專利名稱：：殼寡糖在制備治療非細菌性炎癥藥物中的應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及非細菌性炎癥藥物，具體地說是殼寡糖在制備治療非細菌性炎癥藥物及抑制非細菌性炎癥的功能性保健食品中的應用。技術背景一殼寡糖有很廣泛的生物活性，如抗真菌[文獻1.Hadwiger,L.A.,Ogawa,T.&Kuyama,H.(1994)Chitosanpolymersizeseffectiveininducingphytoalexinaccumulationandfungalsuppressionareverifiedwithsynthesizedoligomers.MolecularPlantandMicrobesInteraction7(4)，531-3.]，促進傷口愈合[文獻2.Ueno，H.,Murakami,M"Okum扁，M.,Kadosawa，T.,Uede,T.&Fujinaga,T.(2001)Chitosanacceleratestheproductionofosteopontinfrompolymorphonuclearleukocytes.Biomaterials22(12),1667-73.]，i呆護月干臟[文獻3.Yan,Y"Wanshun,L.,Baoqin,H.,Bing,L.&Che匿ei,F.(2006)Protectiveeffectsofchitosanoligosaccharideanditsderivativesagainstcarbontetrachloride-inducedliverdamageinmice.HepatologyResearch35(3),178-84.]，治療糖尿病[文獻4.Lee,H.W.,Park,Y.S.,Choi,J.W.,Yi,S.Y.&Shin,W.S.(2003)Antidiabeticeffectsofchitosanoligosaccharidesinneonatalstreptozotocin-inducednoninsulin-dependentdiabetesmellitusinrats.BiologyandPharmacologyBulletins26(8),1100-3.]，促進一些腫瘤細胞凋亡[文獻5.HarishPrashanth,K.V.&Tharanathan,R.N.(2005)Depolymerizedproductsofchitosanaspotentinhibitorsoftumor-inducedangiogenesis.BiochimicaBiophysicaActa1722(1),22-9.]等。殼寡糖能促進靜息中性粒細胞產生超氧陰離子，NO;同時可下調由佛波酯PMA激活的中性粒細胞的脫顆粒作用，粘附活性及超氧陰離子的含炎癥發生組織會召集大量的中性粒細胞，釋放炎癥介質來殺傷入侵的細菌，但同時這些炎癥介質的釋放會對自身機體產生損害。炎癥組織的缺氧環境使得中性粒細胞的半衰期大大延長。因此及時的清除炎癥型中性粒細胞對炎癥的治愈有著重要的意義。而這種清除最有效的途徑就是通過吞噬細胞吞噬凋亡的中性粒細胞。因此研究藥物對炎癥型中性粒細胞的促凋亡作用，對炎癥的治療和緩解有著重要的意義。本發明是在國家科技部"九五"攻關項目的支持下，對殼寡糖在促進炎癥型中性粒細胞凋亡上的研究。
發明內容本發明提出了殼寡糖在制備治療非細菌性炎癥藥物及抑制非細菌性炎癥的功能性保健食品中的應用。經過大量實驗發現，聚合度為2-50殼寡糖能刺激體外培養的小鼠腹膜炎中性粒細胞產生超氧陰離子及過氧化氫，促進該細胞的凋亡，而且這種促凋亡作用是通過超氧陰離子的產生來實現的，并且刺激超氧陰離子產生這一功能是磷脂酶D和PI3K依賴的。此外殼寡糖還能降低炎癥因子髓過氧化物酶的釋放。本發明的技術方案為殼寡糖在制備治療非細菌性炎癥藥物中的應用。殼寡糖在制備具有抑制非細菌性炎癥的功能性保健食品中的應用。所述殼寡糖的聚合度最好為2-50，乙酰化程度〈5%。所述殼寡糖可與藥劑學上可采用的輔料混合形成各種形式的丸劑、散劑、片劑、膏劑、粉劑、針劑、水劑，顆粒劑、膠囊或注射劑。其使用可以采取經口腔和非經口腔的投入方法，非經口腔的投入可以采取皮下和靜脈注射，肛腸投入等。注射液的制作可以任意選用生理鹽水，葡萄糖，安定劑，防腐劑，懸浮劑，乳化劑等。所述殼寡糖可以添加到各種食品當中，作為抗炎保健食品；食品的形態可以是液體的比如像清涼飲料，乳酸飲料，調味品，湯類，固體的奶酪，火腿，點心等。所述殼寡糖通過促炎癥型中性粒細胞的凋亡來緩解非細菌性炎癥，殼寡糖對中性粒細胞的促凋亡作用及其作用機制，包括如下方面1)殼寡糖可以促進體外培養的炎癥型中性粒細胞的凋亡；當殼寡糖的濃度范圍為10-10xl0Vg/ml時，具有顯著促進炎癥型中性粒細胞凋亡的作用。2)殼寡糖促進體外培養的炎癥型中性粒細胞凋亡是通過超氧陰離子的產生來實現的；加入超氧陰離子的清除劑超氧化物歧化酶后，流式細胞儀檢測聚合度為2-50的殼寡糖引起的體外培養的炎癥型中性粒細胞的凋亡消失，證明殼寡糖的促凋亡作用是通過超氧陰離子的產生來實現的。3)磷脂酶D和PI3K參與了殼寡糖刺激中性粒細胞產生超氧陰離子的過程；利用磷脂酶D以及PI3K的抑制劑正丁醇和渥曼青霉素，證實了殼寡糖刺激小鼠炎癥型的中性粒細胞產生超氧陰離子是依賴這兩種的激活的。4)殼寡糖能降低炎癥型中性粒細胞髓過氧化物酶的釋放。5)殼寡糖刺激小鼠炎癥型中性粒細胞過氧化氫產生。本發明具有如下優點1.原料價廉，已產業化。本發明的原料來源易得，殼聚糖的酶解方法操作簡單，成本低。2.應用效果好。聚合度為2-50的殼寡糖，具有很好的促進炎癥型中性粒細胞凋亡的作用。因此可以將殼寡糖作為抗炎癥的治療藥物，或者作為食品添加劑加工制成保健品。3.具體操作時，可采用來源于蝦蟹殼的幾丁質，采用生物酶解法得到殼寡糖，安全性高，無毒副性，可作為抗炎藥物，或者作為食品添加劑加工制成保健品長期使用，不產生耐藥性。具體實施例方式下面通過實例對本發明的技術進一步說明小鼠炎癥型中性粒細胞的分離小鼠在腹腔注射含質量濃度1%糖原的生理鹽水4小時后，頸椎脫臼處死，取腹水，與PH7.4的PBS1:l混溶，離心，400g,10min,取沉淀細胞，90%以上為炎癥型的中性粒細胞。小鼠中性粒細胞的培養條件為在RPMI1640培養液中添加體積濃度10%小牛血清、100u/ml青霉素、100/ml鏈霉素；37°C，通入(1)2體積含量為5%的空氣培養.實施例1聚合度為2-10的殼寡糖對小鼠炎癥型中性粒細胞的促凋亡作用體外培養的炎癥型中性粒細胞(l5xl06/ml)與殼寡糖同時加入到RPMI1640培養液中，作用24或40小時后，PBS(120mMNaCl，5mMKC1，1.7mMKH2P04,8.3mMNa2HP04)洗滌，400g,5min離心，固定液(含質量濃度lc/。多聚甲醛的PBS)固定，細胞用PI染色，流式細胞儀檢測。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>實施例2聚合度為2-10的殼寡糖依賴超氧陰離子對小鼠炎癥型中性粒細胞的促凋亡作用細胞(l5xl0Vml)分為三組，對照，10-10Vg/ml殼寡糖處理組，10-105pg/ml殼寡糖與10-200U/mlSOD(超氧陰離子的清除劑)共處理組，于與RPMI1640培養液中培養16小時后，PBS洗滌，400g,5min離心，固定液固定，用PI染色，然后用流式細胞儀檢測細胞的凋亡百分率。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>以上結果證明殼寡糖對小鼠炎癥型中性粒細胞的促凋亡作用是通過超氧陰離子的產生來實現的。實施例3聚合度為2-10的殼寡糖剌激中性粒細胞產生超氧陰離子超氧陰離子的檢測采用細胞色素C還原的方法。細胞與殼寡糖液混合，細胞用殼寡糖刺激30min后，PBS洗滌，400g,5min離心后，沉淀細胞用1m1KRG(120mMNaCl，5mMKC1,1.7mMKH2P04,8.3mMNa2HP04,lmMCaC12,1.5mMMgCL2，10mM葡萄糖)緩沖液重懸，質量體積比5%金胞色素C(溶在KRG中)37。C預熱3min，550nm下檢測吸光值。渥曼青霉素是PI3K的抑制劑，通過它的使用可以檢測此酶在超氧陰離子產生中是否參與。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例4磷脂酶D在殼寡糖促進中性粒細胞產生超氧陰離子中的作用實驗方法同實施例3，l-butanol(正丁醇)是磷脂酶D的抑制劑，通過正丁醇的使用可以檢測PLD在超氧陰離子產生中的作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>以上結果說明，殼寡糖促進超氧陰離子產生是依賴磷脂酶D的。實施例5聚合度為2-10的殼寡糖能刺激體外培養的小鼠腹膜炎中性粒細胞產生過氧化氫。炎癥型中性粒細胞與殼寡糖在PBS的緩沖體系中共孵育32小時，熒光染料DHR123標記，流式細胞儀檢測D服123陽性的細胞即為產生過氧化氫的細胞<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例6聚合度為2-10的殼寡糖對小鼠炎癥型中性粒細胞髓過氧化物酶釋放的抑制作用髓過氧化物酶的釋放通過酶與顯色底物的反應來檢測，在PBS的緩沖后，加入0.02%的TMB底物(過氧化物酶底物)，37°。反應10min。經過髓過氧化物酶的作用后由TMB由黃色變為藍綠色，酶標儀檢測450nm處的吸光值，可間接反應髓過氧化物酶的釋放。組別濃度A450nm忌、単-1.828±0.22對照1.582±0.122殼寡糖組10-105|ig/ml1.3828±0.03結果證明殼寡糖還能減少炎癥因子髓過氧化物酶的釋放。實施例7聚合度為2-30的殼寡糖，濃度為10-l(TVg/ml對小鼠炎癥型中性粒細胞的促凋亡作用。實驗操作同實施例l。處理濃度時間凋亡百分率(°/。)對照16h10.78殼寡糖10-10Vg/ml16h18.21對照32h34.89殼寡糖10-l。Vg/ml32h53.13實施例8聚合度為2-30的殼寡糖，濃度為10-104|ig/ml對小鼠炎癥型中性粒細胞的促超氧陰離子產生作用,氧陰離子的產生用NBT(硝基四氮唑藍)還原的方法來檢測，在PBS的緩沖體系中，殼寡糖處理細胞30min后，加入1。/。的NBT，37。C反應30min。NBT經還原后由黃色變為藍色，在570nm處檢測吸光度，間接反應超氧陰離子產生的量處理濃度A570nm對照0.174±0.009殼寡糖10-10Vg/ml0.226±0.01權利要求1.殼寡糖在制備治療非細菌性炎癥藥物中的應用。2.按照權利要求l所述應用，其特征在于殼寡糖在制備具有抑制非細菌性炎癥的功能性保健食品中的應用。3.按照權利要求l所述的應用，其特征在于所述殼寡糖的聚合度為2-50，乙酰化程度〈5%。4.按照權利要求l所述的應用，其特征在于所述殼寡糖可與藥劑學上可采用的輔料混合形成各種形式的丸劑、散劑、片劑、膏劑、粉劑、針劑、水劑，顆粒劑、膠囊或注射劑。5.按照權利要求l所述的應用，其特征在于所述殼寡糖通過促炎癥型中性粒細胞的凋亡來緩解非細菌性炎癥。全文摘要本發明涉及殼寡糖在制備治療非細菌性炎癥藥物中的應用，本發明應用現代分離純化技術對殼聚糖進行酶解，獲得聚合度為2-50之間的殼寡糖，并對小鼠炎癥型中性粒細胞的作用進行深入研究，結果表明，殼寡糖具有很好的促進炎癥型中性粒細胞凋亡的作用。因此可以將殼寡糖作為抗炎癥的治療藥物，或者作為食品添加劑加工制成保健品。文檔編號A61P29/00GK101416980SQ200710157669公開日2009年4月29日申請日期2007年10月24日優先權日2007年10月24日發明者曲天明,李曙光,杜昱光,白雪芳,竇江麗,譚成玉申請人:中國科學院大連化學物理研究所