專利名稱：一種藥物組合物在制備改善腦微循環障礙藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于醫藥領域，具體涉及養血清腦顆粒在制備改善微循環障礙藥物中的應用。
背景技術：
世界腦血管疾病的平均發病率為140-200/10萬人口，平均死亡率為100/10萬人口，是發 病率和死亡率較高的病種。改善腦血管損傷對挽救生命和降低醫療財政都有著重要的意義。 缺血再灌注引起的腦血管損傷約占腦血管損傷原因的60%左右。缺血再灌注后產生的過氧化物 降解I-kB，活化NF-kB, NF-kb的亞基進入胞核，激活粘附分子、炎性因子和凋亡相關基因位 點，促進黏附分子的表達，炎性因子的釋放和啟動凋亡相關蛋白的合成。白細胞的L選擇素和 血管內皮的E選擇素表達增加引起白細胞沿血管壁的滾動，進而，過表達的白細胞黏附分子 CDllb/CD18與血管內皮細胞黏附分子ICAM-l的結合導致白細胞與血管內皮細胞的黏附。黏附 于血管內皮的白細胞釋放大量過氧化物和蛋白酶，損傷血管內皮細胞和基底膜，引起血管通 透性增加和血漿白蛋白漏出，造成血管周圍組織的水腫。過氧化物刺激又可引起血管周圍的 肥大細胞脫顆粒釋放炎性因子和血管活性因子，這些因子從血管外攻擊血管加重白細胞與血 管內皮細胞的黏附和白蛋白的外漏。血管周圍組織的水腫從血管外壓迫血管，血管內皮細胞 的腫脹和白細胞黏附，血小板積聚等都成為阻礙血流的因素，導致再灌注后不復灌的區域形 成。
缺血再灌注引起的腦血管損傷是諸多要素參與的多環節的損傷過程，以往的研究主要集 中于用抗過氧化物，抗黏附分子表達，抗血小板凝聚等作用于腦障礙的某一環節，由于作用 環節單一，不足以綜合地改善腦微循環障礙，至今沒有取得良好的臨床療效。可作用于腦微 循環障礙的不同病理環節的，由多成分組合的復合制劑有可能起到綜合地改善腦微循環障礙 的作用。
養血清腦顆粒是由當歸、川芎、白芍、鉤藤、雞血藤、夏枯草、珍珠母、細辛為主要成 分構成的中藥復方制劑，1996年被中國國家食品與藥品監督管理局(SFDA)作為治療頭痛， 眩暈和腦血管疾病的中藥復方制劑，批準在中國臨床應用。已往的體外研究已經證明該中藥 復方制劑中芍藥甙，川芎嗪，阿魏酸在體外有抑制過氧化物產生的作用，川芎嗪體外有抑制白細胞和血管內皮黏附因子表達的作用。進而，體內的研究還證明了川芎嗪，芍藥武，阿魏 酸單獨投入能夠減輕缺血再灌注引起的腦梗塞的面積。我們以往的研究已經證實了養血清腦 顆粒可以抑制自發性高血壓和腦中風易發性大鼠的血壓、延緩腦中風的發病時間、改善腦血 流量。但是，有關養血清腦顆粒對缺血再灌注引起的腦微循環障礙是否具有改善作用未見報
告
發明內容
本發明提供了一種藥物組合物在制備改善腦微循環障礙藥物中的應用，尤其是提供了該 組合物在制備改善缺血再灌注所導致的腦微循環障礙藥物中的應用。 本發明是通過以下方案實施的
本發明的一種藥物組合物在制備抑制白蛋白外漏藥物中的應用，其中組合物是由以下重 量百分比含量的原料藥制成，當歸4~9%川芎4 9°/。白芍2~8% 熟地2 8%勾藤 10 15 雞血藤10~15%夏枯草10 15% 決明子10~15% 珍珠母10 15% 元胡4 9% 細辛0.5 2%。
本發明優選的藥物組合物由以下重量百分比含量的原料藥制成當歸6.75%川芎 6.75% 白芍5.4% 熟地5.4% 勾藤13.5% 雞血藤13.5% 夏枯草13.5% 決明子 13.5% 珍珠母13.5%元胡6.75% 細辛1.34%。
本發明的藥物組合物制成藥學上可以接受的制劑，優選顆粒劑。
本發明的藥物組合物制劑通過以下步驟制備
按上述比例取藥材，加水提取3次，每次1小時，合并提取液，適當濃縮，加2倍量的乙 醇，靜置24小時沉淀，取上清液濃縮成浸膏，相對密度為1.3~1.4，出膏率為10%,取清膏、 蔗糖和糊精按l: 3: 1的比例制成顆粒。其中，制劑部分還可以按照常規的工藝方法制成其 它藥劑學上的任何一種劑型。
經過大量的試驗研究，發現藥物組合物有明顯改善腦微循環障礙的作用，尤其是對由腦 微血管損傷所致的微循環障礙、缺血再灌注損傷所致的微循環障礙、白細胞黏附所導致的微 循環障礙、過氧化物所導致的微循環障礙、白蛋白外漏所導致的微循環障礙效果更佳。
本發明用蒙古沙鼠雙側頸動脈結扎建立的缺血再灌注模型，用可視化動態連續系統觀察 蒙古沙鼠雙側頸動脈結扎之后腦微循環動態，包括腦血流量，血流速度，血管徑，血管內皮 過氧化物產生，白細胞黏附，血管通透性的變化，并用透射和掃描電鏡觀察細靜脈和毛細血 管超微結構的變化，探討藥物組合物對缺血再灌注引起的腦微循環障礙的改善作用。本發明中蒙古沙鼠的雙側頸動脈結扎再灌注后，蒙古沙鼠腦皮層血流量顯著地降低，細 靜脈紅細胞流速的降低，細靜脈黏附白細胞數量、細靜脈過氧化物依存性DHR熒光強度和血 漿白蛋白血管外漏顯著增加。藥物組合物預給藥可以顯著地抑制缺血再灌注引起的蒙古沙鼠 腦皮層血流量和細靜脈紅細胞流速的降低，抑制細靜脈白細胞的黏附、細靜脈過氧化物依存 性D服熒光強度和血漿白蛋白血管外漏的增加。
本發明中蒙古沙鼠缺血再灌注后，血管內皮細胞通過次黃嘌呤和黃嘌呤脫氫酶產生負氧 陰離子，進而，負氧陰離子在SOD的催化下轉換成過氧化氫， 一部分過氧化氫通過Haber-Wei ss 反應生成羥基自由基。過氧化氫，羥基自由基等過氧化物既可以脂質過氧化，斷裂DNA等損 傷血管內皮細胞和血管基底膜細胞，又可以活化NF-icB，誘導選擇素，黏附分子和炎性分子 的釋放。抑制過氧化物的產生是改善再灌注后微循環障礙的主要環節。D服與過氧化氫等過 氧化物反應后轉化成羅達明，羅達明可進入細胞內，結合在線立體膜上，用熒光顯微鏡可以 觀察到DHR反應后的發光部位和熒光強度。本發明用此方法直接觀察到了藥物組合物的預給 藥可以抑制缺血再灌注后沙鼠大腦皮層細靜脈壁過氧化物的產生。
本發明中蒙古沙鼠缺血再灌注誘導的血管內皮細胞E-selectin和白細胞L-selectin的 表達，血管內皮細胞黏附因子ICAM-1和白細胞黏附因子CDllb/CD18的表達，導致白細胞沿 血管內壁的滾動和黏附。掃描電鏡顯示缺血再灌注后血管內突起顯著增加，可能與白細胞與 血管壁的黏附相關。黏附于血管內皮的白細胞釋放的過氧化物和蛋白酶等加重血管內皮細胞 和血管基底膜，導致血管通透性的增加，血漿白蛋白的外漏和血管外水腫。抑制白細胞與血 管內皮的黏附將可改善微循環障礙。本發明用可視化微循環觀察方法證明了藥物組合物的預 給藥可以抑制缺血再灌注后沙鼠大腦皮層細靜脈內白細胞的黏附。
本發明的另一重要發現是藥物組合物預給藥可以抑制缺血再灌注后沙鼠大腦皮層細靜脈 白蛋白的外漏。缺血再灌注后由血管內皮細胞和黏附白細胞產生過氧化物是血管內皮細胞和 血管基底膜損傷和血漿白蛋白外漏的主要原因之一，本發明用動態觀察FITC標記白蛋白細靜 脈外漏的方法首次證明了藥物組合物預給藥可以抑制缺血再灌注后沙鼠大腦皮層細靜脈白蛋 白血管的外漏。本發明掃描電鏡觀察的結果也表明再灌注1小時后的沙鼠大腦皮層細靜脈血 管內皮細胞突起增多，連接間隙增寬，周圍出現水腫。藥物組合物的預給藥抑制了再灌注后 沙鼠大腦皮層細靜脈血管內皮細胞連接間隙的增寬，內皮相對變得光滑，其血管周圍水腫減 輕。該結果證明了藥物組合物預給藥減輕缺血再灌注后腦血管內皮細胞的損傷，藥物組合物 粒抑制缺血再灌注后腦血管的白蛋白外漏的作用可能與保護血管內皮作用相關，而其保護血 管內皮的作用可能與其抑制白細胞血管內皮的黏附和血管壁過氧化物的產生相關。本發明還用激光多普勒血流灌注成像儀的方法證明了養血清腦顆粒可以抑制缺血再灌注 后腦血流量的降低。參考藥物組合物可以加快缺血再灌注后腦細靜脈紅細胞流速較快，抑制 白細胞與血管壁的粘附，抑制血管壁過氧化物的產生等結果可以認為藥物組合物抑制缺血再 灌注后腦血流量降低的作用是其改善腦微循環障礙的結果。同時，本發明掃描電鏡觀察還觀 察到缺血再灌注后腦毛細血管開放數明顯減少，這可能是造成缺血再灌注之后腦血流量降低 的另外一個重要環節。而給予養血清腦顆粒后白蛋白滲出減少，腦血管周圍水腫減輕，毛細 血管開放數增加，說明藥物組合物通過改善微循環減少了再灌注后腦缺血復灌區域，這是可 能是其抑制再灌注后血流量降低的原因之一。
下面的試驗例對本發明進一步說明
試驗例一 養血清腦顆粒對缺血再灌注后蒙古沙鼠腦細靜脈管徑的影響
(一)實驗方法-1、材料
動物蒙古沙土鼠，雄性，體重65 90g，購于首都醫科大學實驗動物部，合格證號
SCXK (京)2000-0012。在北京大學醫學部動物中心，按北京大學醫學部實驗動物處理規定， 自由進食飲水，單籠飼養，溫度22〔，相對濕度40%， 12小時切換燈源(早晨7點開燈)。
養血清腦顆粒:實施例一的制劑，由天津天士力制藥股份有限公司生產，批號Z10960082。 生產過程根據嚴格的現代生產工藝，藥物成分標準化。養血清腦顆粒的主要成分是當歸、川 芎、白芍、鉤藤、雞血藤、夏枯草、珍珠母、細辛，實驗前配制成80mg/ml和160mg/ml的水溶 液。
化學試劑Dihydrorhodamine 123 (DHR)購買于美國Eugene公司；異硫氰酸熒光素標 記白蛋白(FITC-albumin)購買于美國SIGMA公司;Rhodamine 6G perchlorate購買于美國 FLUKA公司；烏來糖(Urethane)購買于中國上海天蓮精細化工有限公司生產。 2、試驗組和對照組的動物模型制備 (1)缺血再灌注組
取20%烏拉坦，按2.0g/kg.bw的用量，經腹腔注射麻醉蒙古沙土鼠。在頸部正中切開， 分離氣管，連接小動物呼吸機(ALC-V8)，S在整個觀察過程保持機械通氣。特殊設計的閉合器
(一根細的聚乙烯導管和一根粗的塑料管組成的套索)放置在雙側頸總動脈而不影響血流。 暴露股靜脈，插入并留置直徑為5mm的聚乙烯導管。切開腦部皮毛，用手提式顱鉆在前囟點 前開一3X3謹的顱窗。將37度的人工腦脊液連續滴加在顱窗上以保持大腦表面濕潤。用連接于熒光攝像機(C7190, HAMAMATSU， J印an)的正立生物顯微鏡(DMLFS, LEICA， Germany), 用10倍物鏡選擇直徑在30-50 !i m， 200 u m長沒有明顯彎曲的細靜脈，在監視器上基礎觀察 (J2118A, TCL， Huizhou， China) 10分后，閉索蒙古沙土鼠雙側頸動脈(缺血)，30分后解 除閉索(再灌注)。連續觀察并用連接于熒光攝像機刻錄機(DVR-R25, Malata， China)記錄 微循環動態60分鐘。
(2) 假手術組
即不閉索雙側頸動脈，其它操作同缺血再灌注組。
(3) 養血清腦顆粒給藥組
養血清腦顆粒給藥組養血清腦顆粒0. 4g/kg +缺血再灌注組，養血清腦顆0. 8g/kg + 缺血再灌注組，在缺血再灌注90分鐘前，分別用灌胃管，灌胃給予養血清腦顆粒水溶液 0. 4g/kg. bw和0. 8g/kg. bw，其它操作同缺血再灌注組。 3、測定方法細靜脈管徑測定
在基礎觀察前10分鐘，將50mg/kg. bw的FITC標記的血漿白蛋白經股靜脈緩慢推注。用 波長488nra的氦氖激光束照射在開顱部位，用共聚焦顯微鏡系統觀察并紀錄在缺血前，以及再 灌注開始、10分、30分、60分時同一視野內細靜脈內外FITC標記熒光圖像。用圖像分析軟 件Image-Pro plus 5.0 (Media Cybemetrics Inc， USA)測定各時間點細靜脈管徑血管內徑。 血管徑是同一位置三次測量的平均值。管徑的變化率是再灌注各個時間點的管徑與缺血前管 徑的比值。 (二)結果
數據是每組6只沙鼠平均值土標準誤表示。數據分析用單因素方差分析one-way analisis of variance(ANOVA)處理和Fisher s post Hoc test檢驗。設p<0. 05為顯著性差異。
圖l表示的是假手術組，缺血再灌注組，養血清腦顆粒0Jg/kg+缺血再灌注組，養血清 腦顆粒0.8+缺血再灌注組在缺血前和再灌注后蒙古沙鼠腦細靜脈血管徑的連續變化。假手 術組在本觀察期間內沒有顯著地變化。缺血再灌注組細靜脈在再灌注開始時有一過性輕微擴 張，持續到再灌注60分。養血清腦顆粒0. 4g/kg+缺血再灌注組和養血清腦顆粒0. 8+缺血再
灌注組的腦細靜脈管徑在觀察期間內沒有顯著地變化。
試驗例二養血清腦顆粒對缺血再灌注后蒙古沙鼠細靜脈紅細胞流速的影響
(一)試驗方法
1、材料同試驗例一2、試驗組和對照組動物模型制備
(1) 缺血再灌注組同試驗例一
(2) 假手術組同試驗例一
(3) 養血清腦顆粒給藥組同試驗例一。
3、測定方法細靜脈紅細胞流速測定
用連接于生物顯微鏡的高速攝影機(FASTCAM-ultima APX， photron， Japan),用1000幅/ 秒的攝影速度記錄細靜脈的紅細胞流速。在25幅/秒的速度回放錄像中用圖像分析軟件 Image-Pro Plus 5. 0 software (Media Cybernetic, USA)測量在缺血前,以及再灌注開始0分、 10分、20分、30分、40分、50分、60分時同一視野內細靜脈紅細胞流速，流速的變化率定 義為再灌注各個時間點的流速與缺血前流速的比值。 (二)結果
數據是每組6只沙鼠平均值士標準誤表示。數據分析用單因素方差分析one-way analisis of variance(ANOVA)處理和Fisher s post Hoc test檢驗。設p〈0. 05為顯著性差異。
圖2表示的是假手術組，缺血再灌注組，養血清腦顆粒0.4g/kg+缺血再灌注組，養血清 腦顆粒0. 8+缺血再灌注組在缺血前和再灌注后蒙古沙鼠腦細靜脈紅細胞流速的連續變化。假 手術組蒙古沙鼠腦細靜脈紅細胞流速在本觀察期間內沒有顯著地變化。缺血再灌注組在再灌 注開始到再灌注20分期間腦細靜脈紅細胞血流速度顯著地降低。養血清腦顆粒0. 4g/kg給藥 組在再灌注io分后，顯著地抑制了缺血再灌注引起的腦細靜脈紅細胞血流速度的降低。養血 清腦顆粒0. 8組在再灌注開始時就抑制了的腦細靜脈紅細胞血流速度的降低。
試驗例三養血清腦顆粒對缺血再灌注后蒙古沙鼠腦血流量的影響
(一)試驗方法
1、 材料同試驗例一
2、 試驗組和對照組動物模型制備
(1) 缺血再灌注組同試驗例一
(2) 假手術組同試驗例一
(3) 養血清腦顆粒給藥組同試驗例一。
3、測定方法腦血流量測定
取一部分蒙古沙土鼠，用激光多普勒血流灌注成像儀(PeriScanP頂3， PER頂ED， Sweden) 測量腦血流量。頭皮正中切口，暴露顱骨'去除粘在顱骨的結締組織。計算機控制的光學掃描器發出低能量的氦-氖激光照射在暴露的顱骨上。掃描器與顱骨的距離是18.5cm。掃描器 的掃描區域是8X10腿，激光束穿透的深度是0. 5誦。掃描后顯示器上顯示一幅彩色圖像代 表不同區域的灌注水平。記錄在缺血前，再灌注開始0分、10分、20分、30分、40分、50 分、60分時腦血流圖像。所有圖像用LDPIwin軟件對圖像進行測量。以缺血再灌注前的全腦 灌注量為基礎值，計算再灌注后各時間點腦血流量的變化率。 (二)結果
數據是每組6只沙鼠平均值士標準誤表示。數據分析用單因素方差分析one-way analisis of variance (ANOVA)處理和Fisher s post Hoc test檢驗。設p〈0. 05為顯著性差異。
圖3表示的是假手術組，缺血再灌注組，養血清腦顆粒0.4g/kg+缺血再灌注組，養血清 腦顆粒0. 8+缺血再灌注組在缺血前和再灌注后蒙古沙鼠腦血流量的連續變化。假手術組的腦 血流量在本觀察期間內沒有明顯的變化，缺血再灌注組在再灌注開始后顯著降低，且持續到 再灌注60分。養血清腦顆粒0. 4g/kg+缺血再灌注組和養血清腦顆粒0. 8+缺血再灌注組在再 灌注io分后，顯著地抑制了缺血再灌注引起的腦血流量的降低。
試驗例四養血清腦顆粒對缺血再灌注后蒙古沙鼠腦細靜脈壁黏附白細胞的影響
(一) 試驗方法
1、 材料同試驗例一
2、 試驗組和對照組動物模型制備
(1) 缺血再灌注組同試驗例一
(2) 假手術組同試驗例一
(3) 養血清腦顆粒給藥組同試驗例一。
3、測定方法黏附于細靜脈壁白細胞測定
在基礎觀察前10分鐘，將熒光標記物Rhodamine 6G按5mg/kg. bw的使用量，經股靜脈 緩慢推注。用連接于生物顯微鏡的共聚焦掃描裝置(Bio-Rad Radiance 2100， England)和計 算機處理系統(Dell叩tiplex Gx加0， Germany)進行觀察和記錄。用波長5們nm的氦氖激光 束照射在開顱部位進行觀察，圖像經8-bit A/D轉換器數字華后，X-t掃描熒光圖像 (512X512X8-bit)儲存在計算機等待處理。設定30秒掃描的30張圖片中部位沒有發生變 化的白細胞為黏附白細胞。在直徑30-50um， 200um長的小靜脈觀察并紀錄在缺血前，以及 再灌注O分、10分、30分、60分黏附與血管壁的白細胞。
(二) 結果數據是每組6只沙鼠平均值土標準誤表示。數據分析用單因素方差分析one-way analisis of variance (AN0VA)處理和Fisher s post Hoc test檢驗。設p<0. 05為顯著性差異。
圖4表示的是假手術組，缺血再灌注組，養血清腦顆粒0.4g/kg+缺血再灌注組，養血清 腦顆粒O. 8+缺血再灌注組在缺血前和再灌注后蒙古沙鼠細靜脈壁黏附白細胞的連續變化。假 手術組在觀察結束時，黏附于腦細靜脈壁的白細胞在不到3個/200um。缺血再灌注組于蒙古 沙鼠腦細靜脈壁的白細胞數在再灌注開始增加，在再灌注結束時，已經達到6個/200ym。養 血清腦顆粒0.4g/kg+缺血再灌注組，在再灌注30分后顯著地抑制了白細胞與大腦細靜脈管 壁粘附。養血清腦顆粒0.8+缺血再灌注組，在再灌注10分后就顯著地抑制了白細胞與大腦 細靜脈管壁粘附。
試驗例五養血清腦顆粒對缺血再灌注后蒙古沙鼠腦細靜脈壁過氧化物產生動態的影響
一、養血清腦顆粒對缺血再灌注后蒙古沙鼠細靜脈壁過氧化物產生動態的影響
(一) 試驗方法
1、 材料同試驗例一
2、 試驗組和對照組動物模型制備
(1) 缺血再灌注組同試驗例一
(2) 假手術組同試驗例一
(3) 養血清腦顆粒給藥組養血清腦顆粒0.4g/kg +缺血再灌注組，在缺血再灌注90分 鐘前，用灌胃管，灌胃給予養血清腦顆粒水溶液0.4g/kg.bw，其它操作同試驗例一
3、 測定方法過氧化物產生動態測定
在基礎觀察前10分鐘，將10umol/ml濃度的過氧化物熒光探針dihydrorhodamine 123連 續滴加在腦觀察部位的表面。當過氧化物與D服相遇時，可以將DHR還原成rhodamine 123， 用連接于生物顯微鏡的超敏感攝像機(Hamamatsu EB-CCD Camera "190 Japan)觀察并紀錄 D服的發光部位和強度(激發波長510nm，發射波長534皿)。為了測量血管內皮組織熒光強 度的差別，用圖像分析軟件Image-Pro plus 5. O測量血管內腔和血管壁的平均熒光強度。測 量每一個血管內腔和血管壁的平均熒光強度，它們的差值(DI)反應了 DHR被氧化的程度。 測量缺血前(Ibase),以及再灌注開始O分、10分、20分、30分、40分、50分、60分時細 靜脈壁和血管內熒光強度差值(Ix)，以缺血前的數值為基礎值，用各時間的值(Ix)與基礎 值(Ibase)的比表示DHR熒光強度的變化，以判定細靜脈壁過氧化物的產生動態。
(二) 結果數據是每組6只沙鼠平均值土標準誤表示。數據分析用單因素方差分析one-way analisis of variance (AN0VA)處理和Fisher s post Hoc test檢驗。設p〈0. 05為顯著性差異。
圖5是缺血再灌注組和養血清腦顆粒組蒙古沙鼠在缺血再灌注前和再灌注60分時腦細靜 脈壁DHR熒光強度變化的圖像。缺血再灌注蒙古沙鼠a和養血清腦顆粒+缺血再灌注組蒙古沙 鼠c在缺血前，沒有觀察到細靜脈壁D服熒光發光部位.在再灌注60分時，可以觀察到缺血 再灌注蒙古沙鼠沿腦細靜脈壁D服熒光強度增強的部位b，而養血清腦顆粒+缺血再灌注組蒙 古沙鼠沒有觀察到腦細靜脈壁DHR熒光強度的增強d.可見養血清腦顆粒的預給藥可以抑制 缺血再灌注后沙鼠大腦皮層細靜脈壁過氧化物的產生。
二、不同劑量的養血清腦顆粒對缺血再灌注后蒙古沙鼠腦細靜脈壁過氧化物產生動態影響
(一) 試驗方法
1、 材料同試驗例一
2、 試驗組和對照組動物模型制備
(1) 缺血再灌注組同試驗例一
(2) 假手術組同試驗例一
(3) 養血清腦顆粒給藥組同試驗例一
3、 測定方法同上述細靜脈壁過氧化物產生動態的測定
(二) 結果
數據是每組6只沙鼠平均值士標準誤表示。數據分析用單因素方差分析oneiay analisis of variance(ANOVA)處理和Fisher s post Hoc test檢驗。設p<0. 05為顯著性差異。
圖6表示的是假手術組，缺血再灌注組，養血清腦顆粒0.4g/kg+缺血再灌注組，養血清 腦顆粒0.8+缺血再灌注組在缺血前和再灌注后蒙古沙鼠腦細靜脈壁DHR熒光強度的連續變 化。假手術組蒙古沙鼠腦細靜脈壁的D服熒光強度比在本觀察期間內幾乎沒有變化。缺血再 灌注組蒙古沙鼠腦靜脈壁的DHR熒光強度比在再灌注10分后開始增加，且持續增加。養血清 腦顆粒0. 4g/kg+缺血再灌注組和養血清腦顆粒0. 8+缺血再灌注組在再灌注10分顯著地抑制 了缺血再灌注引起的腦細靜脈壁的D冊螢光強度的增加。
試驗例六養血清腦顆粒對缺血再灌注后蒙古沙鼠腦細靜脈血漿白蛋白滲出的影響
一、養血清腦顆粒對缺血再灌注后蒙古沙鼠腦細靜脈血漿白蛋白滲出的影響 (一)試驗方法 1、材料同試驗例一2、 試驗組和對照組動物模型制備
(1) 缺血再灌注組同試驗例一
(2) 假手術組同試驗例一
(3) 養血清腦顆粒給藥組養血清腦顆粒0.4g/kg +缺血再灌注組，在缺血再灌注90分鐘 前，用灌胃管，灌胃給予養血清腦顆粒水溶液0.4g/kg.bw，其它操作同試驗例一
3、 測定方法血漿白蛋白漏出率的測定
在基礎觀察前10分鐘，將50mg/kg. bw的FITC標記的血漿白蛋白經股靜脈緩慢推注。用 波長488nm的氦氖激光束照射在開顱部位，用共聚焦顯微鏡系統觀察并紀錄在缺血前，以及再 灌注開始、10分、30分、60分時同一視野內細靜脈內外FITC標記熒光圖像。用圖象分析軟 件Image-Pro plus 5.0 (Media Cybemetrics Inc， USA)測定各個時間點細靜脈內(Iv)和 血管外(Ii) FITC標記白蛋白的螢光強度。以缺血再灌注前的細靜脈血管外的FITC螢光強 度(Ii)與細靜脈血管內的FITC螢光強度(Iv)的比值為基礎值，用各時間Ii/Iv的比值與 基礎值的比表示FITC螢光強度的變化，以判定細靜脈內白蛋白向血管外漏出的動態。 (二)結果
數據是每組6只沙鼠平均值土標準誤表示。數據分析用單因素方差分析oneiay a皿lisis of variance(ANOVA)處理和Fisher s post Hoc test檢驗。設p<0. 05為顯著性差異。
圖7是假手術組，缺血再灌注組和養血清腦顆粒組蒙古沙鼠腦細靜脈FITC標記白蛋白漏 出的圖像。在缺血再灌注前，假手術蒙古沙鼠，缺血再灌注蒙古沙鼠和養血清腦顆粒+缺血再 灌注蒙古沙鼠均沒有觀察到FITC標記白蛋白漏出細靜脈外。在再灌注60分時，假手術蒙古 沙鼠幾乎沒有觀察到腦細靜脈FITC標記白蛋白的漏出。缺血再灌注蒙古沙鼠，可以觀察到 FITC標記白蛋白的明顯漏出。養血清腦顆粒+缺血再灌注蒙古沙鼠，在再灌注后60分時，只 有少量FITC標記白蛋白的漏出于細靜脈外。可見養血清腦顆粒能夠顯著抑制白蛋白外漏。 二、不同劑量的養血清腦顆粒對缺血再灌注后蒙古沙鼠腦細靜脈壁白蛋白滲出的影響 (一)試驗方法
1、 材料同試驗例一
2、 試驗組和對照組動物模型制備
(1) 缺血再灌注組同試驗例一
(2) 假手術組同試驗例一
(3) 養血清腦顆粒給藥組同試驗例一
3、 測定方法同上述細靜脈白蛋白外漏率的測定(二)結果
數據是每組6只沙鼠平均值土標準誤表示。數據分析用單因素方差分析one-way analisis of variance (AN0VA)處理和Fisher s post Hoc test檢驗。設p〈0. 05為顯著性差異。
圖8表示的是假手術組，缺血再灌注組，養血清腦顆粒0.4g/kg+缺血再灌注組，養血清 腦顆粒0.8+缺血再灌注組在缺血前和再灌注后蒙古沙鼠腦細靜脈FITC標記白蛋白漏出的連 續變化。假手術組在本觀察期間，腦細靜脈FITC標記白蛋白的僅有少量的漏出。缺血再灌注 組從再灌注開始就可觀察到FITC標記白蛋白的漏出，并持續增加。養血清腦顆粒0. 4g/kg+缺 血再灌注組在再灌注60分顯著地抑制了缺血再灌注引起的腦細靜脈FITC標記白蛋白的漏出。 養血清腦顆粒0. 8+缺血再灌注組在再灌注30分以后顯著地抑制了缺血再灌注引起的腦細靜 脈FITC標記白蛋白的漏出。可見高劑量的養血清腦顆粒能夠快速地抑制白蛋白外漏。
試驗例七養血清腦顆粒對缺血再灌注蒙古沙鼠腦細靜脈超微結構的影響
(一)試驗方法
1、 材料同試驗例一
2、 試驗組和對照組動物模型制備
(1) 缺血再灌注組同試驗例一
(2) 假手術組同試驗例一
(3) 養血清腦顆粒給藥組養血清腦顆粒0.4g/kg +缺血再灌注組，在缺血再灌注90分 鐘前,用灌胃管，灌胃給予養血清腦顆粒水溶液0.4g/kg.bw，其它操作同試驗例一
3、 測定方法
在再灌注60分鐘后，經左心室以10ml/分鐘灌注生理鹽水將血管內的血液沖洗干凈后， 以3ml/分鐘的速度灌注固定液，固定液成分為4%甲醛，2%戊二醛，0.1M磷酸緩沖液。 灌注40分鐘后，然后迅速取下整個大腦，冠狀切面切成l-2mm厚組織片，然后轉移到3%戊 二醛固定液中4。C固定過夜，然后用0. 1M磷酸緩沖液沖洗三次，再用P/。俄酸固定液4'C固定 2小時。再用系列丙酮脫水，用Epon812樹脂包埋劑包埋，6(TC孵育48小時。然后進行修 塊，切成60nm厚的組織片，用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，再用JEM-1230透射電鏡觀察(JEM 1230, JEOL， Japan)。
掃描電鏡標本制備，灌流后迅速取下整個大腦，切成大約幾個毫米寬的小方薄片。先用 戊二醛固定2小時，用0. 1M磷酸緩沖液沖洗，再用0. 1M磷酸緩沖液配置的OA固定2小時， 用系列酒精脫水，標本移入醋酸戊酯。樣品放在干燥器樣品盒，用C02臨界點干燥法，使樣品干燥而不變形。用導電膠將樣品粘在樣品托上，然后在離子鍍膜儀中鍍金3分鐘，以使樣品 表面導電。最后在掃描電鏡JSM-5600LV(JSM-5600LV, JE0L， Japan)下觀察。
開放毛細血管計數皮質毛細血管開放數在各組的放大20倍的掃描電鏡圖像中計數。每 組圖像的開放毛細血管數的平均值為各組沙鼠的大腦皮質的平均開放毛細血管密度。
(二)結果
數據是每組6只沙鼠平均值土標準誤表示。數據分析用單因素方差分析one-way analisis of variance(AN0VA)處理和Fisher s post Hoc test檢驗。設p〈0. 05為顯著性差異。
圖9-A是假手術組，缺血再灌注組，養血清腦顆粒+缺血再灌注組大腦皮質掃描電鏡下毛 細血管開放的圖像。假手術組可見皮質中有許多毛細血管，且分布較均勻。缺血再灌注組可 以觀察到開放的毛細血管顯著減少，而且分布不均勻，養血清腦顆粒+缺血再灌注組開放的毛 細血管數量與假手術組相接近。圖9-B是假手術組，缺血再灌注組，養血清腦顆粒+缺血再灌 注組毛細血管開放數的結果。毛細血管開放數相對于假手術組(41.33±0.667)在缺血再灌 注后明顯下降(30. 33± 1.667 )，養血清腦顆粒顯著抑制了毛細血管開放數的減少 (42±0. 577)。
圖10是假手術組，缺血再灌注組和養血清腦顆粒+缺血再灌注組蒙古沙鼠再灌注60分后 的大腦皮質毛細血管的透射電鏡和掃描電鏡的圖象。圖a， b， c是透射電鏡圖像，假手術組 (a)可以觀察到血管內皮光滑，血管周圍組織的無水腫現象。缺血再灌注組(b)可以觀察 到血管周圍組織出現明顯水腫。養血清腦顆粒+缺血再灌注組(c)可以觀察到血管周圍水腫 明顯減輕。圖d， e， f是掃描電鏡圖像，假手術組(d)蒙古沙鼠腦皮質部細靜脈血管內皮光 滑，內皮細胞間連接緊密。缺血再灌注組(e)蒙古沙鼠腦皮質部細靜脈血管內皮可以觀察到 血管內細胞眾多的隆起，內皮細胞連接處，細胞間相互嵌合的指狀突起肥大，且內皮表面出 現許多突起的小泡。養血清腦顆粒+缺血再灌注組(f)蒙古沙鼠腦皮質部細靜脈血管內皮較光 滑，連接處指狀突起和小泡明顯減少。
本發明有益效果
本發明的藥物組合物的預給藥抑制了缺血再灌注后腦血管壁過氧化物的產生，白細胞與 腦血管內皮細胞的黏附，保護了腦血管內皮細胞，進而，抑制了血漿白蛋白的外漏和腦血管 周圍水腫，改善腦微循環，抑制了腦血流量的減少。
圖1養血清腦顆粒對缺血再灌注后蒙古沙鼠腦細靜脈管徑的影響。圖2養血清腦顆粒對缺血再灌注后蒙古沙鼠腦細靜脈紅細胞流速的影響。 圖3養血清腦顆粒對缺血再灌注后蒙古沙鼠腦血流量的影響。 圖4養血清腦顆粒對缺血再灌注后蒙古沙鼠腦細靜脈壁黏附白細胞的影響。 圖5養血清腦顆粒對缺血再灌注后蒙古沙鼠腦細靜脈DHR熒光強度的影響。 圖6不同劑量的養血清腦顆粒對缺血再灌注后蒙古沙鼠腦細靜脈DHR熒光強度的影響。 圖7養血清腦顆粒對缺血再灌注后蒙古沙鼠腦細靜脈血漿白蛋白滲出的影響。 圖8不同劑量的養血清腦顆粒對再灌注后蒙古沙鼠腦細靜脈血漿白蛋白滲出的影響。 圖9養血清腦顆粒對缺血再灌注后蒙古沙鼠大腦皮質毛細血管開放掃描電鏡圖象。 圖10養血清腦顆粒對缺血再灌注后蒙古沙鼠大腦皮質毛細血管的透射電鏡和掃描電鏡圖象。 其中Sham:假手術組，I/R:缺血再灌注組，CG0.4+I/R:養血清腦顆粒0. 4g/kg+缺血再 灌注組，CG0.8+I/R:養血清腦顆粒0.8+缺血再灌注組。圖10中所示圖a、 b、 c是投射電
鏡圖象，圖d、 e、 f是掃描電鏡圖象；CJ:細胞連接；V:小囊泡。
具體實施例
下面結合實施例對本發明做進一步的說明，下述各實施例僅用于說明本發明而并非對發 明的限制。
實施例一 藥物組合物制劑
(1) 取當歸67.5g，川芎67.5g，白芍54g，熟地54g，勾藤135g，雞血藤135g，夏枯草135g， 決明子135g，珍珠母135g，元胡67.5g，細辛14.5g;
(2) 將上述藥材加水提取3次，每次1小時，合并提取液，適當濃縮，加2倍量的乙醇，靜 置24小時沉淀，取上清液濃縮成浸膏，相對密度為1.4，出膏率為10%，取清膏、蔗糖和糊 精按1: 3: 1的比例制成顆粒劑125袋。
實施例二藥物組合物制劑
(1) 取當歸80g，川芎80g，白芍80g，熟地80g，勾藤120g，雞血藤120g，夏枯草120g， 決明子120g，珍珠母120g,元胡70g，細辛10g;
(2) 將上述藥材加水提取3次，每次1小時，合并提取液，適當濃縮，加2倍量的乙醇，靜置 24小時沉淀，取上清液濃縮成浸膏，相對密度為1.3，出膏率為10%，取清膏、蔗糖和糊精 按l: 3: 1的比例制成片劑200片。
實施例三中藥組合物制劑 (1)取當歸40g，川芎40g，白芍20g，熟地20g，勾藤歸g，雞血藤100g，夏枯草100g，決明子100g，珍珠母100g，元胡70g，細辛10g;
(2)將上述藥材加水提取3次，每次1小時，合并提取液，適當濃縮，加2倍量的乙醇，靜 置24小時沉淀，取上清液濃縮成浸膏，相對密度為1.3，出膏率為10%，取清膏、蔗糖和糊 精按1: 3: 1的比例制成膠囊100粒。
權利要求
1、一種藥物組合物在制備改善腦微循環障礙藥物中的應用，其中該組合物是由以下重量百分比含量的原料藥制成當歸4～9％川芎4～9％白芍2～8％熟地2～8％勾藤10～15％雞血藤10～15％夏枯草10～15％決明子10～15％珍珠母10～15％元胡4～9％細辛0.5～2％。
2、 如權利要求l所述的應用，其中所述的組合物是由以下百分比含量的原料藥制成 當歸6.75% 川芎6.75% 白芍5.4% 熟地5.4% 勾藤13.5% 雞血藤13.5% 夏枯草13.5% 決明子13.5% 珍珠母13.5% 元胡6.75% 細辛1.34%。
3、 如權利要求1或2所述的應用，其特征在于所述的腦微循環障礙是腦微血管損傷所致的 微循環障礙。
4、 如權利要求1或2所述的應用，其特張在于所述的腦微循環障礙是缺血再灌注損傷所致 的微循環障礙。
5、 如權利要求1或2所述的應用，其特征在于所述的腦微循環障礙是白細胞黏附所致的微 循環障礙。
6、 如權利要求1或2所述的應用，其特征在于所述的腦微循環障礙是過氧化物所致的微循環障礙
7、 如權利要求1或2所述的應用，其特征在于所述的腦微循環障礙是白蛋白外漏所致的微循環障礙。
8、 如權利要求1或2所述的應用，其特征在于所述的藥物組合物制成藥學上可接受的制劑。
9、 如權利要求8所述的應用，其特征在于所述的藥物組合物制成顆粒劑。
全文摘要
本發明提供了一種藥物組合物在制備改善腦微循環障礙藥物中的應用。本發明用蒙古沙鼠雙側頸動脈結扎建立的缺血再灌注模型，通過可視化動態連續系統觀察蒙古沙鼠雙側頸動脈結扎之后腦微循環動態，包括腦血流量、血流速度、血管徑、血管內皮過氧化物產生、白細胞黏附、血管通透性的變化，并用投射和掃描電鏡觀察細靜脈和毛細血管超微結構的變化的觀察和研究，證明了養血清腦顆粒對缺血再灌注所導致的腦微循環障礙有治療和改善作用。
文檔編號A61K36/185GK101428094SQ20071015007
公開日2009年5月13日 申請日期2007年11月6日 優先權日2007年11月6日
發明者劉育英, 凱 孫, 安麗華, 昕 常, 徐想順, 芳 王, 王傳社, 胡白和, 趙新榮, 韓晶巖 申請人:天津天士力制藥股份有限公司