化鈉溶液100mL與氯化鈉2g，攪拌，溶解)50ml，再加入2ml丙酮，超聲(功率250w，頻率20kHz)50分鐘，放冷，加入8ml濃鹽酸，攪拌，靜置，放冷，抽濾，用少量水洗滌殘渣，合并濾液，濾液用氯仿萃取4次，每次40ml，合并氯仿液，置50℃水浴上揮至1～2ml(整個操作過程中不得將氯仿揮干)，再加氯仿定容至3ml，搖勻，即得供試品溶液；分別精密量取對照品溶液與供試品溶液各5μl，注入氣相色譜儀測定含量；本口服制劑中，膠囊劑中含斑蝥素(C10H12O4)為0.025-0.180mg/g；片劑中含斑蝥素(C10H12O4)為0.025-0.180mg/g；顆粒劑中含斑蝥素(C10H12O4)為0.003-0.018mg/g。
本發明的實施例7復方斑蝥制劑的質量控制方法可以包括性狀對于膠囊劑，內容物為黃綠色至棕褐色的粉末，味微苦回甜；對于片劑，產品為薄膜衣片，除去薄膜衣后顯黃綠色至棕褐色，味微苦回甜；對于顆粒劑，產品為棕黃色至深褐色的顆粒；味甜。
鑒別(1)取膠囊劑、片劑或顆粒劑各5g，研細，置索氏提取器中，加適量氯仿，置水浴中回流提取3小時，棄去氯仿液，取出濾筒，晾干，待氯仿揮盡，再置索氏提取器中，加適量甲醇，置水浴中回流提取6小時，回收甲醇至干，殘渣加5％氫氧化鈉溶液10ml使溶解，轉至分液漏斗中，再用10ml水分3次洗滌容器，轉移至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇提取6次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗滌3次，每次10ml，分取正丁醇液，蒸干，殘渣用1.2ml水分5次溶解，轉移至2g、干法裝柱、直徑1cm、長25cm、100～200目的中性氧化鋁柱上，先用50ml氯仿洗脫，棄去氯仿洗脫液，再用70％甲醇40ml洗脫，洗脫液于水浴上蒸干，殘渣加甲醇2ml使溶解，作為供試品溶液；另取人參皂苷Rg1對照品及黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1ml各含2mg的混合溶液，作為對照品溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液20μl，對照品溶液10μl，分別點于同一硅膠G薄層板(厚550μm)上，以三氯甲烷∶甲醇∶水＝50∶2∶10的下層溶液為展開劑(必要時控制濕度)，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置500nm紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。
(2)取膠囊劑、片劑或顆粒劑4g，研細，加乙醚40ml，加熱回流50分鐘，放冷，濾過，棄去濾液，藥渣加甲醇40ml，加熱回流50分鐘，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2ml溶解，作為供試品溶液；另取半支蓮對照藥材2g，同法制成對照藥材溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液、對照藥材溶液各20μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯∶甲酸乙酯∶甲酸＝20∶1∶9為展開劑，展開，取出，晾干；置500nm紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。
(3)取膠囊劑、片劑或顆粒劑5g，研細，加50％甲醇50ml，加熱回流2小時，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加50％甲醇適量溶解，加于中性氧化鋁柱上，用40％甲醇80ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇2ml使溶解，作為供試品溶液；另取馬錢苷對照品，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作為對照品溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液、對照品溶液各20μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上(點成帶狀)，以甲苯∶丙酮∶無水乙醇∶甲酸＝9∶5∶10∶0.1為展開劑，展開，取出，晾干；噴以10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點清晰；供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。
檢查水分 不得過15.0％。
氯仿殘留量 照氣相色譜法測定彈性石英毛細管柱(柱長30m，內徑0.25mm，膜厚度0.25μm)Rtx-5(5％苯基-甲基硅氧烷為固定相)；程序升溫初始溫度60℃，保持5min，以每分鐘30℃的速率升溫至180℃，保持5min；FID檢測器；進樣口溫度200℃；檢測器溫度250℃；分流比10∶1；線速度30cm/sec；氫氣流量40mL/min；空氣流量400mL/min；采用頂空進樣氣化室溫度為120℃，加熱40min，進樣針溫度120℃，傳輸管溫度130℃；理論板數以氯仿峰計算應不低于5000；精密稱取氯仿對照品，加75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，制成每1mL含30μg的溶液，即得對照品溶液；取裝量差異項下的膠囊劑、片劑或顆粒劑，取內容物約2.0g，精密稱定，置具塞試管中，精密加入75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)20ml，密塞，振搖5min，離心，取上清液，即得供試品溶液；分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各4ml于20ml頂空瓶中，軋蓋，于頂空爐中110℃平衡50min后，分別取頂空瓶中飽和氣體2.0ml注入氣相色譜儀測定；本口服制劑中，氯仿殘留量不得過0.006％。
其他 本發明的膠囊劑、片劑或顆粒劑應符合中國藥典關于膠囊劑、片劑或顆粒劑項下的有關規定。
權利要求
1.一種復方斑蝥口服制劑的質量控制方法，所述口服制劑為膠囊劑、片劑或顆粒劑，其特征在于所述質量控制方法主要包括性狀、鑒別、檢查以及含量測定項目中的部分或全部；其中鑒別包括對制劑中人參、黃芪、半枝蓮、山茱萸和女貞子的薄層色譜鑒別；檢查包括水分、氯仿殘留量以及其他常規項目；含量測定是對制劑中黃芪和斑蝥中所含斑蝥素的含量測定。
2.按照權利要求1所述復方斑蝥口服制劑的質量控制方法，其特征在于人參和黃芪的鑒別方法是以人參皂苷Rg1對照品及黃芪甲苷對照品為對照，以三氯甲烷∶甲醇∶水＝5-50∶2-20∶0.5-10的下層溶液為展開劑的薄層色譜法；半枝蓮的鑒別方法是以半枝蓮對照藥材為對照，以甲苯∶甲酸乙酯∶甲酸＝2-20∶1-9∶1-9為展開劑的薄層色譜法；山茱萸的鑒別方法是以馬錢苷對照品為對照，以甲苯∶丙酮∶無水乙醇∶甲酸＝1-9∶5-50∶0.5-10∶0.1-0.9為展開劑的薄層色譜法；女貞子的鑒別方法是以女貞子對照藥材為對照，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝10-50∶1-9∶0.1-0.9為展開劑的薄層色譜法；氯仿殘留量的檢查方法是以氯仿對照品為對照的氣相色譜法；黃芪的含量測定方法是以黃芪甲苷對照品為對照，以乙腈∶水＝10-90∶90-10為流動相的高效液相色譜法；斑蝥中所含斑蝥素的含量測定方法是以斑蝥素對照品為對照的氣相色譜法。
3.按照權利要求1或2所述復方斑蝥口服制劑的質量控制方法，其特征在于所述鑒別方法包括以下項目的部分或全部(1)取膠囊劑、片劑或顆粒劑，研細，置索氏提取器中，加適量氯仿，置水浴中回流提取，棄去氯仿液，取出濾筒，晾干，待氯仿揮盡，再置索氏提取器中，加適量甲醇，置水浴中回流提取，回收甲醇至干，殘渣加氫氧化鈉溶液使溶解，轉至分液漏斗中，再用水洗滌容器，轉移至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇提取，提取液用水洗滌，分取正丁醇液，蒸干，殘渣用水溶解，轉移至中性氧化鋁柱上，先用氯仿洗脫，棄去氯仿洗脫液，再用甲醇洗脫，洗脫液于水浴上蒸干，殘渣加甲醇使溶解，作為供試品溶液；另取人參皂苷Rg1對照品及黃芪甲苷對照品，加甲醇溶解，作為對照品溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液及對照品溶液，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷∶甲醇∶水＝5-50∶2-20∶0.5-10的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置200-500nm紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；(2)取膠囊劑、片劑或顆粒劑，研細，加乙醚加熱回流，放冷，濾過，棄去濾液，藥渣加甲醇加熱回流，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇溶解，作為供試品溶液；另取半支蓮對照藥材，同法制成對照藥材溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液及對照藥材溶液，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯∶甲酸乙酯∶甲酸＝2-20∶1-9∶1-9為展開劑，展開，取出，晾干；置200-500nm紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；(3)取膠囊劑、片劑或顆粒劑，研細，加甲醇，加熱回流，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇適量溶解，加于中性氧化鋁柱上，用甲醇洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇使溶解，作為供試品溶液；另取馬錢苷對照品，加甲醇溶解，作為對照品溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液及對照品溶液，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯∶丙酮∶無水乙醇∶甲酸＝1-9∶5-50∶0.5-10∶0.1-0.9為展開劑，展開，取出，晾干；噴以10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點清晰；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；(4)取膠囊劑、片劑或顆粒劑，研細，加乙酸乙酯，超聲，濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇溶解，作為供試品溶液；另取女貞子對照藥材，同法制成對照藥材溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液及對照藥材溶液，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝10-50∶1-9∶0.1-0.9為展開劑，展開，取出，晾干；噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。
4.按照權利要求3所述復方斑蝥口服制劑的質量控制方法，其特征在于更具體的鑒別方法包括以下項目的部分或全部(1)取膠囊劑、片劑或顆粒劑各2-5g，研細，置索氏提取器中，加適量氯仿，置水浴中回流提取1-3小時，棄去氯仿液，取出濾筒，晾干，待氯仿揮盡，再置索氏提取器中，加適量甲醇，置水浴中回流提取2-6小時，回收甲醇至干，殘渣加5％氫氧化鈉溶液1-10ml使溶解，轉至分液漏斗中，再用1-10ml水分1-3次洗滌容器，轉移至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇提取2-6次，每次2-20ml，合并正丁醇液，用水洗滌1-3次，每次1-10ml，分取正丁醇液，蒸干，殘渣用0.4-1.2ml水分1-5次溶解，轉移至2g、干法裝柱、直徑1cm、長25cm、100～200目的中性氧化鋁柱上，先用10-50ml氯仿洗脫，棄去氯仿洗脫液，再用70％甲醇10-40ml洗脫，洗脫液于水浴上蒸干，殘渣加甲醇0.5-2ml使溶解，作為供試品溶液；另取人參皂苷Rg1對照品及黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1ml各含0.5-2mg的混合溶液，作為對照品溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液5-20μl，對照品溶液2-10μl，分別點于450-550μm厚的同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷∶甲醇∶水＝5-50∶2-20∶0.5-10的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置200-500nm紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；(2)取膠囊劑、片劑或顆粒劑1-4g，研細，加乙醚10-40ml，加熱回流10-50分鐘，放冷，濾過，棄去濾液，藥渣加甲醇10-40ml，加熱回流10-50分鐘，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇0.5-2ml溶解，作為供試品溶液；另取半支蓮對照藥材0.5-2g，同法制成對照藥材溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液、對照藥材溶液各2-20μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯∶甲酸乙酯∶甲酸＝2-20∶1-9∶1-9為展開劑，展開，取出，晾干；置200-500nm紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；(3)取膠囊劑、片劑或顆粒劑1-5g，研細，加50％甲醇10-50ml，加熱回流0.5-2小時，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加50％甲醇適量溶解，加于4g、100～200目的中性氧化鋁柱上，用40％甲醇20-80ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇0.5-2ml使溶解，作為供試品溶液；另取馬錢苷對照品，加甲醇制成每1ml含0.5-2mg的溶液，作為對照品溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液、對照品溶液各5-20μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯∶丙酮∶無水乙醇∶甲酸＝1-9∶5-50∶0.5-10∶0.1-0.9為展開劑，展開，取出，晾干；噴以10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點清晰；供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；(4)取膠囊劑、片劑或顆粒劑1-5g，研細，加乙酸乙酯10-40ml，超聲10-30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇0.5-2ml溶解，作為供試品溶液；另取女貞子對照藥材0.2-2g，同法制成對照藥材溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液、對照藥材溶液各2-20μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝10-50∶1-9∶0.1-0.9為展開劑，展開，取出，晾干；噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。
5.按照權利要求1或2所述復方斑蝥口服制劑的質量控制方法，其特征在于氯仿殘留量的檢查方法為照氣相色譜法測定柱長30m、內徑0.25mm、膜厚0.25μm的彈性石英毛細管柱Rtx-5，以5％苯基-甲基硅氧烷為固定相；程序升溫初始溫度60℃，保持5min，以每分鐘30℃的速率升溫至180℃，保持5min；FID檢測器；進樣口溫度200℃；檢測器溫度250℃；分流比10∶1；線速度30cm/sec；氫氣流量40mL/min；空氣流量400mL/min；采用頂空進樣氣化室溫度為100-120℃，加熱25-40min，進樣針溫度110-120℃，傳輸管溫度110-130℃；理論板數以氯仿峰計算應不低于5000；精密稱取氯仿對照品，加75％N，N-二甲基甲酰胺溶解，即得對照品溶液；取裝量差異項下的膠囊劑、片劑或顆粒劑，精密稱定，置具塞試管中，精密加入75％N，N-二甲基甲酰胺，密塞，振搖，離心，取上清液，即得供試品溶液；分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液于頂空瓶中，軋蓋，于頂空爐中高溫平衡一段時間后，分別取頂空瓶中飽和氣體注入氣相色譜儀測定；本口服制劑中，氯仿殘留量不得過0.006％。
6.按照權利要求5所述復方斑蝥口服制劑的質量控制方法，其特征在于更具體的氯仿殘留量的檢查方法為照氣相色譜法測定柱長30m、內徑0.25mm、膜厚0.25μm的彈性石英毛細管柱Rtx-5，以5％苯基-甲基硅氧烷為固定相；程序升溫初始溫度60℃，保持5min，以每分鐘30℃的速率升溫至180℃，保持5min；FID檢測器；進樣口溫度200℃；檢測器溫度250℃；分流比10∶1；線速度30cm/sec；氫氣流量40mL/min；空氣流量400mL/min；采用頂空進樣氣化室溫度為100-120℃，加熱25-40min，進樣針溫度110-120℃，傳輸管溫度110-130℃；理論板數以氯仿峰計算應不低于5000；精密稱取氯仿對照品，加75％N，N-二甲基甲酰胺溶解，制成每1mL含10-30μg的溶液，即得對照品溶液；取裝量差異項下的膠囊劑、片劑或顆粒劑，取內容物約0.5-2.0g，精密稱定，置具塞試管中，精密加入75％N，N-二甲基甲酰胺5-20ml，密塞，振搖1-5min，離心，取上清液，即得供試品溶液；分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各1-4ml于20ml頂空瓶中，軋蓋，于頂空爐中110℃平衡20-50min后，分別取頂空瓶中飽和氣體0.5-2.0ml注入氣相色譜儀測定；本口服制劑中，氯仿殘留量不得過0.006％。
7.按照權利要求1或2所述復方斑蝥口服制劑的質量控制方法，其特征在于所述含量測定方法包括以下項目的部分或全部(1)黃芪照高效液相色譜法測定色譜柱為C18或C4或C8柱，以乙腈∶水＝10-90∶90-10為流動相；流速0.5-1.0ml/min；柱溫30-60℃；蒸發光散射檢測器漂移管溫度為80-100℃；霧化氣體為空氣，流速為1.5-3.0L/min；理論板數按黃芪甲苷峰計算應不低于3000；精密稱取黃芪甲苷對照品，加甲醇溶解，搖勻，即得對照品溶液；取裝量差異項下的膠囊劑、片劑或顆粒劑，精密稱定，置索氏提取器中，加2％氫氧化鉀甲醇溶液，加熱回流，提取液蒸干，殘渣加水使溶解后轉移至分液漏斗中，用乙酸乙酯提取；加水洗滌，棄去乙酸乙酯液，合并水液，用水飽和的正丁醇提取；提取后用氨試液洗滌，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水適量使溶解，轉移至D101型大孔吸附樹脂柱上，用水洗脫，棄去水液，再用70％乙醇洗脫，收集洗脫液，蒸干，用甲醇溶解并轉移至量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過，即得供試品溶液；分別精密吸取對照品溶液1-10μl和2-20μl、供試品溶液2-20μl注入液相色譜儀測定含量；本口服制劑中，膠囊劑中含黃芪以黃芪甲苷C41H68O14計，不得少于0.08mg/g；片劑中含黃芪以黃芪甲苷C41H68O14計，不得少于0.08mg/g；顆粒劑中含黃芪以黃芪甲苷C41H68O14計，不得少于0.01mg/g；(2)斑蝥素照氣相色譜法測定玻璃色譜柱1-2m×3mm i d，OV-17固定液的涂漬量為1.5％，擔體Shimalite W 80-100目；FID檢測器，進樣口溫度230-250℃；檢測器溫度230-250℃；柱溫為150-160℃；理論板數按斑蝥素峰計算應不低于1000；取斑蝥素對照品，精密稱定，加氯仿溶解，搖勻，即得對照品溶液；取裝量差異項下的膠囊劑、片劑或顆粒劑，精密稱定，置燒杯中，加入氯化鈉-氫氧化鈉溶液，再加入丙酮，超聲，放冷，加入濃鹽酸，攪拌，靜置，放冷，抽濾，用少量水洗滌殘渣，合并濾液，濾液用氯仿萃取，氯仿液置50℃水浴上揮至少量，再加氯仿定容，搖勻，即得供試品溶液；分別精密量取對照品溶液與供試品溶液各0.5-5μl，注入氣相色譜儀測定含量；本口服制劑中，膠囊劑中含斑蝥素C10H12O4為0.025-0.180mg/g；片劑中含斑蝥素C10H12O4為0.025-0.180mg/g；顆粒劑中含斑蝥素C10H12O4為0.003-0.018mg/g。
8.按照權利要求7所述復方斑蝥口服制劑的質量控制方法，其特征在于更具體的含量測定方法包括以下項目的部分或全部(1)黃芪照高效液相色譜法測定色譜柱為C18或C4或C8柱，以乙腈∶水＝10-90∶90-10為流動相；流速0.5-1.0ml/min；柱溫30-60℃；蒸發光散射檢測器漂移管溫度為80-100℃；霧化氣體為空氣，流速為1.5-3.0L/min；理論板數按黃芪甲苷峰計算應不低于3000；精密稱取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1ml含0.05-0.5mg的溶液，即得對照品溶液；取裝量差異項下的膠囊劑、片劑或顆粒劑，研細，取約0.5-2g，精密稱定，置索氏提取器中，加2％氫氧化鉀甲醇溶液50-100ml，加熱回流4-6小時，提取液蒸干，殘渣加水10-40ml使溶解后轉移至分液漏斗中，用乙酸乙酯提取1-3次，每次10-40ml；合并乙酸乙酯液，加水10-20ml洗滌；棄去乙酸乙酯液，合并水液，用水飽和的正丁醇提取3-5次，每次20-60ml；合并正丁醇提取液，用氨試液20-60ml洗滌1-2次，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水適量使溶解，轉移至內徑1.5cm、長12cm的D101型大孔吸附樹脂柱上，用水30-70ml洗脫，棄去水液，再用70％乙醇60-100ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，用甲醇溶解并轉移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液；分別精密吸取對照品溶液1-10μl和2-20μl、供試品溶液2-20μl注入液相色譜儀測定含量；本口服制劑中，膠囊劑中含黃芪以黃芪甲苷C41H68O14計，不得少于0.08mg/g；片劑中含黃芪以黃芪甲苷C41H68O14計，不得少于0.08mg/g；顆粒劑中含黃芪以黃芪甲苷C41H68O14計，不得少于0.01mg/g；(2)斑蝥素照氣相色譜法測定玻璃色譜柱1-2m×3mm i d，OV-17 50％甲基-50％苯基聚硅氧烷固定液的涂漬量為1.5％，擔體Shimalite W 80-100目；FID檢測器，進樣口溫度230-250℃；檢測器溫度230-250℃；柱溫為150-160℃；理論板數按斑蝥素峰計算應不低于1000；取斑蝥素對照品，精密稱定，加氯仿制成每1ml含30-50μg的溶液，即得對照品溶液；取裝量差異項下的膠囊劑、片劑或顆粒劑內容物，研細，取約1-3g，精密稱定，置100ml燒杯中，加入氯化鈉-氫氧化鈉溶液30-50ml，再加入0.5-2ml丙酮，功率250w、頻率20kHz下超聲20-50分鐘，放冷，加入2-8ml濃鹽酸，攪拌，靜置，放冷，抽濾，用少量水洗滌殘渣，合并濾液，濾液用氯仿萃取2-4次，每次30-40ml，合并氯仿液，置50℃水浴上揮至1～2ml，再加氯仿定容至3ml，搖勻，即得供試品溶液；分別精密量取對照品溶液與供試品溶液各0.5-5μl，注入氣相色譜儀測定含量；本口服制劑中，膠囊劑中含斑蝥素C10H12O4為0.025-0.180mg/g；片劑中含斑蝥素C10H12O4為0.025-0.180mg/g；顆粒劑中含斑蝥素C10H12O4為0.003-0.018mg/g。
9.按照權利要求1所述復方斑蝥口服制劑的質量控制方法，其特征在于所述質量控制方法包括性狀對于膠囊劑，內容物為黃綠色至棕褐色的粉末，味微苦回甜；對于片劑，產品為薄膜衣片，除去薄膜衣后顯黃綠色至棕褐色，味微苦回甜；對于顆粒劑，產品為棕黃色至深褐色的顆粒；味甜；鑒別(1)取膠囊劑、片劑或顆粒劑，研細，置索氏提取器中，加適量氯仿，置水浴中回流提取，棄去氯仿液，取出濾筒，晾干，待氯仿揮盡，再置索氏提取器中，加適量甲醇，置水浴中回流提取，回收甲醇至干，殘渣加氫氧化鈉溶液使溶解，轉至分液漏斗中，再用水洗滌容器，轉移至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇提取，提取液用水洗滌，分取正丁醇液，蒸干，殘渣用水溶解，轉移至中性氧化鋁柱上，先用氯仿洗脫，棄去氯仿洗脫液，再用甲醇洗脫，洗脫液于水浴上蒸干，殘渣加甲醇使溶解，作為供試品溶液；另取人參皂苷Rg1對照品及黃芪甲苷對照品，加甲醇溶解，作為對照品溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液及對照品溶液，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷∶甲醇∶水＝5-50∶2-20∶0.5-10的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置200-500nm紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；(2)取膠囊劑、片劑或顆粒劑，研細，加乙醚加熱回流，放冷，濾過，棄去濾液，藥渣加甲醇加熱回流，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇溶解，作為供試品溶液；另取半支蓮對照藥材，同法制成對照藥材溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液及對照藥材溶液，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯∶甲酸乙酯∶甲酸＝2-20∶1-9∶1-9為展開劑，展開，取出，晾干；置200-500nm紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；(3)取膠囊劑、片劑或顆粒劑，研細，加甲醇，加熱回流，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇適量溶解，加于中性氧化鋁柱上，用甲醇洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇使溶解，作為供試品溶液；另取馬錢苷對照品，加甲醇溶解，作為對照品溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液及對照品溶液，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯∶丙酮∶無水乙醇∶甲酸＝1-9∶5-50∶0.5-10∶0.1-0.9為展開劑，展開，取出，晾干；噴以10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點清晰；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；(4)取膠囊劑、片劑或顆粒劑，研細，加乙酸乙酯，超聲，濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇溶解，作為供試品溶液；另取女貞子對照藥材，同法制成對照藥材溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液及對照藥材溶液，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝10-50∶1-9∶0.1-0.9為展開劑，展開，取出，晾干；噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；檢查水分不得過15.0％；氯仿殘留量照氣相色譜法測定柱長30m、內徑0.25mm、膜厚0.25μm的彈性石英毛細管柱Rtx-5，以5％苯基-甲基硅氧烷為固定相；程序升溫初始溫度60℃，保持5min，以每分鐘30℃的速率升溫至180℃，保持5min；FID檢測器；進樣口溫度200℃；檢測器溫度250℃；分流比10∶1；線速度30cm/sec；氫氣流量40mL/min；空氣流量400mL/min；采用頂空進樣氣化室溫度為100-120℃，加熱25-40min，進樣針溫度110-120℃，傳輸管溫度110-130℃；理論板數以氯仿峰計算應不低于5000；精密稱取氯仿對照品，加75％N，N-二甲基甲酰胺溶解，即得對照品溶液；取裝量差異項下的膠囊劑、片劑或顆粒劑，精密稱定，置具塞試管中，精密加入75％N，N-二甲基甲酰胺，密塞，振搖，離心，取上清液，即得供試品溶液；分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液于頂空瓶中，軋蓋，于頂空爐中高溫平衡一段時間后，分別取頂空瓶中飽和氣體注入氣相色譜儀測定；本口服制劑中，氯仿殘留量不得過0.006％；其他本發明的膠囊劑、片劑或顆粒劑應符合中國藥典關于膠囊劑、片劑或顆粒劑項下的有關規定；含量測定(1)黃芪照高效液相色譜法測定色譜柱為C18或C4或C8柱，以乙腈∶水＝10-90∶90-10為流動相；流速0.5-1.0ml/min；柱溫30-60℃；蒸發光散射檢測器漂移管溫度為80-100℃；霧化氣體為空氣，流速為1.5-3.0L/min；理論板數按黃芪甲苷峰計算應不低于3000；精密稱取黃芪甲苷對照品，加甲醇溶解，搖勻，即得對照品溶液；取裝量差異項下的膠囊劑、片劑或顆粒劑，精密稱定，置索氏提取器中，加2％氫氧化鉀甲醇溶液，加熱回流，提取液蒸干，殘渣加水使溶解后轉移至分液漏斗中，用乙酸乙酯提取；加水洗滌，棄去乙酸乙酯液，合并水液，用水飽和的正丁醇提取；提取后用氨試液洗滌，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水適量使溶解，轉移至D101型大孔吸附樹脂柱上，用水洗脫，棄去水液，再用70％乙醇洗脫，收集洗脫液，蒸干，用甲醇溶解并轉移至量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過，即得供試品溶液；分別精密吸取對照品溶液1-10μl和2-20μl、供試品溶液2-20μl注入液相色譜儀測定含量；本口服制劑中，膠囊劑中含黃芪以黃芪甲苷C41H68O14計，不得少于0.08mg/g；片劑中含黃芪以黃芪甲苷C41H68O14計，不得少于0.08mg/g；顆粒劑中含黃芪以黃芪甲苷C41H68O14計，不得少于0.01mg/g；(2)斑蝥素照氣相色譜法測定玻璃色譜柱1-2m×3mm i d，OV-17固定液的涂漬量為1.5％，擔體Shimalite W 80-100目；FID檢測器，進樣口溫度230-250℃；檢測器溫度230-250℃；柱溫為150-160℃；理論板數按斑蝥素峰計算應不低于1000；取斑蝥素對照品，精密稱定，加氯仿溶解，搖勻，即得對照品溶液；取裝量差異項下的膠囊劑、片劑或顆粒劑，精密稱定，置燒杯中，加入氯化鈉-氫氧化鈉溶液，再加入丙酮，超聲，放冷，加入濃鹽酸，攪拌，靜置，放冷，抽濾，用少量水洗滌殘渣，合并濾液，濾液用氯仿萃取，氯仿液置50℃水浴上揮至少量，再加氯仿定容，搖勻，即得供試品溶液；分別精密量取對照品溶液與供試品溶液各0.5-5μl，注入氣相色譜儀測定含量；本口服制劑中，膠囊劑中含斑蝥素C10H12O4為0.025-0.180mg/g；片劑中含斑蝥素C10H12O4為0.025-0.180mg/g；顆粒劑中含斑蝥素C10H12O4為0.003-0.018mg/g。
10.按照權利要求9所述復方斑蝥口服制劑的質量控制方法，其特征在于所述質量控制方法包括性狀對于膠囊劑，內容物為黃綠色至棕褐色的粉末，味微苦回甜；對于片劑，產品為薄膜衣片，除去薄膜衣后顯黃綠色至棕褐色，味微苦回甜；對于顆粒劑，產品為棕黃色至深褐色的顆粒；味甜；鑒別(1)取膠囊劑、片劑或顆粒劑各2-5g，研細，置索氏提取器中，加適量氯仿，置水浴中回流提取1-3小時，棄去氯仿液，取出濾筒，晾干，待氯仿揮盡，再置索氏提取器中，加適量甲醇，置水浴中回流提取2-6小時，回收甲醇至干，殘渣加5％氫氧化鈉溶液1-10ml使溶解，轉至分液漏斗中，再用1-10ml水分1-3次洗滌容器，轉移至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇提取2-6次，每次2-20ml，合并正丁醇液，用水洗滌1-3次，每次1-10ml，分取正丁醇液，蒸干，殘渣用0.4-1.2ml水分1-5次溶解，轉移至2g、干法裝柱、直徑1cm、長25cm、100～200目的中性氧化鋁柱上，先用10-50ml氯仿洗脫，棄去氯仿洗脫液，再用70％甲醇10-40ml洗脫，洗脫液于水浴上蒸干，殘渣加甲醇0.5-2ml使溶解，作為供試品溶液；另取人參皂苷Rg1對照品及黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1ml各含0.5-2mg的混合溶液，作為對照品溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液5-20μl，對照品溶液2-10μl，分別點于450-550μm厚的同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷∶甲醇∶水＝5-50∶2-20∶0.5-10的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置200-500nm紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；(2)取膠囊劑、片劑或顆粒劑1-4g，研細，加乙醚10-40ml，加熱回流10-50分鐘，放冷，濾過，棄去濾液，藥渣加甲醇10-40ml，加熱回流10-50分鐘，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇0.5-2ml溶解，作為供試品溶液；另取半支蓮對照藥材0.5-2g，同法制成對照藥材溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液、對照藥材溶液各2-20μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯∶甲酸乙酯∶甲酸＝2-20∶1-9∶1-9為展開劑，展開，取出，晾干；置200-500nm紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；(3)取膠囊劑、片劑或顆粒劑1-5g，研細，加50％甲醇10-50ml，加熱回流0.5-2小時，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加50％甲醇適量溶解，加于4g、100～200目的中性氧化鋁柱上，用40％甲醇20-80ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇0.5-2ml使溶解，作為供試品溶液；另取馬錢苷對照品，加甲醇制成每1ml含0.5-2mg的溶液，作為對照品溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液、對照品溶液各5-20μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯∶丙酮∶無水乙醇∶甲酸＝1-9∶5-50∶0.5-10∶0.1-0.9為展開劑，展開，取出，晾干；噴以10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點清晰；供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；(4)取膠囊劑、片劑或顆粒劑1-5g，研細，加乙酸乙酯10-40ml，超聲10-30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇0.5-2ml溶解，作為供試品溶液；另取女貞子對照藥材0.2-2g，同法制成對照藥材溶液；照中國藥典薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液、對照藥材溶液各2-20μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝10-50∶1-9∶0.1-0.9為展開劑，展開，取出，晾干；噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；檢查水分不得過15.0％；氯仿殘留量照氣相色譜法測定柱長30m、內徑0.25mm、膜厚0.25μm的彈性石英毛細管柱Rtx-5，以5％苯基-甲基硅氧烷為固定相；程序升溫初始溫度60℃，保持5min，以每分鐘30℃的速率升溫至180℃，保持5min；FID檢測器；進樣口溫度200℃；檢測器溫度250℃；分流比10∶1；線速度30cm/sec；氫氣流量40mL/min；空氣流量400mL/min；采用頂空進樣氣化室溫度為100-120℃，加熱25-40min，進樣針溫度110-120℃，傳輸管溫度110-130℃；理論板數以氯仿峰計算應不低于5000；精密稱取氯仿對照品，加75％N，N-二甲基甲酰胺溶解，制成每1mL含10-30μg的溶液，即得對照品溶液；取裝量差異項下的膠囊劑、片劑或顆粒劑，取內容物約0.5-2.0g，精密稱定，置具塞試管中，精密加入75％N，N-二甲基甲酰胺5-20ml，密塞，振搖1-5min，離心，取上清液，即得供試品溶液；分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各1-4ml于20ml頂空瓶中，軋蓋，于頂空爐中110℃平衡20-50min后，分別取頂空瓶中飽和氣體0.5-2.0ml注入氣相色譜儀測定；本口服制劑中，氯仿殘留量不得過0.006％；其他本發明的膠囊劑、片劑或顆粒劑應符合中國藥典關于膠囊劑、片劑或顆粒劑項下的有關規定；含量測定(1)黃芪照高效液相色譜法測定色譜柱為C18或C4或C8柱，以乙腈∶水＝10-90∶90-10為流動相；流速0.5-1.0ml/min；柱溫30-60℃；蒸發光散射檢測器漂移管溫度為80-100℃；霧化氣體為空氣，流速為1.5-3.0L/min；理論板數按黃芪甲苷峰計算應不低于3000；精密稱取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1ml含0.05-0.5mg的溶液，即得對照品溶液；取裝量差異項下的膠囊劑、片劑或顆粒劑，研細，取約0.5-2g，精密稱定，置索氏提取器中，加2％氫氧化鉀甲醇溶液50-100ml，加熱回流4-6小時，提取液蒸干，殘渣加水10-40ml使溶解后轉移至分液漏斗中，用乙酸乙酯提取1-3次，每次10-40ml；合并乙酸乙酯液，加水10-20ml洗滌；棄去乙酸乙酯液，合并水液，用水飽和的正丁醇提取3-5次，每次20-60ml；合并正丁醇提取液，用氨試液20-60ml洗滌1-2次，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水適量使溶解，轉移至內徑1.5cm、長12cm的D101型大孔吸附樹脂柱上，用水30-70ml洗脫，棄去水液，再用70％乙醇60-100ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，用甲醇溶解并轉移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液；分別精密吸取對照品溶液1-10μl和2-20μl、供試品溶液2-20μl注入液相色譜儀測定含量；本口服制劑中，膠囊劑中含黃芪以黃芪甲苷C41H68O14計，不得少于0.08mg/g；片劑中含黃芪以黃芪甲苷C41H68O14計，不得少于0.08mg/g；顆粒劑中含黃芪以黃芪甲苷C41H68O14計，不得少于0.01mg/g；(2)斑蝥素照氣相色譜法測定玻璃色譜柱1-2m×3mm i d，OV-1750％甲基-50％苯基聚硅氧烷固定液的涂漬量為1.5％，擔體Shimalite W 80-100目；FID檢測器，進樣口溫度230-250℃；檢測器溫度230-250℃；柱溫為150-160℃；理論板數按斑蝥素峰計算應不低于1000；取斑蝥素對照品，精密稱定，加氯仿制成每1ml含30-50μg的溶液，即得對照品溶液；取裝量差異項下的膠囊劑、片劑或顆粒劑內容物，研細，取約1-3g，精密稱定，置100ml燒杯中，加入氯化鈉-氫氧化鈉溶液30-50ml，再加入0.5-2ml丙酮，功率250w、頻率20kHz下超聲20-50分鐘，放冷，加入2-8ml濃鹽酸，攪拌，靜置，放冷，抽濾，用少量水洗滌殘渣，合并濾液，濾液用氯仿萃取2-4次，每次30-40ml，合并氯仿液，置50℃水浴上揮至1～2ml，再加氯仿定容至3ml，搖勻，即得供試品溶液；分別精密量取對照品溶液與供試品溶液各0.5-5μl，注入氣相色譜儀測定含量；本口服制劑中，膠囊劑中含斑蝥素C10H12O4為0.025-0.180mg/g；片劑中含斑蝥素C10H12O4為0.025-0.180mg/g；顆粒劑中含斑蝥素C10H12O4為0.003-0.018mg/g。
11.按照權利要求8、9或10所述復方斑蝥口服制劑的質量控制方法，其特征在于所用的氯化鈉-氫氧化鈉溶液是在1mol/L氫氧化鈉溶液100mL中加入氯化鈉2g，攪拌、溶解而成的。
全文摘要
本發明公開了一種復方斑蝥口服制劑的質量控制方法，所述質量控制方法主要包括性狀、鑒別、檢查以及含量測定項目中的部分或全部；其中鑒別包括對制劑中人參、黃芪、半枝蓮、山茱萸和女貞子的薄層色譜鑒別；檢查包括水分、氯仿殘留量以及其他常規項目；含量測定是對制劑中黃芪和斑蝥中所含斑蝥素的含量測定。與現有技術相比，本發明質量控制方法補充建立了黃芪和斑蝥素的含量測定以及半枝蓮、山茱萸、女貞子的薄層鑒別項目，增加了氯仿殘留量的檢查，并對人參和黃芪兩味藥材的薄層鑒別方法進行了改進，提高了復方斑蝥口服制制劑的質量控制標準，可有效地控制產品質量，從而確保其臨床療效。
文檔編號A61K35/413GK101036774SQ20071020046
公開日2007年9月19日 申請日期2007年4月17日 優先權日2007年4月17日
發明者葉湘武, 湯瓊, 李磊 申請人:貴州益佰制藥股份有限公司