人參皂苷Rb₁的用途的制作方法

專利名稱：：人參皂苷Rb₁的用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及中藥領域，涉及人參皂苷Rb,—種新用途，具體涉及人參皂苷Rb,在制備治療內皮細胞功能障礙藥物中的應用。本申請內皮細胞功能障礙包括內皮細胞損傷、內皮細胞增殖、內皮細胞炎癥等內皮細胞非生理性的功能障礙；本申請內皮細胞包括不同器官的血管的內皮細胞。本申請人參皂苷Rb,可以由不同中藥材提取得到的人參皂苷，比如三七、人參、西洋參、絞股藍等。
背景技術：
：血管內皮是人體的一個重要組成部分，其解剖部位位于一易損傷的功能性界面，成年人約有1012個血管內皮細胞，覆蓋400—500m2的血管內腔表面，重約L5kg，相當于肝臟的重量，自從1993年Ross提出內皮功能障礙的概念，完成了對內皮從結構到功能、從生理到病理的認識之后RossR.Thepathogenesisofatherosclerosis:aperspectiveforthe1992s(j)。Nature,1993，362:801—809，現已證明血管內皮是一個十分活躍的代謝及內分泌器官，其功能眾多1、具有屏障功能；2、具有信息傳遞與內分泌功能；3、具有轉化與滅活功能；4、具有抗凝與抗血栓功能；5、具有調節血管張力的功能；6、對心肌舒縮功能的影響。因此，內皮功能的改變與多種疾病的發生和發展有關，相應對內皮功能障礙具有治療作用的藥物研究，成為新藥研究的熱點。現代中醫研究，由于正氣不足，防御功能減弱，導致內皮細胞易于被外邪損傷，引起功能和結構的障礙，進一步可導致疾病的形成，引起瘀血內停，因而內皮損傷多表現為氣虛血瘀證，其修復需以益氣活血法為主。當代多個研究發現益氣活血中藥能夠調節骨髓干細胞的生理活性，能夠促進骨髓單核細胞在心肌梗死梗死區域歸巢、分化、擴增，產生大量新生的心肌細胞及心肌小血管，促進梗死心肌的修復；有文獻報道自體骨髓單核細胞抑制聯合益氣活血中藥治療可以迅速改善下肢缺血患者的局部血液循環，從而改善患者的疼痛及冷感；另有發現益氣活血中藥能夠減輕及治療骨髓基質細胞的放射損傷。因而，益氣活血法對于內皮細胞可能具有潛在的動員作用；但是上述這些研究多基于內皮細胞障礙可能產生的疾病進行初步的研究，沒有進行更深一步的研究，特別是中藥有效成分對內皮細胞機理研究，還處在起始階段，因此，針對內皮細胞障礙，將中藥有效成分進行深入細致的機理研究，才是巾醫藥走向世界的必經之路。人參皂苷Rbi主要來源于五加科人參屬人參、三七、西洋參、越南人參、竹節參，葫蘆科絞股藍屬絞股藍、緣果絞股藍等植物的根、莖、葉、花蕾中；人參皂苷Rbi具有顯著且廣泛的藥理活性，如人參二醇組皂苷對大鼠心肌細胞鈣通道阻滯作用(基礎醫學與臨床，1994，02)、人參二醇單體對大鼠心肌作用的單鈣通道分析及ESR譜研究(基礎醫學與臨床，1994，04)、人參二醇組皂苷對心肌缺血再灌犬CO、TPVR及血清NE含量的影響(白求恩醫科大學學報1995，05)、人參二醇皂苷對沙土鼠急性腦缺血—再灌注損傷的保護作用(中國藥理學通報、1996、06)、人參—醇組皂苷對兔缺血再灌注損傷心臟血流動力學的影響(中國中醫藥科技200403)等，人參皂苷Rh還具有促智、抗老年癡呆、改善性功能等多方面的藥理作用；上述這些研究都是對具體病癥進行病理研究，沒有針對發病的機理進行深入的研究，而中藥的發展，特別是中藥有效成分的藥物開發，缺乏的是對藥物機理的研究，這就需要廣大科學工作者，通過系列的科學實驗，去挖掘、去探討，才能真正從根本解決中藥的治病的原理。
發明內容基于上述原因，我們科研人員通過創造性的勞動，以人參皂苷為物質基礎,針對內皮細胞障礙進行深入的機理研究，發現人參皂苷Rh對內皮細胞障礙具有很好的治療作用，而這種深入的機理研究，可以很好的確證人參皂苷R1^藥理作用，為人參皂苷Rb,藥效機理的揭示，為人參皂苷Rb,在臨床應用中，提供了確切的、深入的理論基礎。本發明通過以下技術方案實現的。人參皂苷Rb,在制備治療血管內皮細胞功能障礙藥物中的應用。其中人參皂苷Rh含量大于等于50%且小于100%。其中人參皂苷Rbi含量大于等于90X且小于100°%。其中人參皂苷為活性物質制備的藥物制劑。藥物制劑為單位劑量的片劑、膠囊劑、顆粒劑、微丸劑、滴丸劑、口服液、軟膠囊劑、水針劑、粉針劑、輸液劑。其中片劑、膠囊劑、顆粒劑、微丸劑、滴丸劑、口服液劑、軟膠囊劑單位劑量為l一4000mg。其中水針劑、粉針劑、輸液劑單位劑量為l一1000mg。上述藥物制劑的物質基礎是人參皂苷Rbp因此，上述藥物制劑對血管內皮細胞功能障礙具有很好的治療作用。本申請內皮細胞功能障礙包括血管內皮細胞損傷、內皮細胞增殖、內皮細胞炎癥等內皮細胞非生理性的功能障礙。本中請內皮細胞包括不同器官的血管的內皮細胞。本申請人參皂苷Rh可以根據現有科技文獻或專利文獻制備而成，或者按照下述方法制備得到(1)取三七、人參、西洋參或絞股藍提取得到的總皂苷；(2)總皂苷加水溶解，濾過，濾液通過非極性或弱極性大孔吸附樹脂柱，水洗、40%乙醇洗脫，洗脫液棄去，再用50%乙醇洗脫，收集50%洗脫液，干燥；(3)干燥物用乙醇、95%乙醇、正丁醇或甲醇溶解，濾過，濾液加入或者不加入有機溶劑，放置析出，濾過、干燥，得到人參皂苷Rb,。上述步驟(1)中的總皂苷可以直接由市場購買或根據科技文獻制備；上述步驟(3)得到的人參皂苷Rbt可以重復步驟(3)的方法；所述大孔樹脂柱為HPD-100、HPD-100A、HPD-300、HPD-400、HPD-400A、HPD-450、DlOl、1300-1、1400或AB-8。所述有機溶劑為丙酮、乙酸乙酯中的一種或兩種。一、對血管緊張素n誘導人臍靜脈內皮細胞凋亡的影響實驗方法人臍靜脈內皮細胞系ECV304培養于DMEM培養液中，其中含胎牛血清10%、青霉素(100U/mL)和鏈霉素(100U/mL)，置于(202培養箱，5%C02、37°C、95%濕度下靜止培養，2d換液l次。待細胞鋪滿培養瓶底時，用0.25%胰酶消化傳代。按lxlO"mL將細胞接種于96孔培養板，每孔20(VL。培養24h后，換無血清培養液培養24h。分組空白對照組(不加藥)、AngII組(lpmol/L)、AnglI(lpmol/L)+人參總皂苷(15pmol/L)組(加入15pmol/L人參總皂苷，孵育30min后加入Angnipmol/L)、AnglI(l[imol/L)+人參皂苷Rh(10pmol/L)組(加入15pmol/L人參皂苷Rbp孵育30min后加入AngTIlpmol/L)，各組設6個復孔，繼續培養24h后，于光鏡下觀察細胞形態。MTT法檢測ECV304細胞活性，按試劑盒說明測定細胞培養上清液中的NO及NOS含量，流式細胞儀檢測細胞凋亡。結果(1)細胞形態觀察:倒置顯微鏡下動態觀察可見空白對照組細胞緊密貼壁，呈鋪路石狀生長。入1^11組可見多數細胞呈圓形，胞膜空泡，核濃縮；八1^11(1^111101^)+人參總皂苷(2(Vmol/L)組可見多數細胞呈圓形，胞膜空泡，核濃縮，AnglI+人參皂苷Rb,組見上述細胞較空白組明顯減少。(2)與空白對照組比較，AngII組可明顯降低細胞活性(PO.Ol)，AngII+人參皂苷Rbi組均可明顯抑制AngII作用，增加內皮細胞的活性，該組細胞活性與正常細胞無明顯區別。實驗結果見表l:表1人參皂苷Rbl對AngII誘導ECV304內皮細胞的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注與對照組比較"PO.01;與AngII組比較絲PO.Ol;與AngII+人參總皂苷組比較％%P<0.01.二、對大鼠血管內皮早期損傷的保護作用實驗方法大鼠麻醉后，腹臥固定消毒。內皮損傷組在背部皮下埋置AngII緩釋泵，內皮損傷加人參皂苷Rbi組也埋置AngII緩釋泵，但在埋泵前3天和埋泵后經尾靜脈注射人參皂苷RblQAngII用O.Olmol醋酸0.9%氯化鈉稀釋分裝后-80°。保存，AngII釋放劑量為200ng/min/kg，每只泵均加入2mlAngII溶液，藥物緩釋泵釋放速度為1(Vl/h。術后肌注青霉素3d預防感染。分別在埋泵后的第l天、3天、7天和14天，動物麻醉后處死取材口自下而上依次剪開左側肋軟骨，暴露胸腔，剪開心包，右心室抽血(每只動物約可以采血6-8ml)，用作血清學檢測用Liang-500型毛細管血粘度測定儀測定血液粘度。取出腎動脈，肝素0.9%氯化鈉洗滌數次。2.5%戊二醛前固定2h、1%餓酸后固定l-2h。緩沖液漂洗20min。分別用70%、80%、90%、100%丙酮梯度脫水，每次1Omin。Epon812包埋、烤箱內45。C(12h)、60。C(36h)。半薄切片定位，超薄切片于銅網上。醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色。PhilipsTECNAI-12型透射電鏡觀察拍照。實驗結果(1)血清學檢測發現，與對照組相比，人參皂苷Rbi能夠改善血管內皮功能。(2)電鏡觀察腎動脈透射鏡觀察在內皮損傷組可見到內皮細胞不同程度的充血、腫脹、剝脫，在某些部位還可見到內彈力板的暴露，但人參皂苷RbJ且僅有輕微損傷，提示人參皂苷Rbl具有很好的保護內皮細胞的作用。三、對動脈內皮損傷大鼠血管內膜增生的影響研究實驗方法用3%戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔麻醉大鼠后，將動物背位固定在鼠臺上，頸部皮膚用碘酒和酒精常規消毒后，剪開皮膚2-3cm，依次分離皮下組織、肌肉，并暴露氣管，在氣管左側游離左頸總動脈l-1.5cm，將遠心端結扎，近心端用動脈鉗閉夾，于頸動脈遠端用動脈剪剪一斜U，將導管插入胸主動脈約4-5cm長，反復牽拉5次，第6次插入胸主動脈后注入高滲液0.1mL保留卯s，最后拔出導管，結扎左側頸總動脈，逐層縫合皮下脂肪、肌肉及皮膚切口,碘酒涂擦切口。造模成功后，將大鼠隨機分為6組，假手術組、人參皂苷Rbi組(6mg/kg/d)、人參總皂苷對照組(6mg/kg/d)、正常對照組，病理模型組，每組各10只，除正常對照組、病理模型組外，其余各組均手術后經尾靜脈連續給藥14d。各組于造模后第14天處死動物，模型組第3天處死部分動物。動脈留取時剖開頸部，游離頸總動脈，向心端依次留取胸主動脈損傷血管病理標本l-2cm長，分別放入10%中性甲醛固定備用。將病理標本在10。/。中性甲醛液中固定24h后，逐級乙醇脫水，石蠟包埋，間斷均勻切片(每片厚5^im)，制成組織切片備檢。對病理切片進行常規HE染色，光學顯微鏡觀察受損血管病理組織形態學改變，同時病理科協同采用彩色病理圖像分析系統進行圖像分析,測定血管內膜厚度。實驗結果模型組即動脈內皮損傷后大鼠動脈血管形態，血管內膜內皮細胞缺如，管腔內凝血，血管內膜剝脫，血管管壁受損傷后缺損。損傷3d后可見動脈血管內膜被覆內皮細胞，內膜增厚，血管平滑肌細胞增生，血管腔變狹窄。損傷14d后動脈血管內膜被覆內皮細胞，內膜增厚，血管平滑肌細胞增生。人參總皂苷組大鼠動脈血管內膜大部被覆有內皮細胞，內膜呈不均勻增厚，其中5只大鼠動脈內膜無明顯增厚，增厚部內膜血管平滑肌增生，中膜層彈力纖維清晰，外膜未見異常。人參皂苷Rl^組大鼠動脈血管管壁厚薄均勻，內膜被覆完整內皮細胞，內膜無增厚，中膜彈力纖維清晰，平滑肌細胞大小一致，外膜未見異常。四、對主動脈內皮細胞障礙的影響實驗方法5%戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔麻醉大鼠后，常規頸部皮膚碘酒和酒精消毒，剪開皮膚約2-3cm長，依次分離皮下組織、肌肉并暴露氣管，在氣管左側游離左頸總動脈l-1.5cm，將遠心端結扎，近心端用動脈夾鉗夾后，于頸動脈遠端做一切口，將2F球囊導管插入至腹主動脈，注入O.lml生理鹽水使球囊擴張，然后回拉球囊至左頸總動脈與胸主動脈交叉處，回抽生理鹽水后重新送回導管，在3個相隔120。的方向各重復3次共9次，最后拔出導管，結扎左頸總動脈，縫合皮下脂肪及皮膚切口。假手術組不插人球囊導管，其余步驟同上。人參皂苷Rbj組從術前7d至術后14d每日灌胃給藥，劑量為30mg/kg/d，人參總皂苷組從術前7d至術后14d每日灌胃給藥，劑量為30mg/kg/d。取材及處理術后14天，所有大鼠用5%戊巴比妥鈉腹腔麻醉處死，快速開胸，小心取胸主動脈段2cm投于10%福爾馬林固定液屮，然后脫水、透明、石蠟包埋。形態學觀察病理切片HE染色。光鏡下觀察血管內膜增生情況，用計算機圖像分析系統測量大鼠胸主動脈段內膜面積、內膜覆蓋率、內膜/中膜面積。實驗結果見表2:表2大鼠動脈內、中膜測量結果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>假手術組一_一對照組0.231±0.06762.07±11.9440.79±15.17人參總皂苷組0.207±0.04958.76±12.0838.06±13.08人參皂苷Rbi組0.101±0.031**24.83±15.10**13.55±7.03**######注與對照組比較"PO.01;與人參總皂苷組比較弁井P0.01四、對家兔動脈血管成形術后膠原合成的影響實驗方法健康雄性日本大耳兔，隨機分為組損傷組(I組，n=6)，人參總皂苷(劑量1.5mg/kg)，人參皂苷Rbi(劑量1.5mg/kg)及假手術組(僅結扎右頸外動脈)。前3組均用3.5F球囊導管行右頸總動脈內膜剝脫術。普通飼料喂養，自由飲水。用藥組自術后第ld起灌胃給藥，直至術后滿28d。滿28d后處死動物，自心臟取血5mL，取右頸總動脈損傷中段約15mm，用于病理形態學檢査。實驗結果見表3:表3新生內膜厚度及狹窄百分率組別新生內膜厚度狹窄百分率%損傷組141.27±32.5161.8±7.9人參總皂苷組123.06±30.2254.8±8.2人參皂苷Rb,組49,17士4.96**20,9±2.0**##注與損傷組比較"PO.01;與人參總皂苷組比較#砂<0.01。實驗結論通過上述實驗表明，人參皂苷Rbi對內皮細胞障礙具有很好的治療作用，充分說明人參皂苷R^具有治療內皮細胞障礙的新用途。注本發明所要求保護的具體技術方案，不限于上述實施例所表達的技術方案的具體組合。權利要求1、人參皂苷Rb1在制備治療血管內皮細胞功能障礙藥物中的應用。2、根據權利要求1所述的人參皂苷Rb,在制備治療血管內皮細胞功能障礙藥物中的應用，其中人參皂苷Rbi含量大于等于50X且小于100%。3、根據權利要求1所述的人參皂苷Rbi在制備治療血管內皮細胞功能障礙藥物中的應用，其中人參皂苷R^含量大于等于90X且小于100%。4、根據權利要求1所述的人參皂苷Rl^在制備治療血管內皮細胞功能障礙藥物中的應用，其中人參皂苷Rb,為活性物質制備的藥物制劑。5、根據權利要求4所述的人參皂苷Rbi在制備治療血管內皮細胞功能障礙藥物中的應用，其中藥物制劑為單位劑量的片劑、膠囊劑、顆粒劑、微丸劑、滴丸劑、口服液劑、軟膠囊劑、水針劑、粉針劑、輸液劑。6、根據權利要求5所述的人參皂苷Rl^在制備治療血管內皮細胞功能障礙藥物屮的應用，其屮片劑、膠囊劑、顆粒劑、微丸劑、滴丸劑、口服液劑、軟膠囊劑單位劑量為l一4000mg。7、根據權利要求5所述的人參皂苷Rbi在制備治療血管內皮細胞功能障礙藥物中的應用，其中水針劑、粉針劑、輸液劑單位劑量為l一1000mg。全文摘要本發明公開了人參皂苷Rb₁一種新用途，即在制備治療血管內皮細胞功能障礙藥物中的應用，其中人參皂苷Rb₁含量大于等于50％且小于100％，優選人參皂苷Rb₁含量大于等于90％且小于100％，藥效機理研究表明，人參皂苷Rb₁對內皮細胞障礙具有很好的保護作用。文檔編號A61K9/10GK101422473SQ20071017666公開日2009年5月6日申請日期2007年11月1日優先權日2007年11月1日發明者李志剛,林治榮,栗艷彬,鄯慧珍,群顧申請人:北京本草天源藥物研究院