專利名稱：啤酒麥芽根磷脂酶d的提取、純化新方法
技術領域：
本發明涉及啤酒麥芽根中磷脂酶D (PhospholipaseD)的制備新方法，具體 而言，涉及啤酒麥芽根中磷脂酶D的提取純化新方法；本發明還涉及以磷脂酶D 為活性成分在藥物中的應用。
背景技術：
大麥經浸漬、發芽、干燥除根后得到干麥芽，其副產物大麥根的數量占總
投料量的3%-5%左右。我國現有的啤酒廠及專業麥芽生產廠家達數百家，年產 麥芽根的數量非常大，達到10萬噸以上。目前，麥芽根的價格低廉，含有較 多有價值的成分，但國內外對麥芽根的研究很少，再加上有微苦味，所以幾乎 沒有深度的加工。長期以來，我國的麥芽根部分直接作為飼料，其余當作垃圾 處理。由于含有大麥根堿，直接作為飼料存在一定的安全隱患，加之適口性差， 吸收利用率低，麥芽根作為飼料資源受到了很大的限制。麥芽根其它產品的開 發也沒有得到足夠的重視。
近年來，隨著我國構建節約型社會政策的實施以及循環經濟模式的大力發 展，麥芽根資源的再利用問題已經提到日程上來。有研究報道表明，麥芽根含 有可供開發利用的生物活性物質(張晉陸，朱國洪.大麥根綜合利用-磷脂酶提 取及性質研究[J].糧油食品科技，1998,06:34-38)，極具開發潛力。由于啤酒 麥芽根資源豐富，其中磷脂酶D尚未引起人們應有的關注，因而對麥芽根磷脂 酶D還未進行深入的研究。
本實驗室在啤酒麥芽根磷脂酶D提取、純化制備過程中，得到具有生物活 性的磷脂酶D，經親和層析色譜、高效液相色譜等數據分析，確定用親和層析 法從啤酒麥芽根中提取的磷脂酶D具有較高的純度。迄今為止，尚未見到用此 種方法純化啤酒麥芽根中磷脂酶D的相關報道。與此同時，盡管有報道說(張 宇紅，王學東，王力.復合磷酸酯酶提取工藝的研究.山東醫藥工業，2000， 19(13) : 2)，可用麥芽根中磷脂酶D的乙醇等有機溶劑粗提液開發相關的藥物， 但未見到用親和層析色譜法純化的磷脂酶D開發相關藥物的報道。因此，啤酒
3麥芽根中的磷脂酶D作為高純度藥物的原料具有良好的研發應用前景。 本發明的目的之一是，提供磷脂酶D提取、純化的新方法； 本發明的目的之二是，為研究開發以磷脂酶D為活性成分的高純度藥物化
合物創造有利條件。
發明內容
本發明提供的磷脂酶D是水解磷脂的酶類，參與細胞的一系列代謝活動。 磷脂酶D的底物一磷脂類是生物膜結構的主要骨架部分，在細胞生命活動中起 著重要作用。磷脂酶D表達于細胞的胞膜、內質網、高爾基體、細胞核，水解 生物膜上的磷脂酸膽堿(PC)變成磷脂酸(PA)，釋放出極性的膽堿(choline)， 同時改變生物膜的組成和電荷，使膜的生理特性發生顯著變化。磷脂酸膽堿是 膜脂中含量最高的脂質，約占膜脂總量的50%，磷脂酸類似第二信使，可引起多 種生理效應，如促進DNA合成和肌動蛋白聚合，調節超氧離子生成和GTP酶 激活蛋白(Ras—GAP),磷脂酶D參與細胞囊泡的運輸和出胞作用。磷脂酶D介
導的信號轉導被認為是細胞重要的信號轉導途徑。
為了獲得高純度的磷脂酶D，本發明采取了以下技術路線與步驟
1、 啤酒麥芽根的破碎處理首先是將麥芽根粉碎過篩，用機械研磨和復合酶 (纖維素酶和果膠酶)相結合對其細胞壁進行破壁處理，得到待分離純化的樣
口
叩o
2、 磷脂酶D的提取及純化以相應的料水比萃取，離心后取上清液，加極性
有機溶劑(如酒精)進行沉淀，離心除去上清液，收獲沉淀物。采用親和層析 法進行純化，收集蛋白峰的鎦分并測定收集液的蛋白質含量、酶活及比活力。 將親和層析獲得的收集液用蒸餾水透析，真空冷凍干燥制成干粉。
3、 磷脂酶D酶活性測定及純度鑒定酶活性測定及純度鑒定系根據高效液相
色譜儀(熒光檢測器)，以標準樣品磷脂酶D (Sigma)為參照，判斷出峰時間 和峰面積的相似性分析，確定目標化合物磷脂酶D的酶活性和純度。
4、 磷脂酶D分子量的測定磷脂酶D分子量的測定系根據SDS—電泳，以 標準樣品磷脂酶D (Sigma)和低相對分質量標準蛋白質(Sigma)為參照判斷 泳道中亞基帶的相應分子量。
本發明還提供了高純度磷脂酶D在研究開發相關藥物中的應用。
4發明效果
本發明純化的啤酒麥芽根磷脂酶D具有很高的酶活性，有望為研究開發成 為臨床有用的高純度藥物化合物奠定良好基礎。
圖l一親和層析的雜蛋白峰圖譜
其中左縱坐標(蘭色)一吸光值(AU)
右縱坐標(紅色) 一電導率(mS/cm) 橫坐標一時間(min)
紅色曲線一親和層析過程中電導率變化曲線 蘭色曲線一親和層析過程中吸光值變化曲線 圖2—親和層析的Phospholipase D峰圖譜 其中左縱坐標(蘭色)_吸光值(AU)
右縱坐標(紅色) 一電導率(mS/cm) 橫坐標一時間(min)
紅色曲線一親和層析過程中電導率變化曲線 蘭色曲線 一 親和層析過程中吸光值變化曲線 圖3—Phospholipase D標準品的HPLC圖譜 其中縱坐標一響應值(LU) 橫坐標一時間(min) 圖4—Phospholipase D樣品的HPLC圖譜 其中縱坐標一響應值(LU) 橫坐標一時間(min) 圖5—Phospholipase D的SDS —電泳圖譜
其中l一低分子量(14 400—97 400)標準蛋白質
2— 磷脂酶A2
3— 磷脂酶C 4一磷脂酶D 5、 6—樣品
圖6—Phospholipase D分子量的標準曲線
5其中縱坐標一蛋白質分子量的對數 橫坐標一蛋白質相對遷移率
具體實施方案
以下實施例可以使本領域技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式 限制本發明。
〈實施例1>:啤酒麥芽根的破碎處理
將適量的麥芽根粉碎過80目篩子，再在研缽中加入少量的石英砂機械研
磨15分鐘，然后再加入復合酶(1.0%纖維素酶和0.6%果膠酶)在pH5.5， 40 t:條件下，酶解4小時對其細胞壁進行破壁處理，得到待分離純化的樣品。
〈實施例2〉磷脂酶D的提取分離
將破壁處理后的樣品，加l:ll的料水比，在2(TC、 pH5.5條件下，在水中 萃取24小時，離心后取上清液，加1:4的酒精進行沉淀，靜置3小時，離心 除去上清液，收獲浸膏狀沉淀物。 〈實施例3〉磷脂酶D的純化
本發明采用環氧氯丙烷活化載體與偶聯配基。取10mL沉淀體積的 S印harose 4B于G2漏斗中，抽濾成半干，先用約100mL 0. 5mol/L NaCl溶液 淋洗，再用100mL蒸餾水洗滌，以除去其中的保護劑和防腐劑。抽干約得6g 半千品，置于50mL三角瓶中，加入6.5mL2raol/LNaOH， 2mL環氧氯丙烷和15 mL 56%二甲基亞砜，充分混勻，在4(TC下溫和振蕩2小時，然后將膠轉移到 G2漏斗中，用蒸餾水淋洗除去多余的試劑，最后再用約lOOmLO. 2mol/LNa2C03 pH9.5的緩沖液洗滌。接著盡快進行偶聯實驗。將已經活化好的S印harose4B 轉移到三角瓶中。用10mL 0. 2mol/L Na2C03， PH9. 5的緩沖液溶解2g的磷脂酰 膽堿，然后轉移到三角瓶中與活化好的S印harose 4B偶聯，在40。C下溫和振 蕩24小時左右。偶聯終止后，將凝膠倒入G2漏斗中抽干并用100mL 0. 5mol/L NaCl溶液洗去未偶聯上的磷脂酰膽堿，再用100mL蒸餾水淋洗。接著用親和洗 脫液(0. lraol/L甲酸-O. 5mol/L KC1 pH2. 5) 50mL洗一次。最后用蒸餾水洗至 中性，浸泡于親和柱平衡液(0.05mol/L CaCl2, 0. lmol/L pH8. 0 Tris-HC1)緩 沖液中，置于冰箱中，待用。
裝柱取一支層析柱，先裝入1/4體積的親和平衡液。然后將親和吸附劑輕輕攪勻，緩緩加入柱內，待其自然沉降，調好流速1.0mL/分鐘左右，用親和 柱平衡液平衡，檢出流出液A260值小于0.02。
上樣將PLD提取液用5mol/LNaOH調至pH8.0，取lmL樣品上柱吸附。出 現雜蛋白峰(圖1)，流出液A260值小于0.02，則吸附完畢。換洗脫液洗脫(什 麼洗脫液？)。
洗脫及收集PLD:用0. lmol/L甲酸-0. 5mol/L KC1 pH2. 5親和洗脫液進行 洗脫。洗脫速度為2.0mL/分鐘。然后收集蛋白峰(圖2)并測定收集液的蛋白 質含量、酶活及比活力。將親和層析獲得的PLD溶液放入透析袋內，置于4'C 對蒸熘水透析，然后在一80'C真空冷凍干燥，得到磷脂酶D的純品，其純度為 96.7%。
實施例4:磷脂酶D酶活力和純度的鑒定
高效液相色譜儀Agi lent 1100 series，熒光檢測器G1321A (美國Agi 1 ent 公司)，色譜柱Hypersil ODS (4. 6mmX lOOmm， 5 u m)，流動相A液為正己烷-正丙醇-冰醋酸(82:17:l， V:V:V)，流動相B液為正丙醇-水-冰醋酸(85:14:l， V:V:V)兩者均加入0.08%三乙胺。柱溫35。C，流速lmL/分鐘，梯度洗脫。 梯度洗脫程序(流動相B): 0分鐘，5%; 2分鐘，100%; 5分鐘，90%; 10分 鐘，5%。熒光檢測器激發波長475nm，發射波長515nm。取一定量樣品與200uL 0. 125mmol/L磷脂酰膽堿37°C， 1000r/分鐘孵育30分鐘，然后進樣進行測定。 以標準樣品磷脂酶D (Sigma)為參照，判斷分析出峰時間和峰面積的相似性， 確定目標化合物磷脂酶D的活性和純度(圖3、圖4)。在圖3和圖4中僅出 現一個峰，既鑒定了磷脂酶D純度又測定了其活性，其比酶活性為85.77U/mg。 實施例5:磷脂酶D分子量的測定
磷脂酶D分子量的測定系根據SDS—電泳，以標準樣品磷脂酶A2、磷脂 酶C、磷脂酶D (Sigma)和低相對分質量標準蛋白質(Sigma)為參照，判斷 泳道中亞基帶的相應分子量及判斷啤酒麥芽根中具體含有哪種磷脂酶。 15%的分離膠(10mL):丙烯酰胺儲存液(29.2g丙烯酰胺，0.8g雙丙烯酰胺， 蒸餾水定容至100mL)5mL， 4x分離膠緩沖液(18.165g Tris堿，0.4gSDS，蒸餾 水定容至100mL，用濃HCL調節pH值至8.8) 2.5mL，蒸餾水2.5mL， 10% APS 50pL， TEMED5pL。堆積膠(5mL):丙烯酰胺儲存液(29.2g丙烯酰胺，0.8g雙
7丙烯酰胺，蒸餾水定容至100mL)0.67mL，4x堆積膠緩沖液(6.055gTris堿，0.4g SDS，蒸餾水定容至100mL，用濃HCL調節pH值至6.8)1.OmL，蒸餾水2.3mL， 30pL10%APS， 5pLTEMED。然后制膠，加樣。接上電泳儀，調至恒壓80V, 待指示劑全部進入分離膠后，電壓提高到100 200V，繼續電泳直到溴酚藍前 沿到達距凝膠下沿lcm時，關閉電源，停止電泳。電泳后將凝膠小心的轉移到 培養皿中用5mmol/L HC1浸泡1小時，將凝膠置于2.5g/L考馬斯亮藍R-250 染色液中2小時，然后用體積分數為7%的乙酸水溶液中脫色，換液3次，并 保存在此溶液中。通過凝膠成像得SDS—電泳圖譜(圖5)，在此圖譜中確認， 啤酒麥芽根中不含有磷脂酶A2和磷脂酶C，僅含有磷脂酶D，依據磷脂酶D 分子量標準曲線(圖6)，經計算得磷脂酶D的分子量為200,000。
權利要求
1、一種制備磷脂酶D(Phospholipase D)的新方法，其特征是所述方法包括以下步驟1)啤酒麥芽根的破碎處理；2)磷脂酶D的提取及純化；3)磷脂酶D的活性、純度鑒定。
2、 如權利要求1所述的制備方法，其特征是將啤酒麥芽的根渣，粉碎過篩，用 機械研磨和復合酶相結合對其細胞壁進行破壁處理，得到待分離純化樣品。
3、 如權利要求1所述的制備方法，其特征是用1:11的料水比，在2(TC、 pH5. 5 條件下，將破壁處理后的樣品在水中萃取，離心，取上清液，加極性的有機 溶劑進行沉淀，離心除去上清液，收獲沉淀物；純化采用親和層析法，用 Sepharose 4B對含有目標化合物的組分進行純化，親和洗脫采用甲酸-KC1 酸性溶劑；收集蛋白峰餾分及測定收集液蛋白質含量、酶活及比活力；將親 和層析獲得的收集液對蒸餾水透析，真空冷凍干燥，收獲目標化合物磷脂酶 D干粉。
4、 如權利要求1所述的制備方法，其特征是純度鑒定系以磷脂酶D標準品為參 照，根據高效液相色譜儀Agilent 1100 series、熒光檢測器G1321A和Hypersil ODS色譜柱，進行出峰時間和峰面積相似性分析，確定目標化合物磷脂酶D 的活性與純度，再用SDS—電泳測定純化樣品的分子量。
5、權利要求1所述高純度磷脂酶D作為制備相關藥物原料的應用。
全文摘要
本發明涉及從啤酒麥芽根中提取分離純化磷脂酶D(Phospholipase D)的新方法，所說磷脂酶D是以啤酒麥芽根渣為原料，經研磨對其細胞結構進行破壁處理，用水萃取，上清液加極性的有機溶劑進行沉淀；純化系采用親和層析法，用Sepharose 4B對含有目標化合物的組分進行純化，親和洗脫溶劑采用0.1mol/L甲酸-0.5mol/L KCl pH2.5)；收集蛋白峰的餾分，將親和層析獲得的收集液經透析，真空冷凍干燥得干粉；經高效液相色譜測定其酶活，純度達到96.7％。可作為高純度磷脂酶D藥物的制備原料，具有良好的開發前景。
文檔編號A61K38/46GK101434942SQ20071018722
公開日2009年5月20日 申請日期2007年11月16日 優先權日2007年11月16日
發明者陽 畢, 贠建民, 麗 韓 申請人:甘肅農業大學