專利名稱：：偏諾皂苷在制備止血藥物中的應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種化合物偏諾皂苷在制藥領域中的新用途。技術背景偏諾皂苷(pennogenin)化合物，結構通式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>通式中R2-H，CH3，CH2OH，=CH2X=0，N，SC17-OH為R-構型或S-構型Rl-由單糖、雙糖、三糖、四糖、五糖、六糖、七糖所組成的各種型式的直鏈糖鏈或支鏈糖鏈，其糖鏈組成糖的類型包括P-D-葡萄糖(P-D-glucose)、a-D-葡萄糖(a-D-glucose)、a-L-鼠李糖(a-L-rhamnose)、卩-D-半乳糖(卩-D-gakctose)、a-D-半乳糖(a-D-galactose)、卩-D-甘露糖(卩-D-mannose)、a-D-甘露糖(p-D-mannose)、a-D-阿拉伯糖(a-D-aradinose)、卩-D-阿拉伯糖(a-D匿aradinose)、a-D-木糖(a-D-xylose)、p誦D-木糖(ct-D-xylose)、a-D-核糖(a-D-ribose)、卩-D-核糖(j3-D-ribose)、a-D-來蘇糖(a-D-lyxose)、卩-D-來蘇糖(卩-D-lyxose)、a-L-夫糖(a-L-fbcose)o偏諾皂苷在植物界中分布并不十分廣泛，含量較低。中國專利申請號02150907.7公開了一種"17—羥基C^-[27]甾體化合物、合成方法及其用途"，能用于偏諾皂甙元或二氫偏諾皂甙元的合成。
發明內容本發明的目的在于提供偏諾皂苷化合物在制藥中的新的應用。本發明涉及偏諾皂苷作為制備治療全身性出血的藥物中的應用。本發明涉及偏諾皂苷作為制備治療各種內臟出血的藥物中的應用。本發明涉及偏諾皂苷作為制備治療婦女月經過多的藥物中的應用。本發明涉及偏諾皂苷作為制備治療婦女人工流產后出血過多的藥物中的應用。本發明涉及偏諾皂苷作為制備預防各種出血危象的藥物中的應用。本發明涉及偏諾皂苷作為制備白血病人化療后出血傾向治療的藥物中的應用。本發明涉及偏諾皂苷作為制備癌癥病人化療后出血傾向治療的藥物中的應用。本發明涉及偏諾皂苷作為制備輻射、化學因素對人的血小板傷害所致出血傾向治療的藥物中的應用。為了更好地理解本發明的實質，下面將用偏諾皂苷的藥理試驗及結果來說明其在制藥領域中的新用途。用基因芯片篩選功能基因改變并用常規實驗驗證活性，我們發現4個活性較強的偏諾皂苷化合物如下XKD，R2=H，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>我們發現和驗證了其止血作用與基因IL-11顯著表達上調有關。上調IL-ll的基因表達，促進機體產生內源性IL-11,不但可以促進血小板的生成，還可以增強血小板的功能；血小板生成周期約為15天，因此，在15天前后仍有強較作用，有效作用時間長。IL-11的生理、藥理作用為高效率促進地骨髓中造血祖細胞、干細胞及幼稚血小板分化、成熟，并動員至外周血，臨床上可用于癌癥患者化、放療后迅速恢復外周血小板數量以利于恢復人體正常止血功能，以及其它嚴重性血小板數量減少，血小板功能降低所致出血傾向。總而言之，IL-ll對血小板減少和增強血小板止血功能具有明確而強大的治療作用。基因芯片法檢測到的IL-ll上調表達,-Balb-c純系小鼠給予含偏諾皂苷類化合物的藥物，一定天數后從小鼠骨中提取總RNA，分離mRNA，逆轉錄成cDNA，給藥組著Cy-3熒光(黃色)，生理鹽水組著Cy-5熒光(紅色)，混勻后，點于基因芯片上，玻片密封，80。C變性，42°C恒溫雜交三小時，洗滌，晾干后，芯片掃描儀掃描，軟件分析Cy-3和Cy-5兩種熒光信號強度和比值，根據參照基因調整原始信號。熒光比值在1.8以上提示有很強的生物活性。結果見表l。表1偏諾皂苷類化合物對細胞因子IL-ll的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>偏諾皂苷類化合物刺激IL-ll的表達上調達到6.59倍，對其它細胞因子的表達己知的最高也只有3.12倍，說明其作用強，專一性非常好。■IL一ll作用于骨髓巨核系造血細胞，增強血小板功能，促進血小板生成。偏諾皂苷類化合物可以立即刺激IL-ll的基因表達(幾小時之內就已檢出其變化)，進而促進高活性細胞因子IL-ll的生成。基因表達的改變又進一歩從整體動物實驗得到驗證。偏諾皂苷類化合物體內止血作用一、偏諾皂苷類化合物口服給藥對小鼠外周血PLT數量的影響方法Balb/c小鼠40只，18—22g雌性。按體重分成四組，分別為正常對照、偏諾皂苷類化合物10mg/kg、偏諾皂苷類化合物20mg/kg、偏諾皂苷類化合物40mg/kg，一日分為兩次口服給藥，共9次四天半。于給藥前、給藥后1天、3天、5天、7天、10天、14天割尾取血20ul，F—820血細胞計數儀檢測血象。見表2和附圖。表2偏諾皂苷類化合物口服給藥對小鼠外周血血小板數量的影響(n-lO)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>結果血小板的主要功能為參與止血過程。血小板數量和功能障礙是導致出血的主要原因。表2示偏諾皂苷類化合物口服給藥對大鼠外周血血小板數量的影響。從大的趨勢上可以看出，給藥三天后，血小板即已明顯較生理鹽水組升高，表明偏諾皂苷類化合物能迅速動員儲存血小板進入外周血，參與止血等功能；至第七天，此時已停藥四天，偏諾皂苷組仍然較生理鹽水組明顯為高；第十天時偏諾皂苷組與生理鹽水組基本相當；但至第十四天，偏諾皂苷組竟然較生理鹽水組還有一個血小板明顯升高的過程。實驗表明，一定劑量的偏諾皂苷類化合物口服給藥可以通過刺激內源性血小板生成因子，增加大鼠外周血血小板數量，以10mg/Kg和20mg/Kg劑量療效較好。二、偏諾皂苷口服給藥對2xl(T4mol/LADP誘導血小板聚集作用的影響動物分組Wistar大鼠16只，分為四組，分別為正常組、10mg/Kg組、20mg/Kg組和40mg/Kg組，每日給藥兩次，共7次，末次給藥后一小時麻醉取血。血小板分離參考文獻iWistar大鼠ip戊巴比妥40mg/Kg麻醉，用無菌注射器心臟取血約8ml，注入含3.8%檸檬酸鈉(體積比l:10)的塑料管中，搖勻以防血液凝固。于室溫140g離心10分鐘，上層乳濁液為富血小板血漿(PRP)。在20pM腺苷酸存在條件下，室溫1500g離心10分鐘。并用含20^iM腺苷酸的HEPES-Tyrode's緩沖液(137mMNaCl,2.7mMKC1,lmMMgCl2，3.8mMNaH2P04,5.5mMGlucose,3.8mMHEPES,0.35%BSA,PH6.5)洗滌。最后使血小板重新懸浮于HEPES-Tyrode's緩沖液中(PH7.35)。血小板計數用F—820血細胞計數儀計數，HEPES-Tyrode's緩沖液(PH7.35)調整血小板為3xl0Vml。圖形測量Chronolog血小板聚集儀檢測。樣品于37°C保溫2分鐘，放入檢測器。PRP總體積500ul，正常情況下每一樣本均加入1.7mMCaCl2，再加lOulADP(終濃度2xl(^mol/L)誘導聚集。然后記錄5分鐘圖形，讀取1分鐘、2分鐘、3分鐘、5分鐘及最大的聚集率。表3示偏諾皂苷類化合物口服給藥三天后對2xl04mol/LADP誘導血小板聚集作用的影響。ADP200nmol/L對大鼠血小板產生很強的聚集效果，聚集后不發生解離現象，從表3中看出，給予偏諾皂苷類化合物三天后，同生理鹽水組相比，大鼠血小板5分鐘聚集率在各劑量組均有顯著增強，其中以中劑量組效果最好，l分鐘聚集率也有增加，中劑量組與生理鹽水組有明顯差異。表4示偏諾皂苷類化合物口服給藥三天后對2xl(T5m0l/LADP誘導血小板聚集作用的影響。ADP20pmol/L也可誘導血小板聚集，但在刺激后5分鐘內全部解聚。結果看出，同生理鹽水組相比，中劑量組l、2、3分鐘和最大聚集率顯著增強，大劑量組2和3分鐘聚集率明顯增加，小劑量組同生理鹽水組沒有明顯差異。這些結果表明，偏諾皂苷類化合物口服給藥不但可以增強ADP誘導的血小板聚集，而且通過促進血小板造血祖細胞的成熟，聚集功能增強是偏諾皂苷類化合物發揮止血作用的又一影響因素。表3偏諾皂苷類化合物口服給藥對血小板聚集功能的影響(ADP2X10—W/L)(給藥三天，第三天測試)~"""~""""7i^i"i5i""""—5—分;—中一聚i"5F"生理鹽水組29.78±3.5644.11±4.4610mg/Kg組32.54±3.5550.75±4.35**20mg/Kg組39.25±4.95**57.75±8.06**40mg/Kg組34.33±2.8450.42±5.04**給藥組與生理鹽水組比較，*P<0.05，**P<0.01表4偏諾皂苷類化合物口服給藥對血小板聚集功能的影響(ADP2Xl(Tmol/L)(給藥三天，第三天測試)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>給藥組與生理鹽水組比較，*P<0.05,**P<0.01三、偏諾皂苷對出血時間和出血量的影響取昆明種小鼠60只，體重20-25g雌雄兼用，隨機分成四組。正常對照組、陽性對照組、受試藥低劑量組、受試藥高劑量組灌胃給藥后2小時測定出血時間、出血量。實驗時將小鼠放入特制的固定器中，然后剪去小白鼠尾部lcm,用濾紙每隔30秒吸取鼠尾部自行流出的血，記錄出血時間，并把取血的濾紙用堿液浸泡，用751分光光度儀測透光率(T),T值越大表明出血量越小。結果見表5。表5偏諾皂苷對小A鼠出血時間和出血量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>給藥組與生理鹽水組比較，經T檢驗統計處理^P0.01實驗結果表明偏諾皂苷能非常顯著的縮短出血時間、減少出血量。四、偏諾皂苷對凝血時間的影響取小鼠60只，雌雄各半，體重20-25g，隨機分成四組。生理鹽水組、陽性對照組(云南白藥)、受試藥低劑量組、受試藥高劑量組灌胃給藥后2小時用毛細管法、玻片法測定凝血時間。結果見表6。表6偏諾阜苷對小鼠凝血時間的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>偏諾皂苷高偏諾皂苷低6mg/Kg12rag/Kg202072.0±6.7**59.0±5.2林121.8±11.6林101.6±10.4**給藥組與生理鹽水組比較，經T檢驗統計處理^P0.01實驗結果表明偏諾皂苷能非常顯拿的縮短小鼠凝血時間。五、偏諾皂苷對環磷酰胺致出血傾向的治療作用ICR小鼠40只,？(^兼用，均分成4組(n-10),即生理鹽水組、造模組、12mg/Kg組和6mg/Kg組，口服給藥，每天l次。第0、5、10日除生理鹽水組外，其它各組小鼠分別腹腔注射環磷酰胺80mg/kg，然后繼續給藥3天。于末次給藥后2小時用毛細管法、玻片法測定凝血時間。結果見表7。__表7偏諾皂苷對環磷酰胺所致出血傾向的治療作用_X士SD組別劑量動物數(只)毛細管法玻片法生理鹽水組/2095.4±11.1150.9±13.1環磷酰胺組/20165.8±26.4273.5±32.4偏諾皂苷6mg/Kg.20134.2±15.7*210.5±18.5*偏諾皂苷12mg/Kg20118.5±12.6**182,6±19.3林給藥組與環磷酰胺組比較，經T檢驗統計處理*P<0.05**P<0.01實驗結果表明偏諾皂苷能非常顯著的縮短環磷酰胺所致出血傾向的凝血時間。六、偏諾皂苷對苯所致出血傾向的治療作用昆明種小鼠48只,？3兼用,均分成4組(n-12),除生理鹽水組外，其它組小鼠皮下注射苯0.5ml/kg,連續12天，造模的當日，同時口服給藥，每天1次,共18天，末次給藥后lh用毛細管法、玻片法測定凝血時間。結果見表8。表8偏諾皂苷對苯所致出血傾向的治療作用組別動物數(只)凝血時間(秒)毛細管法X士SD玻片法生理鹽水組苯組偏諾皂苷偏諾皂苷,/6mg/Kg12mg/Kg2020202086.1±10.4200.6±33.6145.3±16.9*123.1±14.5**127.8±11.2289.5±37.1225.5±23.5*■175.2±23.3**給藥組與苯組比較，經T檢驗統計處理*P<0.05**P<0.01實驗結果表明偏諾皂苷能非常顯著的縮短苯所致出血傾向的凝血時間,七、偏諾皂苷對輻射所致白細胞減少和凝血功能降低的治療作用為研究對急性放射病的治療作用，觀察了不同劑量的偏諾皂苷對6.5Gy照射小鼠造血恢復的影響。照射時間為給藥第1天。予受照小鼠每日偏諾皂苷1、5及20m^Kg治療，連續15天。末次給藥后lh用毛細管法、玻片法測定凝血時間。結果見表9。表9偏諾皂苷對輻射所致出血傾向的治療作用組別劑量動物數(只)凝血時間(秒)毛細管法X士SD玻片法生理鹽水組/2075.2±9.193.6±12.7輻射組/20177.9±24.0216.2±26.2偏諾皂苷lmg/Kg20126.5±16.9*165.2±19.8*偏諾皂苷5mg/Kg2098.7±13.5**134.3±17.5**偏諾皂苷20呢/Kg2087.4±12.6**112.4±15.3**給藥組與輻射組比較，經T檢驗統計處理*P<0.05**P<0.01實驗結果表明偏諾皂苷能非常顯著的縮短輻射所致出血傾向的凝血時間。其中以20mg/Kg的效果最好。以下八、九說明偏諾皂苷類化合物止血機理與凝血酶、血小板膜糖蛋白無關。八、諾皂苷類化合物口服給藥對大鼠出凝血指標的影響激活部份凝血酶時間(APTT)是測定內源凝血系統較為敏感的篩選試驗，血漿凝血酶原時間(PT)是外源凝血系統常用篩選方法之一，凝血酶時間(TT)是檢測血漿纖維蛋白原含量變化的一種簡便方法。表一比較了偏諾皂苷類化合物口服給藥后大鼠APTT、PT和TT的變化，結果顯示，同生理鹽水組相比，各實驗組APTT、PT和TT沒有明顯縮短，說明偏諾皂苷類化合物對機體內源性和外源性凝血機制無顯著影響，其本身也不具有凝血因子的作用。表10偏諾皂苷類化合物口服給藥后大鼠凝血參數TT、PT、APTT的改變組別例數APTT例數TT例數PT對照組宮血寧:10mg/Kg20mg/Kg40mg/Kg923.20±1.831139.89±3.991112.45±0.28923.40±1.857923.75±1.507924.59±1.50839.40±0.5339.71±1.5636.51±3.151112.32±0.451112.33±0.331113.10±0.28*P<0.05九、偏諾皂苷類化合物對大鼠血小板膜糖蛋白GpIIIa(CD61)、GpIb(CD42b)和GpIa(CD49a)表達的影響偏諾皂苷類化合物對大鼠血小板膜糖蛋白GpIIIa(CD61)、GpIb(CD42b)和GpIa(CD49a)表達的影響血小板膜糖蛋白Ib-IX復合物(GPIb-IX)是血小板膜的主要糖蛋白之一，研究發現GPIb是vW因子和凝血酶的受體，與細胞膜骨架相連，參與血小板的粘附作用，對維系血小板結構的完整及細胞形態具有重要作用，CD42b是GPIb的抗體。應用流式細胞儀檢測了人血小板GPIb的含量，發現加入ADP(200pMol/L)明顯增加GPIb的表達，而加入偏諾皂苷類化合物至25pg/ml，也不能明顯增加GPIb的含量，說明偏諾皂苷類化合物對人血小板GPIb的表達沒有明顯的調節作用。GPIIb-IIIa是血小板上含量最多的膜糖蛋白，GPIIb與GPIIIa在鈣的參與下以1:1的比例構成復合物。GPIIb-IIIa是纖原受體，一個纖原分子可以同時和至少兩個GPIIb-IIIa結合，血小板通過各自表面的GPIIb-IIIa與纖原結合而聚集成團。在正常循環中的血小板不能與血漿纖原結合，只有血小板被激活時，暴露出GPIIb-IIIa上的纖原結合部位，與纖原結合，介導血小板聚集。CD61是GPIIIa的抗體，應用流式細胞儀同批觀察了人血小板GPIIIa的表達，發現ADP(20(HiMol/L)可使血小板GPIIIa的表達增加近一倍，偏諾皂苷類化合物也能使GPIIIa的表達增加，并有劑量效應，但最大增加幅度也不到10%，表明偏諾皂苷類化合物對GPnb-IIIa調節作用不明顯。原理ELISA法，第一抗體為小鼠抗人CD61(或CD42b、CD49b)IgG，第二抗體為抗小鼠IgG-FITC。標準曲線根據標準化包被IgG的微粒制作。流式細胞儀檢測熒光細胞比例及熒光強度。方法人肘靜脈取血，枸椽酸鈉抗凝，分離PRP，PRP細胞數調整為30萬/mm3。取PRP500ul分別與ADP、偏諾皂苷類化合物及溶劑對照各10ul37°C孵育5min。其余可參照說明書如下操作(1)25ulPRP用配套稀釋劑稀釋至200ul。分別加入20ul的anti-CD61-Mab、anti-CD42b-Mab、anti-CD49b-Mab，室溫孵育10min，以結合相應抗原。(2)以上各試管及40ul標準化包被IgG微粒各加IgG-FITC20ul，室溫孵育10min，以著色，再加稀釋劑2ml。(3)選定"門"，用標準化包被IgG微粒建立流式儀標準曲線(4)樣本分析表11偏諾皂苷類化合物對人鼠血小板膜糖蛋白CD61、CD42b和CD49a表達的影響CD61分子數CD42b分子數CD49a分子數ADP2x1CTW/L951872716225743497.059834溶劑對照481446884113834245.785189偏諾皂苷2"g/ral505468444113830049.375514偏諾皂苷4"g/ral511474284223931550,035574擬合曲線為Y=1040.32+90.62xr=0.9993P=7.34xl(T4本發明的優點在于:本發明對已知化合物偏諾皂苷發掘了新的醫療用途，開拓了一個新的應用領域；安全性良好，藥理作用強，預示著很好的藥用前景。本發明的偏諾皂苷可從多種渠道獲得，可從植物中提取，也可用合成、半合成的方法獲得。可用單體或混合物，可以是鹽或與其它分子的復合物。可單獨作為藥用有效成分，也可與其它無排斥作用的組分配伍。偏諾皂苷類化合物與其它直接促進血小板聚集的藥物相比，具有以下不同，其它直接促進血小板聚集的藥物第一人體服用后，體內血藥濃度很低，往往達不到足夠的濃度去直接影響血小板。第二直接刺激血小板聚集的藥物使血液處于高聚狀態，容易引起血管栓塞，導致其它更嚴重的疾病，臨床應用受到極大限制。第三:直接刺激血小板聚集作用是短暫的。第四直接刺激血小板聚集不具有升高血小板數量作用。而偏諾皂苷類化合物通過調控內源性巨核系細胞成熟因子IL-11增強機體止血功能。IL-ll是功能強大的血小板促進因子，促進血小板巨核系祖細胞的成熟，增強血小板聚集和止血功能，能夠達到用量小，作用強，有效時間長，并且在增強血小板功能的同時，能夠顯著增加血小板數量。經由IL-11介導的止血功能，是全身性，強效，持久的。在10-15天仍有較強作用。因此提前服用偏諾皂苷類化合物可以有效預防出血。'因此偏諾皂苷類化合物不僅如中國專利85108520中所述可以治療子宮功能性出血，更可以相比較其它直接促進血小板聚集的藥物而言更安全地用于全身性出血；預防各種出血危象，如運動損傷，血管內彌漫性溶血、手術中出血；各種內臟出血(如流行性出血熱所致不可預見性內臟大出血)；婦女月經過多、婦女產后出血過多，婦女計劃生育措施所致出血；血小板減少所致出血傾向，包括癌癥患者化療、放療后血小板減少所致出血傾向，白血病人化療后血小板減少所致出血傾向，輻射、化學因素對人的血小板傷害所致出血傾向。使用方法偏諾皂苷類化合物直接剌激內源性IL-11生成，口服不會產生過敏反應，可以長期服用。除白血病、癌癥需加倍劑量外，其它病例可根據病程緩急每日服用0.1-80mg/60Kg人體重量，優化的為0.5-5mg/60Kg。服用方式包括口服、血管內注射、血管外注射、透皮吸收、霧化吸入和直腸吸收。附圖1是偏諾皂苷類化合物口服給藥對小鼠外周血血小板數量的影響圖。具體實施方式實施例h由已知方法提取、制備偏諾皂苷。在中國專利85108520，03135590.0,02133381.5中分別介紹了醇法、水法、水-醇法三種提取和以及劑型制備方法。可將偏諾皂苷加入淀粉及相應的輔料，混勻后制粒，壓制成片劑。實施例2:也可以參考中國專利02150907.7的合成方法，由薯蕷皂苷合成母核pennogenin或由劍麻皂苷元合成dihydropennogenin,再在3位接上恰當的糖鏈。可將偏諾皂苷加入淀粉及相應的輔料，混勻后裝入膠囊中制成膠囊劑。權利要求1、偏諾皂苷在作為制備預防各種出血危象的藥物中的應用。全文摘要本發明涉及一種化合物偏諾皂苷在制藥領域中的新用途。本發明涉及偏諾皂苷作為具有止血功能的藥物中的應用。本發明涉及偏諾皂苷作為制備全身性出血、各種內臟出血、月經過多、預防各種出血危象、輻射、化學因素對人的血小板傷害所致出血傾向的藥物中的應用。本發明對已知化合物偏諾皂苷發掘了新的醫療用途，開拓了一個新的應用領域。本發明的偏諾皂苷配制成的藥物主要為口服劑型，即可單獨作為藥用有效成分，也可與其它無排斥作用的組分配伍。文檔編號A61K31/7048GK101164547SQ200710181408公開日2008年4月23日申請日期2004年11月17日優先權日2004年11月17日發明者從玉文,有馮,唐書明申請人:云南白藥集團股份有限公司