水溶性富勒烯衍生物、組合物及其在制備抑制腫瘤生長和轉移藥物中的應用的制作方法

專利名稱：：水溶性富勒烯衍生物、組合物及其在制備抑制腫瘤生長和轉移藥物中的應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種新型納米材料及其在生物醫學中的應用。具體地說，涉及富勒醇顆粒[C6()OxHy]n(10<Y^X<50，n=l5_50)和富勒烯羧酸衍生物C60(C(COOH)2)n(n=l-4的整數)及其在抑制腫瘤生長和轉移中的應用。
背景技術：
：惡性腫瘤是威脅人類健康的重要疾病，目前已成為人類死亡的主要原因。在中國，肺癌，胃癌，肝癌和乳腺癌是發病率最高的腫瘤。資料顯示，在中國，肺癌的發病率約為27/10,000,胃癌的發病率為26.8/10,000,乳腺癌的發病率約為16.39/10,000。目前全世界至少有700萬人死于癌癥，其中我國約130萬。腫瘤是嚴重威脅人民生命、健康的常見多發病。我國每年惡性腫瘤發病人數約160萬。已超過心腦血管病成為致死原因的第l位。90%的胂瘤病人死于轉移。轉移是腫瘤惡性行為的特征性表現，也是臨床治療失敗的主要原因。控制轉移成功與否是決定癌癥患者生存預后的關鍵。只有能有效地控制腫瘤轉移的發生和發展，腫瘤治療才算真正完成。可以毫不夸張的說攻克腫瘤轉移的過程就是攻克腫瘤的過程。目前，手術切除、化療和放療是治療惡性腫瘤的主要方法，但是這些方法都存在著其無法克服的缺陷手術只能切除肉眼可見的瘤塊而不能去除殘余的腫瘤細胞；化療和放療毒副作用非常強烈，在抑制腫瘤生長的同時也損傷了機體正常的組織器官，從而使患者的生活質量急劇下降；如環磷酰胺、阿霉素、順鉑等在起到治療作用的同時，產生骨髓抑制、消化道劇烈反應、腎臟毒性等重度副作用，嚴重地限制了其臨床使用劑量。此外，不少抗腫瘤藥在臨床應用過程中產生耐藥性，降低療效。因此，抗腫瘤藥的研究面臨嚴重的挑戰，新型抗腫瘤以及抗腫瘤轉移藥物研究開發勢在必行。當粒子尺寸進入納米量級時，其本身具有量子尺寸效應、小尺寸效應、表面效應和宏觀量子隧道效應。在生命科學研究中，納米顆粒已經顯示出其獨特的優勢和誘人的應用前景，如靶向性納米藥物載體、疾病高效檢測的量子點、高效醫學成像以及腫瘤治療技術相關的納米材料等，已經成為國際前沿科學問題。Kroto等[l]于1985年發現了巴基球，并提出了球型中空分子的模型，將之命名為富勒烯。C6o的結構研究表明，C6。是一個由12個五元環和20個六元環組成的球形三十二面體，它的外形酷似足5求，直徑為0.71nm。六元環的每個碳原子均以雙鍵與其他碳原子結合，形成類似苯環的結構。獨特的結構賦予了它特殊的理化性質，在生物醫學、材料科學等領域有著重要的應用前景。Friedman等于1993年在J.Am.Chem.Soc,115:6506-6509理論計算模擬了富勒烯C6。衍生物可以抑制HIV病毒的活性C6。是強疏水性球形分子，直徑為0.71nm,而HIV是末端開口的圓柱狀分子，尺寸與<:6()直徑相似，其活性位置表面也是強疏水性的，兩者有可能以共價鍵結合，從而阻止HIV病毒的生長。含有14核苷酸富勒烯衍生物和DNA的加合物可形成較穩定的三螺旋結構，在光催化下可對DNA進行選擇性的位點切割。由于Q。本身具有強烈的疏水性，在極性溶液中的溶解度很低，難以在生理介質中直接使用，嚴重影響了富勒烯在生物醫學中的應用，因此改善C60的水溶性成為研究的關4建。通過引入新的基團，如-OH、-COOH、-NH2等，改善了富勒烯的水溶性，并可同時賦予富勒烯新的物理化學性質。在水環境中，羥基衍生化以及羧基衍生化的富勒烯并不是以單獨的分子形式存在的，而是通過自身、或者與大分子相互作用團聚成納米顆粒物，這些顆粒物有很好的生物親和性[2-5]。發表在2004年10月份NanoLett的一篇論文[2]，指出富勒烯的細胞毒性高度依賴于其碳籠表面是否修飾和修飾的基團。在兩種細胞系中，不同的結構的毒性可相差7個數量級，以富勒醇(C6o(OH)24)最小，富勒烯三加成丙二酸(C60-C3)次之,富勒烯毒性最大。富勒醇(C6。(OH)24)的LD50〉5,000ppm,C60-C3的LD50為10ppm，而富勒烯的LD50為20ppb。等[6]用14C標記的富勒烯羧基衍生物研究了它們在大鼠體內的分布代謝情況。研究發現經口給藥后，藥物吸收比較差，并主要是以糞便排出；而靜脈注射給藥后，藥物迅速地分布在各個器官中，藥物在一周后大多還保留在體內。研究還發現藥物能夠穿過血腦屏障，這種水溶性富勒烯的急性毒性非常低。利用1251標記的C60(OH)x對不同瘤抹的荷瘤鼠的研究發現其主要分布在不同荷瘤鼠的肝、腎和骨骼，在腫瘤組織中有少量富集[7]。運用放射性核素67Ga標記技術[8]研究了富勒烯衍生物C6o(OH)x在正常小鼠體內的分布和代謝。研究結果表明，標記物很快被體內各臟器和組織攝取，主要分布在骨髓、骨、肝臟和脾中，不能通過血腦屏障。其分布具有微粒特征，通過皮下或肌肉注射，有望用于淋巴顯像劑或惡性淋巴肺瘤導向治療的藥物載體。富勒烯的羧基衍生物在動物實驗中具有良好的生物活性和細胞活性，可作為中樞神經系統的神經保護劑，在治療神經變性疾病，如帕金森病等有潛在的應用前景[9]。羧基化衍生物可以清除體內的自由基，還可以抑制角化細胞增生，保護人角化細胞免遭紫外線(UVB)介導的細胞凋亡[10]。多羥基化富勒醇還在細胞培養模型中具有NO自由基的功能[4]。參考文獻1.KrotoHW,..etal，Buckminsterfullerene[J].Nature,1985，318:162-163.2.SayesCM,FortnerJD,GuoW，etal.，Thediffierentialcytotoxicityofwater-so固efullerenes.NanoLett,2004,4(10):1881-1887.3.DuganLL,TuretskyDM,DuC，LobnerD，WheelerM,AlmliCR，etal.Carboxyfullerenesasneuroprotectiveagents.ProcNatlAcadSciUSA1997;94:9434—94394.MirkovaSM,DjordjeviccAN,AndricbNL，AndricbSA，KosticbTS，BogdanovicdGM，etal.Nitricoxide-scavengingactivityofpolyhydroxylatedfullerenolC60(OH)24.NitricOxide2004,11:201-207.5.ChiangLY,WangLY，SwirzewskiJW,SoledS,CameronS.Efficientsynthesisofpolyhydroxylatedfullerenederivativesviahydrolysisofpolycyclosulfatedprecursors.JOrgChem1994,59;3960-3968.6.YamagoS,etal,Invivabiologicalbehaviorofawater-misciblefullerene:14Clabeling,absorption,distribution,excretionandacutetoxicity[J].Chemistry&Biology,1995，2(6):385-389.7.李宇國等."Ga標記C6o衍生物C6Q(OH)x的生物分布研究[J].核技術，2003,26(5):393-396.8.JiZQ，SunHF,WangHF，XieQY，LiuYFandWangZ.BiodistHbutionandtumoruptakeofC60(OH)xinmice.JournalofNanoparticleResearch,2006,8(1):53-63.9.DuganLL,LovettEG,QuickKL，LothariusJ，LinTT,O'MalleyKL.Fullerene-basedantioxidantsandneurodegenerativedisorders.尸a廠h'wsow/s/wT^/她dZ)&ora^2001口:243-246.10.FumelliC,MarconiA,SalvioliS,etal.CarboxyfullerenesProtectHumanKeratinocytesfromUltraviolet—B_inducedApoptosis.InvestDermat，2000，115:835-841
發明內容發明人設計并制備了一種富勒醇和富勒烯羧酸衍生化合物，使其在生理鹽水溶液中形成平均粒徑為100nm至200nm的納米顆粒，結果發現這兩類納米顆粒具有一定的抑制胂瘤生長和很強的腫瘤轉移抑制作用，其作用機制不是通過對腫瘤細胞的直接殺死作用而完成的。本發明的一個目的是提供一種富勒醇和富勒烯丙二酸加成衍生物及其制備方法。本發明的另一目的是提供一種腫瘤抑制組合物，其中含有治療有效量的富勒醇和富勒烯丙二酸加成衍生物顆粒和藥學上可接受的載體。本發明的再一目的是提供一種富勒醇和富勒烯丙二酸加成衍生物在制備抑制腫瘤和抑制腫瘤轉移藥物中的應用。為實現上述目的，本發明包含以下方案一種富勒醇，它以通式C6oOxHy表示，其中，10<Y^X<50。一種富勒烯羧基衍生物，它的分子式以C6。(C(COOH)2)n表示，其中，n=1_3。上述化合物包括一個由碳原子構成的納米碳籠，其表面存在許多羥基基團或羧基基團，這些羥基和羧基基團通過與環境中的氫耦合形成水合分子，因此富勒醇和富勒烯丙二酸衍生物在生物體內有很好的生物親和性。同時，進行水溶化修飾后，與富勒烯本身比較毒性大大降低。富勒醇除與氫原子構成羥基之外，碳籠表面還存在少量的氧離子。本發明的通式為C6()OxHy(10<y^x<50)的富勒醇及通式為C60(C(COOH)2)n(n=1-3)的制備方法。一種腫瘤抑制組合物，其中含有以通式C6oOxHy(l(Ky^c〈50)的羥基化富勒烯顆粒。所述肺瘤為實質固態瘤，其包括但不限于肺癌、肝癌、乳腺癌、子宮頸癌、腦瘤、皮膚癌或直腸結腸癌。另一種腫瘤抑制組合物，其中含有以通式C6()(C(COOH)2)n(n=1-3)的羧基化富勒烯顆粒。所述腫瘤為實質固態瘤，其包括但不限于肺癌、肝癌、乳腺癌、子宮頸癌、腦瘤、皮膚癌或直腸結腸癌。上述組合物還可包括溶劑和/或藥學上可接受的載體。上述溶劑優選水或生理鹽水。上述藥學上可接受的載體是指藥學領域常規的藥物載體，例如稀釋劑、賦形劑，填充劑，吸收促進劑等。合適的藥物載體可以是有機或者無機的惰性載體材料，包括水、明膠、淀粉、二氧化硅、氧化鈦、阿拉伯樹膠等等。也可加入公認的其它添加劑，例如防腐劑、穩定劑、乳化劑等。在治療應用中，本發明的化合物可通過仁毅常^L的施藥途徑使用。這類途徑包括靜脈、皮下、腹膜內、局部或經口等途徑。該化合物可制備成任何常規形式，包括經口使用的固體形式，例如丸劑、膠嚢、片劑、粒劑等；如靜脈使用的制劑，無菌水溶液，如生理鹽水、磷酸緩沖液等。在溶劑環境中，通式為C6oOxH、(l(K^x〈50)的富勒醇和C6()(C(COOH)2)n(n=1-3)的富勒烯羧基衍生物通過與自身或者其它分子的相互作用團聚成納米顆粒物，可以通過超聲波等方法控制顆粒物的尺寸，形成直徑分布范圍在1-400腿的顆粒。本發明的腫瘤抑制組合物，其中，所述的組合物中富勒烯衍生物在溶劑中的濃度優選為lxl(T610mmol/L。當濃度高于10mmol/L時富勒烯衍生物的溶解性降低，且顆粒易發生團聚。此外，兩類富勒烯衍生物在細胞培養體系的終濃度在0.1~106nmol/L之間，對細胞無明顯毒性作用。一種富勒醇在制備抑制腫瘤和腫瘤轉移藥物中的應用，該藥物被制備成所述富勒醇0.42mg/kg/天或0.5nmol/kg/天的劑型。一種富勒烯二加成丙二酸衍生物在制備抑制腫瘤藥物中的應用，該藥物被制備成所述C6。(C(COOH)2)2的0.4mg/kg/天的劑型。上述胂瘤抑制組合物優選通過腹腔內注射或局部給藥的方式施用于需要治療的患者。在本發明的一個優選實施方案中，將上述腫瘤抑制組合物制成注射用溶液。本發明的優點是與目前臨床普遍使用的環磷酰胺、順鉑、紫杉醇等相比，富勒醇和羧基化富勒烯納米顆粒具有用量小，毒性低，且具有抑制腫瘤轉移的優點。圖1C60(C(COOEt)2)2的基質輔助激光電離飛行時間質譜圖。負離子、反射模式。圖2C6o(C(COOH)2)2的紅外光譜圖。圖3為富勒醇的紅外光譜圖.圖4生理鹽水溶液中富勒醇納米顆fe的高分辨原子力顯微鏡5生理鹽水溶液中C60(C(COOH)2)n納米顆粒的高分辨原子力顯微鏡6采用激光動態光散射法測定羧基化富勒烯在純水溶液(A，161.8nm)和生理鹽水(B，171.1nm)的粒徑分布圖7溶解于生理鹽水溶液中的富勒醇納米顆粒的掃描電鏡8溶解于生理鹽水溶液中的羧基化富勒烯納米顆粒的掃描電鏡9腹腔注射給藥C6。(C(COOH)2)2和富勒醇后小鼠EMT6乳腺癌的生長曲線圖。圖10小鼠乳腺癌EMT6模型中肺組織病理切片照片圖11.采用乳酸脫氫酶(LDH)釋放法檢測共培養48小時后羧基化富勒烯對兩種細胞(鼠肝癌細胞RH35或鼠纖維原3T3L1纟田月包)繁殖與毒性作用。圖12利用流式細胞分析技術檢測C6o(C(COOH)2)2對人宮頸癌Hela細胞的潛在毒性。圖13采用MTT檢測羧基化富勒烯對不同細胞包括人神經母細胞瘤SHSY-5Y(A)和人肝癌HepG2細胞(B)存活率的影響圖14采用CCK-8檢測富勒醇對人乳腺癌細胞MCF-7存活率的影響圖1中，m/z代表質荷比。圖2中，橫座標為波數，縱座標為透過率。圖6中，橫座標為直徑，縱座標為體積％。圖ll橫座標為濃度，縱座標為比率。圖12A橫座標為C60濃度，縱座標為凋亡百分率。圖12中，橫座標PI為碘化丙啶，縱座標為總數。具體實施方式C60的二加成丙二酸衍生物的合成方法基于經典的Bingle-Hirsch反應，在堿存在下，C60與溴代丙二酸酯類化合物的反應,利用這一反應可以得到富勒烯碳籠上的6-6閉環丙烷化產物。具體制備過程如下首先,將NaH加入已經配制好的1.5mg/mlC60曱苯溶液中，溶液由原來的紫色變為深紅色,然后滴加入溴代丙二酸二乙酯。將上述溶液體系在氬氣保護下攪動10h,將反應后的溶液過濾。過濾后的上清液通過旋轉蒸發儀真空濃縮去除溶劑，剩余物經硅膠柱(400目)進行層析分離，層析分離的流動相分別為曱苯，曱苯/氯仿1:1，氯仿。通過層析分離分別可以得到色帶IXI，均為不同加成數目的C6。丙二酸酯衍生物。將其中經過曱苯洗脫的深棕色帶IV再經旋轉蒸發后,投入曱苯溶液中，并加入20倍過量的NaH。溶液在Ar保護下繼續加熱攪動10h，反應溫度為8(TC。移去加熱源后,立即在溶液中加入CH30H終止反應，并加入HC1。通過離心法收集容器中的紅色粉末狀沉淀。收集的沉淀物分別經CH30H、2M鹽酸和水分別快速洗滌沉淀各兩次。再將沉淀物用水溶解,并用0.22jum的濾膜濾去不溶物。最后通過真空干燥去除溶劑,所獲得的棕色干燥粉末狀產物即為所需Qq的二加成丙二酸衍生物。c6q丙二酸酯衍生物的質譜表征是在基質輔助激光解析電離飛行時間質語儀(德國Bruker公司，AutoFlex型)上進行的。最終合成的C60丙二酸衍生物的特征基團表征在紅外光i普儀(美國Nicolet公司，AVATAR360型)上獲得。我們采用高效相轉移催化劑四丁基氫氧化銨(TBAH)催化C6()曱苯溶液與濃NaOH水溶液之間的相轉移反應直接將曱苯溶液中的(:60轉化為C6o(OH^的水溶液。富勒醇的具體制備過程如下在1.5mg/mlC60曱苯溶液中加入1.0g/ml的NaOH溶液，然后滴加數滴40%四丁基氫氧化銨(TBAH,tetrabutylammoniumhydroxide),并在室溫下攪拌。當燒杯中的曱苯溶液從深黃色變成無色，同時燒杯底部出現褐色沉淀時，加適量水到燒杯，并攪拌過夜。傾倒上清夜，用100%曱醇洗滌褐色沉淀，并真空千燥。曱醇洗滌過程重復H次，以洗脫大量的TBAH和NaOH。將沉淀溶于去離子水，以去離子水為流動相，用SephadexG-25柱層析(5x100cm"對多羥基富勒烯進行分離純化，以去除痕量的Na+離子。分離過程中，5mL/管收集洗脫液，以獲得羥基數目分布較窄的羥基富勒烯。冷凍干燥保存待用。采用本發明方法制備的富勒醇C6。OxHy，其羥基數目在1050的范圍，幾基數目的正態分布的峰值為12~32，具體峰值由合成反應中NaOH溶液的濃度決定，可根據需要調節NaOH溶液的濃度，從而獲得指定羥基數目的富勒醇。當羥基數目低于10時，富勒醇的生物相溶性不好；當羥基數目高于50時，碳籠的結構不穩定。我們采用高效相轉移催化劑四丁基氬氧化銨(TBAH)催化C6()甲苯溶液與濃NaOH水溶液之間的相轉移反應直接將甲苯溶液中的C60轉化為C6()(OH),,的水溶液。精確測定富勒醇的羥基數目至關重要，本發明中，我們利用北京大學X射線光電子能語(XPS)并結合元素分析方法來確定富勒烯的表面修飾后的羥基數目。XPS實驗在北京大學進行。在單晶硅片上通過磁控離子賊射鍍上高純Pt作為XPS樣品測試基底。富勒醇滴加在高純Pt基底上獲得XPS測量的薄膜，富勒醇的Cls光電子發射譜用于確定樣品包含的羥基數目。改變入射光子能量，采集樣品的價帶光電子能譜。采集樣品的部分產額譜以獲得樣品的吸收譜。裝置的能量分辨率約為0.5eV。樣品的在采集數據前，先進行XPS掃描，以確保樣品表面清潔并確定儀器處于良好運行狀態。以下結合實施例和對比例進一步說明本發明，但并不因此將本發明限制在所述實施例范圍之中。實施例1測定富勒醇的羥基數富勒醇的Cls電子的XPS鐠圖，C-C和C-O鍵之間的相對強度用于分析富勒醇中的羥基數目。經過高斯擬合分析表明分子中主要存在三種不同的碳原子峰位置在284.8eV的是沒有連接其它基團的具有sp2雜化的碳原子(C-C)的結合能；位于286.6_eV的峰是羥基化的碳原子(C-OH)，288.19—eV左右的峰屬于酮或環氧結構OO的峰。由此，獲得富勒醇的羥基數目，本發明方法制得的富勒醇主要控制在為10-50，其中15-25為最佳值，碳籠穩定，水溶性較好。實施例2納米顆粒粒徑的測定富勒醇C6Q(OH)x分子的粒徑約為1nm。在不同溶劑環境中，富勒醇分子通過與自身或其它大分子相互作用團聚成納米顆粒物，可以通過超聲波等方法控制顆粒物的尺寸，形成直徑分布范圍在l-400nm的顆粒。將富勒醇溶于雙蒸水或生理鹽水，濃度為200pmol/L,取10pl滴于平整云母片上，風干。高分辨原子力顯微鏡(SPM-9500J3，SHIMAZU)證實生理鹽水溶液中富勒醇，平均粒徑167nm存在，參見圖4。在含血清的溶劑環境中，富勒醇通過與白蛋白等大分子相互作用，可以形成200-400nm的顆粒。實施例3納米顆粒;粒徑的測定C6o(C(COOH)2)2分子的粒徑約為lnm。在不同溶劑環境中，富勒醇分子通過與自身或其它分子相互作用團聚成納米顆粒物，可以通過超聲波等方法控制顆粒物的尺寸，形成直徑分布范圍在1-400nm的顆粒。將C60(C(COOH)2)2溶于雙蒸水或生理鹽水，濃度為200nmolZL，取101^1滴于平整云母片上，風千。用高分辨原子力顯微鏡(SPM-9500J3)2.5pm探頭掃描，掃描速度1Hz。Profile軟件分析表明C60(C(COOH)2)2在水相中的平均粒徑為118.0nm。參見圖5。在含血清的溶劑環境中，通過與白蛋白等大分子相互作用，可以形成200-400nm的顆粒。實施例4納米顆粒粒徑的測定動態光散射(Dynamiclightscattering,DLS,又名光子相干散射)是指通過測量樣品散射光強度起伏的變化來得出樣品顆粒大小信息的一種技術。測量過程不干擾樣品本身的性質，能夠反映出溶液中樣品分子的真實狀態。將C60(C(COOH)2)2溶于雙蒸水或生理鹽水，濃度為200pmol/L,采用MalvernNanoZS90動態光散射儀測定。結果顯示，在水以及生理鹽水中的粒徑分別為161.8和171.1nm,與AFM結果基本一致。參見圖6。實施例5采用SEM表征富勒醇納米顆粒的粒徑大小首先，用無水乙醇浸泡硅片，超聲處理5min,雙蒸水清洗后，再超聲清洗5min，42。C烘箱烘干備用。將富勒醇溶于生理鹽水，濃度為200pmol/L,超聲處理5次，每次3min。然后吸一滴到預處理好的硅片上，室溫千燥后，采用SEM(HitachiS-4800,Japan)觀察，結果如圖7所示。表明超聲處理后，分散較好，富勒醇在水相中的粒徑為20-150nm，與AFM結果基本一致。實施例6采用SEM表征C6o(C(COOH)2)2納米顆粒的粒徑大小首先，用無水乙醇浸泡硅片，超聲處理5min,雙蒸水清洗后，再超聲清洗5min,42。C烘箱烘干備用。將C6o(C(COOH)2)2溶于生理鹽水，濃度為200|imol/L。然后吸一滴到預處理好的硅片上，室溫干燥后，采用SEM(HitachiS-4800，Japan)觀察，結果如圖8所示。表明C60(C(COOH)2)2在水相中的平均粒徑為120.0nm，與AFM和DLS結果基本一致。實施例7C6o(OH)2QOl4與C6。(C(COOH)2)2納米顆粒對小鼠EMT6乳腺癌腫瘤的抑制作用動物品系BALB/C種雌性小鼠，體重為18到22克。腫瘤模型高轉移乳腺癌(EMT6)瘤抹。實驗分組A.陰性對照組生理鹽水(saline);B.陽性對照組環磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX),臨床上普遍使用的一種抗癌藥物，劑量(20mg/kg)，接種后連續給藥7天；C.藥物組C6Q(C(COOH)2)2,劑量(0.4mg/kg)，每天給藥；D.藥物組C6。(OH)M014，劑量(0.4mg/kg)，每天給藥；E.藥物組C6。(OH)2Q014,劑量(2mg/kg),每天給藥；每組10只小鼠。給藥方式腹月空注射(intraperitoneal,i.p.)。CTX，C6()(OH)2o014與C6o(C(COOH)2)2溶液以0.9%的生理鹽水為溶劑。注射體積均為0.2ml。實驗方法每只小鼠右后肢皮下接種小鼠EMT6乳腺癌瘤株1x106癌細胞(溶于100pl的0.9%生理鹽水中)，接種24小時后開始給藥0.2ml/只；實驗期間每24小時給藥一次，每隔一天測量接種腫瘤的后肢直徑，記錄其生長情況；同時觀察小鼠的攝食量和反應情況；當生理鹽水組小鼠右后肢直徑長到20mm左右時，停止實驗(正常小鼠后肢直徑為6mm)。實驗結束摘除眼球取血；摘取肺瘤，稱重；取臟器/器官并稱重，計算臟器系數；同時用10%的福爾馬林固定臟器/器官。為觀察腫瘤肺轉移情況，解剖完畢后，將肺浸入Bouis液中染色，放置12小時后，取出，計數轉移灶數目。肺轉移灶一般為圓形小突起如皰狀，正、反面及肺葉間的瘤灶均計數在內。實驗結果腹腔注射給藥C6。(C(COOH)2)2和富勒醇后小鼠EMT6乳腺癌的生長曲線9。C6o(OH)20Ol4與C6。(C(COOH)2)2納米顆粒的抗乳腺癌EMT6活性以及抗乳腺癌轉移活性分別如表1和表2中所示，注射兩種富勒烯衍生物納米顆粒后可以抑制小鼠的腫瘤生長，并可以抑制乳腺癌EMT6的肺轉移。小鼠乳腺癌EMT6模型中肺組織病理切片結果以下參見圖10,富勒醇與二加成羧基化富勒烯納米顆粒治療組的肺組織中轉移灶與生理鹽水對照組相比明顯減少。生理鹽水組的肺部肺泡間隔增寬現象明顯，產生嚴重實變；各給藥治療組的肺泡間隔沒有明顯增寬現象，特別是富勒醇高劑量組效果更加明顯。由肺組織病理結果說明QoOxHy與C6o(C(COOH)2)2納米顆粒可以抑制乳腺癌EMT6細胞的肺轉移，并可以明顯改善肺部炎癥反應。圖中箭頭所指為肺瘤轉移灶，藥物組轉移灶的大小數目均大大減少。表1.腹腔注射C6u(C(COOH)2)2和富勒醇后小鼠腫瘤抑制情況<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>.(表中數據以(平均值土標準差)表示)表2.腹腔注射C6。(C(COOH)2)2和富勒醇后小鼠肺轉移抑制情況<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實施例8富勒醇納米顆粒對小鼠Lewis肺癌腫瘤模型抑制腫瘤效果實驗方法C57BL純系雌性小鼠(18-22克)，腋下接種Lewis肺癌細胞懸液(1.5xl0"后，接種24小時后開始給藥，分別給給予富勒醇(0.5pmol/kg)、表阿霉素和生理鹽水。給藥方法富勒醇0.51imol/kg/天xl2天，以富勒醇濃度計算；注射液濃度為0.05(imol/ml，注射體積均為0.2ml。表阿霉素第一周3.45(imol/kgq.d.x7生理鹽水0.2ml/天.xl2動物品系C57BL純系雌性小鼠，每組10只肝瘤模型小鼠lewis肺癌腫瘤模型纟會藥方式腹月空；主射(intraperitonealinjection,i.p.)。注射體積均為0.2ml。表阿霉素和富勒醇溶液,以0.9%的生理鹽水為溶劑。抑制腫瘤實驗結果如表3所示，富勒醇組在0.5(^mol/kg體重給藥12天時抑瘤率可達到37.7%。富勒醇組小鼠在實驗結束時未出現明顯的毒性反應。實驗結果表明，與目前臨床普遍使用的表阿霉素相比，富勒醇具有用量小，毒性低，且腫瘤抑制率高的優點。表3.腹腔注射富勒醇后小鼠Lewis肺癌抑制情況<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實施例9細胞毒性試驗采用乳酸脫氬酶(LDH)釋放法分析羧基化富勒烯對不同癌細胞存活率的影響取對數生長期細胞消化成單細胞懸液，調節細胞濃度為2xl04/ml,接種于96孔細胞培養板，每孔接種IOOmI,分為6個劑量組，每組8個復孔。接種24h后，換成無血清培養基，每孔lOOial,按劑量組濃度分別加入藥物，繼續培養48h后。取上清，檢測LDH酶的活性。細胞死亡或細胞膜發生破壞時胞質會釋放出乳酸脫氳酶到培養上清液中。通過檢測羧基化富勒烯對兩種細胞(鼠肝癌細胞RH35或鼠纖維原3T3Ll纟田月包)共培養48小時后上清液中LDH的活性，可以判斷富勒烯衍生物對細胞的毒性。實驗結果如圖ll所示，在0-100jumol/L的濃度范圍內，未發現釋放LDH有明顯變化，即羧基化富勒醇沒有明顯的細胞毒性。實施例10細胞毒性試驗流式細胞儀的方法分析羧基化富勒烯對人宮頸癌細胞的毒性將5ml濃度為1()S個/ml的人宮頸癌細胞(Hela細胞)接種于25cm2培養瓶中，24h后換成5ml無血清培養基，分別加入1xlO'ppb，1x102ppb，1x103ppb，1xl04ppb,1x105ppb五種不同濃度的C60(C(COOH)2)2,對照組不加C60(C(COOH)2)2(control)。24h后收取細胞，包括培養基中的少量細胞，收集好的細胞用生理鹽水洗兩次，然后用70%乙醇在4。C固定。做流式分析前，用生理鹽水洗2次，最后用生理鹽水懸起細胞，加入RNaseA及碘化丙咬(PI)，終濃度分別是25ppm和50ppm，在37。C水浴中放置30min,用尼龍紗布過濾后上機進行測定。PI不能通過正常細胞的細胞膜，^旦對于凋亡中晚期細胞或死細胞，PI能透過細胞膜而使細胞核紅染。DNA結合PI染色后，可在G1峰前出現一亞二倍體峰，根據此峰的百分率可檢測凋亡細胞數。結果如圖12所示，A為不同濃度下，凋亡細胞的百分比柱狀圖。B為細胞凋亡直方圖。C60(C(COOH)2)2的終濃度在10~105ng/mL范圍內，細胞凋亡比例與對照組基本一致，凋亡細胞的比例均在2.0%~3.5°/。之間，細胞凋亡直方圖中均無凋亡小峰的出現，周期分析表明在不同濃度C6()(C(COOH)2)2作用下的細胞各周期分布比例基本一致，S%(S期細胞所占比例)在25%~31%之間，G2/G1(G2期與Gl期細胞數之比)在1.891.94之間。結果表明10~105ppb濃度范圍內C6o(C(COOH)2)2對Hela細胞作用24h，沒有觀察到細胞毒性作用。藥物各劑量組之間沒有顯著性差別。不誘導Hela細胞凋亡，對細胞的增值和生長沒有影響。實施例11細胞毒性試驗采用噻唑蘭(MTT)細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒的方法分析羧基化富勒烯對人神經母細胞瘤SHSY-5Y和人肝癌HepG2細胞存活率的影響MTT法作為四氮唑類染料之一的MTT進入細胞后，被線粒體呼吸鏈酶(如琥珀酸脫氬酶)還原為不溶性有色產物，結晶物能被二曱基亞砜(DMSO)溶解，利用光吸收的方法測定有色產物的量，從而間接反映細胞的活性。實驗結果如圖13所示，羧基化富勒烯終濃度在1~100|Limol/L范圍內，人肝癌HepG2細胞存活率較未加任何藥物的對照組有所增加，但沒有顯著性差異。在羧基化富勒烯終濃度在1~1000fimol/L范圍內，與人神經母細胞瘤SHSY-5Y細胞共培養48h后，細胞存活率沒有變化，說明藥物對細胞的生長沒有影響，沒有明顯的毒性作用。實施例12細胞毒性試驗采用CCK-8的方法分析富勒醇對人乳腺癌MCF-7細胞的作用。CellCountingKit-8簡稱CCK-8試劑盒，是一種基于WST-8的廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。WST-8是一種類似于MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內的一些脫氫酶還原生成水溶性橙黃色的formazan。細胞增殖越多越快，則顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺。對于同樣的細胞，顏色的深淺和細胞數目呈線性關系。實驗結果如圖14所示，富勒醇(:60(0印22終濃度在1~100mg/L范圍內，與人乳腺癌MCF-7細胞共培養48h后，與對照組相比，細胞存活率沒有變化，說明藥物對細胞的生長沒有影響，沒有明顯的毒性作用。權利要求1、一種水溶性富勒烯衍生物，其特征在于所述的衍生物是以通式C60OxHy(10<y≤x<50)表示的富勒醇或以通式C60(C(COOH)2)n(n＝1-3)表示的富勒烯羧基衍生物。2、根據權利要求1所述的一種水溶性富勒烯衍生物，其特征在于所述的通式C6o(C(COOH)2)。(n-l-3)中,n=2。3、根據權利要求1所述的一種水溶性富勒烯衍生物，其特征在于所述的富勒醇為C60(OH)15.25。4、一種腫瘤抑制組合物，其特征在于它包括權利要求l所述的水溶性富勒烯衍生物的顆粒，和藥學上可接受的載體。5、根據權利要求4所述的一種腫瘤抑制組合物，其特征在于所述的富勒烯羧基衍生物為通式C6()(C(COOH)2)n(n-l-3)中，n=2或富勒醇為C60(OH)關。6、根據權利要求4或5所述的一種腫瘤抑制組合物，其特征在于所述的藥學上可接受的栽體為溶劑和/或藥學上常規的藥物載體。7、根據權利要求6所述的一種腫瘤抑制組合物，其特征在于所述的藥學上可接受的載體為溶劑，該溶劑為水或生理鹽水，所述的富勒烯衍生物的濃度為lxl06~10mmol/L。8、一種權利要求1所述的水溶性富勒烯衍生物在制備抑制腫瘤藥物中的應用。9、根據權利要求8所述的水溶性富勒烯衍生物在制備抑制腫瘤藥物中的應用，其特征在于所述的富勒烯羧基衍生物為通式C6o(C(COOH)2)n(n=1-3)中，n=2或富勒醇為C60(OH)15-25。10、根據權利要求9所述的水溶性富勒烯衍生物在制備抑制腫瘤藥物中的應用，其特征在于，所述的藥物被制備成各種劑型，這些劑型所對應的給藥量以水溶性富勒烯衍生物計為5xl0"5xl(^mmol/kg/天。11、根據權利要求6所述的一種腫瘤抑制組合物，其特征在于所述的富勒烯衍生物在溶劑中的納米顆粒物直徑分布范圍為l-400nm。全文摘要一種水溶性富勒烯衍生物、組合物及其在制備抑制腫瘤生長和轉移藥物中的應用，所述的衍生物是以通式C₆₀O_xH_y(10＜y≤x＜50)表示的富勒醇或以通式C₆₀(C(COOH)₂)_n(n＝1-3)表示的富勒烯羧基衍生物；一種腫瘤抑制組合物，它包括上述的水溶性富勒烯衍生物的顆粒，和藥學上可接受的載體。本發明的優點是與目前臨床普遍使用的環磷酰胺、順鉑、紫杉醇等相比，富勒醇和羧基化富勒烯納米顆粒具有用量小，毒性低，且具有抑制腫瘤生長和抑制腫瘤轉移的優點。文檔編號A61K33/44GK101397132SQ20071017545公開日2009年4月1日申請日期2007年9月29日優先權日2007年9月29日發明者昶葉,煒李,芳焦,趙宇亮,陳春英申請人:中國科學院高能物理研究所;國家納米科學中心