專利名稱：獲得醫用純單唾液酸神經節苷脂gm1的方法
獲得醫用^唾^M神經節苷脂GM1的方法本發明涉及單唾^^神經節苷脂GM1，更確切地，涉A^得和純4傳唾液 酸神經節苷脂GM1的方法. 背景技術神經節苷脂是一類鞘糖脂，具有一個或多個唾'^Wi基，被大量發現于人 類和動物的大腦、神^BL織中。已知單唾^M神經節苷脂GM1可用于很多藥學 應用中，特別是在中才E^周圍神經系統病癥的修復和治療中。按照美國專利US 4 849 413，從牛或豬的 組織中方^ _取沖經節苷 脂。為了適合于制藥學的應用，單唾^M神經節苷脂GM1 ^必須被一離并純 化。為了提高單唾' _神經節苷脂GM1的產率，已知用化學、酶的方法來處理 提取的脂質^^，以姊它神經節苷脂組^^^4唾';^^神經節苷脂GM1。 這些方法包括用弱酸水解，例如CN 1353112中所記載的，或利用唾^^酶進行 酶水解，例如在US 5296360中所記栽的。在EP0150 712中記載了^JJ氯仿甲醇^MU;匕為60: 30: 4. 5的^M^t， 通過棑阻色鐠法對所述強化GM1的脂質^^物的進一步純化。EP 0 489 352記 載了通過用a-環糊精對脂質';^^溶 :#^濾，之后用乙醇溶劑萃取而對 GM1進行萃取，對GM1強^!旨質^^物的純化。據aii可以獲得ityt為95%的 GM1。這些方法先前已經,皮證實在GM1的純度和產率、以及涉及到費用、效率和 應用于工業贈的有效'I^Ji,存在缺陷。對于制藥學應用，需要生產出高艦的神經節苷脂GM1。相應地，>^#著 對獲得高純度神經節苷脂GM1的迫切需求。本申請的發明者驚奇^JL，通it&于離子交換色語法的方法，可以將神 經節苷脂GM1從^f申經節苷脂質中有^i^分離出來。基于本發明，已逸發現^^含有鉀或銫離子的' ^€過離子交換柱色譜 從含有單唾液酸神經節苷脂GM1作為主要神經節苷脂組分的脂質混合物中將4GM1分離出來的方法，可以制備出高^tl的神經節苷脂GM1。基于本發明，提供了一種才M^U'漆求1所述的神經節苷脂GM1的分離和 純化方法。基于本發明的^^脅實施方式，提供了一種含有下逸悉的步驟的方法 (a MM含有鉀或銫離子的洗脫M過離子交換柱色i普從含有單喻;iJt^神 經節苷脂GM1作為主要神經節苷脂組分的脂質;S^中分離出GM1，(b) 從' 6^中回^i^，(c) 對回收的^的7j^目ig^ii行滲濾，(d) 加入鈉鹽，并對所得^i行滲濾，并(e) 回收GM1。優選，本發明的方法允許高純度單神經節苷脂GM1的制備。才財居本發明， 單唾'^M神經節苷脂GM1可以以高于98%的^>1，甚至高于99.0%，甚至99.90/。的^t^皮制備出來。進而，本發明的方法有利^WM簡單步驟，是劃算的，JLit合于工業, 的應用。顯現。詳細說明本發明提供了-"^單神經節苷脂GMl純化的方法，其中GM1是4M含有鉀 或銫離子的^^i過離子交換柱色i普從含有單唾'^^神經節香脂GM1作為主 要神經節苷脂組賴脂質^^中分離出來的。在一個優選的實施方式中，提供了 一種制備高純度單唾液酸神經節苷月旨 GM1的方法，包^#驟(a MM含有鉀或銫離子的、3UWit過離子交換柱色鐠從含有單唾^^神 經節苷脂GM1作為主要神經節苷脂組分的脂質^^中分離出GM1，(b) 從步驟(c)的^^t中回il4^:質，(c) 對步驟(d)回收的溶質的7M目^it行滲濾，從而去除殘留的^f或她(d) 加入鈉離子，M以適宜的鈉鹽的形式，以置換出與GM1結合的鉀或 銫離子，并對7M目ii^ii行滲濾，以除去殘留鈉鹽，并且(e)回收鈉鹽形式的GM1。月旨質;^^可以由牛、綿羊、馬、豬^纟1^只的脂質*14€物制備。 有利地，含有單唾^^神經節苷脂GM1作為主要神經節苷脂組分的脂質混 楊可以由含有至少30%、 ^f^E少50%,更^Li^少70%的神經節苷脂^^ 物的脂質提取物制4#到。脂質提取的剩余物通常由確腦苷脂、腦普脂、脂肪 酸和蛋白質《M,M為約50000道爾頓的膜進4亍滲濾，從而4^Ut鹽。對于滲濾，可以^JD ^^r傳統的透析膜。^i^過濾盒，例如可以使用SART0C0N (賽多利斯)聚砜 ^±>慮盒類型，比如具有約50000道爾頓分離點(cut-off)的。脂質提MH^經受7jc解處理以將^i要神經節苷脂組分例如GTlb、 GTla以及GDlb轉變成GMl以提高GM1的含量。水解可以使用傳統方法進行。水解可以有利地/^jf]文獻中已知的用于神經 節苷脂的被稱為酸水解或酶7]c解的兩種常^Mc解方法中的任何一種進行。酸水解可以例如^^稀itiA^例:M^鹽酸、石if[^和硝^Mi行。^7jc解可 以通過調整脂質提絲7j^目溶液的pH值到襯pH3. 5到5之間，她pH4. 0左 右，然后加熱il^一溫度^^介于90匸到100^之間并##完成^^要神 經節苷脂組^#化成GM1所需要的時間而實現。將主要的神經節苷脂水解成GM1 所需的時間絲于pH值和所選輛溫度。通常，pH鵬高，完成7傳所需要的 時間越長，而M溫J^高，完成水解所需的時間越短。水解反應通常可以進 行大約2到5個小時。例如，當在pH4.0和95t:下進^7jC解時，所需的完成水 ^v^的時間U約3小時。酵水解可以4^H^f5f適宜的唾';^I^Ji行。伏選可以使用產脲節桿菌唾'; ^系s或霍舌m菌喻;^11。 ^^^產脲節桿菌唾^m系s和霍舌ui菌唾，^H對GTla、 GDla、 GDlb是有活性的，但對GM1沒有活性。酶水解可以通過 例:i,整脂質提,7j^目驗的pH傲ij所^^J的S^^佳活性的pH,例如在pH4 和pH6之間，例如大約pH5而進行，通it^加適合的緩沖液例如醋酸緩沖液， 在唾、^H是霍舌Ul菌唾';^l的情況下加入Ca2+離子，并在所用酶的最佳活性 溫度例如大約37。C下加熱溶液，保^t所需的時間從而完A^變。水解通常可以 進行大約12-24小時，取決于添加的酶劑量。由于其屬于非特異性水解過程，以及向^f申經節苷脂類的轉^it常提供較低的GM1產量，所以酸水解是較不 的。而且，^7jc解過程會導致缺乏唾 ^M^的"GM1雜質的形成。由于高的化學轉4沐異性，其通常提供更高的GM1產率，因jH^7jc解方法 是她的。對于酶7jc解，產脲節桿菌唾 ||是她的，因為其不需要為其活 性而添加Ca"離子。進而，由于其52 000道爾頓的襯量(相對于霍舌L^菌唾 酶的82 OOO道爾頓)，其可以有利皿ii^濾被洗去。為了 A^彰良中回收這樣產生的具有提高單唾';^i^神經節苷脂GM1 ^f: 的脂質^^物，^J^液可以有利地^^濾，例M過具有10000到100000道爾 頓，絲約為50000道爾頓的微3U^寸的膜。滲濾可以^^Hi^傳統的透析膜。 可以有利地^U過濾盒，例如SARTOCON (賽多利斯)聚颯的ii;慮盒類型，優 i^具有約50000道爾頓的分離點(cut-off)的，ISt^將滲透物干燥而獲得包含 單唾'^i^神經節苷脂GM1作為主要神經節苷脂組分的脂質^^粉末。干燥可 以通過傳統方法進行。有利地，干燥可以通過噴霧干M真空干燥進行。月旨質》^^通tT以含有10到200g/lt的GMl M, > ^少100g/lt。基于本發明的方法，神經節香脂GM1是{^)離子交換色語W旨質;^^中 的，申經節苦脂中分離出來的。已經驚奇^JL，當^^1含有#^鉀離子的 ^時，從^k^唾'^j^神 經節苷脂類中成功分離出GM1是可能的，￡^現，傳MJi使用的離子交^^UUt常不允許有^kA^^唾^^神 經節苦脂類中分離出GM1。特別值得注意的是在通過已知水解處理生產的豬的脂 質混合物中作為主要的神經節苷脂雜質存在的巖藻糖跣單唾液酸神經節苷脂 GM1。GM1和巖藻糖酰GM1兩種襯具有非常勤以的物理特性。兩絲帶有單個 負電荷，由唾'滅的^iJ^團提供，并財剿以的襯量；分別是1558和1704。 從而，當^^填ffi平衡的離子交換柱中時，兩種神經節苷脂^t脂的結合力 ;i相同的。已^M^到，當向'3yw中添加醋酸鈉以增大'3ym的離子強度，并提供置換神經節苷脂的糾時，^目同的離子強度和相同時間下，GM1和巖藻糖酖 GM1#MC， 。不能實m兩種單唾^M神經節苷脂的分離。然而，本發明者驚奇itk^現，^^)絲鉀離子，例4oiiit^加曱醇鉀或醋酸銫，巖藻糖酰GM1被首先洗脫，從而GM1和巖藻糖酰GM1被分別洗脫。分離 是徹底的，神經節苷脂GM1和巖藻糖酰GM1中每種樹以4紛離。同時，不希望被^K理論所約束，本發明的發明人認為，所，JL^到的分離 可以歸因于下述事實，與傳統的離子交換理^目反，溶質GM1和巖藻糖酰GM1 不但依照其與樹脂結合力的順序，而且依照它們與為了將其^^Ji分離必須 結合的反荷離子的親合力的順序而凈iaMi子上樹出來。從而，遵循這種理論， 假如兩種溶質中的一種具有與反荷離子不同的親合力，那么i^將被以兩種不 同的離子強度釋改出來，并能夠進^^化。本發明人已經驚奇iiyL現，盡管存在所有^H^t金屬屬于同一族的事實，單 唾液酸神經節苷脂GM1和巖藻糖酰GM1對鈉具有相同的親合力，^j"鉀和銫的 親合力不同。已經由本發明者發現，巖藻糖酰GM1對鉀和銫比GM1具有更高的 親合力，并^^b'皿出來。本發明的離子交換色鐠方法能夠方^^/使GMl M藻糖酰GM1中有^tk^ 離出來。進而，本發明的方法^利地允許GM1 ^目應的脂m中分離出來。 與神經節苷脂具有相同電荷的脂肪酸，具有對于M鐘離子更高的親合力。對于離子交換色鐠，可以^^HW可適宜的樹脂。有利地可以使用具有季氨 基的樹脂，例如FRACTOGEI^EMD窗E (S)或瓊脂^t:^M^t脂例:^Q"瓊脂^t凝 膠HP樹脂。在第一步驟中，用合適的溶劑平 悄旨。^i復的溶劑^t乙醇、曱醇或甲 醇和氯仿的混合物。伏i4i^劑為曱醇，因為其是神經節苷脂、鉀和銫鹽都育膝 解的。然后用月旨質^^在合適的，Mf^劑中的溶^^^ti子。 ^劑應當包 含與用于平IW脂的溶劑相同的溶劑組分。^^斤選擇的溶劑是甲醇。用'艦 溶劑初步'W6^^鍵^^質例如腦苷脂得以'WL1^#^或銫離子加入 ^劑中。4f或銫離子皿以鉀或銫的醋,、 甲酸鹽、丙酸鹽或^^W的鹽的曱醇M的形式提供。醋酸鈉或醋酸鉀的 曱醇溶^i優選的。有利地，醋酸鉀或醋酸#^皿液中可以以足夠將洗皿 中的導電率減少到110(KU00nS/cm, 1200~1300pS/cm的量而存在。這種 包^t內或鉀鹽的洗脫液可以以任何^復的沐速，例如介于100inl/h到140ml/h之間的;腿均勻通過柱子。假如^u按照本發明的離子交換色譜方法進行分離，脂肪酸和巖藻糖酰GM1在GM1之前被' ,同時仍然和柱子結合的石細苷脂可以錄洗^Ht程中被含有GM1的洗出液被收集，有利地，M^子上'皿的^M^劑可以通過蒸 餾而回l含有GM1的溶質可以通過將洗出溶液干燥而回收，從而生產出含有GM1的 粉末。干燥可以^^I傳統方法iMi行，例如噴霧干絲真空干燥。隨后，含有GM1的溶質可以通過具有微《LX寸為10000到100000道爾頓， M約50000道爾頓的薄膜的水相i^^濾而初婉化，以去除殘留的鉀或銫鹽。 4iit地，iL^酸，例如含7JC5克酸、硝酸，或者M鹽酸，可以在滲濾^^前^b^ Ai^中以調整pH到# pH6到8之間，M約pH7。鈉離子，合適的是以鈉鹽的7jc溶液的形式，優選NaCl，可以被加AJiJ溶液 中，從而置換出與GM1連接的鉀或銫離子，并獲得生理鈉鹽形式的GM1。船溶經歷第二次滲濾以消除殘留鹽(例如NaCl)。有利地，可以^^]過濾盒，例如 SART0C0N (Sartorius )聚m^:型，伏it具有50000道爾頓的分離點(cut-off) 的it^慮盒。船il^^可以被干燥以回收粉末形式的GM1。干燥可以以員方法進行。 有利地，干燥可以通過噴霧干g真空干燥進行，^ 、本發明獲得的GM1具有98 %或更高^1的級別,通常為約99. 0到99. 9 % 。 ^M本發明的方法獲得的GM1包含巖藻糖酰-GMl雜質少于0.1 %。本發明的方法方^^能夠從^^唾 _神經節苷脂類中有效分離GM1。 特別是，本發明的方法允許^藻糖酰"^M1雜質中將GM1分離出來。有利地，本發明的方法允許^^產率和高7jC平^l的單唾'^^神經節苷脂 GM1的制備。才財居本發明方法純化的GM1可以用于人類和動物受治療者的處理，特別是， 才娥本發明的純化GM1被設想用于人類或哺乳動物的治療，特別是中才沐夕卜圍 神經系統病癥和疾病，包括腦中風，帕金森病、脊髄損傷、阿耳茨海默氏病、 m鏈動障礙、M縮側索硬化、周圍神經病變和自主神經性病變。本發明可進一步通過下述實施例進行闡it實施例實施例1含有單唾^^神經節苷脂GM1作為主要神經節苷脂類的脂質〉V給物的制備以約25g/1的濃度#^有具有70 % M的神經節苷脂濕^的脂質提, 溶解于純化水中。1^溶液通過具有50 000道爾頓分離點(cut~off )的 SART0C0胸聚^Mtifl盒滲濾'船通ii^加50mM的醋酸緩沖液和4mM的氯化鉤將200 1的溶液平衡到 pH5.5。加入30000 U的霍《U^菌唾'^SI，并將il^口熱到37"C保持12小時 以完成^i要神經節苷脂類(GTlb、 GDla、 GDlb)到GM1的轉化。所得的溶 液具有14-15g/l的GMl狄。在酶7]<#^， i^bit過具有50 000道爾頓的分離點(cut-off)的it^慮 盒滲濾。隨后將1M NaCl加入滯留物中，使M經歷第4滲濾。在第4滲 濾之后，通過不經伶阿水置換的滲透物流動，滯留物被濃縮到GM1濃度為 100g/l。然后，^Mt真空下千燥，獲得大約3200g的，具有通過HPLC測量濃 >^7 85 %的粉末。得自含有單唾'^M神經節苷脂GM1作為主要神經節苷脂類的脂質^^物的 GM1的純化^^1前述步^^得的粉末制備^JL^ 10g/l的甲醇溶液，溶液5f頓過0. 22 jam的Sartopore濾芯(由Sartorius AG制造)，船，對每個循環，在含有20 1在曱醇中平l^1 Fractogel EMD TAME (S)樹脂的FPLC柱子Ji^填7升經過濾的溶l歸柱子用具有1200-1300 HiS/cm的傳導率的甲醇醋酸鉀的曱醇驗，以1201/h的-腿'艦。重復循環 J^GM1溶液的終點。洗出液(大約60-70 l)通過蒸餾不斷濃縮，然后被干燥以獲^#末，并 回收甲醇。所獲得的粉末是純GM1和醋酸鉀的混*。由此獲得的粉^解于純化水中至25g/l的M，并添加18 %的HC1將pH 中和到7。通過具有50 000道爾頓的分離點(cut-off)的it)慮盒，外溶^^濾。 而后加入lMNaCl,絲過具有50 000道爾頓的分離點(cut-off)的it 慮盒， 對溶液再次滲濾。在第二次滲濾^，通過不經^^T水置換的'^t物流動，將滯留物棘到100-120 g/1 。濃縮的溶液隨后通過0.22ym過濾器過濾并通過噴霧千燥，以提供大約 2700g白色-淺褐色的GMl粉末，由TLC鑒別，此GMl粉末具有由HPLC測量的 99. 8 %的^。所得的GMl粉末具有通過HPLC測量的小于0.1 %的巖藻糖酰"GMl棘雄實施例制備和純化GM1的方法以與上述實施例1中相同方式進行，除了柱色鐠中 甲醇醋酸鉀的曱醇溶液由曱醇醋酸鈉的甲醇溶液代替"卜。獲得3100g由HPLC測量含有91 %GM1和8 Q/Q巖藻糖酰-GM1的GMl粉末。 M述實施例可以看出假如用醋酸Wt GMl '^ym,獲得的GMl的 _很 低。這可^i由于與相反的完全將兩者的峰分離開的鉀或^^荷離子相比，鈉 反荷離子無法區分GM1和巖藻糖酰-GMl的事實。
權利要求
1.單唾液酸神經節苷脂GM1的分離和純化的方法，包括步驟(a)使用含有鉀或銫離子的洗脫液通過離子交換柱色譜從含有單唾液酸神經節苷脂GM1作為主要神經節苷脂組分的脂質混合物中分離出GM1，(b)從洗脫溶液中回收溶質，(c)對步驟(b)回收的溶質的水相溶液進行滲濾，(d)加入鈉鹽，并對所得的水相溶液進行滲濾，(e)以鈉鹽的形式回收GM1。
2. 才^^5Uf'J^"求1的方法，其中，3fe^包，酸鉀或醋酸銫。
3. 才娘權利要求2的方法，其中洗Wbl醋酸鉀或醋酸銫的甲醇M。
4. 才娘;M'j要求1的方法，其中離子交換柱含有具有季^^團的樹脂。
5， 4娥權利要求1的方法，其中離子交換柱首先用甲醇平衡。
6. #^權利要求1的方法，其中NaCl是在步驟(d)加入的。
7. 才n^m'j^求i的方法，其中滲濾是^^具有^tnx寸為ioooo-iooooo道爾頓的膜進行的。
8. #^權利要求1的方法，其中GM1在步驟(e)中的回收包減過噴霧 干;^真空干燥才^^^iifrt燥從而生產出粉末。
9. 才M^MyNU的方法，^t過離子交換色傳對GMl進行分離之前，包 括一頓純化的步驟，所艦化步驟包括(a) 通過具有微孑U^HH^ 10000-100000道爾頓的膜，對含有單唾、;^ 神經節苷脂GM1作為主要神經節苦脂組^脂質^^物的7K4目溶^ii行滲濾，(b) ，滲透物并回收包含GM1的溶質脂質〉V^物。
10. wj^求1所述的方法，其中包含單唾'^^神經節苷脂GM1作為主要 的神經節苷脂組分的脂質^^是通it7jC^^有具有^y^少50%的神經節苷 脂^^的脂質^^而獲得的。
11. 擬，J^求10的方法，其中水解是通過用產脲節桿菌唾自酶系S或霍 舌li瓜菌唾、mi^t鄉旨質提,而進行的。
12. 純4傳唾^_神經節苷脂GM1的方法，包才錄過^^J含有鉀或銫離子 的洗脫液藉由離子交換柱色鐠，從含有包含單唾液酸神經節苷脂GM1作為主要的神經節苷脂組分的脂質混合物中分離單唾^^神經節苷脂GM1。
13. ^t^U'j^求12所述的方法生產的單唾^m神經節苷脂GM1 ，具有99. 0 %或更高的^1.
14. 才M^U'j^求13所述的單唾:^^神經節苷脂GM1,包含少于0.1%的 巖藻糖酰-GMl.
15. 才娥權矛JJMU3所述的單唾'^^神經節苷脂GM1，用作藥劑'
16. 才M^WJ要求13所述的單唾^^f申經節苷脂GM1用于生產治療中才詠 外圍神經系統病癥和疾病的藥物組合物的用途。
全文摘要
一種制備純的鈉鹽形式的單唾液酸神經節苷脂GM1的方法。提供了一種分離和純化單唾液酸神經節苷脂GM1的方法，包括(a)使用含有鉀或銫離子的洗脫液通過離子交換柱色譜從含有單唾液酸神經節苷脂GM1作為主要神經節苷脂組分的脂質混合物中分離出GM1，(b)從洗脫溶液中回收溶質，(c)回收溶質的水相溶液進行滲濾，以及(d)在加入1M NaCl之后進行第二次滲濾，并回收GM1。獲得的GM1的純度水平高于99.0％。
文檔編號A61P25/02GK101328196SQ200710199780
公開日2008年12月24日 申請日期2007年9月29日 優先權日2007年6月18日
發明者R-P·邦特, S·卡里諾 申請人:梅迪多姆實驗室股份有限公司