專利名稱：：胰島素經鼻給藥制劑的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種胰島素制劑，具體涉及一種胰島素經鼻給藥制劑。
背景技術：
：胰島素是一個由51個氨基酸組成的多肽激素，其分子量約為5800，在正常個體(非糖尿病的)胰島的P細胞內生成。胰島素主要起到調節糖代謝，降低血糖水平；胰島素的缺乏將導致糖尿病。眾多的糖尿病人需要長期頻繁的施用胰島素來維持可接受的血糖水平。胰島素最常用的給藥方法是皮下注射，一般注入腹部或大腿上部。為了維持可接受的血糖水平，通常需要每天注射胰島素至少一次或兩次，并在必要時補充注射速效胰島素。胰島素的注射給藥方式給患者帶來眾多不便。首先，患者會發現每天頻繁的注射既困難又麻煩，還伴隨著疼痛，因此可能會導致不情愿而不遵醫囑，由此一些較嚴重的患者會危及生命。此外，皮下注射胰島素的吸收也相對較慢，通常需要4590分鐘，且釋放緩慢，增加低血糖的風險。因此，醫藥工作者一直在尋求可以避免自我注射同時胰島素又可以迅速吸收入體內的胰島素制劑和給藥途徑。現在國內外己經提出了各種可能的替代性胰島素給藥方式，包括腸溶口服、直腸內、透皮、肺部等給藥方法。盡管這些技術避免了皮下注射的不適，但它們也都受到了自身限制。直腸內給藥不方便不舒適，不易為患者接受。將胰島素制備成腸溶口服制劑最能為患者接受，但是胰島素為多肽藥物，對胃腸道各種蛋白酶非常敏感，并且胃腸道的粘膜緊密程度高，胰島素難于透過，且腸溶口服制劑胰島素的釋放時間難以確定，藥物可能會在不適當的時間釋放入血。透皮給藥同樣需要克服皮膚的障礙，因此生物利用度很低，成本較高。肺部給藥業已取得進展，2006年輝瑞公司的exubera肺部干粉吸入劑成功上市，盡管胰島素的吸收較迅速且避免了疼痛，但是其市場反映并未取得預期效果，因為其使用需要較高的技巧，并且還需要患者定期檢査肺生理情況。將胰島素經鼻給藥，可增加脂溶性的胰島素以霧化液體或粉末的形式釋放至鼻腔粘膜，經粘膜上皮豐富的毛細血管和淋巴管吸收，與皮下注射相比吸收和消除均更為迅速，與肺部吸入相比使用更為便利、安全性更好。但是，經鼻給藥仍然面臨難題。國內外在胰島素鼻腔給藥方面開展了大量的基礎研究工作，二十年前即有研究發現胰島素經鼻給藥可使得血糖下降，使人們對鼻腔給藥途徑寄予了很大期望。胰島素是大分子蛋白質藥物，親水性強，較難透過鼻粘膜的上皮細胞層，通常的辦法是加入吸收促進劑。但經進一步研究表明，鼻腔給藥存在的最大問題是吸收促進劑對鼻粘膜纖毛的毒性。如何減輕或消除藥物及其其添加劑的纖毛毒性，提高胰島素透膜吸收，是使胰島素經鼻給藥成功進入臨床應用的先決條件。日本株式會社DDS研究所2001年在中國申請的專利，其申請號為01801146.2，胰島素的經鼻吸入制劑，公開了以多孔球狀碳酸鈣作為載體的含胰島素制劑，其中多孔球狀碳酸鈣是柱狀或針狀微晶或者它們的平行連生結晶的集合體，碳酸鈣微粒在18-115nm，其比表面積不低于1.5m々g，胰島素以單層或多層的形式附載在其上。該專利存在的一個明顯缺陷是使用大量的碳酸鈣載體，容易對鼻粘膜產生刺激性。日本產業化研究株式會社2002年在中國申請專利，其申請號為02804546.7，胰島素的經鼻藥用組合物，該發明提供一種以具有特定粒子分布的結晶纖維素聚集體作為胰島素載體的經鼻用粒狀組合物，其中胰島素為未實施可溶化處理的粉末，且該結晶纖維素聚集體有卯％以上的粒子分布在1035(^m的粒徑范圍內；胰島素粉末與結晶纖維素聚集體的重量配比為1:1500,優選1:2~100，通過將藥物粉末和固體載體均勻混合進行制備而得。該專利存在的一個明顯缺陷是使用了大量的結晶纖維素，不溶性異物的加入容易對鼻粘膜產生刺激性。美國本特利藥品公司2004年在中國申請專利，其申請號為200480041300.9，用于胰島素治療的藥用組合物及方法，公開了用胰島素治療患者的組合物和方法，其組合了胰島素、滲透增強劑以及保持酸性pH的液體載體，其pH不超過4.5，通過鼻噴霧形式釋放。其中的滲透增強劑為CPE-215(環十五酸內酯)，該滲透增強劑在低溫時容易產生結晶，而為了保持胰島素的穩定性，該制劑需要低溫保存，因此還需要加入結晶抑制劑；此外，該滲透增強劑在包含胰島素的水相中乳化，因此選擇了HLB值714的表面活性劑，所得的油滴粒徑在0.120pm。因此，該專利存在的一個明顯缺陷是滲透增強劑對鼻黏膜可能有刺激性及毒性，且容易吸收進入體內可能導致不可預知的副作用。本發明人在先申請的中國專利申請號為200510028990.0，發明名稱為"一種胰島素鼻用粉霧劑及制備方法"以及申請號為200510028991.5，發明名稱為"一種胰島素經鼻給藥液體制劑"的中國專利的專利中，采用微乳技術制備了胰島素經鼻給藥的納米制劑，通過磷脂微乳提高了胰島素分子的親脂性，并使用了具有生物粘附性的材料延長藥液在鼻腔的滯留時間。但是，上述專利所制備的乳劑粒徑大多在lOOnm以上，而得到100nm以下的乳劑則必須使用大量的表面活性劑，非磷脂的表面活性劑(泊洛沙姆)與磷脂的比例高達3:15:1。現經實驗考察，發現以卵磷脂和泊洛沙姆作為乳化劑，由于兩者的HLB值相差較大(卵磷HLB為5-6,而泊洛沙姆HLB為25)，所得體系物理穩定性較差，盡管兩者具有良好的安全性，并廣泛地應用于脂肪乳劑的制備中，但所得乳劑的粒徑常大于100nm。因此，如何優化胰島素經鼻給藥制劑中的胰島素的含量、表面活性劑和其它助劑的選擇和含量，以期達到較為理想的治療效果和提高胰島素的吸收速度與程度、迅速起效并避免低血糖反應和降低對鼻黏膜的刺激及毒性，一直是本領域十分關注的課題。
發明內容本發明要解決的技術問題是提供一種胰島素經鼻給藥制劑，以克服現有技術存在的上述缺陷，滿足臨床治療的需要。本發明的技術構思是這樣的發明人經過大量的試驗，包括動物試驗發現對于一種含有活性成分胰島素、水為連續相、油脂為分散相的乳劑，俗稱水包油的乳劑(0/W)，胰島素為一兩性蛋白，溶解于水相，其二聚體的疏水內核與乳劑的油相之間存在吸附作用，而對于一個水包油的乳劑，其中的油相以近似圓球的油滴形態懸浮在水相中，胰島素的二聚體的疏水內核則吸附在油滴表面，如圖18所示。因此，申請人的認為，對于胰島素經鼻給藥制劑，應當充分考慮活性成分胰島素的用量與油滴表面積之間的配合關系，而片面的增加胰島素的用量，并不能提高治療效果，反而增加成本。本發明的試驗，也證明了胰島素降血糖作用與乳劑的含油量及油滴粒徑有關，而油滴的粒徑與乳化劑的選擇和用量有關，在一般情況下，乳化劑的用量越多，則形成的油滴粒徑越小，但是，制劑的不安全性也相應的增加，因此，應當綜合考慮上述的各個方面的因素，選擇合適的乳化劑及其用量。發明人通過蟾蜍上顎纖毛毒性試驗和溶血試驗對乳化劑用量進行篩選，發現2%為吐溫的安全濃度，在此濃度下吐溫與磷脂聯合應用能制備出粒徑小于100nm的乳劑，更6有利于促進胰島素的透粘膜吸收。經過實驗發現，此微乳體系具有良好的物理穩定性和粘膜安全性。大量的實驗數據顯示油脂和胰島素的量存在一定的比例關系；當體系中油滴的表面積與胰島素二聚體疏水核的表面積之比達1:11.5，胰島素經鼻腔吸收的降血糖效果最好，油相超過此比例，降糖效果并未增加，相反粘膜刺激性和纖毛毒性均增加。為此，申請人提出了如下的技術方案本發明的胰島素經鼻給藥制劑，為一種含有提高胰島素脂溶性的油脂和表面活性劑組成的納米乳劑，其特征在于胰島素的疏水核的表面積油滴的表面積=1:ii.5，油滴的平均粒徑為io200納米；油脂與水的體積比為油脂水=1:3195;油脂與乳化劑的體積重量比為lml:0.6l,2g;所說的乳化劑為卵磷脂和吐溫80的混合物，卵磷脂和吐溫80的重量份數比例為卵磷脂l份，吐溫800.100.35份。優選的，所說的乳劑包括如下配比的組分油月旨0.42.5ml，水696ml胰島素lg，乳化劑0.243.0g生物凝膠粘附劑0.02lg甘露醇05g，甘油02.5g，防腐劑0.001~0.05g，抗氧劑0.01~0.045g,使體系的pH為3.58.5的pH調節劑；優選的油滴的平均粒徑為40100納米；所說的油脂選自合成油脂如辛癸酸甘油酯或天然植物油脂如豆油、椰子油、茶油、花生油，動物油脂如魚油等；所說的生物凝膠粘附劑選自殼聚糖、海藻酸鹽、阿拉伯膠、羥丙基甲基纖維素、羥丙基纖維素或羧甲基纖維素鈉；所說的pH調節劑包括HCl、NaOH、有機酸、有機堿如醋酸、檸檬酸、氨基丁三醇、乙醇胺或氨基酸如甘氨酸、精氨酸等；優選的，還包括0.0010.05g的防腐劑，所說的防腐劑選自苯扎氯胺或尼泊金酯；優選的，還包括0.010.045g的維生素E;需要著重說明的是，本發明中，胰島素的用量是根據油滴的表面積確定的，為胰島素的疏水核的表面積油滴的表面積二l:11.5;所說的胰島素的疏水核的表面積為一個確定的值，根據文獻[ThePeotidesAnalysis,sythesis，Biology,1981,4:63]的記載，胰島素的疏水核表面積計為1.5nm2，lg胰島素分子所含的分子數為1.03xl0、則其二聚體的個數為5.15"019,總疏水核表面積為7.7xl019nm2，即，lg胰島素與油滴發生吸附作用的胰島素的疏水核的表面積為7.7><1019nm2;油滴的粒徑可采用文獻(鄭少輝，鄧意輝，動態光散射技術在靜脈注射亞微乳劑粒徑評價中的應用，中國藥劑學雜志，2005,3(3):126)報道的方法，采用Nicomp-380激光粒度測定儀進行測定；體系中，單個油滴的表面積可根據球體的面積計算公式計算，計算公式如下單個油滴的表面積S=47ir2=;^2;單個油滴的體積^=i;rr3=36因此，當體系中，總體積為V的油脂被分散為粒徑為d油滴時，其總的油滴的數量n=V/V1;而油滴總的表面積為nXS1;單位體積的油脂分散后其比表面積5="S=&=辱。本發明上述的技術方案中，胰島素與油脂的配比就是按照胰島素與油脂的表面積的之間的關系進行確定的，胰島素的疏水核的表面積與油滴的表面積的之間的關系為胰島素疏水核表面積油滴表面積=1:11.5;大量的動物試驗證明，在上述的條件和配比下，能夠獲得最佳的藥物治療效果。本發明胰島素經鼻給藥制劑的制備方法包括下列步驟-(1)將生物凝膠粘附劑用水或鹽酸溶解，獲得生物凝膠粘附劑與水或鹽酸的混合物；(2)將油脂和表面活性劑混合溶解，獲得油相，然后與總體積2550%的水混合，攪拌，得初乳，將初乳在乳勻機中，400-800bar壓力下均質210個循環，得到半透明至透明的微乳液，其中，油滴的粒徑為10200納米,優選40-100納米；(3)稱取處方量胰島素，加入步驟(2)中微乳液與步驟(1)的水凝膠、滴加l-6mol/L鹽酸或其他酸使胰島素溶解；(4)加入處方中其他組份，并用pH調節劑，調節步驟(4)溶液，使體系pH為3.58.5，最后加入余量的水，獲得產品；本發明的胰島素經鼻給藥制劑，可用于治療糖尿病疾病，可供鼻腔噴霧或滴鼻給藥，劑量一般為25-100IU,具體可根據病人的病情等因素，由醫師決定。本發明的技術效果在于本發明確立了胰島素的用量與油滴之間的關系，并選擇了合適的乳化劑，將胰島素制備成納米乳劑，獲得具有生物粘附性的納米乳劑。含藥組合物進入鼻腔后，納米大小的乳劑易于透過鼻黏膜的屏障，經鼻黏膜內豐富的毛細血管和淋巴管進入體內發揮療效，從而可顯著提高藥物的生物利用度，吸收迅速，而對鼻黏膜無刺激性；另外生物粘附劑使得含藥乳劑滯留時間延長，使藥物吸收和利用更為完全。圖l是本發明及對照胰島素制劑的透黏膜試驗結果圖。圖2溶血試驗結果。圖3家兔經鼻給藥胰島素溶液與胰島素納米乳劑后平均血糖曲線。圖4家兔經鼻給藥不同實施例胰島素納米乳劑后平均血糖曲線。圖5血糖曲線上面積與ins—油脂比關系。圖6Beagle犬經鼻給藥胰島素后平均血糖曲線。圖7800bar壓力制備微乳粒徑測定結果(平均粒徑45.2nm)。圖8600bar壓力制備微乳粒徑測定結果(平均粒徑60.5nm)。圖9400bar壓力制備微乳粒徑測定結果(平均粒徑95.1nm)。圖10空白微乳(實施例9)的粒徑測定電位測定結果(平均粒徑61.4nm)。圖ll胰島素納米乳劑(1:0.4)粒徑測定結果(平均粒徑66.1nm)。圖12胰島素納米乳劑(1:0.8)粒徑測定結果(平均粒徑66.3nm)。圖13胰島素納米乳劑(1:1.2)粒徑測定結果(平均粒徑67.0nm)。圖14空白微乳(實施例9)的zeta電位測定結果(一17.20mv)。圖15胰島素納米乳劑(l:0.8)的zeta電位測定結果(一10.14mv)。圖16胰島素納米乳劑(1:0.8)的zeta電位測定結果(一7.54mv)。圖17胰島素納米乳劑(l:1.2)的zeta電位測定結果(一6.38mv)。圖18為胰島素的二聚體的疏水內核則吸附在油滴表面時的示意圖。具體實施例方式下面用實施例來進一步說明本發明，但本發明并不受其限制。實施例1取殼聚糖75mg用lml0.1mol/l鹽酸溶解備用；取卵磷脂1.6g、辛癸酸甘油酯2.0ml、tween800.4g和維生素E40mg，6CTC溶解得到油相；將油相在6(TC下，倒入同溫的蒸餾水，攪拌，制得初乳，將初乳于高壓乳勻機下以800bar壓力循環6次，得到空白微乳60ml，油滴的平均粒徑測定為45.2nm，單個油滴的表面積為6.42X103nm2;lml空白乳中油滴總表面積為4.42X1018nm2;取胰島素3.0g和上述微乳混合，加入殼聚糖溶液，滴加3mo1/1HC1溶解胰島素；加入1.5g甘露醇，3.0g甘油，苯扎氯胺15mg，用0.1mol/lNaOH調節pH至4.0，水加至150ml，即獲得本發明的胰島素經鼻給藥制劑。實施例2取殼聚糖75mg用lml0.1mol/l鹽酸溶解備用；取卵磷脂1.6g、辛癸酸甘油酯2.0ml、tween800.4g和維生素E40mg，60'C溶解得到油相；將油相在6(TC下，倒入同溫的蒸餾水，攪拌，制得初乳，將初乳于高壓乳勻機下以600bar壓力循環6次，得到空白微乳60ml，粒徑測定為60.5納米，單個油滴的表面積為1.15X104nm2;lml空白乳中油滴總表面積為3.31X1018nm2;取胰島素3.0g和上述微乳混合，加入殼聚糖溶液，滴加3mol/lHC1溶解胰島素；加入1.5g甘露醇，3.0g甘油，苯扎氯胺15mg，用0.1mol/lNaOH調節pH至4.0，水加至150ml，即獲得本發明的胰島素經鼻給藥制劑。實施例3取殼聚糖75mg用lml0.1mol/l鹽酸溶解備用；取卵磷脂1.6g、辛癸酸甘油酯2.0ml、tween800.4g和維生素E40mg，60'C溶解得到油相；將油相在6(TC下，倒入同溫的蒸餾水，攪拌，制得初乳，將初乳于高壓乳勻機下以400bar壓力循環6次，得到空白微乳60ml，粒徑測定為95.1納米，單個油滴的表面積為2.84X104nm2;lml空白乳中油滴總表面積為2.10X1018nm2;取胰島素3.0g和上述微乳混合，加入殼聚糖溶液，滴加3mol/lHC1溶解胰島素；加入1.5g甘露醇，3.0g甘油，苯扎氯胺15mg，用0.1mol/lNaOH調節pH至4.0，水加至150ml，即獲得本發明的胰島素經鼻給藥制劑。實施例4取海藻酸鈉2g用20ml水溶解備用；取卵磷脂1.2g、精制豆油1.8ml、tween800.32g和維生素E30mg，60。C溶解得到油相；將油相在6(TC下，倒入同溫的蒸餾水，攪拌，制得初乳，將初乳于高壓乳勻機下以800bar壓力循環2次，得到空白微乳40ml，粒徑測定為59.6納米，單個油滴的表面積為U2X104nm2;lml空白乳中油滴總表面積為4.28X1018nm2。取胰島素2.0g和上述微乳混合，加入海藻酸鈉溶液，滴加lmol/lHCl溶解胰島素；加入10g甘露醇，尼泊金甲酯100mg，用0.1mol/lNaOH調節pH至7.4，水加至200ml，即獲得本發明的胰島素經鼻給藥制劑。實施例5取殼聚糖O.lg用5mlO.lmol/I鹽酸溶解備用；取卵磷脂2.7g、魚油2.5ml、tween800.3g和維生素E70mg，6(TC溶解得到油相；將油相在6CTC下，倒入同溫的蒸餾水，攪拌，制得初乳，將初乳于高壓乳勻機下以400bar壓力循環IO次，得到空白微乳50ml，粒徑測定為193.3納米，單個油滴的表面積為U7X105nm2;lml空白乳中油滴總表面積為1.55X1018nm2;取胰島素2.0g和上述微乳混合，加入殼聚糖溶液，滴加lmol/1檸檬酸溶解胰島素；加入lg甘露醇，尼泊金丙酯25mg，用甘氨酸調節pH至3.5，水加至lOOml，即獲得本發明的胰島素經鼻給藥制劑。實施例6取羥丙基纖維素5g用50ml水溶脹備用；取卵磷脂2.5g、辛癸酸甘油酯5.1ml、tween800.5g和維生素E60mg，60。C溶解得到油相；將油相在6(TC下，倒入同溫的蒸餾水，攪拌，制得初乳，將初乳于高壓乳勻機下以800bar壓力循環IO次，得到空白微乳120ml，粒徑測定為為39.9納米，單個油滴的表面積為5.0X103nm2;lml油滴總表面積為6.39X1018nm2;11取胰島素10.0g和上述微乳混合，加入羥丙基纖維素溶液，滴加6mo1/1HC1溶解胰島素；加入25g甘油，苯扎氯胺80mg，用氨基丁三醇調節pH至6.0，水加至800ml，即獲得本發明的胰島素經鼻給藥制劑。實施例7取羧甲基纖維素鈉0.5g用10ml水溶解備用；取卵磷脂1.8g、辛癸酸甘油酯2.0ml、tween800.6g和維生素E60mg以及，6(TC溶解得到油相；將油相在6(TC下，倒入同溫的蒸餾水，攪拌，制得初乳，將初乳于高壓乳勻機下以600bar壓力循環4次，得到空白微乳40ml，粒徑測定為55.2納米，單個油滴的表面積為9.57X103nm2;lml空白乳中油滴總表面積為5.43X1018nm2;取胰島素2.0g和上述微乳混合，加入羧甲基纖維素鈉溶液，滴加lmol/1HC1溶解胰島素；加入2g甘油，尼泊金甲酯26.4mg，尼泊金丙酯13.6mg，用O.lmol/1NaOH調節pH至8.5，水加至80ml，即獲得本發明的胰島素經鼻給藥制劑。實施例8取殼聚糖200mg用10mlO.lmol/1鹽酸溶解備用；取卵磷脂13.5g、茶油19.2ml、tween801.5g和維生素E450mg，6CTC溶解得到油相；將油相在6(TC下，倒入同溫的蒸餾水，攪拌，制得初乳，將初乳于高壓乳勻機下以600bar壓力循環6次，得到空白微乳75ml，粒徑測定99.4nm，單個油滴的表面積為3.10X104nm2;lml空白乳中油滴總表面積為1.54X1019nm2;取胰島素10.0g和上述微乳混合，加入殼聚糖溶液，滴加6mol/lHCl溶解胰島素；加入苯扎氯胺10mg，用O.lmol/1NaOH調節pH至5.0，水加至lOOml，即獲得本發明的胰島素經鼻給藥制劑。實施例9取殼聚糖200mg用10mlO.lmol/1鹽酸溶解備用；取卵磷脂5g、辛癸酸甘油酯lO.Oml、tween80lg和維生素E150mg，60'C溶解得到油相；將油相在6(TC下，倒入同溫的蒸餾水，攪拌，制得初乳，將初乳于高壓乳勻機下以600bar壓力循環10次，得到空白微乳60ml，粒徑測定61.4納米，單個油滴的表面積為1.18X104nm2;lml空白乳中油滴總表面積為1.63X1019nm2;取胰島素10.0g和上述微乳混合，加入殼聚糖溶液，滴加6mol/lHCl溶解胰島素；加入5g甘露醇，甘油lg，苯扎氯胺20mg，用乙醇胺調節pH至4.5，水加至200ml，即獲得本發明的胰島素經鼻給藥制劑。實施例10取羥丙基纖維素5g用50ml水溶脹備用；取卵磷脂2g、辛癸酸甘油酯4ml、tween800.4g和維生素E50mg，60。C溶解得到油相；將油相在6(TC下，倒入同溫的蒸餾水，攪拌，制得初乳，將初乳于高壓乳勻機下以800bar壓力循環IO次，得到空白微乳100ml，粒徑測定為為21.7納米，單個油滴的表面積為1.48X103nm2;lml油滴總表面積為UOX1018nm2;取胰島素10.0g和上述微乳混合，加入羥丙基纖維素溶液，滴加3mol/lHCl溶解胰島素；加入25g甘油，苯扎氯胺80mg，用甘氨酸調節pH至4.5，水加至800ml，即獲得本發明的胰島素經鼻給藥制劑。實施例11透膜實驗1、試驗方法取新鮮牛鼻黏膜，生理鹽水洗凈，剝離脂肪等組織，取牛鼻黏膜剪成適宜大小，固定在改裝Franz擴散池的供給室與接收室之間，黏膜外表面朝向供給室，在接收室中注入pH4.0的生理鹽水至滿，記錄加入液的體積。開啟磁力攪拌器和恒溫水浴，保持恒速攪拌，37'C恒溫，用移液管分別移取2ml胰島素溶液置于擴散室中，于各個時間點取樣0.3ml，并在接收室中補充新鮮pH4.0的生理鹽水0.3ml。將所取得樣品離心后用HPLC法測定胰島素透膜量。2、測定采用高效液相法測定。儀器型號SHIMADZUSCL-10AVP,SPD-10AVP，LC-10ADVP，SIL-10ADVP，CTO-10AS;色譜柱色譜柱Cl8250mmx4.6mm(5pm)(Dikma,Diamonsil);流動相0.2mol/L硫酸鹽緩沖溶液(取無水硫酸鈉28.4g，加水溶解后，加磷酸2.7ml、水800ml，用乙醇胺調節pH至2.3，加水至1000ml)-乙腈(74:26);流速1.0mL/min;紫外檢測波長214nm，柱溫40°C，進樣體積20(aL。3、試驗樣品配置樣品1:pH4.0胰島素溶液(l.Omg/ml)(配方胰島素O.lg，0.1mol/1鹽酸lg，0.1mol/1NaOH調節ph為4.0，lg甘露醇,水加至100ml)樣品2:pH4.0胰島素的納米乳劑(1.0mg/ml)(實施例2制劑，1%甘露醇稀釋得)；樣品3:pH4.0胰島素加表面活性劑溶液(l.Omg/ml)(配方胰島素O.lg，磷脂0.027g，吐溫800.007g,0.1mol/1鹽酸lg，0.1mol/1NaOH調節ph為4.0，lg甘露醇，水加至100ml);4、透膜試驗結果透膜試驗結果見圖l。由測定結果可見，對于同一種生物膜而言，本發明胰島素納米乳劑透黏膜能力明顯大于單純溶液和胰島素加表面活性劑溶液。由上述試驗結果提示本發明的胰島素經鼻給藥制劑透黏膜能力增強，生物利用度將獲得提高。實施例12鼻黏膜刺激性試驗(在體法)鼻黏膜纖毛毒性評價分組,每組各3只，組l:本發明胰島素納米乳劑(實施例6)，組2:生理鹽水，組3:1%普萘洛爾。將蟾蜍仰臥固定于蛙板上，用止血鉗使口腔張開，分別滴加0.21111上述溶液于黏膜處，放置0.5h后用手術剪分離上腭黏膜，取約3mmx3mm的黏膜，生理鹽水洗凈血塊及雜物，將其平鋪于載玻片上，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察黏膜纖毛的擺動情況，之后將載玻片置于加有少量蒸餾水飽和的層析缸中，密閉，置于室溫環境(25°C)中，此后每隔一定時間取出標本，置于顯微鏡下觀察，如纖毛繼續擺動則放回層析缸中，直至纖毛停止運動為止，記錄纖毛持續運動時間，見表l。實驗結果顯示生理鹽水組纖毛清晰完整，纖毛運動活躍，擺動的纖毛數量多，持續擺動時間為668±20min;給予1%普萘洛爾溶液后，觀察可見少量黏膜上皮脫落且纖毛運動停止。給予本發明胰島素納米乳劑后，纖毛較清晰，持續擺動時間為680i24min。結果可見，本發明的胰島素納米乳劑對鼻腔纖毛具有良好的相容性，不會對纖毛擺動造成損傷。表1纖毛持續擺動時間<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實施例13鼻黏膜剌激性試驗(離體法)鼻黏膜纖毛毒性評價分組,每組各3只，組l:本發明胰島素納米乳劑(實施例IO)，組2:生理鹽水，組3:1%普萘洛爾。將蟾蜍仰臥固定于蛙板上，用止血鉗使口腔張開，生理鹽水清洗粘膜后手術剪分離上腭黏膜，取約3mmx3mm的黏膜，生理鹽水洗凈血塊及雜物，將其平鋪于載玻片上，滴加上述試液，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察黏膜纖毛的擺動情況，之后將載玻片置于加有少量蒸餾水飽和的層析缸中，密閉，置于室溫環境(25°C)中，此后每隔一定時間取出標本，置于顯微鏡下觀察，如纖毛繼續擺動則放回層析缸中，直至纖毛停止運動為止，記錄纖毛持續運動時間，見表2。實驗結果顯示生理鹽水組纖毛清晰完整，纖毛運動活躍，擺動的纖毛數量多，持續擺動時間為676±30min;給予1%普萘洛爾溶液后，觀察可見少量黏膜上皮脫落且纖毛運動停止。給予本發明胰島素納米乳劑后，纖毛較清晰，持續擺動時間為662±20min。結果可見，本發明的胰島素納米乳劑對鼻腔纖毛具有良好的相容性，不會對纖毛擺動造成損傷。表2纖毛持續擺動時間<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實施例14溶血性試驗鼻粘膜組織受損的原因之一是藥物或輔料對細胞膜有破壞作用,因此通過考察藥物或輔料對生物膜的作用可間接評價鼻粘膜毒性。常用的天然生物膜是紅細胞膜,通過溶血實驗來考察。血細胞懸液的配制取兔血數毫升(約20ml)，放入含玻璃珠的三角燒瓶中振搖10分鐘，或用玻璃棒攪動血液，除去纖維蛋白原，使成脫纖血液。加入0.9%氯化鈉溶液約10倍量，搖勻，1200r/min離心15分鐘，除去上清液，沉淀的紅細胞再用0.9%氯化鈉溶液按上述方法洗滌3次，至上清液不顯紅色為止。將所得紅細胞用0.9%氯化鈉溶液配成2%的混懸液，供試驗用。受試物的制備-本發明胰島素納米乳劑(實施例5)，均用0.9%氯化鈉溶液1:3稀釋后作為供試品溶液。試驗方法取潔凈試管7只，進行編號，1-5號管為供試品管，6號管為陰性對照管，7號管為陽性對照管。按下表所示依次加入2%紅細胞懸液、0.9%氯化鈉溶液混勻后，立即置37。C士0.5。C的恒溫箱中進行溫育，開始每隔15分鐘觀察l次，1小時后，每隔l小時觀察l次，一般觀察3小時。按下列順序加入各種溶液試管編號12345672X紅細胞混懸液ml2.52.52.52.52.52.52.5生理鹽水ml2.02.12.22.32.42.5-蒸餾水ml2,5受試物ml0.50.40.30.20.1--結果觀察3h后取出各試管，于3000r/m下離心5min，觀察結果見圖2，試驗中的7號管(陽性對照)溶液呈澄明紅色，管底無細胞殘留，表明有溶血發生；6號紅細胞全部下沉，上清液體無色澄明，表明無溶血發生。l-5號樣品管與陰性管相比未見明顯血紅色，無溶血發生。結果判斷陰性對照管無溶血，陽性對照管有溶血發生，受試物管中的溶液在3小時內不發生溶血。可以看出，本發明的胰島素納米乳劑具有良好的生物膜相容性。實施例15動物藥效學試驗實驗動物和給藥方式家兔12只，雌雄各半，隨機分為兩組，體重2.5土0.2kg，分為組l:胰島素溶液劑；組2:本發明實施例8制備的胰島素經鼻給藥納米乳劑組。詞養7天后，開始實驗。實驗前夜禁食，只飲凈水。給藥劑量25IU/只分別于給藥前30、IO分鐘及給藥后O、5、15、30、45、60、75、90、120、180、240、300、360分鐘兔耳靜脈，用葡萄糖氧化酶測定法測定血清葡萄糖含量；測定結果見圖3。從圖3可以看出本發明的胰島素經鼻給藥納米乳劑經鼻給藥后，能夠有效促進胰島素透過鼻黏膜進入血液循環，發揮降血糖作用;而胰島素溶液劑，未見其降血糖作用，說明胰島素未能經鼻吸收。實施例16動物藥效學試驗實驗動物和給藥方式家兔18只，體重2.5士0.2kg，雌雄各半，隨機分為3組。飼養7天后，開始實驗。實驗前夜禁食，只飲凈水。組1給予實施例1所制得胰島素納米乳劑、組2給予實施例2所制得胰島素納米乳劑、組3給予實施例3所制得胰島素納米乳劑。給藥劑量25IU/只分別于給藥前及給藥后5、15、30、45、60、75、90、120、180、240、360分鐘兔耳靜脈，用葡萄糖氧化酶測定法測定血清葡萄糖含量，計算平均血糖，結果見圖4。結果表明，在處方相同的條件下，乳劑粒徑的大小對藥效具有明顯影響，粒徑越小，所具有的油滴表面積越大，降糖效果越好，說明根據乳劑粒徑或油脂用量與胰島素降糖效果相關的假設得到驗證。實施例17動物藥效學試驗藥液配置制備實施例4所制備的空白微乳，以胰島素與空白乳I:IO、1:15、1:18、1:25、l:30(g/ml)的比例制備胰島素納米乳，其余各組分均相同。實驗動物和給藥方式家兔15只，體重2.5士0.2kg，雌7雄8，隨機分為5組。詞養7天后，開始實驗。實驗前夜禁食，只飲凈水。分別給予上述所制得胰島素納米乳劑。給藥劑量25IU/只分別于給藥前及給藥后5、15、30、45、60、75、90、120、180、240、360分鐘兔耳靜脈，用葡萄糖氧化酶測定法測定血清葡萄糖含量，計算平均血糖，比較各制劑(空白微乳粒徑相近而油脂與胰島素比例不同)的血糖曲線上面積的關系，結果見圖5。結果表明，在相同粒徑(約60nm)時，當胰島素與空白乳比例在l:18(g/ml)以上即胰島素17與油脂的比例達到l:0.77(油滴與胰島素疏水面積比為l.O)以上時，其血糖曲線上面積基本保持不變，而低于該比值時降糖效果隨胰島素與油脂比例增大而增加。實施例18動物藥效學試驗實驗動物和給藥方式-Beagle犬6只，體重10.0±0.5kg，雌雄各半，隨機分為2組。飼養7天后，開始實驗。實驗前夜禁食，只飲凈水。組1給予實施例1所制得胰島素納米乳劑、組2給予實施例7所制得胰島素納米乳劑。給藥劑量25IU/只分別于給藥前及給藥后5、15、30、45、60、75、90、120、180、240、360分鐘兔耳靜脈，用葡萄糖氧化酶測定法測定血清葡萄糖含量，計算平均血糖，結果見圖6。由結果顯示，兩處方的降糖效果明顯，僅略微差別；盡管實施例1和7的胰島素與油脂用量比值分別為1:0.67和1:1(g/ml)，而其粒徑分別為45.2、6L4nm，油滴與胰島素疏水面積比分別為1.15:1和1.27:1再次驗證了胰島素與油脂用量比的關系當兩者總表面積比在11.5:1時，降糖效果也相當。實施例19空白微乳及胰島素納米乳劑的粒徑及zeta電位測定(1)分別取適量實施例l、2、3所制備的空白微乳，于NicompZPW380粒度測定儀進行粒徑測定，結果見圖7-9。(2)制備適量實施例9空白微乳，分別配置相同濃度的胰島素溶液，加入不同量的空白乳，換算后加入胰島素的重量與油脂的體積比例為1:0.4、1:0.8、1:1.2(g/ml),測定空白乳及配置的胰島素乳劑粒徑及zeta電位，結果見圖10-17。由粒徑測定結果發現，相同處方在不同壓力下制備的空白微乳粒徑不同，壓力越大，粒徑越小；胰島素加入到微乳中粒徑增加，表明兩者之間產生了相互作用，同時zeta電位的變化也可以揭示兩者之間的作用。權利要求1.胰島素經鼻給藥制劑，為一種含有提高胰島素脂溶性的油脂和表面活性劑組成的納米乳劑，其特征在于，胰島素的疏水核的表面積油滴的表面積＝1∶1～1.5，油滴的平均粒徑為10～200納米；油脂與水的體積比為油脂∶水＝1∶3～195；油脂與乳化劑的體積重量比為1ml∶0.6～1.2g；所說的乳化劑為卵磷脂和吐溫80的混合物，卵磷脂和吐溫80的重量份數比例為卵磷脂 1份，吐溫80 0.10～0.35份。2.根據權利要求1所述的胰島素經鼻給藥制劑，其特征在于，所說的乳劑包括如下配比的組分油脂0.42.5ml，水696ml胰島素lg，乳化劑0.243.0g生物凝膠粘附劑0.02lg甘露醇05g，甘油02.5g，防腐劑0.001~0.05g，抗氧劑0.01-0.045g,使體系的pH為3.58.5的pH調節劑；油滴的平均粒徑為40-100納米；所說的油脂選自合成油脂如辛癸酸甘油酯或天然植物油脂如豆油、椰子油、茶油、花生油，動物油脂。3.根據權利要求2所述的胰島素經鼻給藥制劑，其特征在于，所說的生物凝膠粘附劑選自殼聚糖、海藻酸鹽、阿拉伯膠、羥丙基甲基纖維素、羥丙基纖維素或羧甲基纖維素。4.根據權利要1所述的胰島素經鼻給藥制劑，其特征在于，所說的pH調節劑包括HC1、NaOH，有機酸、有機堿或氨基酸。5.根據權利要求4所述的胰島素經鼻給藥制劑，其特征在于，所說的有機堿選自氨基丁三醇或乙醇胺；所說的有機酸包括醋酸或檸檬酸；所說的氨基酸包括甘氨酸或精氨酸。6.根據權利要求1所述的胰島素經鼻給藥制劑，其特征在于，還包括0.001~0.05g的防腐劑。7.根據權利要求6所述的胰島素經鼻給藥制劑，其特征在于，所說的防腐劑選自苯扎氯胺或尼泊金酯。8.根據權利要求1所述的胰島素經鼻給藥制劑，其特征在于，還包括0.010.045g的維生素E。9.權利要求18任一項所述的胰島素經鼻給藥制劑的制備方法，包括下列步驟-(1)將生物凝膠粘附劑用水或鹽酸溶解，獲得生物凝膠粘附劑與水或鹽酸的混合物；(2)將油脂和表面活性劑混合溶解，獲得油相，然后與總體積2550%的水混合，攪拌，得初乳，將初乳在乳勻機中，400-800bar壓力下均質210個循環，得到半透明至透明的微乳液，其中，油滴的粒徑為10200納米；G)稱取處方量胰島素，加入步驟(2)中微乳液與步驟(1)的水凝膠、滴加l-6mol/L鹽酸或其他酸使胰島素溶解；(4)加入處方中其他組份，并用pH調節劑，調節步驟(4)溶液，使體系pH為3.58.5，最后加入余量的水，獲得產品；全文摘要本發明提供了一種胰島素經鼻給藥制劑，胰島素的疏水核的表面積∶油滴的表面積＝1∶1～1.5，油滴的粒徑為10～200納米；油脂與水的體積比為油脂∶水＝1∶3～195；油脂與乳化劑的體積重量比為1ml∶0.6～1.2g；所說的乳化劑為卵磷脂和吐溫80的混合物，卵磷脂和吐溫80的重量份數比例為卵磷脂1份，吐溫800.10～0.35份。本發明的制劑，含藥組合物的乳劑易于透過鼻黏膜的屏障，可顯著提高藥物的生物利用度，藥物吸收和利用完全，且對鼻黏膜無刺激，具有良好的安全性。文檔編號A61K38/28GK101422431SQ20071017362公開日2009年5月6日申請日期2007年12月28日優先權日2007年12月28日發明者方金,聰聞,雷伯開申請人:上海醫藥工業研究院