一種泌尿生殖系統疾病的治療系統的制作方法

專利名稱：一種泌尿生殖系統疾病的治療系統的制作方法
技術領域：
本發明用于泌尿生殖系統疾病的治療。與本發明相關的背景技術泌尿生殖系統疾病通常累及男女兩性，包括泌尿系統和生殖系 統的感染和/或炎癥。例如，根據美國國家少兒健康和發育研究所 (NICHD)的統計，"大多數女性一生中至少患過一種類型的陰道 炎。"《陰道炎》(Vaginitis),發表于《美國國家兒少健康和發育研 究,斤-在線刊物》(iVart'owa/ /"s份wte o/ C/w7<af //ea/A owd //w/waw Deve/opwe/i^Pi/W/cariww 2000年1月 12日1務定，<http:〃www.nichd.nih.gov/publications/pubs/vag 1 .html> )。 導致陰道 炎的原因包括從細菌、真菌或病毒感染到乳液、噴霧或者貼身衣物 所含的化學物質的刺激。同樣地，對于有細菌和真菌感染的女性， 這些感染因素經常來自肛門區，從此處經過會陰到達陰道或尿道。常見的一類陰道炎是念珠菌或酵母菌感染，主要由白色念珠菌 感染引起。念珠菌屬于人體正常菌群，存在于皮膚、口腔和消化道(Robbins，《疾病的病理學基礎》第五版(/wrf/zo/og/c 5必& o/ 2Xyeose 5沐Saunders公司，費城(1994) p.354 )，女性陰道也 可有少量存在。它們最適合的生長環境是諸如陰道或口腔的溫暖潮 濕環境.念珠菌通常不致病，但當環境改變時，例如女性絕經后、 懷孕期、或應激時發生體內激素水平的改變，會過度繁殖造成酵母 菌感染。此情況也可見于免疫抑制或身體機能受損的個體，如接受 化療、服用免疫抑制劑的病人，或艾滋病患者。目前對于念珠菌感染的治療包括非處方藥物，其活性成分如布 康唑硝酸鹽(Femstat )、克霉唑(Gyne-Lotrimh^及其它)、咪康唑 (1^01^1&1@及其它)和漆康唑(Vagistat )。這些藥物作為陰道感染 的局部用藥，可以裂解念珠菌的細胞壁.其它類似的治療包括處方 藥物，其活性成分來自與氟康唑(Diflucan )、三康唑(Terazol ) 和酮康唾(Nizoral )等同一系列。雖然通常的觀點認為陰道炎與念珠菌有關，但據NICHD的調 查(《陰道炎》(^g/"/fe))，實際上細菌性陰道炎是育齡婦女最常 見的陰道感染疾病。陰道內的細菌過度繁殖會導致與念珠菌性陰道 炎相似的細菌性陰道炎，其治療藥物不同。另一方面，男性陰莖也可以感染念珠菌，累及陰莖頭和包皮。 陰莖頭包皮炎是陰莖頭和包皮的非特異性感染，由多種^l生物引 起，包括真菌(如念珠菌)和化膿性細菌(如葡萄球菌)(Robbins， 《疾病的病理學基礎》第五版(o/D&eose 5rt e^O ., Saunders公司，費城(1994 ) p.1008 )。葡萄球菌為革蘭氏染色陽性細菌，通常存在于人體的皮膚和其 它粘膜。特別值得一提的是金黃色葡萄球菌，為毒性致病源，可以 引起皮膚損傷、心內膜炎、呼吸系統感染、食物中毒、甚至中毒性 休克綜合征等多種病癥。對于采用高吸收性月經棉條的女性而言， 金黃色葡萄球菌可以在陰道內形成菌落，并分泌一種稱為中毒性休克綜合征毒素(TSST-1 )的毒素。據FDA的統計，目前報導的大 約半數中毒性休克綜合征病例與月經期棉條關，多為年輕女性(《月 經棉條與石棉、二惡英以及中毒性休克綜合征》(rampo似 爿Ae對os, Z)/ojc/",在7b:ac 5/wc矢)， FDA i殳備與放射健康中 心(July 23,1999 ) ， <http:y7www.fda.gov/cdrh/ocd/tamponsabs.html> )。金黃色葡萄球菌感染一般用曱氧西林(methicillin)治療。此藥 雖然很有效，但金黃色葡萄球菌的一些菌抹已經產生抗藥性，只有 少數抗生素能有效治療耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)。常 用于治療MRSA的抗生素之一是萬古霉素(vancomycin),但是， 現已發現對萬古霉素敏感性下降的金黃色葡萄球菌菌株(Khuishid， M.A.等，《對萬古霉素敏感性下降的金黃色葡萄球菌》(Staphylococcus aureus with Reduced susceptibility to Vancomycin )， 發表于伊利諾斯1999《發病率與死亡率周報》(MoAW0; "wd M)W鄉 股e詠 鄉ow)， 48(51): 1165-1167(2000 ) ，<http:〃www.cdc.gov/epo/mmwr/preview/mmwrhtml/mm485 lal.htm>)。抗藥性菌抹的出現使應用其他方法用于治療細菌感染成 為必要。除真菌和細菌感染外，病毒性陰道炎也比較常見。此類感染大 多通過性交傳播，包括單純皰療病毒(HSV)或人類乳頭狀病毒(HPV)引起的感染。例如，HSV病毒，在生殖系統的入口處復制， 也感染支配生殖器的神經。為了躲避機體免疫系統，HSV病毒潛伏 在這些神經元中，在某些環境條件下活化，如應激、免疫抑制、放 射或病毒感染等。目前治療HSV感染的藥物包括阿昔洛韋(acyclovir )、法昔洛韋(famciclovir )、或4戈昔洛韋(valacyclovir) 等。對于泌尿系統，根據美國醫藥協會的調查數據，泌尿道感染 (UTIs)是促使就醫的最常見疾患之一 (《女性健康》一《尿道感染治療的患者才旨導 )，《在線《建康4言息-AMA #:康透#見》 1998年10月30日更新，<http:〃www. ama-assn. org/insight/h—focus/ wom一hlthAiti/uti. html>。此類感染性疾患主要是由埃希氏大腸桿菌(E.coli.)引起，但念珠菌和葡萄球菌也有參與。同樣地，這些感 染始于尿道，向膀胱發展引起膀胱炎。最后，病菌可沿輸尿管上行 至雙腎，導致腎盂腎炎。男性和女性均可感染。既然泌尿-生殖系統疾病不局限于單一病因，那么目前的治療 就需要針對特定病因采用不同的藥物。當然，要先確定病因。檢測 病源需要時間，但更重要的是對女性要進行婦科檢查以確定是否有 特異感染因素存在。隨著抗生素和其它藥物應用的增加，耐甲氧西林金黃色葡萄球 菌這類的微生物就越容易對目前所用藥物產生抗藥性。這樣，就持 續需要新的廣諳抗菌藥物。發明簡述本發明用于治療泌尿生殖系統疾病，它的一個方面涉及的由單 一或多種肽組成的用于泌尿生殖系統疾病的治療體系，其中多肽的 氨基酸序列有KPV (序列號1號)，MEHFRWG (序列號2號)， HFRWGK (序列號3號)，SYSMEHFRWGLPV (序列號4號)。單 個或多個多肽也可以通過上述氨基酸序列形成二聚體。泌尿生殖系 統疾病包括感染、炎癥，或者二者兼有。在本發明的一個優選實施 例中，泌尿-生殖系統疾病包括陰道、外陰、尿道、陰莖和/或直腸 的感染和/或炎癥。在另一個優選實施例中，單一或多種多肽溶于載 體內。在第三個優選實例中， 一種或多種多肽與棉條結合，以避免 中毒性休克綜合征。在第四個優選實施例中， 一種或多種多肽與避 孕工具相結合，以防止性傳播疾病或感染。在第五個實施例中，一種或多種多肽與栓劑結合，以便于插入陰道或肛門。在本發明的第 六個實施例中， 一種或多種多肽溶于液體載體中，以用于陰道灌注。附困簡要描述

圖1: ot-MSH和/或其衍生物對金黃色葡萄球菌生長的抑制效應。圖2: a-MSH和/或其衍生物對尿激酶(UK)誘導的金黃色葡 萄球菌生長的影響。圖3: ot -MSH和/或其衍生物對白色念珠菌(C albicans )生長 的抑制效應。圖4: oc-MSH和/或其衍生物與氟康唑抗真菌活性的比較。圖5A-5D: ot-MSH和/或其衍生物對白色念珠菌芽管形成的 4中制效應。圖6: a-MSH和/或其衍生物抗念珠菌的強化中性粒細胞殺傷 力的效應。圖7、 8、 9: a-MSH和/或其衍生物抑制白色念珠菌生長的機制。圖10-13: a-MSH和/或其衍生物對慢性感染細胞內病毒復制 和表達的抑制效應。圖14: a-MSH和/或其衍生物抑制病毒復制、表達和活化的機制。圖15: oc-MSH和/或其衍生物對急性感染細胞內病毒復制和表 達的抑制效應。圖16:用于本發明一方面的一種KPV 二聚體形式的4匕學結構 示例.發明詳述以下所引用的文獻在此作為參考文獻。本發明是關于采用oc-黑素細胞刺激素(a-MSH)和/或其衍生物治療泌尿生殖系統疾病 的一種方法和系統。ct-MSH是經典的由13個氨基酸組成的肽(序 列號4號)，由較大的前體分子——前黑阿皮素原經翻譯后修飾產 生。它與同是來自前黑阿皮素原的促腎上腺皮質激素(ACTH)的 1 — 13氨基酸序列相同。許多種細胞均可分泌a-MSH，包括垂體細 胞、單核細胞、黑素細胞和角化細胞。oc-MSH可見于大鼠皮膚、 人體表皮以及正常和垂體切除術大鼠消化道的粘膜屏障(可參閱 Eberie，A.N.，《促黑激素》(rAe Afe/a"c^o/ / >w )，瑞士巴塞爾Karger (1998 );Lipton， J.m.等，《ot-MSH神經免疫調質的抗炎影響》-MSTn，《今日免疫學》(//w附m"o/. 7b^y) 18,140-145 ( 1997 ); Thody， A丄等，《ct-MSH的免疫反應性，在正常和垂體切除大鼠消 4b道的分布》(7>w/ w"oreflC/ve "-il^fe/a"ocj^e 5W附m/a"wg i/o/vnowe,i^/ o; ;^je"o附/zec 及ato )，《生命科學》(丄z/e. Sc/. ) 18， 2127-2132 (1981 ))。現已知道oc-MSH及其衍生物具有很強的解熱和抗炎特性，而 且毒性極低。它可以降低宿主細胞的離體前炎癥介質的產生，并且 可以降低動物炎癥才莫型的局部和全身反應。例如，oc-MSH的核心 序列(4-10)(序列號2號)具有學習和記憶行為效應，但解熱和 抗炎活性很低。相反，解熱和抗炎活性的活化信息序列位于oc-MSH的C-末端M酸序列，即賴氨酸 一 脯氨酸-纈氨酸("Lys-Pro-Val " 或"KPV")(序列號1號)。此三肽在體和離體情況下與母體分子 有相同的活性。a-MSH和/或其衍生物的抗炎活性在下述兩項專利 有闡述，并包括在所列的參考中美國專利第5，028，592號，1991 年7月2曰提交于Lipton， J.M.，題為《Lys Pro Val解熱和抗炎成分 及其4吏用方'法》(^wrt^)re"cy4w".-/^/7a/w <2fOA7 Z>w iVo CowpowY/ow flr"i/Afe^ic^ o/Ose);美國專利第5,157,023號，1992 年10月20日提交于Lipton， J.M.，題為《Lys Pro Val解熱和抗炎成分 及其4吏用方'法》(y4w";p)Te"c aw/ v4"H" i/7a/w附fl^oA7丄ys尸ro Co附po礎o附朋d Ms^oc/ o/ L/ie )。(參閱Catania A.等，《ct -MSH 對宿主機體反應的調節》("-Afe/朋ocyfe W附w/ariwg //o;vno"e z" fAe JWb^m/fl"ort o/ i/oW / eacrio/w)，《內分泌、綜述》(endocr. Rev.) 14,564-576 ( 1993); Lipton， J. 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B. 等，《a-MSH (11-13) (lys-pro-val)對兔發熱的作用》(o/物質》5,815-817 ( 1984); Hiltz M E.等，《神經肽a-MSH COOH 末端片斷的抗炎活'性》(爿"f"7 /7"附w"too; o/ a COOWe加z'"fl/ Firagffie加o/決e Wewro; e/7"cfe a-A/S//)， FASEB雜志3,2282-2284 (1989 )。除了抗炎和解熱功能外，本發明的另一方面涉及a-MSH和/或 其衍生物的抗孩殳生物和抗感染活性。如下所述，ot-MSH和/或其衍 生物有重要的抗感染用途，包括如下的應用降低微生物生存力， 降低酵母菌長芽，在不損害中性粒細胞對微生物的殺傷能力的情況 下殺傷孩t生物，治療與^t生物感染有關的炎癥而不降低省史生物的殺 傷力，增加微生物細胞內cAMP的積累，抑制病毒性致病源的復制 與表達。在本發明的首選實施例中，這些抗微生物或抗感染活性最主要 與C-末端^^酸序列-KPV有關。此三肽與a-MSH及其書f生物在 很大濃度范圍內均有效，包括通常存在于人體漿液的皮摩爾濃度。正如在技術背景部分中所討論的，泌尿生殖系統疾病并不局限 于單一病因。從細菌、真菌到病毒在內的多種微生物和感染因素可 以單獨或聯合引起多種病癥，包括陰道炎、外陰炎、尿道炎、陰莖 頭包皮炎、念珠菌病、行傳播疾病以及中毒性休克綜合征。a-MSH 和/或其《汙生物可局部用于上述疾病狀態的感染和/或炎癥部位以達 到治療目的，可利用現有技術的施藥方法。例如，ot-MSH及其衍 生物可以溶于一些溶液中，諸如磷酸鹽緩沖液、透明質酸、甲基纖 維素、羧曱基纖維素或乙醇。還可以用一般的載體，如油骨、油脂、 膠體、可溶性彈丸、氣溶膠噴霧、栓劑、灌注所用液體溶劑或者具 吸收性的物質，攜帶ot-MSH和/或其4汁生物作為活性成分治療泌尿 生殖系統疾病。這些載體可用敷料器施用于感染或炎癥部位，敷料 器可以是注射器或類注射器式的器具、繃帶、導管、帶活塞的管子、涂藥用抹刀或其它類型的平面敷料器、避孕套、海綿、棉簽、或手 指.更明確地說，本發明的一個優選實施例是將ot -MSH和/或其衍 生物溶于以液體基底的栽體，然后將溶有oc-MSH和/或其衍生物的 栽體儲存于密封加壓箱內。打開釋放閥門或通過其它方式將栽體從 密封加壓箱內釋放時，會形成氣溶膠泡沫并被裝進注射器和注射器 類的器具。接著，注射器部分插入陰道，其內容物也就釋放入陰道 腔內。注射器或注射器類的器具及其開口也可以有不同的大小、形 狀和長度，以插入不同的泌尿生殖區，如尿道或肛門，本發明的另 一個優選實施例為包含栽體的栓劑。此載體如膠體 或甘油在常溫下為固體或半固體，但是插入陰道或肛門后在體溫下 便融化。載體融化后，攜帶所溶的ct-MSH和/或其衍生物至泌尿生 殖系統疾病的發病部位。我們采用油脂、油奮、膠體、噴霧、泡沫材料或止痛香骨等形 式將a-MSH和/或其衍生物涂于外陰、陰莖頭和陰莖包皮等外生殖 器部分。其組分為本技術領域所熟知。在本發明的另一方面，還可以在棉條的生產加工過程中用cx -MSH和/或其衍生物進行處理，這樣棉條中存在ot -MSH和/或其衍 生物，可以抑制分泌中毒性休克綜合征(TSST-1 )的微生物的生長， 如金黃色葡萄球菌，此種棉條的加工處理技術為本領域現有技術所 熟知。采用a-MSH和/或其衍生物處理的棉條吸收性材料進行治 療， 一種方法是將棉條的吸收性材料浸泡于含有a -MSH和/或其衍 生物的溶液，然后予以干燥。可供選擇的另一種方法，是將a-MSH 以干燥4分末形式噴灑到棉條的吸收性材料上。在本發明的另 一方面，a -MSH和/或其衍生物可通過避孕工具 轉運至感染部位，這些避孕工具包括避孕套、隔膜、海綿或其它用于防止懷孕或性傳播疾病的屏障型工具.ot-MSH和/或其衍生物可溶于避孕套所用的潤滑劑以及與隔膜共同使用的膠質或泡沫材料， 或者溶于與避孕套、隔膜或海綿共用的任何類型的殺精子溶液.在本發明的另一方面，a-MSH和/或其f汙生物可溶于灌注用的 液體。這些液體可以通過灌注被轉運至陰道以治療感染和/或炎癥。下述實施例闡明了 a-MSH和/或其^t生物抗感染的效力及其應 用。實施例中所用的微生物學、分子生物學以及細胞培養的方法沒 有在文中詳細說明，但在科研文獻中有大量的報導。本領域技術人 員熟知這些方法。下述實施例中所用的肽類包括ot-MSH (1-13)(序列號4 號)、(4-10)(序列號002號)、(6-13)(序列號003號)、和(ll - 13)(序列號1號)，均有乙酰化的N末端和酰胺化的C末端，以 及促腎上腺皮質激素ACTH ( 1 - 39)和(18 - 39) ( CLIP )。這些 肽類由固相肽合成方法制備，經保留相的高效液相色普法純化。部 分實施例還包括氨基酸序列CKPV (序列號8號)的二聚體(KPV 二聚體)，此二聚體同樣也有乙?；腘末端和酰胺化的C末端。 圖16顯示了 KPV二聚體的化學結構。在上述任意一種多肽的N末 端加半胱氨酸，并4吏兩個多肽的半胱氨酸形成二石危鍵，即可得到二 聚體，同源二聚體和異源二聚體均可由此方法獲得。下述實施例中所闡述的統計學意義采用方差的單因素分析和斯 氏t檢驗。概率大于0.05被認為是有顯著性差異的。實施例I本實施例目的在于闡明ot-MSH和/或其衍生物的抗孩i生物特 性，這里選取金黃色葡萄球菌(Stop/^/ococcM^ )為例。金黃色葡萄球菌培養物(ATCC 29213 )由Ospedale Maggiore di Milano微生物學系提供。金黃色葡萄球菌(于Hank平衡鹽溶液中 lxloV毫升)在ot-MSH (1-13)(序列號4號)、a-MSH (11-13)(序列號1號)或KPV二聚體存在或缺如的情況下，37C培養 2小時，肽的濃度為10_15-10_4M。隨后細胞在冷蒸餾水中沖洗， 并用HBSS稀釋至100個生物體/毫升。將一微升的等分試樣涂于血 漿瓊脂板，37匸培養24小時。然后根據所形成的菌落評估微生物 的生存力。另一實驗中是在細菌濃度為lOVlOO毫升的培養液中加 入不同的肽段和500單位的尿激酶(金黃色葡萄球菌的生長促進 劑)，并且在37*€水浴中振蕩培養4小時.圖l表明a-MSH (1-13)(序列號4號)、cx-MSH (11-13) (序列號1號)和KPV二聚體均抑制金黃色葡萄球菌菌落的形成。 此抑制效應在很大濃度范圍內均可發生，并在10_12 - 1(T4M的濃度 范圍內有顯著性差異(p>0.01)。圖2說明了濃度為10_6摩爾/升的 oc-MSH (1-13)(序列號4號)和oc-MSH (11-13)(序列號1 號)明顯抑制尿激酶的生長促進作用。這樣，a-MSH或其衍生物 可以抑制金黃色葡萄球菌的生長，此細菌會引起中毒性休克綜合 癥，該病征與月經棉條使用、陰道炎、泌尿道感染、以及陰莖頭包 皮炎有關。實施例n本實施例的目的在于闡明a-MSH和/或其4汙生物的抗真菌特 性，這里選取的實驗菌抹是白色念珠菌(Om^Wa a/6!'cam )。白色念珠菌的臨床隔離林由Ospedale Maggiore di Milano微生 物學系提供，白色念珠菌的培養在沙氏瓊脂斜面板上進行，并周期 性地轉移到沙氏瓊脂板上，28'C培養48小時.為了制備靜止期酵 母菌，從瓊脂板上杏t取菌落，將其轉移到30毫升沙氏葡糖液體培 養基中，32C培養72小時。將所得細胞以lOOOxg離心IO分鐘， 用蒸餾水沖洗沉積細胞兩次.然后計數細胞個數，并懸浮于Hank 平衡鹽溶液(HBSS)中至需要的濃度。通過0.01%的甲基藍外排 實驗，以此確定細菌的生存力.結果顯示其生存能力大于98%,在HBSS中密度為1 x 106/毫升時，這些真菌在oc-MSH( 1 - 13 ) (序列號4號)、oc-MSH (11-13)(序列號1號)或KPV二聚體 存在或缺如的情況下，37C培養2小時，肽的濃度為10_ 15 - IO"M。 隨后用冷蒸餾水沖洗細胞，并用HBSS稀釋至100個生物體/毫升。 將一毫升的等分樣品涂于血漿瓊脂板上，37匸培養48小時。微生 物的生存力才艮據所形成的菌落估計。圖3表明a-MSH (1-13)(序列號4號)、oc-MSH (11-13) (序列號1號)和KPV二聚體在10_12-10—"M濃度范圍內均抑制 白色念珠菌菌落形成的能力(與對照相比pO.Ol)。此結果說明， a-MSH或其衍生物能夠抑制白色念珠菌的生長，此真菌是已知導 致念珠菌病、陰道炎、尿道炎和陰莖頭包皮炎的因素。實施例邁本實施例的目的在于比較a-MSH和/或其衍生物與氟康唑 (fluconazole)的抗菌活性，后者是已被承認的抗真菌藥物。檢測oc-MSH(l-13)(序列號4號)、(4-10)(序列號2號)、 (6-13)(序列號3號)、(11-13)(序列號1號)和ACTH (1-39 )、 ( 18 - 39 )以及氟康唑在10 —6 - 10—4M濃度下的抗白色念珠菌的能力，方法同實施例n。圖4表明，與氟康唑相比，a-MSH(ll-13)(序列號l號)、(4-10)(序列號2號)、(6-13)(序列號3號)和(1-13)(序列號4號)抗白色念珠菌是非常有效的，其抑 制活性與等摩爾濃度的氟康唑是類似的.相比之下，具有行為效應^f旦極少抗炎活性的核心cx-MSH序列(4-10)(序列號2號)產生了近50 %的對菌落形成單位抑制效應。雖然此抑制效應具有顯著性 (與對照相比p<0.01 )，但是明顯弱于含有KPV信號序列的oc -MSH片斷，這些KPV信號序列包括oc-MSH(6-13)(序列號3號)、(11 -13)(序列號1號)(pO.Ol)，或者母體分子ot-MSH (1-13) (p<0.05)。圖4也表明ACTH (1-39)及其片斷(18-39)不能降低白色念珠菌的生存力。甚至在IO"M濃度下(圖中未顯示)，ACTH肽段也同樣無效。由此本實施例i兌明oc-MSH或其書f生物在抑制白色念珠菌生長 方面與氟康唑同樣有效。實施例IV本實施例的目的在于闡明oc-MSH及其衍生物對白色念珠菌出 芽或芽管形成的抑制作用。芽管形成是白色念珠菌感染發病^L理的 重要方面，包括粘附于宿主上皮和內皮細胞的過程，從橢圓形的芽 生孢子到各種絲狀體的形態轉變，如芽管、假菌絲、菌絲。(Gow， N.A.,《白色念珠菌芽管的生長》(Gwm r"6e o/ Ca"力c/"a/6/ca似)，《當4戈醫學真菌話題》(Curr. Topics Med. Myco.) 8，43-55 (1997))。蒸餾水沖洗培養所得的靜止期白色念珠菌兩次，然后將菌體懸 浮于HBSS中，密度為2x 106/毫升。于此菌液中加入10%的滅活 馬血清(由英國Paisley GIBCO/BRL提供)，37匸振蕩培養45分鐘， 可以誘導白色念珠菌菌絲的生長。HBSS沖洗菌體兩次以去除馬血 清，然后在濃度為10—6M的ct-MSH (1-13)(序列號4號)、(6-13)(序列號3號)或(11-13)(序列號l號)存在的條件下， 37X:繼續培養60分鐘，并不斷振蕩。采用血細胞計數器在光學顯 微鏡下計算出絲狀菌體的百分比。此實驗以重復三次，至少計數了 200個細胞。采用裝配在Axioskop Zeiss顯微鏡上的MC100相機拍 攝顯微照片.圖5A至5D表明cc-MSH(l-13)(序列號4號)或(11-13) (序列號1號)可以抑制由馬血清誘導的白色念珠菌芽管形成。oc -MSH (1 - 13 )(序列號4號)使絲狀菌體數目降低28 - 32% , a -MSH (11-13)(序列號1號)導致絲狀菌體數目降低54-58%。 雖然圖中未顯示，a-MSH (6-13)(序列號3號)同樣可以引起 絲狀菌體數目降低近50 % 。由此說明oc -MSH或其書1"生物通過抑制 芽管形成可以抑制念珠菌發病機理的一種模式。實施例V對病原體殺傷力的降低是感染期間應用皮質類固醇和其它非甾 體類消炎藥物治療的負面作用(Stevens, D丄.，《非甾體類消炎藥物 (NSAIDs)是否能促進細菌性感染發展為中毒性休克綜合征》尸rogrew/ow o/ 5flc&Wa/ /w々c"o朋fo 7b;)ac S7zoc Syw^ome )，《'降床 感染'性疾病》(Clin.Infect.Dis.) 21,977 — 80 ( 1997 ); Capsoni， F.等， 《皮質類固醇對中性粒細胞功能的影響抑制抗體依賴的細胞介導 的細月包毒'性(ADCC )》(^fe" o/ CorricoWeWo必ow iVew^pp/n'/C^otoxzc/ ^Z)a^ ),《免疫藥理學雜志》( / T)wmmo/ /w^waco/.) 5,217-30 ( 1983 ))。本實施例闡明a-MSH和/或其衍生物抑制感染 源的生長，而且不降低中性粒細胞抗感染的能力。本實施例進一步 表明oc-MSH和/或其衫f生物確實可以增強中性粒細胞殺傷感染源 的能力。來自健康志愿者的靜脈血(20毫升)肝素抗凝處理后，加入右 旋糖苷沉淀劑并采用Ficoll-Hypaque (購于美國密蘇里州圣路易斯 的Sigma化學制劑公司)離心機離心分離中性粒細胞，4氐滲休克下 紅細胞溶解，中性粒細胞則至少占細胞懸浮液的97%。由胎盤蘭排 除法得到的細胞生存力大于98%.中性粒細胞再懸浮于HBSS中， 以用于實驗。將白色念珠菌(1 x 106 )與AB型血清置于37X:振蕩水浴中調理 30分鐘。隨后，在單純培養基上或含有濃度為l(T15 - 1(T4M的a -MSH (1-13)(序列號4號)或ot-MSH (11-13)(序列號1號)培養 基上與中性粒細胞一起培養，于振蕩水浴中37'C培養2小時。2小 時后，將培養管置于冰上以中斷生長，沖洗細胞外生物體兩次，并 4'C離心(1000xg),于懸浮液中加入2.5%的脫氧膽酸鈉溶液，振 蕩試管5分鐘。然后加入冷蒸餾水得到密度為106個細胞/毫升的菌 液，再在HBSS中按1/100地比例依次稀釋兩次，從而得到密度為 100個細胞/毫升的菌液。從此菌液中取一毫升的等分樣品涂于血瓊 脂板，37X:培養48小時。48小時后選取三分之一計數菌落形成單 位，并采用五個不同個體來源的血漿重復計數。圖6表明a-MSH (1-13)(序列號4號)和(11-13)(序列 號1號)在10M2 - 10"M濃度范圍內(pO.Ol)確實能夠增強中性 粒細胞對白色念珠菌的殺傷力，同時圖6表明它們在很大的濃度范 圍內都可以促進中性粒細胞的殺傷力，即使是在相當于人血漿oc -MSH濃度的皮摩爾濃度條件下。由此本實施例i兌明a-MSH或其衍生物可以同時抗感染和炎 癥，此特性也適用于念珠菌病、陰道炎、尿道炎、陰莖頭包皮炎或 痔瘡。本實施例提示oc-MSH和/或其彩于生物的抗微生物特性的一般細 胞機制，以及抗真菌特性的特殊機制。
經甲苯/乙醇滲透作用的白色念珠菌(106/毫升)，在10_6M濃 度的a-MSH (1-13)(序列號4號)、(11-13)(序列號1號)或 毛喉碎(forskolin)(已知能夠增加細胞內cAMP )存在或缺失的條 件下，37X:下振蕩培養.三分鐘后加入用水冷卻的乙醇以中止反應。 cAMP 7jc平由市售酶免疫試劑盒(購于英國Amersham )測定兩次， 在測定之前根據產品說明通過液相方法對反應體系進行抽提。在另 一個相關實驗中，白色念珠菌暴露于濃度為25、 50和lxi0-SM的 雙脫氧腺苷(ddAdo， Sigma) 2小時，再與ot-MSH或其衍生物作 用2小時。雙脫氧腺苷是蛋白抑制劑，抑制腺苷酸環化酶。采用與 實施例II相同的方法測定毛喉辟和雙脫氧腺苷對白色念珠菌菌落 形成的影響。
圖7表明ot-MSH (1-13)(序列號4號)和(11-13)(序列 號1號)可提高白色念珠菌內cAMP含量，其cAMP的增加量與等 摩爾毛喉萜誘導的增加量的數量級相同.圖8顯示與cc-MSH (l-13)(序列號4號)和(11-13)(序列號1號) 一樣，毛喉萜也明 顯抑制白色念珠菌生長(與對照相比p<0.01 )。圖9表明雙脫氧腺 苷能過扭轉oc-MSH (1-13)(序列號4號)和(11-13)(序列號 1號)對白色念珠菌生長的影響。
本實施例說明ot-MSH及其衍生物抑制白色念珠菌和其它微生 物生長的作用最可能是通過增加cAMP水平實現的，cAMP含量的 提高抑制mRNA和蛋白合成(參閱Bhattacharya A.等，《cAMP對 白色念珠菌RNA和蛋白合成的作用》(E#e"o/C>c"c^MPo" AA^ /Vwe/" S7"f/1ey/sCa"J/cto a/6/ca似)，《生4匕與生理研究通ifO〉 (5/0/ /zj^/cy. i ^. Ccw附w". ) 77: 1483 - 44 ( 1997 ))。實施例vn
本實施例闡明ct-MSH或其矛;t生物抑制人體細胞內病毒復制的
能力，或者更確切地說，闡明oc-MSH抑制慢性感染的人單核細胞
內mv-i病毒的復制和表達，
fflV-l慢性感染的幼單核細胞Ul細胞系是潛伏型單核細胞 fflV感染的體外模型，這些細胞攜帶兩套整合的HIV原病毒拷貝， HIV的基本表達較低。但是，根據RNA轉錄、p24抗原或逆轉錄酶 釋放等測定的病毒復制可以被不同的刺激活化，如TNF-oc、 IL-6、 IL-IO、 PMA或細胞擁擠狀態。
上述細胞置于由完全培養基(含有10毫摩爾Hepes的RPMI 1640培養基)、包含2毫摩爾L-谷氨酸(Sigma-Aldrich)、 10%熱滅 活的FCS (美國猶他州Logan的Hyclone實驗室提供)、100單位/ 毫升的青霉素和100微克/毫升的鏈霉素(紐約，Grand Island, Gibco 實驗室提供)，組成的培養基中維持對數期生長，以觀察ct-MSH和 /或其衍生物對HIV復制的影響。首次的試驗性實驗用來確定上述 培養條件下的最佳細胞密度、刺激物濃度HIV-1 p24抗原生成的動 力學。在使用前，用HBSS沖洗細胞三次以去除細胞外病毒。然后 在濃度為10_15-10—4摩爾范圍的ot-MSH (1-13)(序列號4號) 或(11 - 13 )(序列號1號)存在或缺乏的條件下，將細J!包以2x 105/ 毫升的密度(1毫升的最終體積)鋪于24孔的平底培一，培養皿 中只有培養基或加入TNF-a (io毫微克/毫升)(英國英格蘭牛津
R&D系統提供)。
在進一步的實驗中，Ul細胞中單獨加入濃度為10—5M的oc -MSH(11-13)(序列號1號)，這些細胞是經過TNF-a ( 10毫微 克/毫升)、IL-6 ( 20毫孩t克/毫升)、IL-10 ( 20毫孩t克/毫升)(英國 英格蘭牛津的R&D系統提供)、PMA ( 1毫微克/毫升) (Sigma-Aldrich)或細胞擁擠刺激的。將密度為2 x 105/毫升的Ul細胞在37C、 5。/。C02的條件下不更換培養基培養7天，細胞即可 達到擁擠狀態。由細胞因子或PMA激活的培養只能持續48小時。 然后離心以分離上清液，采用市售ELISA試劑盒(美國紐約Buffalo 的細胞實驗產品有P艮公司生產)檢測p24抗原，采用市售逆轉錄酶 ELISA反向分析試劑盒(瑞典Lund Innovagen生產)檢測逆轉錄酶 的釋》丈。對于所有這些實驗，在第一天加入oc-MSH (11-13)(序 列號l號)，每一種條件下的結果的測定均重復三次。
圖10表明a-MSH(l-13)(序列號4號)和(11-13)(序列 號1號)在較大濃度范圍內明顯抑制TNF-ct刺激的Ul細胞的p24 抗原釋放.對于上述二種肽最有效的濃度均是10—SM，分別產生52.7 %和56.0%的抑制效應。圖11表明a-MSH (11-13)(序列號1 號)也抑制IL-6、 IL-IO、 PMA或細胞擁擠狀態誘導的Ul細胞的 p24抗原和逆轉錄酶釋放。此外，圖12表明，根據Northern印記分 析的測定結果，oc-MSH(11-13)(序列號1號)還可以抑制PMA 刺激的Ul細胞的剪切和未剪切HIV-1 RNA的轉錄，
由此本實施例i兌明oc-MSH或其書f生物能夠抑制由TNF-a、 IL-6和IL-10途徑誘導的病毒基因的轉錄。
實施例Vffl
本實施例進一步闡明了 ct-MSH抑制病毒復制和活4匕的能力， 或者更確切地說，闡明了向Ul細胞中加入ct-MSH的中和性抗體 明顯增加p24抗原的釋放。
Ul細胞的培養方法與實施例VII中所述的類似。采用親和純化的 兔抗a -MSH抗體(瑞典，Malmo，Euro-Diagnostica提供)阻斷Ul 細胞內源性a-MSH的產生，此抗體對介質以1:250稀釋。對照抗 體選用同等稀釋度的兔IgG?？筧-MSH抗體和對照抗體處理的細 胞(2 x IOV毫升)在培養基或PMA ( 1毫微克/毫升)中共同培養。37C培養48小時后，分離上清液并檢測p24抗原的釋放。在擁擠 狀態實驗中，Ul細胞的培養同上述方法，抗oc -MSH抗體和對照IgG 在第一天加入，第七天收集上清液。圖13表明在靜止狀態、PMA誘導狀態、或U1細胞擁擠狀態， 阻斷a-MSH會明顯增加p24抗原的釋放.本實施例強有力地提示 病毒復制受a-MSH的影響。實施例k本實施例闡明了 ot -MSH和/或其衍生物抑制病毒復制和表達的 機制，或者更確切地說，闡明了 a-MSH或其衍生物抑制TNF-a誘 導的NF-kB活化和結合的機制。取20 x 106個Ul細胞(在完整培養基中密度為2 x 105/毫升) 制備核提取物，以測定NF-kB活性水平，其中U1細胞先在濃度 為10—5m的oc-MSH( 11 - 13)(序列號1號)存在或缺失的條件下 用TNF-a (20毫微克/毫升)刺激4小時。用冷PBS沖洗細胞一次， 緩沖液A ( 10毫摩爾Hepes (pH7.9)， 1.5毫摩爾MgCl2, 10毫摩 爾KC1， 0.5毫摩爾PMSF和0.5毫摩爾DTT)沖洗兩次，離心， 置于冰上，在加入0.1。/。NP-40的緩沖液A中培養IO分鐘。隨后， 棄去上清液，核碎片懸浮于15孩i升的緩沖液C (20毫摩爾Hepes(pH7.9)， 1.5毫摩爾MgCl2，0.42摩爾KC1， 0.2毫摩爾EDTA， 25%甘油，0.5毫摩爾PMSF和0.5毫摩爾DTT)中，冰上培養15 分鐘，混勻，離心.用75微升標定的緩沖液D (20毫摩爾Hepes(pH7.9), 0.05毫摩爾KC1， 0.2毫摩爾EDTA， 20%甘油，0.5毫 摩爾PMSF和0.5毫摩爾DTT)稀釋上清液，.80X:保存。結合反 應于室溫下進行10分鐘，反應體系中含有IO微克核提取蛋白和0.5 毫微克32P標記的NF - k B ( 30,000 cpm/微升)或者API混合于緩 沖液A(12毫摩爾Tris-HCl ( pH7.8 ), 60毫摩爾KC1， 0.2毫摩爾 EDTA和0.3毫摩爾DTT)，再加入10%甘油、2微克/毫升牛血清白蛋白和1孩i克/毫升單鏈DNA (Pharmacia Biotech )。此研究中用 于NF — k B的寡核苷酸有+GAT CCA AGG GGA CTT TCC GCT GGG GAC TTT CCA TG,和-GAT CCA TGG AAA GTC CCC AGC GGA AAG TCC CCT TG。每一個寡核苷酸退火與其互補結合，并 且用多聚核苷酸酶在末端標記"P-Y-ATP。為了確定特定鏈，在與 標記探針溫浴之前，核提取物先與IOO倍過量的未標記探針溫浴五 分鐘。然后，混合物在lxTBE條件下，于5% (30:1)聚丙烯酰胺 凝膠上進行電泳，再將凝膠干燥，進行放射自顯,影。圖14表明TNF-oc明顯增強NF-KB的結合活性，但是與濃度 為10_5M的ot-MSH (11-13)(序列號1號)共同培養明顯降低 NF-kB的活化。但是oc-MSH (11-13)(序列號1號)并不改變 靜止細胞NF- k B的活化。此現象il明ct -MSH和/或其書f生物通過 調控NF-kB的結合而抑制病毒復制和表達。病毒物質的復制通常依賴被感染細胞的活化狀態，受病毒和宿 主的相互作用調控.這些宿主因素可能包4舌TNF-ct和其它細胞因 子，如白介素。與HIV-1感染和活化類似，單純皰療病毒(HSV)-在宿主細月包因子作用下也可以從潛伏狀態活4匕。例如，TNF-(X和 IL-6， i旦不包括IL-l和IL-3,已經確定可以活化HSV感染。用抗 IL-6抗體中和IL-6可明顯抑制HSV的活化，相比之下中和ot或P 干擾素卻沒有影響。(參閱Baker， M.等，《白介素-6和單純皰滲病 毒1型的關系對行為和免疫病理的提示》(7Tze及e/加'o朋/^5e/wWo/" /附附Mwo/7af/20/ogy )， 《大腦4亍為免疫》(5e/zav./附/mwo/. ) 13 (3): 201-11 ( 1999); Noisakran S.等，《體外 移植的潛伏感染的三叉神經節中HSV-1活化過程中'淋巴細胞延遲 動力學》(Z^附/ Aocj^ey Z)e/ay K&erics q/" i/SF-/及earc"va"o" /" v&ra ￡":c/7/a"e;s o/Z^ewf /"/e"eaf 7Hge/m'"a/ G^rtg〃a ),《神經免疫 學雜志》(《/ 7Veww/附www/. ) 95 ( 1-2): 126-35 ( 1999); Walev， I.等，《TNF- a對小鼠三叉神經節內潛伏單純皰滲病毒的復活和復制 的增S雖作用》(五w/wwceme/rf " o/及eac"vartVwi ep/fcario" o/Z^rfe"f //er/ es S7加/ /ex P7rws^^"o/m 7Wge/w/"a/ o/ A/zce )，《病毒學文獻》(Arch. 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權利要求
1.一種包含兩個連接在一起的單體的二聚體，其中，兩個單體中的每個單體包括具有氨基酸序列Lys-Pro-Val的C末端。
2. 根據權利要求1所述的二聚體，其中，所述單體在N末端連接。
3. 根據權利要求1所述的二聚體，其中，所述二聚體是一個同型 二聚體。
4. 根據權利要求1所述的二聚體，其中，所述二聚體是一個異質 二聚體。
5. 根據權利要求1所述的二聚體，其中，所述二聚體包括至少一 個D型氨基酸。
6. 根據權利要求1所述的二聚體，其中，每個單體具有一個N末 端的半胱氨酸，其中所述N末端的半胱氨酸通過一個二石克鍵將 單體連接在一起。
7. 根據權利要求1所述的二聚體，其中，所述二聚體被N端乙酰 化、或C端酰胺化、或者二者兼有。
全文摘要
本發明涉及用于治療泌尿生殖系統疾病的一種或多種多肽所形成的二聚體。泌尿生殖系統疾病包括感染、炎癥、或者二者兼有。在本發明的一個優選實施例中，泌尿生殖系統疾病包括陰道、外陰、尿道、陰莖、和/或直腸的感染、和/或炎癥。在本發明的另一個優選實施例中，一種或多種多肽溶于載體內。而另一個優選實施例中，一種或多種多肽與棉條結合，用來預防中毒性休克綜合癥。在另一個優選實施例中，一種或多種多肽與避孕工具結合，以防止性傳播疾病或感染。在一個優選實施例中，一種或多種多肽與栓劑結合，以便于插入陰道或肛門。
文檔編號A61F13/20GK101240017SQ20071016672
公開日2008年8月13日 申請日期2000年3月23日 優先權日1999年3月24日
發明者安娜·卡塔尼亞, 詹姆斯·利普頓 申請人:曾根公司